新型破囊壺菌類微藻及用其生產生物油的方法
2023-07-22 13:40:31 4
專利名稱:新型破囊壺菌類微藻及用其生產生物油的方法
技術領域：
本發明涉及具有生產生物油能力的新型破囊壺菌(thraustochytrid)類微藻及用其生產生物油的方法。
背景技術：
從油類植物如油菜籽、大豆和棕櫚的油中生產的生物柴油是已商品化的典型生物柴油，並且其生產在全世界迅速增長。然而，由於用於生產生物柴油的原料作物價格昂貴，所以與原油來源的柴油相比，生物柴油在生產成本方面不具優勢並且競 爭力較低。因此，儘管它在環境和農業經濟方面有多種優勢，但如果不減稅，生物柴油似乎不具有商業競爭力。儘管預期能源枯竭引起的原油價格上升會為生物柴油帶來商業競爭力，但生物柴油生產近來增加引起的原料作物價格的突然上升成為降低生物柴油競爭力的新因素。
此外，由於利用日光並循環二氧化碳，來自油類植物和光合微藻的光合油(其是用於生產生物柴油的生物油的主要來源)具有重要的優勢，但它受包括時間、空間、季節和氣候在內的多種因素的不利影響。而且，產自光合油的生物柴油使用的增加會引起食物短缺和由於大量種植原料作物而產生的新的環境問題，因而存在對來自光合油的生物柴油效能的質疑。
由於這些原因，有機營養微生物的發酵作為用於大量生產生物油的方法已經受到了關注。產油的典型微生物包括原殼小球藻(Chlorellaprotothecoides)、解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica)、圓紅冬抱酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)等,人們已經積極進行了對其發酵方法的研究。
在這些油類微生物中，屬於破囊壺菌家族的微藻是能夠產生生物油的油類微生物，其含有含量高達細胞乾重70%的多不飽和脂肪酸，如DHA (二十二碳六烯酸)。公知DHA(腦、眼組織和神經組織的必需脂肪酸)在嬰兒視力和運動神經的發育中起重要作用。此外，據報導，在痴呆患者的腦中DHA的量顯著降低，也有報導DHA具有多種新功能，如抑制與年齡相關的黃斑退行性改變。儘管有此類有益的生理功能，但人體無法自身合成足量的DHA。因此，公認DHA是從外界補充的必需營養成分，許多國際組織包括世界衛生組織建議每日攝入Ig或更多的DHA。因此,DHA被商品化為包括健康功能性食品在內的多種廣品，並且其作為醫藥原料的實用性高，這說明DHA具有非常高的商業價值。因此，不同於一般的微生物油或光合油，產自屬於破囊壺菌家族的微藻發酵的油能夠在利用DHA的高附加值產業和生物柴油產業間提供聯繫，從而為生物柴油提供了商業競爭力。
然而，保證微生物發酵油作為生物柴油原料的商業競爭力的最重要因素是使用工業廢料、廢料資源和剩餘生物質作為營養源，並最終使用豐富的不可食用的纖維素類生物質。非食物性纖維素類生物質資源的實例包括木質生物質、農業副產品、城市廢品等。
已報導了許多種使用破囊壺菌家族的微生物生產DHA (二十二碳六烯酸)的方法。此類方法主要是通過在含葡萄糖作為碳源的培養基中培養破囊壺菌家族的微生物來生產DHA的方法(韓國專利公開號2008-0087820、韓國專利公開號2009-0064603、美國專利公開號20080009045和美國專利公開號20050019880)。然而，還沒有關於使用下一代生物質資源的非食物性纖維素類生物質生產生物油的方法的報導。
為此，本發明人付出大量的努力來開發使用微藻生產高產量DHA的方法，由此發現從馬來西亞紅樹林區域的土壤中分離出的新型破囊壺菌類微藻含有高濃度的DHA，並且當使用豆粉或纖維素類生物質作為營養源培養所述新型微藻時會產生含DHA的生物油，從而完成了本發明。
