炎症疾病治療劑的製作方法

2023-07-22 00:45:16

炎症疾病治療劑的製作方法
【專利摘要】本發明涉及包含與下列物質結合的單克隆抗體或其抗原結合片段：含SSVLYGGPPSAA(SEQ ID NO:1)所示的胺基酸序列的肽或該肽和藥學上可容許的載體的結合體的，與組蛋白相關的炎症治療劑。
NITE BP-972
20100817
【專利說明】炎症疾病治療劑
[0001]【關聯申請】
[0002] 本專利申請伴隨基於作為在先申請的日本專利申請的特願2012-35965號（申請 日：2012年2月22日）的優先權的主張。在所涉及的在先的專利申請中的全部公開內容 引用通過作為本說明書之一部分。 【【技術領域】】
[0003] 本發明涉及以單克隆抗體或其抗原結合片段作為有效成分的新穎的炎症疾病治 療劑。 【【背景技術】】
[0004] 近年、作為損傷關聯分子樣式分子組（DAMPs :Damage_associated molecular pattern molecules),報告有作為核內的構成成分的組蛋白。這樣的損傷關聯分子樣式分 子組作為器官傷害等的炎症疾病的原因受到關注。
[0005] 另一方面，敗血症是以如感染症、肝硬化、腎功能衰竭、糖尿病、異常分娩一樣的疾 病或，如留置導管、輸液器具、透析、氣管切開一樣的對傷或疾病的治療作為原因，不從細菌 感染巢斷絕或細菌斷續地侵入血液的重症全身性感染症。另外，敗血症不限於由廣泛微生 物所致的宿主的侵襲，感染症的臨床症狀、即定義為滿足（1)體溫>38°C至90 次/分；（3)呼吸率>20 次呼吸/分至PaC02〈32mmHg ;(4)白細胞數>12000/μ 1、〈4000/ μ 1至杆狀核嗜中性粒細胞>10%之中2項以上的病態。最近將顯示這樣的症狀的病態稱 為全身性炎症反應症候群（Systemic inflammatory response symdrome :SIRS)(非專利文 獻I :Crit. Care Med.，20 :864-874, 1992)。再者敗血症也包含合併器官功能障礙、低灌流 或低血壓而合併重症敗血症、乳酸性酸中毒、乏尿、意識障礙的敗血症性休克等（非專利文 獻2 :Chest，101 :1644-1655, 1992)。然後病態從重症敗血症、敗血症休克導致彌散性血管 內凝血症候群（DIC)、成人呼吸穹迫症候群（ARDS)、多器官功能障礙（MODS)。
[0006] 作為這樣的敗血症的原因菌，主要確認葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞 菌、克雷伯菌（Klebsiella)、腸桿菌（Enterobacter)等。由這些的細菌感染顯示高熱、惡 寒、頻脈、強的全身症狀，從而屢屢在動一靜脈血、髓液、骨髓液中確認感染菌。
[0007] 近年，由各種強力的抗生物質的開發導致以這些的菌作為原因的敗血症變少，由 獲得以MRSA作為代表的抗性基因的新的病原菌所致的敗血症增加。另外，反映使用留置導 管或輸液器具的處置、或者人工透析、氣管切開等的侵襲的處置一手術的廣泛使用，敗血症 的發生越是大醫院越有增加傾向。再者，在對於感染抵抗力低的新生兒、高齡者、造血器腫 瘤患者的發症頻度、及在施用腎上腺皮質激素或抗癌劑，免疫力降低的患者的敗血症的發 症頻度增加。由這些，敗血症隨著醫療的進步反到持續增加。
[0008] 作為這樣的敗血症的預防一治療方法，現在已知，檢測原因菌而測定其抗生物質 感受性，施用對於起因菌最適的抗生物質的同時，如補液、電解質補正、低蛋白血症的改善、 營養的補給、Y-球蛋白的施用一樣的致力於宿主的防衛力的方法等。另外，不幸地，陷入 休克時，進行利用外科手術的病巢的除去、循環障礙的改善、調理素活化物質的施用、腎上 腺皮質激素的施用、合成蛋白酶抑制劑的施用等的處置。但是，由於基礎疾病的症狀與敗 血症的症狀重疊，難以進行明確的診斷，導致敗血症的預防一治療困難的情況也屢屢見到。 再者，陷入敗血症性休克等時，其預防一治療是困難，敗血症是在現在導致高的死亡率的疾 病。
[0009] 敗血症的死亡率是10%?20%，甚至50%，報告不一。敗血症休克佔敗血病例的 40 %，休克例的預後不良，也有77?90 %的死亡率的報告。所以，敗血症性休克的預防成為 治療的第一目標，特別是，掌握在休克的初期階段發生的變化而可進行早期診斷，則早期治 療變得可能，可期待預後的改善。但是至今，對多種被認為有效的抗休克藥或治療法的臨床 效果有探討，但其中被判斷為有效的則幾乎沒有。
[0010] 敗血症被認為是以由感染刺激（菌自體、內毒素或肽聚糖/磷壁酸複合物的細胞 壁成分及外毒素等）從單核細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞等過量地產生的腫瘤壞死因子 (TNF)、白細胞介素 I (IL-I)、白細胞介素6 (IL-6)及白細胞介素8 (IL-8)等的炎症性細胞因 子作為原因而發症。由過量地產生的炎症性細胞因子，類花生酸或血小板活化因子的脂質 介質也被釋放，由它們的相互作用而細胞因子網絡被活化，炎症反應擴增。在此過程之中， 補體系統、凝固系、激肽系統、腎上腺皮質刺激激素/內啡肽系統也被活化，引發以血管內 皮障礙作為基礎病態的全身性的炎症反應。特別是，在循環障礙或組織障礙的表達中顯示 粒細胞來源的彈性蛋白酶或活性氧的相關。
[0011] 因此，進行了多數如抑制炎症性細胞因子一樣的物質的施用等所代表的炎症性細 胞因子抑制療法的臨床治驗。但是它們以完全的失敗告終（非專利文獻3 :Lancet，351 : 929-933, 1998、JAMA，271 :1836-1843, 1994)。
[0012] 儘管這樣的各種的治療方法被探討，敗血症的死亡率依然居高不下，有效的治療 藥也幾乎沒有。其理由是尚未完全地理解敗血症的病態（非專利文獻4 :Nath. J. Med.，55 : 132-141， 1999)。
[0013] 另外，作為損傷關聯分子樣式分子組相關的別的炎症疾病，缺血再灌注傷害被報 告。另外報告有，起因於腎缺血再灌注傷害，從而急性腎功能衰竭屢屢發生。但是，對這樣 的病態的有效的治療法幾乎沒有。
[0014] 從而，依然要求創造對損傷關聯分子樣式分子組相關的炎症疾病的優良的治療 劑。
[0015] 【現有技術文獻】
[0016]【非專利文獻】
[0017] 非專利文獻 I :Crit. Care Med.，20 :864-874, 1992
[0018] 非專利文獻 2 :Chest，101 :1644-1655, 1992
[0019] 非專利文獻 3 :Lancet，351 :929-933, 1998、JAMA，271 :1836-1843, 1994
[0020] 非專利文獻 4 :Nath. J. Med.，55 :132-141，1999
[0021] 【發明概述】
[0022] 本發明人此番發現、可特異性地識別含SSVLYGGPPSAA(SEQ ID N0:1)所示的氨基 酸序列的肽的單克隆抗體或其抗原結合片段對於組蛋白相關的炎症疾病發揮優良的治療 效果。本發明基於該見解作出。
[0023] 從而，本發明旨在提供對炎症疾病的新穎的治療劑。