發明內容
本發明的一個目的是提供生產高產量生物油的新型微藻菌株。
本發明的另一目的是提供使用所述新型微藻菌株生產生物油的方法。
為了實現上述目的，本發明提供具有生產生物油能力的破囊壺菌類微藻KRSlOl (KCTC11686BP)。
本發明還提供一種生產生物油的方法，所述方法包括如下步驟(a)培養破囊壺菌類微藻KRSlOl (KCTCl 1686BP)以產生生物油；及(10回收所產生的生物油。
本發明還提供一種生產生物油的方法，所述方法包括如下步驟(a)在含豆粉的培養基中培養破囊壺菌類微藻KRSlOl (KCTC11686BP)以產生生物油；及(10回收所產生的生物油。
本發明還提供一種生產生物油的方法，所述方法包括如下步驟(a)在含纖維素類生物質的培養基中培養破囊壺菌類微藻KRSlOl (KCTC11686BP)以產生生物油；及(10回收所產生的生物油。
本發明的其它特徵和實施方式從以下詳細說明和所附權利要求
書中將會更為顯而易見。
圖1為新型破囊壺菌類微藻KRSlOl的顯微照片。
圖2顯示了新型破囊壺菌類微藻KRSlOl的系統發育圖。
圖3顯示了新型破囊壺菌類微藻KRSlOl在5L發酵罐中分批培養的結果。
圖4顯示了新型破囊壺菌類微藻KRSlOl在5L發酵罐中補料分批培養的結果。
圖5為顯示通過新型破囊壺菌類微藻KRSlOl用纖維素類生物質作為營養源生產生物油及其用途的示意圖。
圖6為顯示新型破囊壺菌類微藻KRSlOl用纖維素類生物質作為營養源時增殖的圖。
圖7為顯示通過使用纖維素類生物質作為營養源培養新型破囊壺菌類微藻KRSlOl所生產的油和DHA的量的圖。
圖8為顯示使用纖維素類生物質作為營養源培養的新型破囊壺菌類微藻KRS 101培養物的羧甲基纖維素酶活性的圖。
圖9為顯示使用纖維素類生物質作為營養源培養的新型破囊壺菌類微藻KRS 101培養物的纖維二糖糖苷酶活性的圖。
具體實施方式
除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語均具有本發明所屬領域普通技術人員通常理解的相同含義。通常，本文所用的命名法是公知的並在本領域普遍使用。
一方面，本發明涉及具有生產生物油能力的破囊壺菌類微藻KRSlOl(KCTC11686BP)。
本發明的破囊壺菌類微藻KRSlOl分離自馬來西亞紅樹林區域的樹葉/ 土壤樣品，通過在BI培養基(在IL含300mg/L青黴素G和500mg/L硫酸鏈黴素的天然海水中的lg/L酵母提取物、lg/L蛋白腖和10g/L瓊脂的溶液)中培養所述樣品來分離破囊壺菌微藻、分離·所述培養物並分離形成破囊壺菌微藻典型特徵性遊動孢子的菌株而獲得。
對破囊壺菌類微藻KRSlOl (KCTC11686BP)進行生物學鑑定的18SrRNA測序結果顯示所述微藻具有SEQ ID NO:1的18S rRNA核苷酸序列。
在本發明中，由微藻KRSlOl生產的生物油可包含不飽和脂肪酸，所述不飽和脂肪酸可以是二十二碳六烯酸(DHA)。
微藻KRSlOl中含有的二十二碳六烯酸(DHA)的含量佔其中脂肪酸總含量的比例可以為40%或更高，優選為45%或更高，更優選為49%或更高。
在本發明的一個實施例中，顯示本發明的微藻菌株KRSlOl含有高濃度的高度不飽和脂肪酸，尤其是DHA含量達到總脂肪酸含量的49. 5%。
在本發明的另一實施例中，在含多種濃度的葡萄糖作為單一碳源的基礎培養基中培養本發明的微藻菌株KRS101。結果，顯示微藻細胞的生長在60g/L的葡萄糖濃度中為最高(細胞乾重9. 09g/L)，並且油含量為細胞乾重的45%，DHA含量為總脂肪酸含量的41. 22%。