[0024] 然後，本發明提供包含與含SSVLYGGPPSAA(SEQ ID N0:1)所示的胺基酸序列的肽 或該肽和藥學上可容許的載體的結合體結合的單克隆抗體或抗原結合片段的炎症疾病治 療劑。
[0025] 本發明的單克隆抗體或抗原結合片段可有效治療炎症疾病。 【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0026] 【圖1】示本發明的單克隆抗體（以下稱為"SSVmAb"）的同種型的鑑定試驗的結 果。
[0027] 【圖2】示關於本發明的單克隆抗體（SSVmAb)，比較向組蛋白H1、組蛋白H2A、H2B、 H3或H4的結合親和性的試驗的結果。
[0028] 【圖3】示關於參考例：保藏號FERMBP-10413的原保藏的雜交瘤16G9所產生的單 克隆抗體（以下，也稱為"16G9mAb"），比較向組蛋白H1、組蛋白H2A、H2B、H3或H4的結合 親和性的試驗的結果。
[0029] 【圖4】示使用本發明的單克隆抗體（SSVmAb)及16G9mAb的混合淋巴細胞反應 (MLR)試驗的結果。
[0030] 【圖5】示由流式細胞術比較本發明的單克隆抗體（SSVmAb)及16G9mAb的對T細 胞的反應性的結果。
[0031] 【圖6】A示關於本發明的單克隆抗體（SSVmAb)及對照試劑（同種型IgGl)的，使 用ATP合成酶未被siRNA敲落的脾臟細胞的MLR試驗的結果。B示關於本發明的單克隆抗 體（SSVmAb)及對照試劑（同種型IgGl)的，使用ATP合成酶被siRNA敲落的脾臟細胞的 MLR試驗的結果。
[0032] 【圖7】是示在試驗例7中，本發明的單克隆抗體（SSVmAb)在敗血症模型中提高動 物的生存率的圖。
[0033] 【圖8】是示在試驗例8中，本發明的單克隆抗體（SSVmAb)在敗血症模型中提高動 物的生存率的圖。
[0034] 【圖9】示在試驗例8的對照組及SSV mAb施用組中，測定血液樣品（血清）中及 肺中的組蛋白Hl濃度的結果。圖9A是血液樣品中的組蛋白Hl濃度的坐標圖。圖9B是肺 中的組蛋白Hl濃度的坐標圖。
[0035] 【圖10】示在試驗例8的對照組及SSV mAb施用組中，測定血液樣品中及肺中的組 蛋白H3濃度的結果。圖IOA是血液樣品中的組蛋白H3濃度的坐標圖。圖IOB是肺中的組 蛋白H3濃度的坐標圖。
[0036] 【圖11】示在試驗例8的對照組及SSV mAb施用組中，測定血液樣品中及肺中的組 蛋白H4濃度的結果。圖IlA是血液樣品中的組蛋白H4濃度的坐標圖。圖IlB是肺中的組 蛋白H4濃度的坐標圖。
[0037] 【圖12】是試驗例8的試驗結束後，從健康大鼠、以及SSV mAb施用組及對照組的 大鼠取得，染色的肺組織切片的顯微鏡照片。圖12A是健康大鼠的照片。圖12B是SSV mAb 施用組的照片。圖12C是對照組的照片。
[0038] 【圖13】是示試驗例8的試驗結束後，對於SSV mAb施用組及對照組的大鼠，關於 鬱血、浮腫、炎症及出血評價的結果的坐標圖。
[0039] 【圖14】示在試驗例8的對照組及SSV mAb施用組中，測定炎症性細胞因子 (TNF-a、IL-I β、IL-6)和抑制性細胞因子（IL-10)的血液樣品中濃度的結果。圖14A示 血液樣品中的TNF-α濃度。圖14Β示血液樣品中的IL-I β濃度。圖14C示血液樣品中的 IL-6濃度。圖14D示血液樣品中的IL-10濃度。
[0040] 【實施方式】
[0041] 【保藏】
[0042] 本發明的雜交瘤小鼠-小鼠雜交瘤SSV-C93-3是在原保藏日2010年8月17日， 在獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物保藏中心（住所：日本國千葉縣木更津 市上總鐮足2-5-8生物技術本部），以保藏號NITE ΒΡ-972被原保藏。
[0043]【單克隆抗體及雜交瘤】
[0044] 本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段以與含SSVLYGGPPSAA(SEQ ID Ν0:1)所示 的胺基酸序列的肽或該肽和藥學上可容許的載體的結合體結合作為一個特徵。涉及的單克 隆抗體或其抗原結合片段對於炎症疾病發揮優良的治療效果是意外的事實。
[0045] 本發明的炎症疾病優選為與組蛋白相關的炎症疾病，更優選為急性炎症疾病，更 優選為敗血症、腎缺血再灌注傷害或腎功能衰竭，再優選為敗血症、腎缺血再灌注傷害或急 性腎功能衰竭，再更優選是敗血症。
[0046] 根據本發明的優選的實施方式，上述抗體或其抗原結合片段針對含 SSVLYGGPPSAA(SEQ ID Ν0:1)所示的胺基酸序列的肽或該肽和藥學上可容許的載體。
[0047] 另外，根據本發明之一的實施方式，上述抗體或其抗原結合片段特異性地結合組 蛋白Η1、組蛋白Η3及組蛋白Η4。有涉及的結合能的抗體或其抗原結合片段如後述的實施 例中的8-2所示，可在炎症疾病的治療中特別有利地利用。
[0048] 另外，根據本發明的一實施方式，上述抗體或其抗原結合片段相比對接頭組蛋白 (組蛋白Hl)的結合親和性，對核心組蛋白的結合親和性更高。
[0049] 另外，根據本發明的優選的實施方式，核心組蛋白是組蛋白Η2Α、Η2Β、Η3或Η4,更 優選為Η2Α、Η3或Η4。
[0050] 另外，本發明的抗體或其抗體結合片段可含重鏈及/或輕鏈。各輕鏈及重鏈可在 其N-末端具有可變區域，在各可變區域中交替含4個框架區域（framework region) (FR) 和，3個互補性決定區域（CDR)。可變區域中的殘基根據由Kabat等考慮的系統習慣性地編 號。此系統在 Kabat 等，1987、Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Departement of Health and Human Services，NIH, USA 中有記述。除非特別說明，本說明 書中使用此編號體系。基於這樣的Kabat等的方法的編號可使用例如，網站http://WWW. bioinf. org. uk/abysis/tools/analyze. cgi 簡易也進行。
[0051] Kabat殘基命名法與胺基酸殘基的直線編號未必直接一致。實際的直線的氨基 酸序列，儘管有基本可變區域結構的結構的要素、框架或CDR之任何，但對應於其縮短或插 入，相比嚴格的Kabat編號有更少的或追加的胺基酸。殘基的正確的Kabat的編號是，對於 給定的抗體，通過將"標準的'Tiabat編號的序列和抗體的序列中的相同性殘基對齊來確定。
[0052] 根據一實施方式，本發明的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區域包含含有：含 RASSSVSYMH(SEQ ID N0:2)所示的胺基酸序列的 CDR1、含 ATSNLAS(SEQ ID N0:3)所示的氨 基酸序列的⑶R2、及含QQWSSNPWT(SEQ ID N0:4)所示的胺基酸序列的⑶R3。根據再優選 的實施方式，上述輕鏈可變區域含SEQ ID NO: 6的第23位?第128位所示的胺基酸序列。