在本發明的又一實施例中，在含多種濃度的酵母提取物作為單一氮源的基礎培養基中培養本發明的微藻菌株KRS101。結果，顯示微藻細胞的生長隨酵母提取物濃度的升高而變得更高，但油含量隨酵母提取物濃度的降低而升高。此外，DHA含量隨酵母提取物濃度的降低而略微降低。檢測了海水鹽濃度的作用，結果顯示微藻細胞的生長和油及DHA的含量隨海水鹽濃度的降低而升高。
在本發明的又一實施例中，在含60g/L的果糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘油或粗甘油代替葡萄糖作為碳源的培養基中培養本發明的微藻菌株KRSlOl。結果，顯示微藻細胞的生長略微降低但仍然可以生長，尤其是使用生物柴油廢料粗甘油作為碳源與使用純甘油相比顯示出微藻細胞生長的增加。
在本發明的又一實施例中，在含10g/L的玉米漿、牛肉膏、麥芽提取物、蛋白腖或胰蛋白腖代替酵母提取物作為有機氮源的培養基中培養本發明的微藻菌株KRS 101。結果，顯示微藻細胞的生長是可以進行的，尤其是使用玉米漿顯示出與使用酵母提取物相似的微藻細胞生長。此外，使用含乙酸銨(2.34g/L)、硝酸銨(1.22g/L)、硫酸銨(2.0g/L)、硝酸鈉(2. 58g/L)或尿素(O. 9g/L)的培養基檢測了多種無機氮鹽的作用，結果，顯示微藻細胞的生長在含乙酸銨或尿素的培養基中為最高。同時，使用含乙酸鈉(15. 48g/L)、碳酸氫鈉(15. 86g/L)、碳酸鈉(10. Og/L)、檸檬酸鈉(27. 8g/L)、硝酸鈉(16. Og/L)和硫酸鈉(13. 4g/L)的培養基檢測了非氯鹽的作用，結果，顯示KRSlOl菌株在所有培養基中均表現出良好的細胞生長。[0036]另一方面，本發明涉及一種生產生物油的方法，所述方法包括如下步驟(a)培養破囊壺菌類微藻KRSlOl (KCTC11686BP)以產生生物油；及(10回收所產生的生物油。
在本發明中，培養可以是分批培養或補料分批培養。
在本發明的一個實施例中，在含60g/L葡萄糖、10g/L玉米漿、5g/L乙酸銨、3g/LKH2PO4和15g/L海水鹽的培養基中分批培養微藻菌株KRSlOl。結果，顯示所述菌株在培養72小時時完全消耗了葡萄糖，此時，細胞乾重、油含量和DHA含量分別為24. 8g/L、31.2%和36. 7%，並且油和DHA的產量分別為7. 8g/L和2. 9g/L。同時，在如上相同條件下補料分批培養微藻菌株KRS101，結果，顯示最高細胞生長出現在培養60小時時，此時，細胞乾重、油含量和DHA含量分別為50. 2g/L、43. 5%和40. 3%，並且油和DHA的產量分別為21. 9g/L和8.8g/L。
又一方面，本發明涉及一種生產生物油的方法，所述方法包括如下步驟(a)在含豆粉的培養基中培養破囊壺菌類微藻KRSlOl (KCTC11686BP)以產生生物油；及(10回收所 產生的生物油。
在本發明中，可使用豆粉作為單一氮源。
在本發明中，由KRSlOl菌株生產的生物油可以是不飽和脂肪酸，所述不飽和脂肪酸可以是二十二碳六烯酸(DHA)。
此外，培養可以是補料分批培養或分批培養。
在本發明的一個實施例中，微藻菌株KRSlOl在含豆粉作為氮源的培養基中顯不出高細胞生長率，並且含DHA的生物油的生產率在所述培養基中也很高。
又一方面，本發明涉及一種生產生物油的方法，所述方法包括如下步驟Ca)在含纖維素類生物質的培養基中培養破囊壺菌類微藻KRSlOl (KCTC11686BP)以產生生物油；及(b)回收所產生的生物油。