[0053] 另外，根據別的實施方式，本發明的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區域包含 含有：含 GYNMN(SEQ ID N0:7)所示的胺基酸序列的 CDR1、含 NINPYYGSTSYNQKFKG(SEQ ID N0:8)所示的胺基酸序列的⑶R2、及含SPYYSNYWRYFDY(SEQ ID N0:9)所示的胺基酸序列的 ⑶R3。根據再優選的實施方式，上述重鏈可變區域含SEQ ID NO: 11的第20位?第141位 所示的胺基酸序列。
[0054] 另外，根據本發明的更加優選的實施方式，本發明的抗體或其抗原結合片段包含 含有下列⑶Rl?3的輕鏈可變區域：含RASSSVSYMH(SEQ ID N0:2)所示的胺基酸序列的 CDR1、含 ATSNLAS(SEQ ID N0:3)所示的胺基酸序列的 CDR2、及含 QQWSSNPWT(SEQ ID N0:4) 所示的胺基酸序列的CDR3 ;包含含有下列CDRl?3的重鏈可變區域：含GYNMN(SEQ ID N0:7)所示的胺基酸序列的CDR1、含NINPYYGSTSYNQKFKG(SEQ ID N0:8)所示的胺基酸序列 的CDR2、及含SPYYSNYWRYFDY(SEQ ID N0:9)所示的胺基酸序列的CDR3。
[0055] 另外，根據本發明的更加優選的實施方式，本發明的抗體或其抗原結合片段包含： 含SEQ ID N0:6的第23位?第128位所示的胺基酸序列的輕鏈可變區域，和含SEQ ID NO: 11的第20位?第141位所示的胺基酸序列的重鏈可變區域。
[0056] 另外，根據本發明的優選的實施方式，上述單克隆抗體或其抗原結合片段可下調 ATP合成酶活性。另外，根據本發明的更優選的實施方式，上述ATP合成酶是線粒體的ATP 合成酶。
[0057] 本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段之上述結合親和性及ATP合成酶活性的 下調活性例如，由本申請說明書的試驗例2及4中記載的方法確認。
[0058] 另外，本發明的單克隆抗體優選為，嵌合抗體、人源化抗體或完全人型抗體。這 些抗體可由本領域技術人員基於例如，Morrison, S. L.，Oi，V. T.，"immunoglobulin genes" Academic Press (London), 260-274 (1989) > Roguska, M. L. et. Al. , Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 969-973 (1994) > Tomizuka, K. et. al. Functional expressionand germline transmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice, Nature Genet. , 16, 133-143(1997)> Winter, G. et. al. , Making antibodies by phage display technology, Ann. Rev. Tmmunol · , 12, 433-455 (1994)、Griffiths, A. D. et. al. , Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires, ΕΜΒ0. J.，13, 3245-3260(1994)等中記載的現有【技術領域】的公知技術來製造。
[0059] 另外，根據本發明的優選的實施方式，上述抗原結合片段優選為Fab、Fab'、 (Fab，） 2、Fv 或 scFv。
[0060] 另外，根據本發明的別的優選的實施方式，上述單克隆抗體或其抗原結合片段由 雜交瘤小鼠-小鼠雜交瘤SSV-C93-3產生。
[0061] 本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段、及雜交瘤可例如，如以下一樣製造。艮P， 首先，本發明的雜交瘤可通過，將含SSVLYGGPPSAA(SEQ ID N0:1)所示的胺基酸序列的肽或 該肽和藥學上可容許的載體的結合體作為致敏抗原使用，使利用此致敏抗原免疫的哺乳動 物的漿細胞（免疫細胞）與哺乳動物的骨髓瘤細胞融合，對得到的雜交瘤進行克隆，從該雜 交瘤中篩選來得到。然後，本發明的單克隆抗體可通過培養本發明的雜交瘤，回收其產生的 抗體而得到。
[0062] 作為免疫哺乳動物的方法,可使用在現有【技術領域】的一般施用法,具體而言,可舉 出腹腔內注射、脾臟內注射、肌肉內注射、皮下注射、皮內注射、經口施用、經黏膜施用、經皮 施用等，優選為腹腔內注射、脾臟內注射。致敏抗原的施用間隔根據致敏抗原的施用量及哺 乳動物的種類等適宜決定，但可設為例如，每1個月間數次。
[0063] 免疫的哺乳動物不特別限定，但優選考慮細胞融合中使用的與骨髓瘤細胞的適合 性等而選擇，可舉出例如，小鼠、大鼠、倉鼠等，優選為小鼠。
[0064] 另外，作為免疫細胞，優選使用脾細胞。
[0065] 作為本發明中使用的骨髓瘤細胞，可舉出例如，P3(P3X63Ag8. 653) (J. Immunol.， 123，1548，1978)、p3_Ul (Current Topics in Micro-biology 及 Immunology, 81，1-7, 1978)、NS-I (Eur.J. Immunol.，6, 511-519, 1976)、MPC-Il (Cell，8, 405-415, 1976)、 Sp2/0-Agl4 (Nature, 276, 269-270, 1978), FO (J. Immunol. Meth. ,35, 1-21, 1980), S194(J. Exp. Med. ,148,313-323, 1978)、及 R210 (Nature, 277, 131-133, 1979)等，優選為 P3 或 P3-U1，更優選為P3。
[0066] 免疫細胞和骨髓瘤細胞的細胞融合可根據例如，Milstein等（Milstein et. al.) 的方法（Methods Enzymol.，73, 3-46, 1981)等進行。具體而言，細胞融合可通過例如，在融 合促進劑的存在下、在培養基中使免疫細胞和骨髓瘤細胞混合來實施。然後，在細胞融合 中，可添加適宜培養基，重複離心分離的操作而生成雜交瘤。
[0067] 作為細胞融合中使用的培養基，可舉出例如，RPMI-1640培養基、MEM培養基等的 細胞融合中通常使用的培養基。另外，可適宜聯用牛胎兒血清（FBS)等的血清補液。
[0068] 另外，細胞融合溫度優選於25?37°C，更優選於30?37°C。
[0069] 另外，骨髓瘤細胞和免疫細胞的混合比率優選為1:1?1:10左右。
[0070] 作為融合促進劑，可舉出例如，聚乙二醇（PEG)、仙臺病毒（HVJ)等，優選為PEG。 PEG的分子量可適宜選擇，例如，平均分子量可為1，000?6, 000左右。另外，培養基中的 PEG的濃度優選為約30?60% (W/V)。