在本發明中，培養基可包含纖維素類生物質作為單一碳源，所述纖維素類生物質可選自羧甲基纖維素、纖維二糖和棕櫚油副產品。
所述破囊壺菌類微藻可以是KRSlOl (KCTC11686BP)。
此外，由破囊壺菌類微藻生產的生物油可含有不飽和脂肪酸，所述不飽和脂肪酸可以是二十二碳六烯酸(DHA)。
在本發明中，培養可以是分批培養或補料分批培養。
在本發明的一個實施例中，使用纖維素類生物質羧甲基纖維素、纖維二糖或棕櫚油副產品作為碳源培養微藻菌株KRS101，結果，顯示KRSlOl菌株可以增殖。此外，使用改良的Bligh-Dyer方法測定油和DHA的含量，結果，顯示在培養72小時時，當使用羧甲基纖維素時，油和DHA的產量分別為O. 3g/L和O. 18g/L ( (60. 7%TFA);當使用纖維二糖時，油和DHA的產量分別為O. 4g/L和O. 24g/L (59. 8%TFA)。當使用棕櫚油副產品時，油和DHA的產量為 O. 3g/L 和 O. 16g/L (54. 3%TFA)。
在本發明的另一實施例中，檢測了微藻KRSlOl培養液中被認為與利用纖維素類生物質相關的羧甲基纖維素酶和纖維二糖糖苷酶酶活性。結果，顯示在微藻KRSlOl培養液中檢測到了羧甲基纖維素酶和纖維二糖糖苷酶酶活性，儘管這些活性隨纖維素類營養源的種類而變化。
實施例[0052]在下文中，將通過實施例進一步詳細描述本發明。這些實施例僅為說明目的而不應解釋為限制本發明的範圍，這對於本領域普通技術人員而言是顯而易見的。
實施例1 :分離和鑑定含DHA的新型油類微藻
用50ml的falcon管在馬來西亞的紅樹林區域收集樹葉/ 土壤樣品並懸浮於IOml鹽水中，隨後將懸浮液適當稀釋並接種於BI培養基(在IL含300mg/L青黴素G和500mg/L硫酸鏈黴素的天然海水中的lg/L酵母提取物、lg/L蛋白腖和10g/L瓊脂的溶液)(Burja等，2006)中用於分離破囊壺菌微藻。將培養基在28°C以200rpm溫育2 — 4天，並將所獲的菌落再次接種於BI培養基中。隨後，用顯微鏡觀察菌落，並分離30個菌落，這些菌落均形成了破囊壺菌微藻典型特徵性遊動孢子(見圖1)。
將30 個分離出的菌落在 50mL 海生菌肉湯(marine broth, Sigma_Aldrich)(250mL三角瓶)中在28°C以200rpm培養3天，並隨後收集細胞並在真空離心機中在60°C乾燥12小時。在3ml的5%甲醇硫酸中懸浮乾燥後的細胞並在90°C溫育I小時，隨後用O. 6mL的己 烷萃取所產生的脂肪酸酯並經氣相色譜分析。
分析結果顯示在下文的表I中。如其中所示，微藻細胞含高濃度的高度不飽和脂肪酸，尤其是細胞中DHA含量達到總脂肪酸含量的49. 5%。此外，所分析的30個菌落均顯示出相似的脂肪酸組成。
[表I]新型破囊壺菌類微藻KRSlOl的脂肪酸組成
月旨肪"酸*且成
— 14:0 15:0 16:1 16 O 17:0 18:3 18:2 18:1 20:5 22:5(n6) 22:6 22:5(n3)
(% TFA)_____________
海生菌肉湯 -17.39對於分離到的菌落的分子生物學鑑定，進行了 18S rRNA測序。
使用常規酚-氯仿方法從一個菌落中分離染色體DNA，並使用用於擴增破囊壺菌微藻的 18S rRNA 基因的引物 5』 -ATGAACATCAAAAA-3』 (PI, SEQ ID NO:2)和5』-ATGAACATCAAAAA-3』(P2，SEQ ID NO: 3)通過 PCR 擴增其中的 18S rRNA 基因。具體而言，對於PCR擴增，製備含EFTaq聚合酶(Takara)(2. 5U)、聚合酶緩衝液、dNTP(每種lmM)、l μ I的各引物(IOOpmol)和500ng模板DNA的PCR反應溶液(50 μ I)並使用PCR系統(Takara，日本)進行PCR反應30個循環，每一循環由96 °C 30秒、43°C I分鐘和72 °C 3分鐘組成。在1%的瓊脂糖凝膠上對PCR產物進行電泳以確定具有期望大小的DNA片段得到了擴增，並使用pGEM-TEasy載體(Promega, USA)將其轉化入大腸桿菌(E. coli)DH5 α中。從轉化後重組的大腸桿菌細胞(Qiagen，美國)中提取質粒DNA並用限制性內切酶EcoRI消化以確定具有所需大小的DNA片段得到了克隆，並對其測序(SEQ ID NO:1,GenBank登錄號HM126528)。序列同源性分析結果顯不該菌株為分別與Aurantiochytrium mangrovei和Aurantiochytriumsp. BLl具有99. 3%和98. 9%同源性的新型破囊壺菌類微藻菌株。由此，將該微藻菌株命名為「KRS101」並在2010年4月22日以登錄號KCTC11686BP保藏於韓國生命工學研究院韓國典型培養物保藏中心(KCTC )。
圖2顯示了新型破囊壺菌類微藻KRS 101的系統發育圖。[0062]實施例2 :新型破囊壺菌類微藻KRSlOl的細胞生長和所述微藻產含DHA油的能力的分析
在多種營養源條件下檢測實施例1中分離的新型破囊壺菌類微藻KRS 101的細胞生長和所述微藻產含DHA油的能力。
使用含60g/L的碳源葡萄糖、lg/L的氮源酵母提取物和6g/L的人工海水鹽的培養基作為基礎培養基。將單一菌落在15ml的基礎培養基中在28°C以120rpm預培養3天，隨後將Iml的培養液接種至含多種濃度的碳源、氮源和海水鹽的培養基中並在28°C以120rpm培養3天。用PBS緩衝液(磷酸鹽緩衝鹽溶液，pH 7. 2)將經離心收集的細胞洗滌三次，在60°C乾燥12小時，並測定細胞乾重(DCW)。
使用改良的Bligh-Dyer方法(Burja等，2007)分析含DHA油的含量。具體而言，向125mg的幹細胞中加入6. 25mL氯仿、12. 5mL甲醇和5mL 50mM K2HPO4緩衝液(pH 7. 4)，之後在28°C以200rpm溫育I小時，隨後加入6. 25mL氯仿和6. 25mL K2HPO4緩衝液，將細胞 溶液振蕩約30次並將其靜置30分鐘，使其分為水層和含油的有機溶劑層。小心地將氯仿層轉移至已預先稱重的鋁皿中，之後在80°C乾燥30分鐘，隨後測定油重。總油含量用以下公式計算
總油含量(%)=油(g)/細胞乾重(IOOg)= (Wl-Wd) X Vcx 100/VPx Ws
Wl :鋁皿重量；
Wd :招皿+油脂的重量；
Vc :氯仿總體積；
Vp :轉移至鋁皿的氯仿體積；
Ws :所用的細胞重量(細胞乾重)。
同時，通過氣相色譜測定油中的DHA含量。具體而言，在3ml 5%的甲醇硫酸溶液中懸浮合適量的幹細胞並在90°C溫育I小時以產生脂肪酸酯，隨後用O. 6ml的己烷萃取並通過氣相色譜分析。
分析結果顯示於上文表I中。如其中所示，相比於在海生菌肉湯中培養菌株，當在基礎培養基中培養新型微藻菌株KRSlOl時，脂肪酸組成略微變化，但包括DHA的高度不飽和脂肪酸均以高濃度產生。
在含多種濃度的葡萄糖作為單一碳源的基礎培養基中培養新型微藻菌株KRSlOl。結果，如下文表2中可見，該菌株在葡萄糖濃度為60g/L時顯示出最高的細胞生長(細胞乾重9. 09g/L)，在該濃度下，油含量為細胞乾重的45%，DHA含量為總脂肪酸含量的41. 22%。