[0071] 另外，可根據期望將二甲基亞碸等的輔助劑適宜添加到培養基中。
[0072] 本發明的雜交瘤的選擇可通過，將由細胞融合得到的雜交瘤在例如，HAT培養基 等的通常的選擇培養基中培養，使用通常的有限稀釋法，作為例如，對含SSVLYGGPPSAA(SEQ ID NO: 1)所示的胺基酸序列的肽或該肽和藥學上可容許的載體的結合體的抗體價等指標 而進行篩選來實施。利用HAT培養基的培養期間是對於殺滅作為目的的雜交瘤以外的細胞 (未融合細胞）充分的時間，通常可為數天?數周。如此得到的本發明的雜交瘤可在通常的 培養基中進行繼代培養，另外，可在液氮中長期保存。
[0073]另外，作為回收本發明的單克隆抗體或其抗體結合片段的方法，可舉出例如，將雜 交瘤根據常規方法培養，從該培養上清得到單克隆抗體等的方法、或者將雜交瘤施用於與 此有適合性的哺乳動物而使增殖，從其腹水得到單克隆抗體等的方法等。其中，前者的方法 對於得到高純度的抗體而言優選，另一方面，後者的方法對於大量地生產抗體而優選。
[0074] 再者，本發明的單克隆抗體或其抗體結合片段可由鹽析法、凝膠過濾法、親和性層 析等的方法純化至高純度。
[0075] 本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段，如上所述，對與組蛋白相關的炎症疾病 有優良的治療效果。從而，根據本發明的別的實施方式，在炎症疾病治療劑的製造中提供本 發明的單克隆抗體的使用。另外，在上述方法中，炎症疾病優選為與組蛋白相關的炎症疾 病，更優選為急性炎症疾病，更優選為敗血症、腎缺血再灌注傷害或腎功能衰竭，再優選為 敗血症、腎缺血再灌注傷害或急性腎功能衰竭，再更加優選是敗血症。另外，本發明的單克 隆抗體或其抗原結合片段可直接使用，也可與藥學容許的添加劑等一同作為醫藥組合物使 用。從而，根據本發明之一的實施方式，提供含本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段的炎 症疾病治療用的醫藥製劑。
[0076] 本發明的敗血症治療劑，例如，可將本發明的單克隆抗體溶解於注射用生理鹽水、 注射用蒸餾水、注射用緩衝溶液等而製備。再者，在本發明的免疫抑制用組合物中可含有 適當的溶劑、溶解輔助劑、保存劑、穩定劑、乳化劑、懸浮劑、無痛化劑、張度劑、緩衝劑、賦形 齊?、增粘劑、著色劑、公知的載體（各種脂質體、聚胺基酸載體、合成高分子、天然高分子等） 等。
[0077] 另外，根據本發明的別的實施方式提供炎症疾病的治療方法，其包括向受試者施 用有效量的本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段。其中，"治療"是指改善確立的病態。 另外，根據本發明的別的實施方式，提供減輕受試者的炎症疾病的發生風險的方法，包括向 受試者施用有效量的本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段。另外，在上述方法中，炎症疾 病優選為與組蛋白相關的炎症疾病，更優選為急性炎症疾病，更優選為敗血症、腎缺血再灌 注傷害或腎功能衰竭，再優選為敗血症、腎缺血再灌注傷害或急性腎功能衰竭，再更加優選 是敗血症。
[0078] 另外，本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段可發揮顯著的免疫抑制作用。可在 炎症疾病治療中使用的上述單克隆抗體或其抗原結合片段可產生免疫抑制作用是意外的 事實。從而，根據一個的實施方式，本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段作為免疫抑制劑 使用。
[0079] 另外，根據一實施方式，作為上述待測樣品，優選為哺乳動物，更優選為人。
[0080] 另外，本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段也可與炎症疾病中使用的其他藥劑 組合而同時或依次施用給哺乳動物。
[0081] 另外，本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段可全身或局部地施用，作為具體性 的施用方法，可舉出點滴、靜脈內注射、肌肉內注射、皮下注射、皮內注射、經口施用、經黏膜 施用、經皮施用等。
[0082] 另外，本發明的單克隆抗體或抗原結合片段的有效量不特別限定，可由本領域技 術人員根據待測樣品的種類、性質、性別、年齡、症狀等而適宜決定。例如，作為涉及的有效 量，可舉出1次或數次0. 05?40mg/體重kg/日、優選為2?IOmg/體重kg/日等。 【實施例】
[0083] 以下，舉實施例具體說明本發明，本發明不限於這些實施例。
[0084] 【實施例1 :單克隆抗體（SSVmAb)的製造】
[0085] 【抗原物質的製造】
[0086] 作為抗原物質，使用含SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列的肽及KLH的結合體。
[0087] 在抗原物質的製備中，首先，含SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列的肽由Fmoc肽 固相合成法（製造裝置；ABI430型Applied Biosystems公司制）合成。再者，上述肽及 KLH(SIGMA公司制）的結合體是將上述肽5mg、KLH約20mg及戊二醛30 μ g(片山化學工業 株式會社）在磷酸緩衝液（pH 8. 0)中，於室溫攪拌約6小時而合成。
[0088] 【雜交瘤的製造】
[0089] 【免疫】
[0090] 將在PBS中溶解抗原物質的溶液0. 8mL(抗原物質濃度：0. 5mg/mL)和弗氏完全佐 劑（和光純藥株式會社制）〇. 8mL混合，得到懸浮液（抗原濃度：0. 25mg/mL)。接下來，將此 懸浮液0.2mL腹腔內施用給BALB/c小鼠。再者，將此懸浮液每2周以同量施用給小鼠。然 後，從施用開始16周後，將溶解PBS中抗原的溶液0. 2mL (抗原濃度：600?1000mg/mL)最 終施用到小鼠腹腔內。再有，在施用時，從眼底靜脈進行採血，由ELISA測定抗體價。最終 施用的4天後，進行全採血，將得到的血液離心分離（2000rpm、20分鐘），得到抗血清而作為 以下的實驗的對照抗血清使用。另外，全採血後，從大鼠摘出脾臟，將得到的脾細胞在以下 的細胞融合中使用。
[0091] 【細胞融合】
[0092] 將上述的脾細胞及骨髓瘤細胞（P3X63_Ag. 8. 653)以脾細胞：骨髓瘤細胞= 10:1?10混合而進行離心分離（1500rpm，5分鐘）。離心分離之後，使用吸吐器除去上清， 向得到的細胞沉澱經1分鐘添加37°C的聚乙二醇4000 (50% PBS溶液）ImL而作為混合液。 將此混合液於37 °C靜置1分鐘之後，每30秒鐘加 ImL的37 °C的IMDM培養基（計9mL)之 後，進行離心分離（1500rpm、5分鐘）。離心分離後，將上清吸除，適量添加37°C的含有15% FCS(JRH BI0SCIENCES制）的頂DM(GIBO)制）培養基。將得到的懸浮液向96孔培養板進 行各IOOmL分注，在37°C /5% CO2溫育器中培養1天。再者，添加 HAT培養基（將HAT粉 末（HAT MEDIA SUPPLEMENT (X 50)、SIGMA制）溶解於無血清MDM培養基IOmL中，用含有 10% FCS的MDM培養基稀釋50倍的）IOOmL,在37°C /5% CO2溫育器中培養。每2?3 天進行HAT培養基的更換，10天後切換為HT培養基（將HT粉末（HT MEDIA SUPPLEMENT、 SIGMA制）溶解於無血清MDM培養基IOmL中，用含有10% FCS的MDM培養基稀釋50倍 的），在37°C /5% CO2溫育器中進行3天培養。之後每2?3天進行培養基（HT培養基） 的更換。由顯微鏡確認細胞增殖之後，回收培養上清（約IOOmL)。使用此培養上清進行利 用抗體價測定的雜交瘤的篩選。
[0093] 【雜交瘤細胞的篩選】
[0094] 【抗體價測定】
[0095] 向96孔平底板每1孔添加各50 μ L上述含抗原物質（5mg)的緩衝液（碳酸氫 鹽緩衝液=IOOmM NaHC03-Na0H、pH9. 2?9. 5、肽濃度：1 μ g/mL)，於室溫靜置2小時而包 被。將板用清洗緩衝液（PBST)清洗3次，以200?250 μ L/孔加封閉緩衝液（3 %脫脂 乳1% BSA、PBS)，於4°C反應一晝夜之後，清洗3次。然後，以100 μ L/孔加雜交瘤的培養 上清，於37°C反應4小時或於4°C反應一晝夜。將板清洗3次之後，以50μ!7孔加用稀 釋緩衝液（IOmM Tris-HCl(pH 8.0)、0· 9% (W/V)NaCl、0. 05% (W/V)Tween20)稀釋 10000 倍的生物素標記抗小鼠 IgG(Biotion_labeled anti-mouse IgG、SIGMA),於室溫反應2 小時。其後清洗6次之後，以50 μ L/孔加用稀釋緩衝液稀釋1000倍的鹼性磷酸酶標記 Streptaridin (Streptaridin)，於室溫反應1?2小時。其後進行6次清洗，以50 μ L/孔 加突光底物緩衝液（Attophos substrate buffer、Roche_Diagnostics公司制），將板遮光 而顯色。螢光強度用CytoFluorII (PERCEPTIVE公司制）測定。
[0096]【雜交瘤的篩選】
[0097] 通過上述抗體價測定，向顯示陽性的結果的孔（IXlO5細胞/mL)加含有15% FCSlO% HCF(雜交瘤克隆因子、Origin公司制）的IMDM培養基，分注到96孔培養板至成約 200細胞/孔，在37°C 5% CO2溫育器中進行培養。然後，與上述同樣地進行抗體價測定，選 擇抗體產生量多的雜交瘤。
[0098] 再進行有限稀釋，用含有15% FCSUO%的HCF的IMDM培養基稀釋至選擇的雜交 瘤成0. 5?1細胞/孔，在37°C /5% CO2溫育器中培養約3?4天之後，與上述同樣地進 行抗體價測定，選擇抗體產生量多的雜交瘤。再重複有限稀釋，得到產生針對上述抗原物 質的單克隆抗體的雜交瘤。其中，選擇抗體價最高的雜交瘤而命名為小鼠-小鼠雜交瘤 SSV-C93-3。
[0099]【單克隆抗體的取得】
[0100] 使用含有15 % FCS的RPMI培養基培養雜交瘤小鼠-小鼠雜交瘤 SSV-C93-3 (I X IO6細胞/mL)。接下來，回收雜交瘤培養液，為了除去死細胞片而用濾器過 濾。接下來，向培養上清加硫酸銨至終濃度成40%，於40°C攪拌1小時。接下來，進行離心 分離（3000g、30分鐘、4°C )，捨去上清而回收沉澱。將此沉澱用上述培養上清的1/10量的 PBS溶解，用PBS作為外液而透析一晚。
[0101] 接下來，將上述沉澱用20mM磷酸鈉緩衝液（pH7. 0)進行2倍稀釋，與IM TriS-HCl 緩衝液一同添加到HiTrapNHS活化柱。再者，用0. IM甘氨酸-HCl溶液（pH2. 7)將抗體的 溶出，回收到級分管中。
[0102] 【試驗例I :SSVmAb的同種型的鑑定】
[0103] 為了鑑定實施例1的單克隆抗體（SSVmAb)的同種型，進行使用小鼠單克隆抗體同 種型試劑（SIGMA)的同種型鑑定試驗。
[0104] 結果如圖1所示，IgGl示最高的值。
[0105] 另外，將小鼠 IgGl (eBioscience公司）及實施例1的單克隆抗體（SSVmAb)用 2-巰基乙醇還原，用SDS-PAGE處理時，均在同樣的位置（50KD、25KD)確認相當於重鏈及輕 鏈的條帶。另一方面，代替小鼠 IgGl而使用小鼠 IgM(eBioscience公司）進行同樣的實驗 時，確認不到同樣的條帶。
[0106] 從圖1及SDS-PAGE的結果確認，實施例1的單克隆抗體（SSVmAb)的同種型是 IgGl。
[0107] 【試驗例2 :對SSVmAb的核心組蛋白的親和性的確認】
[0108] 在W02006/025580號公報中，作為可在免疫抑制中使用，與含SEQ ID N0:1所示的 胺基酸序列的肽結合的抗Hl單克隆抗體，報告有雜交瘤16G9 (保藏號FERMBP-10413)所產 生的單克隆抗體（16G9mAb)。
[0109] 從而，以W02006/025580號公報中記載的抗體（16G9mAb)作為參考例1，進行對與 實施例1的單克隆抗體（SSVmAb)的抗原的親和性的比較。
[0110] 作為抗原，選擇作為參考例l(16G9mAb)的抗原的組蛋白H1、及作為組蛋白Hl類似 抗原的核心組蛋白H2A、H2B、H3及H4。
[0111] 用ELISA確定組蛋白Hl或核心組蛋白和SSVmAb的親和性。
[0112] 將96孔微平板用組蛋白H1、H2A、H2B、H3或H4包被。各自的組蛋白溶解於IOOmM 碳酸鈉緩衝液（PH9. 3)而使用。將該板用PBS-吐溫20(0. 05% )清洗，用3%脫脂乳和 1 % BSA封閉1小時。向各孔添加 SSVmAb 5 μ g/mL，溫育1小時。將結合的SSVmAb使用 過氧化物酶（HRP)綴合物抗小鼠 IgGl Ab(SIGM)檢測，溫育1小時。將結合的SSVmAb使 用ABTS[2, 2' -連氮基-雙（3-乙基苯並噻唑啉-磺酸）]底物溶液檢測，使用Multiskan Ascent (Thermo Fisher Scientific Inc. ,Waltham，MA)測定 405nm 的吸光度。
[0113] 結果如圖2及3所示。
[0114] 如圖2所示，在實施例I(SSVmAb)中，相比對組蛋白Hl的親和性，對組蛋白H2A、 H2B、H3或H4的親和性更高。
[0115] 另一方面，如圖3所示，在參考例1(16G9)中，相比對組蛋白H2A、H2B、H3及H4的 親和性，對組蛋白Hl的親和性更高。
[0116] 【試驗例3 :MLR試驗】
[0117] 使用無處理的M大鼠來源的脾臟淋巴細胞（應答細胞）及進行絲裂黴素 C(協 和發酵工業株式會社制）處理的LEI大鼠來源的脾臟淋巴細胞（刺激細胞）。將應答細胞 用10% FCS-RPMI培養基調節到5 X IO5細胞/mL，將刺激細胞用10% FCS-RPMI培養基調 節到8 X IO6細胞/mL。將此應答細胞懸浮液及刺激細胞懸浮液各自100 μ L接種到96孔 圓底板（Nunc Brand Products公司制）之後，在混合培養開始時添加參考例1的單克隆抗 體16G9mAb (0. 1、2、4或6 μ g/mL/孔）或實施例1的單克隆抗體SSVmAb (4 μ g/mL/孔），在 37°C，5% C02/95%空氣的條件下培養3. 5天以上。另外，作為陽性對照，添加免疫抑制劑他 克莫司（FK506:藤澤藥品公司制、InM/孔）。再者，在培養結束15小時前添加溴脫氧尿苷 (BrdU) 10 μ L。然後，使用BrdU標記&檢測試劑盒III (Roche Diagnostics公司制），以提 取的細胞內DNA的BrdU量作為指標，由免疫抑制物質測定處理的細胞的增殖能，作為免疫 抑制水平的指標。
[0118] 結果如圖4所示。
[0119] 在實施例I (SSVmAb)中，顯示BrdU量提取的吸光度相比參考例I (16G9mAb)及他 克莫司（FK506)的更低。特別是，比較實施例1(SSV mAb)的吸光度0. 552±0. 114(平均 ±3』.）和同添加量（4以8/11117孔）的參考例1(16691^13)的吸光度1.351±0.389(平均 土S. E.)，則實施例1的平均值是參考例1的約41 %左右。
[0120] 【試驗例4 :對單克隆抗體（SSVmAb) T細胞的反應性的確認】
[0121] 由以下的方法，從C57BL/6小鼠（5周齡、雌、日本Charles River公司制）摘出脾 髒，製備全脾細胞。
[0122] 首先，在放入5ml的RPMI1640培養基（Sigma-Aldrich公司制R-8758)的5ml培養 皿（BD Bioscience公司制FALCON 351007)中將脾臟用解剖用夾和鑷子良好分解而懸浮脾 細胞後，移到15ml離心管（BD Bioscience公司制FALCON 352096)中。接下來，將5ml皿 上用磷酸緩衝鹽水（PBS，Invitrogen公司制20012-027)清洗數次，將這些也加到先前的細 胞懸浮液中而靜置後，將上清回收到別的15ml離心管中。再者，向殘渣的不溶性脾臟組織 也再加 RPMI1640培養基5ml，僅回收靜置後上清，將這和上述的細胞懸浮液合併而進行以 l，500rpm，5min的離心分離。向回收的細胞加裂解緩衝液（150mM NH4Cl/15mM NaHCO3A). ImM EDTA-Na2，pH 7. 3)2ml，由叩敲溶血後，加 PBS 10ml，將以l，500rpm，5min離心清洗3次的細 胞作為全脾細胞。
[0123] 接下來，基於接下來記載的方法，從本脾細胞將全T細胞使用Pan T細胞分離試劑 盒，小鼠 （Miltenyi Biotec公司制130-090-861)，由磁篩選（MACS)純化。
[0124] 首先，將脾細胞用MACS緩衝液（0· 5%牛血清白蛋白（BSA，Nacalai tesque公司 制08777-36)/PBS)以5xl07個細胞/200 μ 1的比例懸浮，添加50 μ 1生物素-抗體混劑 /^107個細胞，於41：溫育101^11。將其懸浮於15(^1嫩05緩衝液/5\10 7個細胞後，添加 100 μ 1抗生物素微珠/5 X IO7個細胞，於4°C溫育15min。向其添加 MACS緩衝液（10ml)， 以1500rpm離心清洗5min後，將回收細胞懸浮於MACS緩衝液500 μ 1。將MACS柱（MS柱、 Miltenyi Biotec 公司制 130-042-201)設置於磁體（MiniMACS 分離單兀、Miltenyi Biotec 公司制130-090-312)中，用500 μ I MACS緩衝液將柱平衡化後，供應上述的細胞懸浮液。回 收經過的級分500 μ 1及其後的利用MACS緩衝液的柱清洗級分（I. 5ml)而作為純化未刺激 T細胞（純度約97% )。
[0125] 由流式細胞術（FACS)解析上述的未刺激和16G9mAb或SSV mAb的反應性。
[0126] 首先，將各T細胞樣品（IxlO6個細胞）懸浮於89 μ 1的FACS緩衝液（0. 5% FBS/ PBS/0. 02 % NaN3)後，加 1 μ g 的抗-小鼠 CD16/32-阻斷 Fc 結合（eBioscience 公司制 14-0161-85)，於 4°C溫育 20min。向其加作為第 1 抗體的 16G9mAb 或 SSV mAb(100yg/ ml) 10 μ 1，於4°C溫育60min。用FACS緩衝液將細胞離心清洗2次後，加100 μ 1第2抗體 (生物素-綴合的大鼠抗-小鼠 IgMmAMeBioscience公司制13-5780-85)或生物素-綴合 的大鼠抗-小鼠 IgGlmAb (BD Biosciences 公司制 553441)、各 1 μ g/ml)，於 4°C溫育 30min。 再用FACS緩衝液將細胞離心清洗2次後，加100 μ 1鏈黴親合素-PE-Cy7 (BD Biosciences 公司制556463、1 μ g/ml)，向其添加 FITC-綴合的大鼠抗-小鼠 CD3mAb (BD Biosciences 公司制553062)至終濃度成1 μ g/ml，於4°C溫育30min。用FACS緩衝液離心清洗2次及 用40 μ m細胞濾器（BD Bioscience公司制FALCON 352340)過濾處理後，將各樣品供應到 FACSCalibur流式細胞儀及CellQuest軟體（BD Bioscience公司制）而解析16G9mAb或 SSV mAb陽性/⑶3陽性T細胞數。
[0127] 結果如圖5所示。
[0128] 比較參考例I (16G9mAb)及實施例I (SSV mAb)，則在對⑶3陽性T細胞的反應性中 確認不到顯著差異，這些抗體示同等的反應性（student t-test、p〈0. 05)。
[0129] 【試驗例5 :由SSV mAb的下調的革巴的確定】
[0130] 用蛋白質組解析鑑定7種由實施例I (SSV mAb)下調的候選蛋白質。
[0131] 然後，7種候選蛋白質中，由以下的方法確認ATP合成酶是實施例1(SSV mAb)的靶 抗原。
[0132] 首先，使用ThermoFisher公司的Accell siRNA試劑盒，取得敲落了線粒體ATP合 成酶的Balb/c小鼠來源的T細胞。
[0133] 接下來，根據試驗例2的方法，使用得到的T細胞，以實施例I (SSV mAb)作為試驗 物質進行MLR試驗。
[0134] 其中，作為對照試劑使用同種型IgGl (eBioscience公司）。另外，作為對照試驗， 使用未敲落ATP合成酶的小鼠來源的T細胞進行同樣的試驗。
[0135] 結果如圖6A及B所示。
[0136] 如圖6A所示，在ATP合成酶未被敲落時，實施例1(SSV mAb)相比同種型IgGl顯 著地抑制細胞增殖。
[0137] 另一方面，如圖6B所示，在ATP合成酶被敲落時，關於細胞增殖的抑制，在實施例 1(SSV mAb)和同種型IgGl之間確認不到顯著差異。
[0138] 在圖6A及B中，由ATP合成酶的敲落而SSV mAb的免疫抑制活性降低，提示SSV mAb在免疫抑制時下調ATP合成酶活性。
[0139] 【試驗例6 :SSV mAb的輕鏈及重鏈的可變區域序列的鑑定】
[0140] 【雜交瘤cDNA的合成】
[0141] 使用快速純化RNA試劑盒（TaKaRa公司制），從在試驗例1中取得的雜交瘤（小 鼠-小鼠雜交瘤SSV-C93-3)製備I. 6 X IO7個細胞總RNA。使用多聚（A) +自總RNA分離試 劑盒（NIPPON GENE 制），從 240 μ g 的總 RNA 製備 mRNA。使用 Etachinmate (NIPPON GENE 公司制）進行乙醇沉澱，使mRNA沉澱。用75%乙醇清洗之後，將mRNA乾燥。向其加10 μ L 無 RNA酶的水，溶解mRNA。將得到的mRNA溶液於-80°C保存。使用SMARTer RACE cDNA擴 增試劑盒（Clontech公司制），從1 μ g的SSV雜交瘤mRNA合成5' -RACE用的cDNA。將得 到的cDNA溶液於-20°C保存。
[0142] 【SSV mAb輕鏈及重鏈中的互補性決定區域（⑶R)的鑑定】
[0143] 基於小鼠 IgGl重鏈恆定區的鹼基序列製作引物5'-CAC CAT GGA GTT AGT TTG GGC AGC AG-3'（SEQ ID NO: 12)。基於小鼠輕鏈κ恆定區的鹼基序列製作引物5' -CAC GAC TGA GGC ACC TCC AGA TG-3'（SEQ ID NO: 13)。使用各自的引物和通用引物A混合物 (SMARTer RACE cDNA擴增試劑盒附屬引物），以cDNA作為模板進行5' -RACE。RACE反應使 用Advantage2 PCR試劑盒（Clontech公司制）。對反應液進行瓊脂糖電泳，將約600bp的 重鏈5'-RACE產物及約550bp的輕鏈5'-RACE產物使用E. Z. N. A.凝膠提取試劑盒（OMEGA bio-tek公司制）從凝膠純化。將其連結到pGEM-T Easy載體（Prco公司制），轉化感受態高 大腸桿菌（E. coli)DH5 α (Τ0Υ0Β0公司制）。從得到的轉化體，使用E. Z. N. A.質粒Minipr印 試劑盒I (OMEGA bio-tek公司制）製備質粒。將製備的質粒作為模板，使用BigDye終止子 v3. 1環測序試劑盒（Applied Biosystems公司制）進行循環反應。
[0144] 接下來，使用DNA測序儀（Applied Biosystems制），解析輕鏈及重鏈可變區域的 鹼基序列。
[0145] 結果，輕鏈可變區域的鹼基序列如SEQ ID NO: 5的第67位?第384位所示。
[0146] 另外，重鏈可變區域的鹼基序列如SEQ ID NO: 10的第58位?第423位所示。
[0147] 再有，基於由翻譯起始密碼子和Kabat等的方法確定的FR(恆定區）1的位置，推 定SEQ ID NO: 5的第1位?第66位是輕鏈信號肽的鹼基序列，及SEQ ID NO: 10的第1位? 第57位是重鏈的信號肽的鹼基序列。
[0148] 接下來，從得到的鹼基序列推定輕鏈及重鏈的可變區域的胺基酸序列，根據Kabat 等的方法鑑定⑶R區域。
[0149] 結果，輕鏈的可變區域的胺基酸序列如SEQ ID NO:6的第23位?第128位所示。 其中，SEQ ID NO:6的第1位?第22位是輕鏈信號肽的胺基酸序列。
[0150] 另外，輕鏈可變區域可變區域的胺基酸序列之中確認，⑶Rl如RASSSVSYMH(SEQ ID N0:2)所示，CDR2 如 ATSNLAS(SEQ ID N0:3)所示，CDR3 如 QQWSSNPWT(SEQ ID N0:4)所示。
[0151] 另外，重鏈的可變區域的胺基酸序列如SEQ ID NO: 11的第20位?第141位所示。 其中，SEQ ID NO: 11的第1位?第19位是重鏈信號肽的胺基酸序列。
[0152] 另外，重鏈可變區域的胺基酸序列之中確認，⑶Rl如GYNMN(SEQ ID NO:7)所示， CDR2 如 NINPYYGSTSYNQKFKG(SEQ ID N0:8)所示，CDR3 如 SPYYSNYWRYFDY(SEQ ID N0:9)所 /Jn 〇
[0153] 【試驗例7 :敗血症治療作用的評價】
[0154] 將BALB/c小鼠（實驗開始時體重20g-30g、n = 6)利用SPF、恆溫恆溼（22± 1度、 55±5%)，在塑料制籠內，在12小時明暗循環的條件下飼育。餌及水自由攝取。作為實驗 的敗血症模型，由LPS40mg/kg的腹腔內施用誘發一般地使用的脂多糖（LPS)誘發致死的敗 血症。將溶解於生理鹽水的SSV mAb向腹腔內，以LPS施用30分鐘前、LPS施用6小時後， 12小時後的3次、作為SSV mAb量以100 μ g/次施用到腹腔內。研究其後的動物個體的生 存。再有，對照是代替SSV mAb而同樣地施用溶解於生理鹽水的IgG(SIGMA公司制）。
[0155] 結果示於圖7。對於LPS施用（敗血症衍生）後70小時的生存率而言，對照組 (IgG)是20% (累積生存比例0. 2)，而SSV mAb施用組是70% (累積生存比例0. 7)。對於 LPS施用（敗血症衍生）後70小時的生存率而言，SSV mAb施用組（SSV)是對照組（IgG) 的約3. 5倍，SSV mAb施用組顯著地更高（p〈0. 05)。
[0156] 【試驗例8 :炎症疾病治療作用的評價】
[0157] 【8-1】
[0158] 將BALB/c小鼠（實驗開始時體重20g-30g、η = 10)利用SPF、恆溫恆溼（22±1 度、55±5%)，在塑料制籠內，在12小時明暗循環的條件下飼育。餌及水自由攝取。接下 來，對小鼠進行LPS40mg/kg的腹腔內施用，作為炎症疾病，與試驗例7同樣地誘發脂多糖 (LPS)誘發致死的敗血症。將溶解於生理鹽水的SSV mAb向腹腔內，以LPS施用30分鐘前、 LPS施用6小時後，12小時後的3次、以100 μ g/次的SSV mAb量施用於腹腔內。研究其後 的動物個體的生存。再有，對照是代替SSV mAb而同樣地施用溶解於生理鹽水的IgG (SIGMA 公司制）。
[0159] 結果示於圖8。對照組（IgG)的LPS施用（敗血症衍生）後24小時的生存率是 20 %，而SSV mAb施用組是70 %。SSV mAb施用組（SSV)的LPS施用（炎症衍生）後70小 時的生存率是對照組（IgG)的約3. 5倍，SSV mAb施用組顯著地更高（p〈0. 05)。
[0160] 【8-2 :血清及炎症組織中的組蛋白濃度測定】
[0161] 在試驗例8中，在對照組及SSV mAb施用組中，基於長谷川等（Surg Res. 2012 May 1;174(1):136-41.)進行的方法，在全身麻醉下取得心臟來源的血液或肺組織。對於得到 的樣品，由使用ELISA法的市售的測定試劑盒測定組蛋白H1、組蛋白H3及H4的濃度。
[0162] 組蛋白Hl濃度測定的結果如圖9A(血液來源血清）及圖9B(肺組織）所示。
[0163] SSV mAb施用組的血液樣品中的組蛋白Hl濃度在試驗中不增加，維持大致一定。 另一方面，對照組的血液樣品中的組蛋白Hl濃度在試驗期間確認增減。
[0164] 另外確認，炎症組織（肺）的組蛋白Hl濃度是，SSV mAb施用組相比對照組更顯 著地降低。
[0165] 組蛋白H3濃度測定的結果如圖IOA(血液來源血清）及圖IOB(肺組織）所示。
[0166] 經確認，血液樣品及炎症組織（肺）的組蛋白H3濃度呈現出SSVmAb施用組相比 對照組更低的傾向。
[0167] 組蛋白H4濃度測定的結果如圖IlA(血液來源血清）及圖IlB(肺組織）所示。
[0168] 經確認，血液樣品及炎症組織（肺）的組蛋白H3濃度呈現出SSVmAb施用組相比 對照組更低的傾向。
[0169] 再有，試驗結束後，由與試驗例2同樣的方法，由ELISA進行SSV mAb和，組蛋白 Hl、組蛋白H3及組蛋白H4的結合測定。
[0170] 結果確認，SSV mAb在體外與組蛋白H1、組蛋白H3及組蛋白H4有結合能力。
[0171] 【8-3 :肺組織的染色試驗】
[0172] 試驗例8的試驗結束後，從對照組及SSV mAb施用組的大鼠各自取得肺組織切片， 基於長谷川等（Surg Res. 2012 May 1;174(1) :136-41.)進行的方法，使用蘇木精一曙紅染 色液（和光純藥制）進行染色。接下來，對得到的樣品的顯微鏡照片進行攝影。
[0173] 作為參考，對於健康大鼠也同樣地對肺組織片段的照片進行攝影。
[0174] 結果如圖12A?C所示。
[0175] 圖12A(健康大鼠）和，圖12B(SSV mAb施用組）觀察不到肺中的炎症。另一方面， 在圖12C(對照組）中，在肺中確認炎症。
[0176] 【8-4 :鬱血、浮腫、炎症及出血的評價】
[0177] 試驗例8的試驗結束後,根據Murakami等的方法（Shock, 18 (2002), p. 236)評價 鬱血、浮腫、炎症及出血評分。具體而言，利用顯微鏡的24視野的擴大像作為觀測對象。然 後，在SSV mAb施用組及對照組的鬱血、浮腫及炎症的惡化程度用評分0-4的5個階段（4 的惡化度最商）評價。
[0178] 結果如圖13所示（評分的平均值土標準偏差）。
[0179] 對於鬱血、浮腫、炎症及出血之任何，均是相比對照組，SSV mAb施用組示顯著地更 低的值。
[0180] 【8-5 :炎症關聯細胞因子的測定】
[0181] 在試驗例8中，在對照組及SSV mAb施用組中，每3小時從靜脈血取得血清。然 後，對於得到的樣品，由使用ELISA法的市售的測定試劑盒測定炎症性細胞因子（TNF-α、 IL-I i3、IL-6)和抑制性細胞因子（IL-10)的濃度。
[0182] 結果如圖14A?D所示。
[0183] 如圖14A?C所示，關於炎症性細胞因子TNF-α、IL-Ιβ及IL-6而言，SSV mAb 施用組的值相比對照組顯著地降低。
[0184] 另一方面，如圖14D所示，關於抑制性細胞因子IL-10而言，SSVmAb施用組的值相 比對照組顯著地升高。
[0185] 從上述結果也可確認，SSV mAb施用組相比對照組炎症被抑制。
[0186] 【試驗例9:由腎缺血再灌注傷害所致的對急性腎功能衰竭的治療效果的確認試驗 1]
[0187] 對於Wistar系雄性大鼠 （η = 4)，在全身麻醉下摘出右腎後，將左腎用血管夾進行 缺血再灌注而製成模型。接下來，在SSV mAb施用組中，在模型製成30分鐘前及再灌注後 立即，施用lOmg/kg的SSVmAb。另外，在對照組中，代替SSV mAb而同樣地施用IgG(SIGMA 公司制）。然後，測定模型製成24小時後的血清中的尿素氮（BUN)及肌酸酐（Cr),評價腎 障礙的水平。另外，試驗結束後，進行大鼠的剖檢，進行組織學評價。
[0188] 結果如表1所示。
[0189] 【表1】
[0190]
【權利要求】
1. 炎症疾病治療劑，其包含與下列物質結合的單克隆抗體或其抗原結合片段： 含SSVLYGGPPSAA(SEQIDN0:1)所示的胺基酸序列的肽，或 該肽和藥學上可容許的載體的結合體。
2. 權利要求1所述的治療劑，其中所述炎症疾病與組蛋白相關。
3. 權利要求1或2所述的治療劑，其中所述炎症疾病是急性炎症疾病。
4. 權利要求1?3之任一項所述的治療劑，其中所述炎症疾病選自敗血症、腎缺血再灌 注傷害及腎功能衰竭。
5. 權利要求1?4之任一項所述的治療劑，其中所述炎症疾病是敗血症。
6. 權利要求1?5之任一項所述的治療劑，其與組蛋白H1、組蛋白H3及組蛋白H4結 合。
7. 權利要求1?6之任一項所述的敗血症治療劑，其包含含有下列⑶R1?3的輕鏈可 變區域： 含RASSSVSYMH(SEQIDN0:2)所示的胺基酸序列的CDR1、 含ATSNLAS(SEQIDN0:3)所示的胺基酸序列的⑶R2、及 含QQWSSNPWT(SEQIDN0:4)所示的胺基酸序列的CDR3。
8. 權利要求1?7之任一項所述的治療劑，其中所述單克隆抗體或其抗原結合片段的 輕鏈可變區域含SEQIDNO:6的第23位?第128位所示的胺基酸序列。
9. 權利要求1?8之任一項所述的治療劑，其包含含有下列⑶R1?3的重鏈可變區 域： 含GYNMN(SEQIDN0:7)所示的胺基酸序列的CDR1、 含NINPYYGSTSYNQKFKG(SEQIDN0:8)所示的胺基酸序列的CDR2、及 含SPYYSNYWRYFDY(SEQIDN0:9)所示的胺基酸序列的CDR3。
10. 權利要求1?9之任一項所述的治療劑，其中所述單克隆抗體或其抗原結合片段的 重鏈可變區域含SEQIDNO: 11的第20位?第141位所示的胺基酸序列。
11. 權利要求1?10之任一項所述的治療劑，其中所述單克隆抗體或其抗原結合片段 針對上述肽或肽和藥學上可容許的載體。
12. 權利要求1?11之任一項所述的治療劑，其中所述藥學上可容許的載體是鑰孔青 貝血藍蛋白、卵白蛋白或牛血清白蛋白。
13. 權利要求1?12之任一項所述的治療劑，其中所述單克隆抗體或其抗原結合片段 可下調ATP合成酶活性。
14. 權利要求1?13之任一項所述的治療劑，其中所述單克隆抗體是嵌合抗體、人源化 抗體、或者人抗體。
15. 權利要求1?14之任一項所述的治療劑，其中所述單克隆抗體由雜交瘤小鼠-小 鼠雜交瘤SSV-C93-3產生。
16. 權利要求1?15之任一項所述的治療劑，其中所述抗原結合片段是Fab、Fab'、 (Fab，）2、Fv或scFv。
17. 炎症疾病的治療方法，其包括向受試者施用有效量的權利要求1?16之任一項所 述的單克隆抗體或其抗原結合片段。
18. 權利要求1?16之任一項所述的單克隆抗體或其抗原結合片段用於製造炎症疾病 的治療劑的用途。
【文檔編號】C12N15/09GK104379165SQ201380020995
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年2月22日 優先權日:2012年2月22日
【發明者】佐藤秀次, 後藤武, 大森直哉, 江貴真, 島田彌生, 豬股雅史, 草野徹, 平冢孝宏, 野口隆之, 萩原聰 申請人:學校法人城西大學