[表2]葡萄糖濃度對新型破囊壺菌類微藻KRSlOl的細胞生長和油及DHA含量的作用
權利要求
1.具有生產生物油能力的破囊壺菌(thraustochytrid)類微藻KRSlOl(KCTC11686BP)。
2.根據權利要求
1所述的破囊壺菌類微藻KRS10KKCTC11686BP)，其具有SEQID NO:1的18S DNA核苷酸序列。
3.根據權利要求
1所述的破囊壺菌類微藻KRSlOl(KCTC11686BP)，其中所述生物油包含不飽和脂肪酸。
4.根據權利要求
3所述的破囊壺菌類微藻KRSlOl(KCTC11686BP)，其中所述不飽和脂肪酸為二十二碳六烯酸(DHA)。
5.根據權利要求
4所述的破囊壺菌類微藻KRSlOl(KCTC11686BP)，其中所述微藻KRSlOl中含有的二十二碳六烯酸(DHA)的含量佔其中脂肪酸總含量的比例為40%或更多。
6.—種生產生物油的方法，所述方法包括如下步驟 Ca)培養權利要求
1所述的破囊壺菌類微藻KRS 101 (KCTC11686BP)以產生生物油；及 (b)回收所產生的生物油。
7.根據權利要求
6所述的方法，其中所述生物油包含不飽和脂肪酸。
8.根據權利要求
6所述的方法，其中所述不飽和脂肪酸為二十二碳六烯酸(DHA)。
9.一種生產生物油的方法，所述方法包括如下步驟(a)在含豆粉的培養基中培養破囊壺菌類微藻KRSlOl(KCTC11686BP)以產生生物油；及 (b)回收所產生的生物油。
10.根據權利要求
9所述的方法，其中所述培養基包含的豆粉作為單一氮源。
11.根據權利要求
9所述的方法，其中所述生物油包含不飽和脂肪酸。
12.根據權利要求
11所述的方法，其中所述不飽和脂肪酸為二十二碳六烯酸(DHA)。
13.—種生產生物油的方法，所述方法包括如下步驟 (a)在含纖維素類生物質的培養基中培養破囊壺菌類微藻KRSlOl(KCTC11686BP)以產生生物油 '及 (b)回收所產生的生物油。
14.根據權利要求
13所述的方法，其中所述培養基包含的纖維素類生物質作為單一碳源或營養源。
15.根據權利要求
13所述的方法，其中所述纖維素類生物質選自羧甲基纖維素、纖維二糖和棕櫚油副產品。
16.根據權利要求
13所述的方法，其中所述生物油包含不飽和脂肪酸。
17.根據權利要求
16所述的方法，其中所述不飽和脂肪酸為二十二碳六烯酸(DHA)。
18.根據權利要求
13所述的方法，其中所述破囊壺菌類微藻為KRS10KKCTC11686BP)。
專利摘要
本發明涉及具有生產生物油能力的新型破囊壺菌類微藻及用其生產生物油的方法。當在含葡萄糖的培養基中培養時，本發明的微藻在菌株中以高比例積累生物油，並因此可生產高產量的生物油。所述微藻還可使用豆粉作為氮源生產生物油，通過用可食用豆粉作為培養基培養所獲的產品可用作生產食品和飼料的原料。此外，本發明所述微藻還可使用非食物性纖維素類生物質作為碳源生產生物油，使用非食物性纖維素類生物質作為培養基可以克服諸如食物資源供需失衡、原料成本增加等限制生物油開發的因素，確保微生物發酵油的產業競爭力。
文檔編號C12P7/64GKCN103025862SQ201180033272
公開日2013年4月3日 申請日期2011年4月25日
發明者徐正又, 金哲鎬, 迪納·萊拉克華達, 洪瑗京 申請人:韓國生命工學研究院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan