抑制3型3α－羥基類固醇脫氫酶的製作方法

2023-07-22 14:21:56 2

專利名稱：抑制3型3α－羥基類固醇脫氫酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及應用由天然前體生物合成類固醇性激素的酶的抑制劑治療類固醇性激素依賴性疾病的方法。具體地說，公開了減少天然產生雄激素如睪丸激素和二氫睪丸激素的抑制劑。
相關技術背景已知許多雄激素敏感性疾病，即雄激素活性促進其發生或發展的疾病。這樣的疾病包括但不限於前列腺癌、良性前列腺增生、痤瘡、皮脂溢、多毛症、雄激素性脫髮、性早熟、腎上腺增生和多囊卵巢症候群。也已知許多雌激素敏感性疾病，即雌激素活性促進其發生或發展的疾病。這樣的疾病包括但不限於乳腺癌、子宮內膜癌、子宮內膜異位症、平滑肌瘤和性早熟。
當分別給予雄激素受體拮抗劑(「抗雄激素物質」)或雌激素受體拮抗劑(「抗雌激素物質」)時，可抑制雄激素和雌激素活性。參見例如WO 94/26767和WO 96/26201。通過用已知方法抑制雄激素或雌激素生物合成或分泌也可以減少雄激素和雌激素活性。參見例如WO90/10462、WO 91/00731、WO 91/00733和WO 86/01105。在WO97/11162中描述了5型17β-羥基類固醇脫氫酶。
Dufor等(Biochemical and Biophysical Research Communications 228，474-479(1996))描述，從人前列腺cDNA文庫分子克隆以及特徵鑑定了人3型3α-羥基類固醇脫氫酶。
在1998年3月11日提交、系列號為60/077,510的美國臨時專利申請中公開了人5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑。
本發明提供人3型3α羥基類固醇脫氫酶有效抑制劑或人3型3α羥基類固醇脫氫酶和人5型17β-羥基類固醇脫氫酶兩者的有效抑制劑，因為發現它們可抑制雄激素的形成。並不認為現有技術描述或提出了抑制3型3α羥基類固醇脫氫酶在減少靶組織睪丸激素和二氫睪丸激素量中可起有益的作用。
發明概述因此本發明目的之一是在優先避免抑制2型或4型17β-羥基類固醇脫氫酶、1型3α羥基類固醇脫氫酶或任何其它雄激素降解酶的同時應用人3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑選擇性更強而更有效地抑制4-雄甾烯-3，17-二酮轉化為睪丸激素和5α-雄甾烯-3，17-二酮轉化為二氫睪丸激素。
本發明另一個目的是在優先避免抑制2型或4型17β-羥基類固醇脫氫酶、1型3α羥基類固醇脫氫酶或任何其它雄激素降解酶的同時應用人3型3α-羥基類固醇脫氫酶和5型17β-羥基類固醇脫氫酶兩者的抑制劑選擇性更強而更有效地抑制4-雄甾烯-3，17-二酮轉化為睪丸激素和5α-雄甾烯-3，17-二酮轉化為二氫睪丸激素。
另一目的是提供前列腺癌、良性前列腺增生和前列腺炎的治療和預防方案。
另一目的是提供雄激素敏感性皮膚疾病尤其是痤瘡、皮脂溢、多毛症和雄激素性脫髮的治療和預防方案。
在一個實施方案中，本發明提供在其需要患者抑制4-雄甾烯-3，17-二酮轉化為睪丸激素或抑制5α-雄甾烯-3，17-2酮轉化為二氫睪丸激素的方法，包括給予所述患者治療有效量的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑而不是17-內酯衍生化合物。
在另一實施方案中，本發明提供抑制人3型3α-羥基類固醇脫氫酶活性的方法，包括將治療有效量的具有下式結構的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑給予需要這樣的治療的患者 其中所述虛線為任選π鍵；其中R3為選自以下的部分C1-C20烷氧基、C1-C10醯氧基、C1-C20烷氧基羰氧基、C1-C20烷氧基烷氧基、羥基、(N-烷基或-H)氨基甲酸酯和體內轉化為羥基的部分；其中R2和R4獨立選自氫、氰基、氟基、氯基、溴基和硝基(其中R2和R4不能同時為氫)。
其中R17α選自氫、選自以下的基團取代的C2-C14碳部分氫、滷素、羧基、醯氨基、C1-C3烷氧基和C1-C5烷基，或者R17α和R17β一起構成C5-C7內酯環或為羰基氧；其中R17β為羥基、醯氧基、烷氧基、鏈烯氧基、(N-烷基或H)醯氨基；或R17α和R17β一起構成C5-C7內酯環或為羰基氧；其中R16α和R16β獨立選自氫、低級烷基和苄基，或R16α和R16β一起構成C5-C6環烯。
在另一個實施方案中，本發明提供抑制人3型3α-羥基類固醇脫氫酶活性的方法，包括將治療有效量的選自以下的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑給予需要這種抑制的患者 在另一個實施方案中，本發明提供測定4-雄甾烯-3，17-二酮轉化為睪丸激素和5α-雄甾烯-3，17-二酮轉化為二氫睪丸激素的推定抑制劑的有效性，包括測定在存在所述推定抑制劑下3型3α-羥基類固醇脫氫酶的活性，並確定相對於缺乏所述推定抑制劑時與所述脫氫酶活性有關的降低所述活性的相關有效性。
在另一實施方案中，本發明提供包含一種藥學上可接受的稀釋劑或載體和治療有效量的具有以下分子結構的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑的藥用組合物 其中R3為選自以下的部分C1-C20烷氧基、C1-C10醯氧基、C1-C20烷氧基羰氧基、C1-C20烷氧基烷氧基、羥基、(N-烷基或-H)氨基甲酸酯和體內轉化為羥基的部分；其中R2和R4獨立選自氫、氰基、氟基、氯基、溴基和硝基(其中R2和R4不能同時為氫)；其中所述虛線為任選π鍵；其中R17α選自氫、選自以下的基團取代的C2-C14碳部分氫、滷素、羧基、醯氨基、C1-C3烷氧基和C1-C5烷基，或者R17α和R17β一起構成C5-C7內酯環或為羰基氧；其中R17β選自羥基、醯氧基、烷氧基、鏈烯氧基、(N-烷基或H)醯氨基；或R17α和R17β一起構成C5-C7內酯環或為羰基氧；在另一實施方案中，本發明提供包含藥學上可接受的稀釋劑或載體和治療有效量的具有以下分子結構的人3型-3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑的藥用組合物
其中R100選自氫、羧基、醯氨基、C1-C5烷基、滷基、硝基、羥基和C1-C3烷氧基。
在又一實施方案中，本發明提供以下分子結構的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑 其中R3為選自以下的部分C1-C20烷氧基、C1-C10醯氧基、C1-C20烷氧基羰氧基、C1-C20烷氧基烷氧基、羥基、(N-烷基或-H)氨基甲酸酯和體內轉化為羥基的部分；其中R2和R4獨立選自氫、氰基、氟基、氯基、溴基和硝基(其中R2和R4不能同時為氫)；其中所述虛線為任選π鍵；其中R17α選自氫、選自以下的基團取代的C2-C14碳部分氫、滷素、羧基、醯氨基、C1-C3烷氧基和C1-C5烷基，或者R17α和R17β一起構成C5-C7內酯環或為羰基氧；其中R17β選自羥基、醯氧基、烷氧基、鏈烯氧基、(N-烷基或H)醯氨基；或R17α和R17β一起構成C5-C7內酯環或為羰基氧；其中R16α和R16β獨立選自氫、低級烷基和苄基，或R16α和R16β一起構成C5-C6環烯。
在另一個實施方案中，本發明提供具有以下分子結構的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑 其中R100選自氫、羧基、醯氨基、C1-C5烷基、滷基、硝基、羥基和C1-C3烷氧基。
在又一實施方案中，本發明提供治療或降低前列腺癌發生風險的方法，包括將治療有效量的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑而不是17-內酯衍生化合物給予需要這種治療或降低的患者。
在又一實施方案中，本發明提供治療或降低良性前列腺增生發生風險的方法，包括將治療有效量的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑而不是17-內酯衍生化合物給予需要這種治療或降低的患者。
在另一實施方案中，本發明提供治療或降低前列腺炎發生風險的方法，包括將治療有效量的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶的抑制劑給予需要這種治療或降低的患者。
在另一實施方案中，本發明提供治療或降低痤瘡、皮脂溢、多毛症或雄激素性脫髮發生風險的方法，包括對需要這種治療或降低的患者給予治療有效量的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶的人5型17β-羥基類固醇脫氫酶的活性抑制劑而不是給予17-內酯衍生化合物。
本發明的抑制劑用於預防和/或治療本文所述的某些疾病，即雄激素活性刺激其發生或發展的疾病。我們的實驗室工作一個更為令人驚奇的結果是發現本申請人目前證實已知其催化活性反應影響類固醇的3位的3型3α-HSD催化涉及17位的反應。發現3型3α-HSD參與由雄甾烯二酮和雄甾烯二酮形成睪丸激素和DHT，該發現使得可以通過抑制本申請人發現的該新生物合成途徑增強抑制這兩種重要的雄激素的生物合成。發現3型3α-羥基類固醇脫氫酶具有類似於17β-羥基類固醇脫氫酶(催化4-雄甾烯二酮-3，17-二酮轉化為睪丸激素和5α-雄甾烯-3，17-二酮轉化為二氫睪丸激素)的活性，抑制3型3α-羥基類固醇脫氫酶的17β-羥基類固醇脫氫酶活性的抑制劑聯合或不聯合5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑和/或5α-還原酶抑制劑可減少這些酶催化產生的雄激素。因為這些酶的催化反應形成的雄激素是雌激素的前體，所以本發明也適用於雌激素活性促進其發生或發展的疾病。
關於本文推薦的所有劑量，主治醫師應該監測個體患者反應並據此調節劑量。
需要治療或降低特定疾病發生風險的患者為診斷患有這種疾病的患者或懷疑患有這種疾病的患者。
除非另有指明，本發明活性化合物的優選劑量對於治療目的和預防目的是相同的。無論治療(或預防)那種特定疾病，本文所述每一活性組分的劑量相同。
在降低疾病發生風險方法的醫學治療法中所用的「3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑」是指抑制所述酶的IC50(用本文表1所述的相同方法計算)不高於200nM的化合物。這種抑制劑的IC50優選不高於50nM，最優選低於10nM。此外，優選不需要的對1型3α-HSD和2型17β-HSD的抑制在3.10-7M時低於90％，優選低於80％，最優選低於70％。在某些實施方案中，優選在10-7M濃度時刺激Shionogi細胞的雄激素活性低於100％，優選低於50％，最優選低於20％。
當將兩種或多種不同活性劑在本文論述為聯合療法的一個部分(例如酶抑制劑和抗雄激素物質)時，給予多個不同的化合物而不是給予具有多種活性的單一化合物。
除非另有說明或本文顯而易見的，本文所述劑量是指不受藥用賦形劑、稀釋劑、載體或其它成分影響的活性化合物的重量，儘管這樣的附加成份最好包含在其中，見本文實施例所述。通常用於製藥工業的任何劑型(膠囊、片劑、注射劑等)均適用於本發明，而術語「賦形劑」、「稀釋劑」或「載體」包括通常在製藥工業的這類劑型中與活性成分一起的這類非活性成分。例如包括常見的膠囊、丸劑、腸溶包衣、固體或液體稀釋劑或賦形劑、調味劑、防腐劑等。
如本文所述，術語烴部分包括但不限於直鏈或支鏈烷基、直鏈或支鏈鏈烯基、直鏈或支鏈鏈炔基、苯基、苯基烷基、苯基鏈烯基、苯基鏈炔基。
附圖簡述

圖1圖示活性雄激素在人體前列腺中的生物合成途徑。
圖2圖示用3型3α-HSD穩定轉染的培養的完整293細胞(ATCCCRL 1573)中的17β-HSD和3α-HSD活性。將用3型3α-HSD穩定轉染的細胞以105細胞/孔密度接種在24孔培養板中。在新更換的培養基中加入0.1μM[14C]-標記的4-二酮和[14C]-標記的DHT，以分別評價3型3α-HSD酶的17β-HSD活性[4-二酮轉化為睪丸激素(□)]和3型3α-HSD酶的3α-HSD活性[DHT轉化為3α-二醇(○))和轉染酶的活性。非轉染細胞用作對照。在培養指定時間後，收集並萃取培養基，如本文「1、2、3型和517β-HSD以及1和3型3α-HSD的酶學測定」所述進行測定。
圖3a-3c顯示用對3型3α-HSD的抗體免疫染色的正常人皮的石蠟切片。在以下部位可見存在的3型3α-羥基類固醇脫氫酶；a)上皮和成纖維細胞b)毛囊c)汗腺。
優選實施方案的詳細說明前列腺癌是前列腺上皮的疾病，而良性前列腺增生(BPH)主要涉及前列腺的基質部分。前列腺炎儘管更常見於前列腺上皮，但是可見於前列腺的這兩種區域。
本申請人的最新結果表明，5型17β-羥基類固醇脫氫酶(5型17β-HSD)和3型3α羥基類固醇脫氫酶(3型3-HSD)存在於前列腺上皮，主要存在於上皮基底細胞，因此通過圖1所示的途徑將雄甾烯二酮轉化為睪丸激素。然後這種睪丸激素擴散到雄激素依賴性腺腔上皮細胞，以及使前列腺癌生長。關於基質部分，3型3α-HSD和5型17β-HSD主要見於散布於肌肉細胞中的成纖維細胞。據認為，成纖維細胞分泌的生長因子刺激周圍細胞，因此產生BPH。在這些基質成纖維細胞中存在的雌激素可能為雌激素以及雄激素在BPH中發揮作用提供了基礎。然而，前列腺癌只是一種雄激素敏感型疾病。
在先有技術中，已知3型3α-HSD將DHT轉化為無活性代謝產物雄甾烷-3α，17β-二醇。本申請人最近發現3α-HSD的令人驚奇的作用，它分別催化雄甾烯二酮和雄甾烷二酮形成睪丸激素和DHT(見圖1)。據認為，抑制3型3α-HSD以抑制形成睪丸激素和DHT的好處明顯勝過當抑制3型3α-HSD時可能產生的任何雄激素代謝中的降低。因為在前列腺組織中存在許多其它形成雄激素必需的酶，所以提出這樣一種可能性本文所討論的聯合療法(例如應用其它酶活性抑制劑、抗雄激素物質和/或睪丸切除術)將產生較單獨應用一種活性劑更好的效果。人們特別認為正確的是通過兩種或多種不同機制治療疾病的聯合治療(例如抑制兩種或多種不同合成途徑，抑制雄激素形成同時聯合阻斷與雄激素受體的結合等)。
圖1適用於各種前列腺癌、良性前列腺增生和前列腺炎，雖然前列腺癌和BPH的細胞類型不同。在前列腺癌中，5型17β-HSD和3型3α-HSD主要存在於一種細胞類型(基底細胞)，而5α-還原酶存在於就位於基底細胞之上的腺泡腔細胞中，因此使得睪丸激素可由基底細胞擴散到腺泡腔細胞，然後轉化為作用更強的雄激素DHT。位於基質間隔的成纖維細胞將雄甾烯二酮轉化為睪丸激素，然後在同一細胞中轉化為DHT。
1型3α-HSD在前列腺中的量不多，而是肝臟的一種主要酶。在本發明中使用的抑制劑(例如3型3α-HSD抑制劑、5型17β-HSD抑制劑、5α-還原酶抑制劑等)最好對1型3α-HSD幾乎沒有或沒有抑制作用，因為它有益地使雄激素滅活。所以本申請人優選避免抑制1型3α-HSD當實施本發明時不會延遲肝臟組織對雄激素的滅活。
我們發現人3型3α-HSD在將5α雄甾烷-3，17-二酮和二氫睪丸激素分別轉化為雄甾酮和雄甾烷-3α，17β-二醇的同時，將4-雄甾烯-3，17-二酮轉化為睪丸激素和5α-雄甾烷3，17-二酮轉化為二氫睪丸激素。在前列腺組織中，人3型3α-HSD的表達比人5型17β-HSD的表達高得多，因此說明在前列腺中通過該途徑形成大部分的雄激素(圖1)。
在一個優選實施方案中，如圖1所示，通過同時有效抑制5α-還原酶和5型17β-羥基類固醇脫氫酶活性有效阻斷二氫睪丸激素的產生，從而抑制形成雄激素。
存在兩種類型的5α-還原酶。這兩種類型均在前列腺中表達，但是2型5α-還原酶的表達水平更高。Merck的產品Proscar(非那甾胺，MK-906)主要抑制2型5α-還原酶。
Glaxo Wellcome生產的化合物GI 198745(17β-{N-2，5-雙(三氟甲基)苯基}氨基甲醯基-4-氮雜-5α-雄甾-1-烯-3-酮)和Endorecherche的化合物EM-503(17β-(N，苯甲醯基，N-苯基)氨基-4-甲基-4-氮雜-雄甾烷-3-酮)既有效抑制1型5α-還原酶又有效抑制2型5α-還原酶，因此可更有效地阻斷DHT形成。
但是抑制5α-還原酶活性確實提高睪丸激素(T)水平。儘管弱於DHT，但是T也具有使前列腺不同程度生長的雄激素作用。
為了更有效地阻斷雄激素形成，抑制17β-羥基類固醇脫氫酶活性也是有用的，該酶將4-二酮轉化為T或者將A-二酮轉化為DHT。該活性在前列腺由5型17β-HSD而且令人驚奇的是由3型3α-HSD催化。我們開發了5型17β-HSD的高效抑制劑，其分子結構和合成如下EM-1401，EM1404的合成流程A 3-三氟甲磺醯氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17(R)-螺-2』-(5』，5』-二甲基-6』-氧代)四氫吡喃(b)在氬氣氛下，將化合物a(500mg，1.35mmol)、2，6-二甲基吡啶(0.355mL，3.05mmol)和4-二甲基氨基吡啶(33mg，0.27mmol)在無水二氯甲烷(25mL)中的溶液在0℃下冷卻，用三氟甲磺酸酐(0.308mL，1.83mmol)處理並攪拌45分鐘。用水猝滅反應混合物，用二氯甲烷萃取。用2％鹽酸、飽和碳酸氫鈉和水洗滌有機相，經硫酸鎂乾燥，過濾並蒸發。經快速層析(己烷-乙酸乙酯49-1至己烷-乙酸乙酯4-1)純化粗製油，獲得三氟甲磺酸鹽b(EM-1 399)(540 mg，80％)IR(CHCl3)2957，2872，1711，1490，1426，1248，1214，1141，926，846，621cm-1；1HNMR(300MHz，CDCl3)δ1.03(s，3H)，1.28(s，3H)，1.29(s，3H)，1.35-2.40(m，17H)，2.88(m，2H)，6.98(s，1H)，7.02(d，J＝8Hz，1H)，7.33(d，J＝8.7Hz，1H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ14.32，23.22，25.48，25.80，26.89，27.57，27.68，29.37，31.49，31.80，34.69，37.72，38.46，43.66，47.10，48.59，93.43，116.54，118.08，120.80，121.07，127.05，139.31，140.43，147.46，177.70。3-羧基-1，3，5(10)-雌三烯-17(R)-螺-2』-(5』，5』-二甲基-6』-氧代)四氫吡喃(EM-1401)方法A用一氧化碳衝洗化合物b(560mg，1.12mmol)、醋酸鉀(440mg，4.48mmol)、醋酸鈀(12.6mg，0.056mmol)和1，1』-雙(二苯基膦基)二茂鐵(125mg，0.255mmol)在二甲亞碸(20mL)中的混合物20分鐘，於80℃在一氧化碳氣球中攪拌3小時以上。用0.5N鹽酸稀釋反應混合物並用二氯甲烷萃取。用水洗滌有機相，經硫酸鎂乾燥，過濾並蒸發。經快速層析(二氯甲烷-甲醇19-1至二氯甲烷-甲醇4-1)純化反應混合物，獲得羧酸EM-1401(300mg，68％)IR(KBr)2937，2872，1718，1676，1388，1314，1230，1180，，1160cm-1；1H NMR(300MHz，CDCl3+CD3OD)δ0.75(s，3H)，1.01(s，6H)，1.10-2.17(m，17H)，2.65(m，2H)，7.09(d，J＝8.1Hz，1H)，7.48(s，1H)，7.51(d，J＝8.5Hz，1H)；13CNMR(75MHz，CDCl3+CD3OD)δ13.71，22.75，24.98，25.27，26.65，26.87，28.76，30.84，31.46，34.21，37.33，38.22，43.84，46.74，93.92，124.84，126.52，127.32，129.91，136.31，144.94，168.70，178.97。3-烷氧基羰基-1，3，5-(10)-雌三烯-17(R)-螺-2』-(5』，5』-二甲基-6』-氧代)四氫吡喃(c)用一氧化碳衝洗化合物b、三乙胺(3.25equiv)、醋酸鈀(0.07equiv)、1，3-二(二苯基膦基)丙烷(0.06equiv)和乙醇(1.5equiv至大量過剩)在DMF(10％W/V)中的混合物20分鐘，於90℃在一氧化碳氣球中攪拌16小時以上。在室溫下冷卻反應混合物，用水稀釋並用二氯甲烷萃取。用鹽水洗滌有機相，經硫酸鎂乾燥，過濾並蒸發。經3次快速層析(2次用苯-丙酮4-1和己烷-乙酸乙酯7-3)純化反應混合物，獲得混合物c(例如EM-1398，R＝苄基，70％)IR(CHCl3)2938，1716，1293，1262，1177，1152，1130，1109，732 cm-1；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.02(s，3H)，1.28(s，3H)，1.29(s，3H)，1.34-1.41(m，17H)，2.91(m，2H)，5.35(s，2H)，7.33-7.45(m，6H)，7.79(s，1H)，7.83(d，J＝8.1Hz，1H)；13CNMR(75MHz，CDCl3)δ14.39，23.28，25.55，25.74，27.14，27.64，27.75，29.25，31.56，31.93，34.75，37.77，38.56，44.34，47.16，48.82，66.42，93.50，125.34，126.90，127.45，128.05，128.10，128.52，130.23，136.22，136.81，145.49，166.55，177.75。3-羧基-1，3，5(10)-雌三烯-17(R)-螺-2』-(5』，5』-二甲基-6』-氧代)四氫吡喃(EM-1401)方法B將化合物c(350mg，0.72mmol)和10％鈀活性炭(50mg)在乙酸乙酯(40mL)中的混合物在氫氣球中攪拌3小時以上。反應混合物經C鹽過濾並蒸發。經快速層析(二氯甲烷-THF 19-1至二氯甲烷-THF 3-1)純化粗製混合物，獲得羧酸EM-1401(240mg，84％)。用甲醇-THF重結晶樣品(特徵如前所述)。3-醯胺基-1，3，5(10)-雌三烯-17(R)-螺-2』-(5』，5』-二甲基-6』-氧代)四氫吡喃(d)在氬氣氛下，將EM-1401和吡啶(15equiv)在無水二氯甲烷(1.6％W/V)中的溶液在0℃下冷卻，用用草醯氯(6equiv處理並攪拌0.5小時。使反應混合物達到室溫並攪拌4小時以上。蒸發反應混合物，將其溶解於無水THF(1.6％W/V)中，於0℃冷卻，用10equiv胺處理並攪拌15分鐘。用水猝滅反應混合物，用二氯甲烷萃取，經硫酸鎂乾燥，過濾並蒸發。經快速層析(己烷-丙酮19-1至己烷-丙酮3-2)純化粗製混合物，獲得化合物d(例如EM-1404，R1＝R2＝H，65％)IR(CHCl3)3433，3350，2941，2873，1702，1664，1611，1388，1310，1159cm-1；1H NMR(300MHz，CDCl3+CD3OD)δ0.73(s，3H)，0.99(s，6H)，1.10-2.16(m，17H)，2.64(m，2H)，7.08(d，J＝8.0Hz，1H)，7.30(s，1H)，7.32(d，J≈9Hz，1H)；13C NMR(75MHz，CDCl3+CD3OD)δ13.69，22.72，24.96，25.27，26.64，26.84，28.78，29.09，30.81，31.44，34.19，37.31，38.27，43.72，46.74，93.92，124.20，124.93，127.70，130.00，136.45，143.88，170.63，178.96。
5型17β-HSD和3型3α-HSD具有85.5％胺基酸同一性。在5型17β-HSD和3型3α-HSD之間一級結構的高度同源性能夠解釋見於3型3α-HSD活性的微弱17β-HSD活性。但是，因為3型3α-HSD的表達水平比5型17β-HSD高得多，所以3型3α-HSD產生的意外17β-HSD活性在前列腺中起作重要作用。因此必需抑制3型3α-HSD活性，以有效阻斷雄激素形成(圖1)。
3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑可按照本發明單獨使用或作為與其它策略(見下文)的聯合療法的一部分，聯合療法通過不同機制對雄激素敏感型疾病產生有益的作用，因而獲得協同的聯合作用。這類聯合療法除了3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑(以及在某些實施方案中與5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑聯合)之外包括一種或多種以下策略策略1通過化學或外科切除術抑制卵巢或睪丸分泌激素。該方法適用於治療雌激素或雄激素分別對其產生不利作用的疾病。當使用外科或化學切除術時，優選使用LHRH拮抗劑、LHRH拮抗劑和/或3型3α-羥基類固醇脫氫酶(如本文所述它催化一定的睪丸雄激素形成)抑制劑的化學切除法。在美國專利4,659,695中報告了合適的LHRH拮抗劑，但是可使用任何具有產生化學切除作用的LHRH拮抗劑，因為它們均通過最初所述的相同機制起作用(Labrie等，J.Androl.1209-228，1980)。使用劑量是本領域已知的。某些合適LHRH拮抗劑報導於美國專利4,666,885，但是如果按照生產商的建議使用，任何LHRH拮抗劑均適用。
策略2採用雄激素或雌激素受體拮抗劑(「抗雄激素物質」或「抗雌激素物質」)分別防止雄激素或雌激素激活雄激素或雌激素受體。策略2適用於雄激素活性或雌激素活性分別對其產生不利作用的疾病。抗雄激素物質(例如氟他胺(N-[4-硝基-3-(三氟甲基)苯基)]-2-甲基丙醯胺)及其劑量是本領域已知的，劑量為250mg，2-3次/日，尼魯米特的劑量為150mg/日，卡地索的劑量為50-750mg/日。
當按照本發明使用抗雌激素物質時，或者單獨使用或者作為本文所述聯合療法的一部分使用，主治醫師至少在開始應該使用生產商推薦的劑量。但是，主治醫師應該監測個體患者的反應和代謝，並對患者作相應的劑量調整。實際上，這適用於本文所討論的所有策略和在本發明的任何聯合療法中使用的所有活性成分。一種優選的抗雌激素物質為報告於PCT/CA96/00097(WO 96/26201)中的EM-800。EM-800的分子結構為 本發明的另一優選抗雌激素物質是EM-01538 本發明的其它優選SERM包括他莫昔芬((Z)-2-[4-(1，2-二苯基-1-丁烯基)]-N，N-二甲基乙胺)(Zeneca，UK有售)、託瑞米芬(芬蘭的Orion-Farmos或Schering-Plough有售)、屈洛昔芬和CP-336，156(順式-1R-[4』-吡咯烷代(pyrrolidino)-乙氧基苯基]-2S-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫萘D-(-)-酒石酸鹽)(Pfizer Inc.，USA)、雷洛昔芬(Eli Lilly and Co.，USA)、LY 335563和LY 353381(Eli Lilly and Co.，USA)、Iodoxifene(SmithKline Beecham，USA)、公開於Shalmi等的WO 97/25034，WO97/25935，WO 97/25037，WO 97/25038和Korsgaard等的WO 97/25036的Levormeloxifene(3，4-反式-2，2-二甲基-3-苯基-4-[4-(2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基]-7-甲氧基苯並二氫吡喃(Novo Nordisk，A/S，丹麥)、GW5638(Willson等公開於Endocrinology 138(9)，3901-3911，1997)和吲哚衍生物(Miller等公開於EP 0802183A1)和Wyeth Ayers(USA)開發並公開於JP10036347的TSE 424(American home products corporation)和在WO 97/32837中描述的非類固醇雌激素衍生物。
存在兩種類型的5α-還原酶。兩種類型均在前列腺表達，但是2型5α-還原酶的表達水平更高。Merck產品Proscar(非那甾胺，MK-906)主要抑制2型5α-還原酶。
Glaxo Wellcome生產的化合物GI 198745(17β-{N-2，5-雙(三氟甲基)苯基}氨基甲醯基-4-氮雜-5α-雄甾-1-烯-3-酮)和Endorecherche的化合物EM-503(17β-(N，苯甲醯基，N-苯基)氨基-4-甲基-4-氮雜-雄甾烷-3-酮)既有效抑制1型5α-還原酶又有效抑制2型5α-還原酶，因此可更有效地阻斷DHT形成。
策略3通過抑制睪丸激素5α-還原酶的活性抑制雄激素睪丸激素轉化為更強的雄激素二氫睪丸激素(DHT)(例如以推薦劑量給予Proscar，Merck Sharp和Dohme Canada有售)。可使用任何其它有效的5α-還原酶抑制劑。使用的劑量可以是每日口服2-20mg。所述劑量應該是生產商推薦劑量。策略3適用於雄激素活性對其產生不利影響的疾病。
策略4使用芳香酶抑制劑減少雌激素的產生。策略4適用於雌激素活性對其產生不利影響的疾病或同樣為雌激素敏感性疾病的雌激素受體介導的惡化型雌激素敏感型疾病(例如良性前列腺增生)。芳香酶抑制劑(和抗雌激素物質)也可用來減輕雌激素水平升高產生的不需要的雌激素作用，雌激素水平升高見於某些雄激素依賴性疾病的治療。當按照本發明使用芳香酶抑制劑時，或者單獨使用或者作為本文所述的一種聯合療法的一部分使用，主治醫師應該在開始時使用生產商的推薦劑量。當口服給藥時，一般獲得需要血清水平的有效劑量為每50公斤體重1.0mg-20mg活性成分/日。例如Arimidex(Zeneca)的每日口服劑量為1mg。但是，主治醫師應該監測患者個體反應和代謝，並相應調節患者的具體劑量。某些芳香酶抑制劑包括例如美國專利5,227,375中所述分子結構。也可通過以1mg/日的劑量給予Zeneca，UK銷售的Arimidex(2，2』-[5-(1H-1，2，4-三唑-1-基甲基)-1，3-次苯基雙(2-甲基丙醯基腈)。任何其它芳香酶抑制劑均可按照生產商建議使用。
一般來說，對於雄激素敏感型疾病和雌激素敏感型疾病而言，據認為，同時用性激素類固醇生物合成抑制劑(催化雌激素或雄激素生物合成、或雌激素或雄激素前體生物合成的一個或多個步驟的酶的抑制劑)和雌激素受體拮抗劑和/或雄激素受體拮抗劑的治療具有相加作用而不是多餘的作用，因為它們通過不同機制以有益的方式發揮作用。同樣人們認為，兩種不同酶抑制劑(催化性激素類固醇生物合成的一個或多個不同步驟的酶)的活性提供相加作用，尤其是當所述抑制劑影響一個以上合成途徑時。據認為這種方法可獲得更充分的效果。
本發明的3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑和5型17-β羥基類固醇脫氫酶抑制劑可與上述策略1-4中的任意一個任意組合使用，所述策略的作用(增強或降低雄激素活性或雌激素活性)與對所述疾病的需要作用一致。注意，以下所述是列舉的按照本發明可治療或可降低其風險的典型疾病。在每種疾病下面指出了對所述特定疾病的治療或降低風險的優選療法或聯合療法。但是，這類聯合療法可用一種或多種以上所列的四種策略進行追加，所述策略的選擇只受限於雌激素活性和/或雄激素活性對特定疾病是產生有利作用還是不利作用。
A)前列腺癌(雄激素活性對其產生不利作用)1.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑2.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑3.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+LHRH-激動劑(或拮抗劑)4.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+3型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑5.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+3型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+LHRH-激動劑(或拮抗劑)6.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+LHRH-激動劑(或拮抗劑)+抗雄激素物質7.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+3型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雄激素物質8.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+3型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+LHRH-激動劑(或拮抗劑)+抗雄激素物質9.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雄激素物質+5 α-還原酶抑制劑+LHRH激動劑(或拮抗劑)10.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+LHRH-激動劑+5α-還原酶抑制劑11.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+3型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5α-還原酶抑制劑12.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+3型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雄激素物質+5α-還原酶抑制劑13.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+3型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+LHRH激動劑(或拮抗劑)+抗雄激素物質+5α-還原酶抑制劑B)良性前列腺增生(雄激素活性和雌激素活性均對其產生不利作用)1.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑
2.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雌激素物質或芳香酶抑制劑3.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雄激素物質4.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雄激素物質+5α-還原酶抑制劑+抗雌激素物質或芳香酶抑制劑5.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5α-還原酶抑制劑6.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雄激素物質+5α-還原酶抑制劑7.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5α-還原酶抑制劑+抗雌激素物質或芳香酶抑制劑8.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑9.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雌激素物質或芳香酶抑制劑10.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雄激素物質11.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雄激素物質+5α-還原酶抑制劑+抗雌激素物質或芳香酶抑制劑12.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5α-還原酶抑制劑13.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雄激素物質+5α-還原酶抑制劑14.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5α-還原酶抑制劑+抗雌激素物質或芳香酶抑制劑C)前列腺炎(雄激素活性對其產生不利作用)1.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雄激素物質
2.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5α-還原酶抑制劑3.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雄激素物質+5α-還原酶抑制劑4.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑5.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雄激素物質6.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5α-還原酶抑制劑7.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雄激素物質+5α-還原酶抑制劑。
D)痤瘡、皮脂溢、多毛症、雄激素性脫髮(雄激素活性對其產生不利作用)1.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑2.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑3.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雄激素物質4.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雄激素物質5.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5α-還原酶抑制劑6.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+5α-還原酶抑制劑7.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雄激素物質+5α-還原酶抑制劑。
8.3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑+抗雄激素物質+5α-還原酶抑制劑當按照本發明使用3型3α-羥基類固醇抑制劑時，或者單獨使用或者作為本文所述聯合療法的一部分使用，最好主治醫師使患者的3型抑制劑血清濃度控制在0.5ng/ml-100ng/ml，優選為1ng/ml-20ng/ml，最優選為1ng/ml-10ng/ml。可用LC/MS測定血清濃度。當口服給藥時，一般獲得所需血清水平的有效劑量為每50公斤體重每日1.0mg-1,000mg活性成分，優選10mg-500mg，最優選10mg-100mg。然而劑量應該隨所選定抑制劑的生物利用度和患者個體反應而不同。例如當選定EM-01645或EM-01667-C時，口服劑量優選為每50公斤體重每日5mg-500mg，更優選為10mg/日-300mg/日，例如為20mg/日-100mg/日。主治醫師應該監測患者個體反應和血清水平，判斷是否適當，並相應調整患者的劑量。當注射給藥時，通常較低的劑量是合適的，例如每50公斤體重每日10mg-100mg.
當按照本發明使用5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑時，作為一種本文所述聯合療法的一部分使用，主治醫師最好將患者血清的5型抑制劑濃度控制於0.5ng/ml-100ng/ml，優選為1ng/ml-20ng/ml，最優選為1ng/ml-10ng/ml。可用LC/MS測定血清濃度。當口服給藥時，一般獲得所需血清水平的有效劑量為每50公斤體重每日1.0mg-1,000mg活性成分，優選10mg-500mg，最優選10mg-100mg。然而劑量應該隨所選定抑制劑的生物利用度和患者個體反應而不同。例如當選定EM-1404時，口服劑量優選為每50公斤體重每日5mg-500mg，更優選為10mg/日-300mg/日，例如為20mg/日-100mg/日。主治醫師應該監測患者個體反應和代謝(血清水平，判斷是否適當)，並相應調整患者的劑量。當注射給藥時，通常較低的劑量是合適的，例如每50公斤體重每日10mg-100mg。
當按照本發明使用3型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑時，作為一種本文所述聯合療法的一部分使用，主治醫師最好將患者的3型抑制劑血清濃度控制在0.5ng/ml-100ng/ml之間，優選在1ng/ml-20ng/ml之間，最優選在1ng/ml-10ng/ml之間。當口服給藥時，所述劑量優選為每50公斤體重每日1.0mg-1,000mg活性成分，優選在5mg-500mg之間，最優選在10mg-100mg之間。然而主治醫師應該監測患者個體反應和代謝，並對患者的劑量作相應調整。這類抑制劑的合成如下所示3型17β-HSD抑制劑的合成流程B 用TBDMS保護17β-醇 在二氫睪丸激素(DHT，e)(5g，17.2mmol)的DMF溶液中加入咪唑(6eq.)和TBDMSCl(6eq.)。在室溫下攪拌反應物過夜。將混合物傾倒在冰上並過濾。用水洗滌生成的白色沉澱物，經五氧化磷減壓乾燥24小時。獲得85-90％產率17β-[(叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基]-5α-雄甾烷-3-酮(f)白色固體；IR(KBr)v1719(C＝O，酮)；1H NMR(CDCl3)δ-0.001和0.005(s，6H，Si(CH3)2)，0.71(s，3H，CH3-18)，0.87(s，9H，SiC(CH3)3)，1.01(s，3H，CH3-19)，3.54(t，J＝8.2Hz，1H，CH-17)；13C NMR(CDCl3)δ-4 80和-4.47，11.41，11.52，18.11，21.13，23.56，25.87，28.98，30.94，31.36，35.54，35.78，37.13，38.21，38.65，43.36，44.74，46.84，50.55，54.15，81.79，212.03。3位羰基的烷基化於0℃，在化合物f(500mg，1.23mmol)的無水THF(100mL)溶液中滴加3eq.市售格氏試劑的無水THF。使混合物在0℃下反應3小時，然後在室溫下留置過夜。加入飽和氯化銨溶液，並用乙酸乙酯萃取粗產物。用飽和氯化鈉溶液洗滌有機相，經硫酸鎂乾燥，減壓蒸發。用己烷和乙酸乙酯混合物作洗脫劑，在矽膠上經快速層析容易地使3β-烷基化的立體異構體與3α-烷基化立體異構體分離。當原位產生格氏試劑時，如在乙基苯基溴化鎂的情況下，用相應的溴化物、活性鎂和碘化物通過周知的方法製得5eq.。然後將所述類固醇溶解於無水乙醚中，並將其滴加至試劑溶液中。獲得所述兩種立體異構體的產率約為60％。3β-苄基-17β[(叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基]-3α-羥基-5α-雄甾烷(ga)白色固體(24％)；IR(KBr)v 3585和3460(OH，醇)；1H NMR(CDCl3)δ0.002和0.009(s，6H，Si(CH3)2)，0.69(s，3H，CH3-18)，0.75(s，3H，CH3-19)，0.88(s，9H，SiC(CH3)3)，2.71(s，2H，CH2Ph)，3.54(t，J＝8.2Hz，1H，CH-17)，7.20-7.34(5H，Ph)；13C NMR(CDCl3)δ-4.82和-4.50(SiC(CH3)3)，11.25，11.40，18.08，20.62，23.50，25.85，28.41，30.91，31.62，33.27，33.81，35.60，35.84，37.19，40.10，40.84，43.30，50.43，50.69，54.43，71.22，81.82(C-17)，126.37，128.09(2X)，130.56(2X)，137.06。3α-羥基-3β-(苯乙基)-17β[(叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基]-5α-雄甾烷(gb)白色固體(38％)；IR(膜)v 3447(OH，醇)；1H NMR(CDCl3)δ0.018和0.025(s，6H，Si(CH3)2)，0.71(s，3H，CH3-18)，0.78(s，3H，CH3-19)，0.89(s，9H，SiC(CH3)3)，2.73(m，2H，Ph-CH2)，3.56(t，J＝8.1Hz，1H，CH-17)，7.18-7.31(5H，Ph)；13C NMR(CDCl3)δ-4.77和-4.46(SiC(CH3)3)，11.28，11.44，18.12(SiC(CH3)3)，20.67，23.54，25.89(SiC(CH3)3)，28.52，29.60，30.97，31.66，33.31，33.92，35.66，36.04，37.25，40.03，41.05，43.35，46.47，50.76，54.55，71.50(C-3)，81.86(C-17)，125.68，128.38(4X)，142.82。水解TBDMS基團和氧化生成的醇的方法將甲矽烷基化醚溶解於鹽酸的甲醇溶液(2％，v/v)中，使生成的混合物在室溫下攪拌3小時。然後加入水，真空蒸發甲醇。使獲得的白色沉澱物在未純化的情況下進行瓊斯氧化。於0℃下，向粗製醇的丙酮攪拌溶液中滴加瓊斯試劑(2.7M鉻酸溶液)。30-45分鐘後結束反應。加入異丙醇和水，真空去除丙酮。用乙酸乙酯萃取餘下的水溶液層。用鹽水洗滌合併的有機相，經硫酸鎂乾燥，過濾並減壓蒸發。用HPLC級溶劑乙酸乙酯和己烷作為洗脫劑在矽膠上進行純化。3β-苄基-3α-羥基-5α-雄甾烷-17-酮(CS-213)白色固體(對於所述兩步驟為88％)；IR(KBr)v 3408(OH，醇)，1732(C＝O，酮)；1H NMR(CDCl3)δ0.75(s，3H，CH3-19)，0.84(s，3H，CH3-18)，2.69(s，2H，CH2Ph)，7.18-7.32(5H，Ph)；13C NMR(CDCl3)δ11.18，13.78，20.20，21.71，28.16，30.79，31.52，33.18，33.70，35.64，35.79，35.88，39.97，40.69，47.75，50.39，51.41，54.22，71.22，126.40，128.09(2X)，130.51(2X)，136.93，221.27。3α-羥基-3β-苯乙基-5α-雄甾烷-17-酮(EM-1324-CS) 白色固體(對於所述兩步驟為82％)；IR(膜)v 3486(OH，醇)，1737(C＝O，酮)；1HNMR(CDCl3)δ0.79(s，3H，CH3-19)，0.86(s，3H，CH3-18)，2.71(m，2H，PhCH2)，7.18-7.30(5H，Ph)；13C NMR(CDCl3)δ11.21，13.82，20.26，21.76，28.26，29.54，30.87，31.58，33.27，33.80，35.10，35.84，36.07，39.89，40.90，46.43，47.80，51.49，54.35，71.42，125.69，128.31(2X)，128.39(2X)，142.70，221.31。
在所述任何療法中使用的所有活性成分均可配製為藥用組合物，該藥用組合物含有一種或多種其它活性成分。或者，它們中的每一種成分可分別給予，但是儘可能同時給予，使得患者最終的血液水平升高或者同時從每一活性成分(或策略)獲得有益作用。在本發明的一部分優選實施方案中，例如一種或多種活性成分配製成一種藥用組合物。在本發明的其它實施方案中，提供包括至少兩個獨立容器的試劑盒，就容器中含有的活性成分而言，其中至少一個容器的內容物完全或部分不同於至少另一個容器的內容物。在本發明的這些聯合療法中使用兩個或多個不同容器。本文所討論的聯合療法同樣包括在生產治療(或預防)所述疾病的藥物中使用所述聯合治療組合中的一種活性成分，在此所述治療或預防還包括所述組合的其它活性成分或策略。治療或預防所述疾病的方法的一部分實施方案應用本文所述的特定5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑和/或3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑(即本文所述分子結構)。
除非另有說明，可交互使用LHRH激動劑和LHRH拮抗劑通過已知技術抑制睪丸激素或卵巢激素的分泌。希望當給予本發明的活性成分時對糖皮質激素受體的激活最小化。3型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑可用來獲得類似於LHRH激動劑或拮抗劑提供的益處。
3型3α-羥基類固醇脫氫酶的優選抑制劑下表列舉了我們發現可用作3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑的化合物。該表還包括許多情況，進一步測試了特定化合物的其它重要參數的，例如雄激素活性和抗雄激素活性，以及化合物對雄激素受體、雄激素敏感細胞增生的作用，而其它作用在下文中更全面地解釋。在其表號沒有「撇號」(』)的下表中，給出了詳細的優選抑制劑(或比較化合物)的分子結構。其表號具有「撇號」(』)的相應表提供每一受試化合物的功能效能的信息。欄頭的數字對應於所有表格末的說明，說明每欄報告的信息以及如何測得的。空白條目表示還沒有測定。
表1
表1』
表2
表2』
表格說明第1欄為優選的3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑的口服生物利用度，用ng/mL.h表示，按下文中的「體內測定人3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑」所述測定。最好數字較大。ND表示未測定。
第2欄為對人3型3α-羥基類固醇脫氫酶活性的抑制，用抑制50％酶活性的濃度表示(IC50，nM)。其中測定IC50的方法描述於下文的「II-1，2，3和5型17β-HSD以及1和3型3α-HSD的酶測定」中。空白表示未測定。括號內為3.10-7和3.10-6M抑制劑抑制酶活性的百分率。
第3欄為對人1型17β-羥基類固醇脫氫酶活性的抑制，用抑制50％酶活性的濃度(IC50，nM)表示。其中測定IC50的方法描述於下文的「II-1，2，3和5型17β-HSD以及1和3型3α-HSD的酶測定」中最好IC50值較高。空白表示未測定。括號內為3.10-7和3.10-6M抑制劑抑制酶活性的百分率。
第4欄為對人2型17β-羥基類固醇脫氫酶活性的抑制，用抑制50％酶活性的濃度(IC50，nM)表示。其中測定IC50的方法描述於下文的「II-1，2，3和5型17β-HSD以及1和3型3α-HSD的酶測定」中。最好IC50數字較大。空白表示未測定。括號內為3.10-7和3.10-6M抑制劑抑制酶活性的百分率。
第5欄為對人3型17β-羥基類固醇脫氫酶活性的抑制，用抑制50％酶活性的濃度(IC50，nM)表示。其中測定IC50的方法描述於下文的「II-1，2，3和5型17β-HSD以及1和3型3α-HSD的酶測定」中。最好IC50數字較小。空白表示未測定。括號內為3.10-7和3.10-6M抑制劑抑制酶活性的百分率。
第6欄為對人1型3α-羥基類固醇脫氫酶活性的抑制，用抑制50％酶活性的濃度(IC50，nM)表示。其中測定IC50的方法描述於下文的「II-1，2，3和5型17β-HSD以及1和3型3α-HSD的酶測定」中。最好IC50數字較大。空白表示未測定。括號內為3.10-7和3.10-6M抑制劑抑制酶活性的百分率。
第7欄為對人5型17β-羥基類固醇脫氫酶活性的抑制，用抑制50％酶活性的濃度(IC50，nM)(中間的數字)表示。其中測定IC50的方法描述於下文的「II-1，2，3和5型17β-HSD以及1和3型3α-HSD的酶測定」中。最好IC50數字較小。當未測定IC50時，括號內為3.10-7M(左側數字)和3.10-6M(右側數字)抑制劑抑制酶活性的百分率。括號內為3.10-7和3.10-6M抑制劑抑制酶活性的百分率。
第8欄為優選的3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑的雄激素活性，用抑制劑濃度10-7M(左側數字)和10-6M(右側數字)刺激Shionogi細胞增殖的百分率表示。其中測定對細胞的刺激作用的方法描述於下文的「III-雄激素/抗雄激素活性」中。最好數字較小。ND表示未測定。
第9欄為優選的3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑的抗雄激素活性，用抑制50％DHT誘導的Shionogi細胞增殖的濃度(IC50，nM)(括號中間的數字)表示。還報告了抑制劑濃度10-7M(左側數字)和10-6M(右側數字)抑制DHT誘導的Shionogi細胞增殖的百分率。其中對細胞抑制作用的測定方法描述於「III-雄激素/抗雄激素活性」中。最好數字較小。ND表示未測定。
第10欄為優選的3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑的雌激素活性，用抑制劑濃度10-7M(左側數字)和10-6M(右側數字)刺激ZR-75-1細胞增殖的百分率表示。其中對細胞刺激作用的測定方法描述於「IV-雌激素/抗雌激素活性」中。最好數字較小。ND表示未測定。
第11欄為優選的3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑的抗雌激素活性，用抑制劑濃度10-7M(左側數字)和10-6M(右側數字)抑制E2誘導的ZR-75-1細胞增殖的百分率表示。其中對細胞抑制作用的測定方法描述於「IV-雌激素/抗雌激素活性」中。最好數字較小。ND表示未測定。
第12欄為與雄激素受體的結合，用抑制劑濃度10-8M(星號數字為10-7M)(左側數字)和10-6M(星號數字為10-5)(右側數字)抑制[3H]R1881結合的百分率表示。其中測定抑制百分率的方法描述於「V-雄激素受體(AR)測定」中。最好數字較小。
第13欄為與孕激素受體的結合，用抑制劑濃度10-8M(星號數字為10-7M)(左側數字)和10-6M(星號數字為10-5)(右側數字)抑制[3H]R5020結合的百分率表示。其中測定抑制百分率的方法描述於「VI-孕激素受體測定」中。最好數字較小。
第14欄為與糖皮質激素受體的結合，用抑制劑濃度10-8M(星號數字為10-7M)(左側數字)和10-6M(星號數字為10-5)(右側數字)抑制[6，7-3H*(N)]-地塞米松結合的百分率表示。其中測定抑制百分率的方法描述於「VII-糖皮質激素受體測定」中。
第15欄為與雌激素受體的結合，用抑制劑濃度10-8M(星號數字為10-7M)(左側數字)和10-6M(星號數字為10-5)(右側數字)抑制[3H]-E2結合的百分率表示。其中測定抑制百分率的方法描述於「VIII-雌激素受體(ER)測定」中。
優選抑制劑的效用I-人類3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑的生物利用度的體內測定1)原理通過測定單次經口給予3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑後的血漿濃度在Sprague Dawley大鼠體內進行其生物利用度測定。在不同時間間隔的測量值大於或等於1.0ng/mL和小於或等於50ng/mL。a)動物和處理雄性Sprague-Dawley大鼠[CrLCD(SD)Br]重275-350g，得自Charles-River Canada Inc.，在環境適應期間每籠2隻大鼠，試驗期間每籠1隻。將動物保持在12小時光照12小時黑暗(在0800時開燈)環境下。動物任意進食鑑定合格的大鼠飼料(Lab Diet #5002，顆粒)和自來水。給藥前一個晚上大鼠開始禁食(只可以飲水)。
對三隻動物經口管飼給予劑量為0.5mg/大鼠(1.0ml/大鼠)作為0.4％甲基纖維素懸浮液的每種待測化合物。每天測試4-8種新化合物，一組動物在相同條件下在每個給藥日接受甲地孕酮醋酸鹽(MGA)作為對照。在管飼後1、2、3、4和7小時在異氟烷誘導麻醉下從大鼠頸靜脈取約0.7ml血液樣本。將血液樣本立即轉移到含有DETA的冷藏的0.75ml Micrtainer中，並保持在冰水浴中直到以3000 rpm離心10分鐘。收集血液後迅速(50分鐘以內)分離血漿。然後將一等份0.25ml血漿轉移到硼矽酸鹽管(13×100)中，在乾冰上迅速冷凍。將血漿樣品保持於-80℃，然後用LCMS/MS檢測所述抑制劑的血漿濃度。2)LCMS檢測a)儀器1.真空歧管2.渦輪Vap LV蒸發器3.具有相關外圍設備的質譜儀API III或API-300(PE/Sciex)4.自動注射器5.HPLC泵6.輸注泵7.校準吸移管b)試劑和溶液1.甲醇，HPLC級2.水，超純(Super Q)3.乙醇，試劑級4.N-丁基氯，HPLC級5.丙酮，HPLC級6.雄性大鼠血漿(EDTA)7.在參比標準乙醇溶液中3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑約100μg/mL8.EM 248內標參比標準品(50ng/mL溶液)9.質量校準溶液(mass calibrator solution)聚乙二醇(PE/Sciex)c)質譜條件檢測儀質譜儀API-300(PE/Sciex)界面渦輪離子噴霧口(開口1/5)輔流4.5L/分鐘(氮)霧化流11幕氣流(curtain gas flow)11探測溫度460℃壓力約3×10-5託CAD氣體厚度3計數控制1流動相甲醇和1mm甲酸銨以及水和1mm甲酸銨的梯度流速1mL/分鐘d)EM-118的質譜分析參數採樣時間150秒間歇時間30秒持續時間4分鐘MRM模式用於EM-1118分析444.2和398.3注射10μL數據處理「API標準軟體」更新版e)標準溶液的製備用甲醇製備每種3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑母液，不使用時，將所述甲醇溶液保藏於-20℃。如表1所述，用雄性大鼠血漿製備每種化合物的校準曲線標準溶液。
由保藏於-20℃的EM-248標準母液製備含有EM-248 50ng/mL的內標甲醇溶液。
3α-HSD抑制劑的濃度 溶液體積 血漿體積標準溶液50ng/mL 90μl，μg/mL 1.71mL標準溶液20ng/mL 0.8mL，50ng/mL1.2mL標準溶液10ng/mL 0.9mL，20ng/mL0.9mL標準溶液5ng/mL 0.8mL，10ng/mL0.8mL標準溶液2ng/mL 0.6mL，5ng/mL 0.9mL標準溶液1ng/mL 0.5mL，2ng/mL 0.5mL標準溶液0ng/mL N/A 0.5mL空白 N/A 0.5mLf)從大鼠血漿萃取3型抑制劑的方法將等份的大鼠血漿(0.250mL)轉移到13×100mm硼矽酸鹽管。在每個樣品中加入水(1.0mL)和內標溶液(0.1mL)，渦旋混合2分鐘。在每個樣品中加入N-丁基氯和丙酮(v∶v，7∶3)的混合物，並渦旋混合2分鐘。重複該步驟，用渦輪Vap蒸發器在35℃、氮氣下蒸發合併的有機相至幹。用1mL甲醇複製殘餘物，用渦輪Vap蒸發器於35℃蒸發。將最終的萃取物複製入0.1mL甲醇/水(v/v，75∶25)中，然後轉移入錐形瓶中，以注射入質譜儀。g)分析通過分析6個不同5型抑制劑濃度(1、2、5、10、20和50ng/mL)的復份大鼠血漿樣品，進行分析步驟。確定定量底限(LOQ)為1.0ng/mL。低於1.0ng/mL的值表示為低於定量界限(BLQ)。h)線性發現EM-1118的分析方法在1.0-50ng/mL範圍內是線性的。加權(1/X)線性回歸分析獲得相關性(R2)為0.991。i)AUC值的計算對測試的所有化合物確定血漿濃度與時間曲線(AUC)在給藥後0-7小時的曲線下面積。用線性梯形法(linear trapezoidal method)(與模型無關)計算每隻大鼠的AUC0-7值，數據以平均值AUC0-7±SEM(n＝3)表示。II-1、2、3和5型17β-HSD以及1和3型3α-HSD的酶測定酶來源用磷酸鈣法(Kingston等，Current Protocols in MolecularBiology，E.M.Ausbel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidaman，J.A.Smith，K.Struhl.編輯，John Wiley Sons，New York，第9.1.1-9.1.9頁，1991；Luu-The等，J.Invest.Dermatol.，102221-226，1994)，利用編碼1、2和3型17β-HSD(Luu-The等，J.SteroidBiochem.Molec.Biol.，55581-587，1995)、5型17β-HSD(描述於WO97/11162)以及1和3型3α-HSD(Dufort等，Biochem.Biophys.Res.Commun.228474-479，1996)的表達載體瞬時轉染293細胞。對於採用亞細胞部分測定，將細胞在50mM磷酸鈉緩衝液(pH7.4)中進行超聲處理，所述緩衝液含有20％甘油和1mM EDTA，分別以10 000×g離心30分鐘，然後以100 000×g離心1小時分離線粒體部分和微粒體部分。胞質部分(100 000×g上清液)用於測定1型活性，而所述微粒體部分(100 000×g沉澱)用於測定2和3型17β-HSD活性。
孵育在6孔培養板中新更換的培養基中缺乏或加入濃度逐漸增加的本發明優選抑制劑的情況下，在1ml含有20％甘油、1mMEDTA和2mM輔因子(NADPH或NAD+)的50mM磷酸鈉緩衝液，pH7.4中，含有以下0.1μM14C-標記底物於37℃進行酶反應1小時，所述底物為1型17β-HSD的底物雌激素酮、3和5型17β-HSD的底物DHEA和4-雄甾烯-3，17-二酮(Δ4)、2型17β-HSD的底物睪丸激素以及1和3型3α-HSD活性的底物雄甾烷二酮和DHT。溫育1小時後，用2ml乙醚萃取所述類固醇兩次。合併有機相併蒸發至幹。將所述類固醇溶解於50μl二氯甲烷，上樣於矽膠60薄層層析(TLC)板(Merck，Darmstad，Germany)，然後用甲苯-丙酮(4∶1)溶劑系統展開分離。通過與參比類固醇比較鑑定底物和代謝產物，通過放射性自顯影顯示，用Phosphoimager System(Molecular Dynamics，Sunnyval，CA)定量。也可用HeLa、SW-13、293、COS-1細胞進行轉染，優選的細胞係為293細胞。III-Shionogi活性用Shionogi小鼠乳腺癌細胞檢測了部分優選化合物的雄激素/抗雄激素活性。
材料基本必需培養基(MEM)、非必需胺基酸和胎牛血清購自Flow Laboratories。為了去除內源性類固醇，將血清與1％活性炭(NoritA，Fisher)和0.1％Dextran T-70(Pharmacia)於4℃孵育過夜。於25℃再吸附2小時以進一步去除蛋白結合的類固醇。血清也可於56℃孵育20分鐘滅活。5α-二氫睪丸激素(DHT)得自Steraloids。抗雄激素羥氟他胺(OH-FLU)由T.L.Nagabuschan和R.Neri博士(Schering Corporation，Kenilworth，U.S.A.)惠贈。
分散細胞、培養和克隆帶有雄激素敏感型乳腺腫瘤的Shionogi雄性小鼠由Keishi Matsumoto博士，Osaka，日本和Yvonne Lefebvre博士，Ottwa，加拿大提供。取出腫瘤並在冰冷無菌25 mM Hepes緩衝液(137mM NaCl；5mM KCl；0.7mM Na2HPO4；10mM葡萄糖，pH7.2)中洗滌，以用於原代培養。用剪刀剪碎組織，在含有3.8mg/ml膠原酶(Clostridium，Boehringer)、1.5mg/ml透明質酸酶II(Sigma)和3％牛血清白蛋白部分V(Schwartz-Mann)的Hepes緩衝液中於37℃消化腫瘤組織2小時。離心(500×g，10分鐘)收集分散細胞，通過懸浮在含有5％葡聚糖包被、炭處理胎牛血清(DCC-FCS)、1％非必需胺基酸、10IU/ml青黴素、50μg/ml鏈黴素和100 nM二氫睪丸激素(DHT)(Steraloids)的基本必需培養基(MEM)中洗滌兩次。
將細胞以75 000細胞/ml密度平板培養在5％二氧化碳、37℃環境下的75cm2培養瓶的相同培養基中。每周更換培養基一次。將類固醇和抗類固醇溶解於乙醇中並保持在選定母液中，以使培養基中的乙醇終濃度低於0.01％。這樣的乙醇濃度不會影響細胞生長。
通過在含有3mM乙二胺四乙酸(EDTA)(pH7.2)的0.1％胰酶(FlowLaboratories)的Hepes緩衝液中溫和消化對接近融合的細胞進行傳代。離心沉澱細胞，用培養基重懸浮，用Coulter計數器計數，如上所述再平板培養。在存在100nM DHT下如文獻所述(Stanley等，Cell 1035-44，1977)進行軟瓊脂集落培養。
測定類固醇和抗類固醇的細胞生長和敏感性將細胞以20 000細胞/孔密度培養在24孔培養板中。在每3孔中加入指定增加濃度的藥劑，使細胞生長10-12天，每3-4天更換一次培養基。通過用Coulter計數器直接計數細胞數。
計算和統計學分析按照所述最小平方回歸(Rodbard，Endocrinology 941427-1431，1974)計算DHT和糖皮質激素作用的ED50值。按照多極檢驗(multiple-range test)(Kramer，Biometrics 12307-310，1956)計算統計學顯著性。IV-雌激素/抗雌激素活性已用ZR-71-1人乳腺癌細胞系測定部分優選化合物的雌激素/抗雌激素活性，見以下更詳細的描述。
備用培養物的保持 ZR-75-1細胞(第83代)獲自美國典型培養物收藏中心(Rockville，MD)，常規用含有1nM雌二醇(E2)、2mM L穀氨醯胺、1mM焦磷酸鈉、15mM N-2-羥乙基哌嗪-N』-乙磺酸、10IU青黴素/ml、100μg鏈黴素/ml和10％(v/v)胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的無酚紅RPMI 1640在95％空氣、5％二氧化碳的溼化環境下，於37℃培養。所有培養基和培養基添加成分均購自Sigma。通過用含有EDTA(0.2g/L)的胰酶溶液處理每周傳代細胞一次。用於本文所述試驗的細胞培養物為89-94代細胞。
細胞增殖的測定收穫對數生長期細胞，簡單離心，重懸浮在RPMI 1640中。然後將細胞以一式三份平板培養在LIMBRO 24-孔塑料培養板(2 cm2/孔)中。因為平板培養細胞密度影響激素對ZR-75-1細胞生長的影響，因此以1×104細胞/孔平板接種細胞。72小時後，在缺乏或存在0.1M雌二醇(E2)下用含有3.10-7和10-6M抑制劑濃度的新鮮培養基更換培養基。對照培養物只接受乙醇溶媒。然後使細胞於37℃生長10天，每2天更換一次培養基(組成相同)。缺乏抑制劑時，ZR-75-1細胞在含0.1M雌二醇(E2)的培養基中的倍增時間約48小時。
在E2和/或抗雌激素處理後，於37℃加入0.5ml胰酶溶液(Sigma)5-10分鐘，然後加入含5％葡聚糖包被的無炭牛血清的0.5mlRPMI 1640以阻斷酶作用，從而收穫細胞。如前所述，通過測定DNA含量確定細胞數(0.10ml等份)(Simard等，Endocrinology 1263223-3231，1990)。V-雄激素受體(AR)測定組織準備雄性Sprague-Dawley大鼠(CrlCD(SD)Br)重200-300g，獲自Charles-River Inc.(St-Constant，Québec，加拿大)。在全身麻醉(異氟烷)下切除大鼠性腺，24小時後頸脫臼處死大鼠。迅速取出腹部的前列腺，並使其與粘著組織游離解剖，在乾冰上冷凍。前列腺保持在-80℃直到測定為止。
所有後續步驟於0-4℃進行。用Polytron PT-10勻漿器(BrinkmanInstruments，加拿大)，設定為5，處理三次，每次10秒，兩次之間間隔10秒以便冷卻，在5體積(重量/體積)緩衝液A(25 mM Tris-HCl，1.5mM EDTA二鈉鹽，10mM α-一硫代甘油，10％甘油和10mM鉬酸鈉，pH7.4)中勻漿前列腺。然後用Beckman L5-65超速離心機(Fullerton，CA)以105,000×g離心勻漿60分鐘。按照Bradford方法(Anal.Biochem.72248-254，1976)用牛血清白蛋白作為標準品檢測胞質部分的蛋白濃度。
雄激素受體測定利用羥基磷灰石測定法(HAP)測定雄激素結合。簡而言之，將溶解於乙醇中的放射性類固醇[3H]R1881稀釋入緩衝液A中。然後在存在或缺乏指定濃度的未標記化合物(0.1ml，用含有10％乙醇的緩衝液A製備)下將等份前列腺胞質製備物(0.1ml)與8nM[3H]R1881(0.1ml，～200,000cpm)於0-4℃孵育16-18小時。加入丙炎松(150nM)以遮蔽孕激素受體。通過與用緩衝液P(50mM，Tris-HCl，10mM KH2PO4，pH7.4)如下製備的0.3ml HAP於0-4℃孵育40分鐘分離未結合的類固醇用緩衝液P洗滌10g HAP直到上清液pH達到7.4為止，然後在離心和傾析上清液後加入37.5ml緩中液P。在與HAP孵育並以1,000×g離心10分鐘後，用1ml緩衝液P洗滌沉澱3次。再後通過與1ml乙醇在室溫下孵育60分鐘從所述沉澱萃取放射性。離心後，將上清液傾入閃爍瓶，用乙醇再萃取沉澱一次。之後在合併的上清液中加入10ml Formula-989閃爍液，用Beckman計數器測定放射性。
計算以抑制劑濃度10-8和10-6M時抑制[3H]R1881結合的百分率報告結果。VI-孕激素受體測定化學物質[17α-甲基-3H]-孕激素(R5020)(84Ci/mmol)和相應的未標記化合物購自New England Nuclear(Lachine，Québec，加拿大)。所有其它化學物質均分析級。
未標記類固醇母液用乙醇保持在4℃。然後用含有30％乙醇的緩衝液B(10mM Tris-HCl，1.5mM EDTA，10mMα-一硫代甘油，pH7.4)經適當稀釋製備需要的類固醇溶液。
組織準備雄性Sprague-Dawley大鼠重200-300g，獲自Charles-River Inc.(St-Constant，Québec，加拿大)。在全身麻醉(異氟烷)下切除大鼠性腺，24小時後頸脫臼處死大鼠。迅速取出子宮，並使其與粘著組織游離解剖，在乾冰上冷凍。將組織保持在-80℃備用。
胞質準備所有步驟於4℃進行。用Thermovac粉碎機在乾冰上冷凍粉碎組織。然後用Polytron PT-10勻漿器(Brinkman Instruments，加拿大)，設定為5，處理兩次，每次10秒，兩次之間間隔10秒以便冷卻，在10體積(重量/體積)緩衝液A(25mM Tris-HCl，1.5mM EDTA，10mM α-一硫代甘油，10％甘油和10mM鉬酸鈉，pH7.4)中勻漿樣品。然後以105,000×g離心勻漿90分鐘。上清液立即用以測定。
結合測定 利用葡聚糖包被的炭吸附技術測定孕激素結合。在0-4℃用100μl胞質、100μl[3H]-R5020(5nM終濃度，其含有1,000nM的地塞米松以便遮蔽糖皮質激素受體)和100μl指定濃度的未標記化合物孵育16-18小時。每一濃度以一式三份進行。用300μlDCC(1％NoritA和0.1％Dextran T-70的緩衝液B)結束測定。孵育10分鐘後，各管以2,000×g離心10分鐘，並傾入裝有6ml BCS液體閃爍液(NewEngland Nuclear，Dupont)的管形瓶中。用Beckman計數器以35％計數效率測定放射性。
計算以抑制劑濃度10-8和10-6M時抑制[3H]R5020結合的百分率報告結果。VII-糖皮質激素受體測定化學物質[6，7-3H(N)]-地塞米松(39Ci/mmol)購自New EnglandNuclear(Lachine，Québec，加拿大)，而未標記的地塞米松獲自Steraloids(Wilton，NH)。所有其它化學物質均為分析級。
未標記類固醇母液用乙醇保持在4℃。然後用含有30％乙醇的緩衝液B(10mM Tris-HCl，1.5mM EDTA，10mMα-一硫代甘油，pH7.4)經適當稀釋製備需要的類固醇溶液。
組織準備雄性Sprague-Dawley大鼠重200-300g，獲自Charles-River Inc.(St-Constant，Québec，加拿大)。頸脫臼處死大鼠並迅速取出肝臟，並使其與粘著組織游離解剖，在乾冰上冷凍。將組織保持在-80℃備用。
胞質準備所有步驟均於4℃進行。剪碎組織並用Polytron PT-10勻漿器(Brinkman Instruments，加拿大)，設定為5，處理兩次，每次10秒，兩次之間間隔10秒以便冷卻，在10體積(重量/體積)緩衝液A(25mMTris-HCl，1.5mM EDTA，10mMα-一硫代甘油，10％甘油和10mM鉬酸鈉，pH7-4)中勻漿。然後以105,000×g離心勻漿90分鐘。上清液立即用以測定。
結合測定利用葡聚糖包被的炭吸附技術測定糖皮質激素結合。用100μl胞質、100μl[3H]-地塞米松(5nM終濃度)和100μl指定濃度的未標記化合物於0-4℃孵育16-18小時。每一濃度進行一式三份。用300μlDCC(2.5％Norit A和0.25％Dextran T-70的緩衝液B)結束測定。孵育10分鐘後，各管以2,000×g離心10分鐘，並傾入裝有6ml BCS液體閃爍液(New England Nuclear，Dupont)的管形瓶中。用Beckman計數器以35％計數效率測定放射性。
計算以抑制劑濃度10-8和10-6M時抑制[3H]-地塞米松結合的百分率報告結果。VIII-雌激素受體(ER)測定組織準備雌性Sprague-Dawley大鼠(CrlCD(SD)Br)重200-300g，獲自Charles-River Inc.(St-Constant，Québec，加拿大)。在全身麻醉(異氟烷)下切除大鼠性腺，24小時後頸脫臼處死大鼠。迅速取出子宮，並使其與粘著組織游離解剖，在乾冰上冷凍。子宮保持在-80℃直到測定為止。
所有後續步驟於0-4℃進行。用Polytron PT-10勻漿器(BrinkmanInstruments，加拿大)，設定為5，處理三次，每次10秒，兩次之間間隔10秒以便冷卻，在10體積(重量/體積)緩衝液A(25mM Tris-HCl，1.5mM EDTA二鈉鹽，10mMα-一硫代甘油，10％甘油和10mM鉬酸鈉，pH 7.4)中勻漿子宮。然後用Beckman L5-65超速離心機(Fullerton，CA)以105,000×g離心勻漿60分鐘。按照Bradford方法(Anal.Biochem.72248-254，1976)用牛血清白蛋白作為標準品檢測胞質部分的蛋白濃度。
利用前述葡聚糖包被的炭吸附技術(Asselin等，Endocrinology，101666-671，1977；Asselin和Labrie，J.Steroid Biochem.，91079-1082，1978)測定雌激素結合。簡而言之，將溶解於乙醇中的[3H]E2稀釋入緩衝液A中。然後在存在或缺乏指定濃度的未標記化合物(0.1ml，用含有10％乙醇的緩衝液A製備)下將等份子宮胞質製備物(0.1ml)與5nM[3H]E2(～200,000cpm，0.1ml)在室溫下孵育3小時。然後通過與0.3ml0.5％Norit-A和0.05％Detran T-70的緩衝液B(1.5mM EDTA二鈉鹽，10mM一硫代甘油和10mM Tris-HCl，pH7.4)於0-4℃孵育15分鐘分離未結合的類固醇，並以3,000×g離心15分鐘。取出等份上清液(0.3ml)進行放射性測定。加入10ml Formula-989閃爍液(New EnglandNuclear-DuPont)後，用Beckman計數器以計數效率62％測定放射性。
計算以抑制劑濃度10-8和10-6M時抑制E2結合的百分率報告結果。
選擇優選抑制劑的主要標準包括生物利用度、對3型3α-羥基類固醇脫氫酶和5型17β羥基類固醇脫氫酶的所需要的抑制作用、不需要的對2型17β羥基類固醇脫氫酶的抑制程度和抗雄激素活性。人們認為EM 01645和EM 01667以及類似化合物的5』位的甲基增強對5型17β-HSD抑制作用(相對於不需要的對2型的抑制作用)的選擇性。人們還認為3位的游離羥基與2位取代具有同樣有益的作用。
本申請人測試了廣泛化合物作為3型3α-HSD抑制劑的效果。根據本實驗室工作，我們認為本文所述的一些分子結構特徵為本發明的類固醇化合物提供了有益的特徵。例如我們認為芳香A環和為羥基或常見的在體內轉化為羥基的前體藥物基團的3位部分是使得當同時在2位和/或4位適當取代時對3型3α-HSD具有良好抑制作用的特徵。2和/或4位的取代基優選獨立選自氫、氰基、氟基、氯基、溴基和硝基(前提是2和4位取代基不能同時為氫)。在2位具有良好作用的取代基往往在4位也具有良好作用，反之亦然。從產生的角度來看同時在2和4位進行相同的取代更容易，而且我們測試的該型化合物往往為3型3α-HSD的良好抑制劑。
本申請人還發現當具有D-環取代基時，例如類固醇核16或17位的本文所述取代基，3型3α-HSD抑制劑具有更好的選擇性。選擇性是指優選的D-環取代基、尤其是17位的所述取代基往往抑制本發明抑制劑和例如不需要抑制的酶或不需要激活的受體之間的相互作用。測試的某些參數(均為需要和不需要的)見本文中其表號後面具有撇號(』)的表格。(另外參見所述表格下面的詳細解釋)。從表中看出，本發明的優選化合物有效抑制3型3α-HSD活性同時基本上避免了本申請人對相同化合物測試的許多不需要活性。例如合適的D-環取代基往往減少不需要的雄激素或雌激素活性。我們發現17-螺-內酯和17α-苄基取代基對3型3α-HSD提供良好的選擇性。並不是要求保護本文所討論的所有3型3α-HSD化合物，因為其中部分化合物還對5型17β-HSD具有良好的活性，而它們在本申請人另外針對這種獨立活性的專利申請中要求保護。「體外」抑制3型3α-HSD使4-雄甾烯二酮(4-二酮)轉化為睪丸激素(T)利用抑制DHT轉化為雄甾烷-3α，17β-二醇，初步確定對3型3α-HSD的抑制作用，如在上文的「II-1、2、3和5型17β-HSD以及1和3型3α-HSD的酶測定」所述並報告於表1和2的第2欄。為了完成該數據，某些優選抑制劑對3型3α-HSD將4-雄甾烯二酮(4-二酮)轉化為睪丸激素(T)的抑制作用在表3和4中報告。
3型3α-HSD將4-雄甾烯二酮(4-二酮)轉化為睪丸激素(T)的酶測定酶來源純化在大腸桿菌中表達完成的人3型3α-HSD。通過PCR擴增人3型3α-HSD的編碼區，並插入pGEX-1λT(Amersham Pharmacia Biotech，Inc.，Québec，加拿大)載體中，以產生與穀胱甘肽-S-轉移酶的融合蛋白。3型3α-HSD在大腸桿菌表達完成，經穀胱甘肽-瓊脂糖4B親和柱(Amersham Pharmacia Biotech)純化，按生產商所述用凝血酶裂解融合蛋白。
孵育在終體積為1ml的50mM磷酸鈉緩衝液(pH7.5)、20％甘油、1mMEDTA和0.1μM[14C]-標記類固醇和1 mM NADPH中孵育純化酶。孵育2小時後，用1ml乙醚萃取所述類固醇兩次。合併有機相併蒸發至幹。將所述類固醇溶解於50μl二氯甲烷，上樣於矽膠60 TLC板(Merck，Darmstad，Germany)，然後用甲苯-丙酮(4∶1)溶劑系統展開分離。通過與參比類固醇比較鑑定底物和代謝產物，通過放射性自顯影顯示，用Phosphoimager System(Molecular Dynamics，Sunnyval，CA)定量。
表3
見表1的結構表4
在上述表格的化合物中最優選化合物的分子結構如下
優選抑制劑的合成實施例本文中的IR譜用Perkin-Elmer 1600系列FT-IR分光光度計獲得。質子NMR譜用Brucker AC-F 300儀器記錄獲得。使用以下縮小s，單峰；d，雙峰；dd，兩個雙峰；t，三重峰；q，四重峰；和m，多重峰。參照氯仿(對於1H為7.26ppm，對於13C為77.00ppm)的化學位移(δ)，並以ppm表示。用Jasco DIP 360旋光計在室溫下測定旋光度。質譜(MS)用V.G.Micromass 16F機器獲得。薄層層析(TLC)在0.25mm Kieselgel 60F254板(E.Merck，Darmstadt，FRG)上進行。對於快速層析使用Merck-Kieselgel 60(230-400目A.S.T.M.)。除非另有說明，原料和反應物在市面購買獲得，直接使用或用標準方法純化後使用。所有純化乾燥的溶劑和反應物均保藏於氬氣下。在惰性環境即氬氣下調定裝配的冷卻環境下進行無水反應。有機溶液經硫酸鎂乾燥，經旋轉蒸發器減壓蒸發。原料和試劑獲自Aldrich Chemical Company，Inc.(Milwaukee，Wisconsin)。縮寫一覽表DHP 3，4-二氫-2H-吡喃EDTA 乙二胺四乙酸HPLC 高壓液相層析PTSA 對甲苯磺酸THF 四氫呋喃THP 四氫吡喃TMS 四甲基甲矽烷基實施例1合成2-硝基-1，3，5(10)-雌三烯-17-螺-δ-內酯衍生物這些化合物的合成按流程1所述進行。
流程1 a.NaNO2，HNO3，AcOH b.TBDMSCL，咪唑 c.HCC(CH2)2OTHP，MeLi d.H2，Pd/CaCO3e.5％HCl，MeOH f.瓊斯試劑 g.LDA，Met實施例1A3-羥基-2-硝基-1，3，5(10)-雌三烯-17-酮(2a)該標題化合物的製備按Stubenrauch和Knuppen所述方法進行。該方法如下所述。
將雌酮(1，18.004g，66.6mmol)溶解於煮沸的醋酸(540mL)，並使其冷卻至50℃。由70％硝酸(4.5mL，70mmol)、水(10mL)和少量硝酸鈉晶體製備硝化混合物，溫熱到50℃並在攪拌下滴加至雌酮溶液中。在室溫下攪拌過夜後，經抽吸過濾黃色沉澱物，由92％醋酸水溶液重結晶。因此獲得為淺黃色固體的4-硝基衍生物(6.800g，32％)。IR(v)3227(OH)，2931，2864，1723(C＝O)，1626，1584，1523，1458，1404，1374，1295，1264，1245，1211，1169，1085，1062，1027，954，930，908，881，823，796，719，654，588，556，530，494cm-1；1H NMR(吡啶-d5)δ0.85(3H，s，18』-CH3)，2.85(2H，d，6』-CH2)，5.00(1H，s，OH)，7.11(1H，d，J＝8.7Hz，2』-CH)，7.26(1H，d，J＝8.7Hz，1』-CH)；13C NMR(吡啶-d5)δ13.8(C-18)，21.6(C-15)，24.4(C-11)，25.7(C-7)，26.2(C-12)，32.0(C-6)，35.9(C-16)，37.7(C-8)，44.0(C-14)，47.9(C-13)，50.1(C-9)，115.4(C-2)，128.4(C-1)，129.0(C-10)，131.8(C-5)，148.4(C-3)，219.2(C-17)。
減壓蒸發上述反應物濾液，用乙醇/水8.5∶1.5重結晶殘留物。獲得的棕色固體(7.854g)進一步經二氧化矽柱(乙酸乙酯/己烷，8-20％梯度)快速層析，獲得純淨化合物2a(6.284g，30％)的黃色固體。IR(n)3300(OH)，2933，2864，1737(C＝O)，1630，1562，1522，1480，1431，1372，1311，1252，1216，1146，1084，1054，1035，1008，905，832，762，722，662，600，520cm-1；1H NMR(吡啶-d5)δ0.85(3H，s，18』-CH3)，2.76(2H，d，6』-CH2)，4.99(1H，s，OH)，6.98(1H，s，4』-CH)，7.96(1H，s，1』-CH)；13CNMR(吡啶-d5)δ13.8(C-18)，21.7(C-15)，25.8(C-11)，26.1(C-7)，29.6(C-12)，31.9(C-6)，35.9(C-16)，37.8(C-8)，43.5(C-14)，47.9(C-13)，50.3(C-9)，119.8(C-4)，122.2(C-1)，132.8(C-10)，147.8(C-2)，152.6(C-3)，219.1(C-17)。
實施例1B3-(叔丁基二甲基甲矽烷氧基)-2-硝基-1，3，5(10)-雌三烯-17-酮(2b)將2-硝基-雌酮(2a，1.118g，3.55mmole)、咪唑(0.670g，9.84mmole)和TBDMSCl(0.781g，5.18mmole)的無水DMF(50mL)溶液在Ar(g)下攪拌過夜。然後將混合物傾入冰/水(80mL)上。過濾白色沉澱物，用水洗滌，然後真空乾燥獲得(2b)淺黃色粉末(1.447g，95％)。[a]D25+123.9°(c1.03，CHCl3)；IR(NaCl)2933，2860，1736(s，C＝O)，1617，1561，1518，1492，1408，1351，1291，1256，1054，909，832，790，697cm-1；1H NMRδ0.24(6H，s，Si(CH3)2)，0.92(3H，s，18-CH3)，1.01(9H，s，SiC(CH3)3)，1.40-1.78(6H，m)，1.90-2.35(5H，m)，2.37-2.60(2H，m)，2.90(2H，m，6-CH2)，6.67(1H，s，4-CH)，7.76(1H，s，1-CH)；13C NMRδ220.2，147.2，143.8，139.6，133.3，122.6，122.1，50.3，47.9，43.6，37.8，35.8，31.3，29.4，26.1，25.7，25.6，21.5，18.2，13.8，-4.4。實施例1C3-(叔丁基二甲基甲矽烷氧基)-17β-羥基2-硝基-17α-(4』-(2」-四氫-2」H-吡喃氧基)-丁炔基)-1，3，5(10)-雌三烯(3) 在四氫-2-(丁炔氧基)-2H-吡喃(1.71mL，10.91mmole)的無水THF(75mL)攪拌溶液中，於Ar(g)、35℃下滴加MeLi 1.4M的乙醚(7.80mL，10.92mmole)溶液。將溶液攪拌45分鐘，然後於-35℃加入酮2b(1.294g，3.01mmole)的無水THF(20mL)溶液。75分鐘後，向反應混合物中加入冰(20g)和飽和碳酸氫鈉水溶液(70mL)並用乙酸乙酯萃取水相。用鹽水洗滌合併的有機層，經硫酸鎂乾燥，過濾，然後真空濃縮。粗製品黃色油經二氧化矽(40g，2∶8乙酸乙酯/己烷)純化獲得黃色泡沫狀物的化合物3(1.617g，92％)。[a]D25-57.5°(c 0.72，CHCl3)；IR(NaCl)3423(寬峰，OH)，2936，2870，2366，1654，1630，1578，1560，1527，1481，1458，1438，1313，1268，1121，1080，1032，899，869，761，669cm-1；1H NMRδ0.23(6H，s，Si(CH3)2)，0.87(3H，s，18-CH3)，1.00(9H，s，SiC(CH3)3)，1.20-2.35(20H，m)，2.55(2H，t，J＝6.9Hz，CCCH2)，2.84(2H，m，6-CH2)，3.55(2H，m，鏈的CH2O)，3.85(2H，m，THP的CH2O)，4.65(1H，m，THP的CH)，6.65(1H，s，4-CH)，7.76(1H，s，1-CH)；13C NMRδ147.0，144.2，139.5，133.9，122.6，122.0，98.8，84.5，83.4，79.8，65.8，62.2，49.4，47.1，43.2，38.9，32.6，30.6，29.6，26.7，26.2，25.6，25.4，22.8，20.4，19.4，18.2，12.7，-4.4。實施例1D3-(叔丁基二甲基甲矽烷氧基)-17β-羥基-2-硝基-17α-(4』-(2」-四氫-2」H-吡喃氧基)-丁基)-1，3，5(10)-雌三烯(4) 將化合物3(2.00g，3.42mmol)和5％Pd/CaCO3(400mg)的無水甲醇(400mL)溶液在H2(g)環境(氣球)下攪拌1小時。然後將混合物通過C鹽過濾，旋轉蒸發濾液。殘餘物經矽膠(2∶8乙酸乙酯/己烷)純化獲得白色泡沫狀固體的化合物4(1.483g，74％)。[a]D25+31.3°(c 0.90，CHCl3)；IR(NaCl)3458(寬峰，OH)，2935，2860，1616，1563，1518(NO2)，1491，1408，1348(NO2)，1291，1256，1119，1070，1023，925，893，832，784，672cm-1；1H NMR δ0.23(6H，s，Si(CH3)2)，0.91(3H，s，18-CH3)，1.00(9H，s，SiC(CH3)3)，1.20-2.38(26H，m)，2.85(2H，m，6-CH2)，3.48(2H，m，鏈的CH2O)，3.83(2H，m，THP的CH2O)，4.59(1H，m，THP的CH)，6.65(1H，s，4-CH)，7.75(1H，s，1-CH)；13C NMRδ146.9，144.1，139.4，134.0，122.4，121.9，98.9，83.2，67.6，67.6，62.4，49.3，46.6，36.3，34.1，31.3，30.7，30.3，29.5，26.9，26.0，25.5，25.4，23.3，20.4，19.6，18.1，14.3，-4.4。實施例1E17α-(4』-羥基丁基)-3，17β-二羥基-2-硝基-1，3，5(10)-雌三烯(5)將化合物4(300mg，0.510mmol)的5％鹽酸的甲醇(10mL)溶液在室溫而且在氬氣下攪拌12小時。然後將反應混合物傾入碳酸氫鈉/冰上，減壓蒸發甲醇，用乙酸乙酯萃取水相，用鹽水洗滌合併的有機層，經硫酸鎂乾燥，過濾並蒸發至幹。獲得粗製品黃色泡沫狀物(198mg，100％)。經快速層析(用二氯甲烷裝柱，然後用乙酸乙酯/二氯甲烷2∶8，4∶6，1∶1，6∶4，9∶1洗脫)純化獲得黃色固體的化合物82(127.0mg，64％)。Rf0.21(8∶2乙酸乙酯/己烷)；M.p.184-6℃；[a]D26+58.8°(c 1.00，CHCl)；IR(v)3335，2934，2865，1735，1719 1654，1630，1576，1522，1479，1434，1373，1305，1266，1169，1112，1067，1033，1000，896，874，762，659cm-1；1H NMR δ0.90(3H，s)，3.69(2H，d，J＝5.7Hz)，6.84(1H，s)，7.98(1H，s)，10.42(1H，s)；13C NMRδ14.3，19.8，23.3，26.1，26.8，29.8，31.2，33.3，34.3，36.1，39.0，43.2，46.5，49.4，61.7，62.8，83.4，118.8，121.4，131.6，133.7，149.2，152.8。實施例1F2-硝基-1，3，5(10)-雌三烯-3-醇-17(R)-螺-2』-(6』-氧代)四氫吡喃(EM-1124)在0℃向化合物5(128mg，0.33mmole)的無水丙酮(25mL)的攪拌溶液中緩慢加入第一個1.1相當量的瓊斯試劑(1.25M，0.29mL，0.80mmol)。然後攪拌橙色溶液0.5小時，再後加入第二個相當量的瓊斯試劑。再攪拌黑色溶液0.5小時，再後用異丙醇猝滅(形成綠色沉澱物)。攪拌該混合物10分鐘。然後通過C鹽過濾，旋轉蒸發濾液。將殘餘物溶解於乙酸乙酯中，然後用飽和碳酸氫鈉水溶液、水、鹽水洗滌，乾燥(硫酸鎂)，過濾，旋轉蒸發。粗製品固體在二氧化矽(3∶7乙酸乙酯/己烷)上經快速層析純化獲得黃色固體的EM-1124(108mg，85％)。M.p.213℃；[a]25D+90.0°(c 0.70，CHCl3)；IR(NaCl)3198，2934，2876，2245，1720(s，C＝O，內酯)，1630，1577，1522，1480，1434，1378，1314，1267，1234，1199，1169，1151，1120，1070，1036，1024，992，914，851，759，732，662，585cm-1；1H NMRδ 1.02(3H，s，18-CH3)，1.20-2.23(16H，m)，2.25-2.65(3H，m)，2.90(2H，m，6-CH2)，6.85(1H，s，4-CH)，7.97(1H，s，1-CH)，10.41(1H，s，OH苯酚)；13C NMRδ171.9，152.8，148.9，133.3，131.7，121.5，118.9，93.0，48.8，47.1，43.1，38.4，33.9，31.6，29.7，29.4，27.9，26.8，25.8，23.4，15.8，14.2。實施例1G2-硝基-1，3，5(10)-雌三烯-3-醇-17(R)-螺-2』-(5』-甲基-6』-氧代)四氫吡喃(EM-1126，EM-1131) 如下製備LDA在-78℃、Ar(g)下，向二異丙胺(92μL，71mg，0.70mmol)的無水THF(5mL)攪拌溶液中加入n-BuLi(1.2M/己烷，580μL，0.68mmol)，然後於0℃攪拌該溶液25分鐘，再後冷卻至-78℃。加入EM-1124(66mg，0.17mmol)的無水THF(5mL)溶液，然後攪拌生成的深橙色溶液30分鐘。加入無水HMPA(2mL)，15分鐘後加入MeI(107μL，243mg，1.71mmol)。然後再攪拌所述溶液4小時。用飽和氯化銨水溶液猝滅反應並用乙酸乙酯萃取。用1M硫酸銅水溶液(4×)、水、1M亞硫酸鈉水溶液、鹽水洗滌有機相，乾燥(硫酸鎂)，過濾，然後旋轉蒸發獲得粗製固體(103mg)。在二氧化矽(1∶9→2∶8乙酸乙酯/己烷)上經快速層析純化首先獲得EM-1126(11mg，16％)，緊接著獲得EM-1131(34mg，34％)，兩者均為黃色固體。EM-1126M.p.204-6℃；[a]25D+73.4°(c 1.67，CHCl3)；IR v 3422(br，OH)，2937，2874，1725(vs，CO)，1630，1577，1525，1479，1458，1432，1378，1311，1269，1249，1205，1188，1150，1118，1088，1071，1007，990，934，896，760，731，668，585，495cm-1；1H NMRδ1.03(3H，s)，1.30(3H，d，J＝7.1Hz)，1.31-1.77(10H，m)，1.89-2.03(5H，m)，2.15(1H，td，J＝7.1Hz，J』＝5.0Hz)，2.30-2.50(2H，m)，2.90(2H，dd，J＝8.3Hz，J』＝4.9Hz)，6.85(1H，s)，7.98(1H，s)，10.43(1H，s，OH)；13C NMRδ174.8，152.9，149.0，133.4，131.7，121.5，118.9，93.4，48.7，47.1，43.1，38.5，36.2，34.6，31.6，29.7，28.6，26.9，25.9，25.2，23.4，17.4，14.4。EM-1131(EM-1126的5』-差向異構體，未測定真正構型)M.p.206-8℃；[a]25D+62.6°(c 0.68，CHCl3)；IR v 3422(br，OH)，3192，2934，2876，2858，2824，1721(vs，CO)，1631，1578，1522，1482，1458，1436，1377，1314，1271，1237，1204，1173，1120，1103，1082，1051，1019，1002，933，901，877，860，759，663，638，600，495cm-1；1H NMRδ1.01(3H，s)，1.24(3H，d，J＝7.0Hz)，1.31-1.80(10H，m)，1.89-2.20(6H，m)，2.35(1H，br s)，2.55(1H，六重峰，J＝7.5Hz)，2.89(2H，t，J＝5.2Hz)，6.84(1H，s)，7.96(1H，s)，10.41(H，s，OH)；13C NMRδ175.8，152.8，148.9，133.3，131.6，121.4，118.8，92.5，77.4，77.0，76.6，48.5，47.0，43.0，38.4，33.8，33.4，31.6，29.7，27.16，26.7，25.8，243，23.6，17.2，14.3。實施例1H2-硝基-1，3，5(10)-雌三烯-3-醇-17(R)-螺-2』-(5』，5』-二甲基-6』-氧代)四氫吡喃(EM-1125) 如下製備LDA在-78℃、Ar(g)下，向二異丙胺(206μL，159mg，1.57mmol)的無水THF(12 mL)攪拌溶液中加入n-BuLi(1.2M/己烷，1.28mL，1.53mmol)，然後於0℃攪拌該溶液20分鐘，再後冷卻至-78℃。加入EM-1126和EM-1131(153mg，0.38mmol)的無水THF(10mL)混合溶液，然後攪拌生成的深橙色溶液20分鐘。加入無水HMPA(4.7mL)，15分鐘後加入MeI(238μL，544mg，3.83mmol)。然後再攪拌所述溶液5分鐘，之後溫熱至-30℃，再攪拌1小時。用飽和氯化銨水溶液猝滅反應並用乙酸乙酯萃取。用鹽水(6×)、水、1M亞硫酸鈉水溶液、鹽水洗滌有機相，乾燥(硫酸鎂)，過濾，然後旋轉蒸發獲得粗製液體。在二氧化矽(1∶9→2∶8乙酸乙酯/己烷)上經快速層析純化獲得EM-1125(82mg，52％)的黃色固體。M.p.195-7℃；[a]25D+72.8°(c 1.61，CHCl3)；IR v 3421(br，OH)，3194，2954，2927，2873，1718(vs，CO)，1631，1578，1523，1476，1458，1438，1386，1312，1298，1271，1204，1151，1118，1059，1032，1016，931，898，872，855，758，663，595cm-1；1H NMRδ1.02(3H，s)，1.28(6H，s)，1.32-1.77(10H，m)，1.85-2.15(6H，m)，2.36(1H，br s)，2.89(2H，dd，J＝8.2Hz，J』＝4.9Hz)，6.85(1H，s)，7.97(1H，s)，10.42(1H，s，OH)；13C NMRδ177.7，152.8，149.0，133.3，131.7，121.5，118.9，93.4，48.6，47.1，43.1，38.5，37.8，34.7，31.6，31.5，29.7，27.7(4)，27.6(8)，26.7，25.9，25.5，23.3，14.4。
實施例2合成2-氰基-1，3，5(10)-雌三烯-30』-17(R)-螺-2』-(5』，5』-二甲基-6』-氧代)四氫吡喃(13)流程2 3-叔丁基二甲基甲矽烷氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17-酮(7)按照Pelletier等(Steroids 59536-547，1994)所述方法由雌酮(6)製備該醚。3-叔丁基二甲基甲矽烷氧基-17β-羥基-17α-{4』-(2」-四氫-2」H-吡喃基)丁炔-1』-基}-1，3，5(10)-雌三烯(8)於0℃向HC≡C(CH2)2OTHP(18.3mL，117mmol)的無水THF(600mL)溶液中滴加正丁基鋰(43.7mL，109mmol)，攪拌該混合物90分鐘。將混合物冷卻至-78℃，滴加TBDMS-雌酮7(15g，39mmol)的THF(500mL)溶液。然後使該反應混合物降至室溫，再攪拌15小時。蒸發溶劑至1/2體積，加入水200mL。用乙酸乙酯(3×200mL)萃取該混合物，用鹽水洗滌有機層，乾燥(硫酸鎂)並蒸發至幹。用己烷/乙酸乙酯(9/1)作為洗脫劑經矽膠柱層析純化殘餘物獲得15.1g(72％)所述產物；IR(NaCl cm-1)3432，2934，2858，1607，1495，1287，1256，1033，958，839；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.12(d，1H，J＝8.4Hz)，6.62(dd，1H，J＝2.4，8.4Hz)，6.54(d，1H，J＝2.2Hz)，4.66(br.s.，1H)，3.89-3.79(m，2H)，3.56-3.50(m，2H)，2.79(br.s.，2H)，2.56(t，2H，J＝7.0Hz)，2.35-2.17(m，3H)，2.07-1，23(m，17H)，0.98(s，9H)，0.87(s，3H，18-Me)，0.19(s，6H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ153.3，137.8，133.0，126.1，119.9，117.1，98.7，84.7，83.2，80.0，65.8，62.1，49.5，47.2，43.7，39.4，39.0，32.9，30.6，29.7，27.3，26.4，25.7，25.4，22.8，20.3，19.3，18.1，12.8，-4.4。3-叔丁基二甲基甲矽烷氧基17β-羥基-17α-{4』-(2」-四氫-2」H-吡喃基)丁炔-1』-基}-1，3，5(10)-雌三烯(9)在室溫下向鏈炔8(15.1g，28mmol)的乙酸乙酯(500mL)溶液中加入5％活性炭載鈀(1.5g，10％重量)。向燒瓶中充入氫氣3次(真空後充入氫氣)，然後在1個大氣壓的氫氣下攪拌。反應後進行TLC。3小時後，通過C鹽塞過濾該混合物，減壓去除溶劑。將粗產物直接用於下一步驟而不用再純化；IR(NaCl cm-1)3474，2935，2858，1607，1570，1496，1471，1286，1257，1156，1137，1119，1033，954，839，780；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.12(d，1H，J＝8.4Hz)，6.62(dd，1H，J＝2.1，8.4Hz)，6.55(s，1H)，4.59(br.s，1H)，3.92-3.73(m，2H)，3.55-3.38(m，2H)，2.82-2.77(m，2H)，2.30-1.33(m，26H)，0.97(s，9H)，0.90(s，3H，18-Me)，0.18(s，6H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ153.27，137.81，133.08，126.02，119.87，117.06，(98.90，98.84)，83.38，67.61，62.33，49.50，46.67，43.81，39.58，36.35，34.28，31.60，30.75，30.36，29.62，27.51，26.26，25.67，25.47，23.37，20.45，19.66，18.12，14.35，-4.43。3-叔丁基二甲基甲矽烷氧基17β-羥基-17α-(4』-羥基丁炔-1』-基)-1，3，5(10)-雌三烯(10)在THP醚9(15.1g，28mmol)的甲醇(400mL)溶液中加入對甲苯磺酸一水合物(150mg，0.8mmol)，攪拌反應5小時。加入飽和碳酸氫鈉水溶液(100mL)，在旋轉蒸發器中蒸發溶劑體積至一半。用二氯甲烷萃取該混合物，用鹽水洗滌有機相，乾燥(硫酸鎂)並蒸發至幹。將粗產物直接用於下一步驟而不需要進一步純化；IR(NaCl cm-1)3356，2931，2858，1608，1496，1471，1286，1256，954，839，780；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.12(d，1H，J＝8.5Hz)，6.61(dd，1H，J＝2.5，8.5Hz)，6.55(s，1H)，3.69(br.d，2H，J＝5.2Hz)，2.82-2.78(m，2H)，2.35-2.26(m，1H)，2.20-1.94(m，2H)，1.90-1.81(m，1H)，1.62-1.22(m，17H)，0.98(s，9H)，0.90(s，3H，18-Me)，0.19(s，6H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ153.27，137.81，133.05，126.02，119.89，117.09，83.59，62.56，49.50，46.69，48.81，39.58，35.98，34.32，33.20，31.61，29.62，27.51，26.26，25.68，23.37，19.74，18.14，14.36，-4.40。3-叔丁基二甲基甲矽烷氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17(R)-螺-2』-(6』-氧代)四氫吡喃(11) 於4℃，在二醇10(12.5g，27mmol)的丙酮(500mL)溶液中滴加2.7M瓊斯試劑(15.1mL，41mmol)溶液。攪拌反應物30分鐘。加入2-丙醇(100mL)，然後加入飽和碳酸氫鈉水溶液(200mL)。蒸發溶劑至1/2體積，用乙酸乙酯萃取該混合物。用鹽水洗滌有機相，乾燥(硫酸鎂)並減壓濃縮。用己烷/丙酮(6/1)經矽膠柱層析純化殘留物，獲得8.6g內酯。(3步驟的得率為68％)；IR(NaCl，cm-1)2960，2930，2857，1732，1607，1496，1284，1264，1244，1037，958，840；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.11(d，1H，J＝8.4Hz)，6.61(dd，1H，J＝2.3，8.4Hz)，6.56(s，1H)，2.85-2.79(m，2H)，258-2.39(m，2H)，2.38-2.25(m，1H)，2.21-2.10(m，1H)，2.03-1.27(m，15H)，1.02(s，3H，18-Me)，0.97(s，9H)，0.18(s，6H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ172.00，153.36，137.63，132.62，126.02，119.92，117.19，93.25，48.88，47.26，43.68，39.05，33.98，31.96，29.50，29.48，27.94，27.46，25.98，25.67，23.48，18.12，15.87，14.30，-4.43。3-叔丁基二甲基甲矽烷氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17(R)-螺-2』-(5』，5』-二甲基-6』-氧代)四氫吡喃(12)在氬氣下的1L乾燥燒瓶中將內酯11(8.6g，19mmol)溶解於無水THF(300mL)中，並冷卻至0℃。滴加1MLiHMDS(47.3mL，47.3mmol)溶液。於0℃攪拌混合物15分鐘，冷卻至-78℃，然後加入甲基碘(5.9mL，79mmol)。在此溫度下攪拌反應物1小時，然後在2小時內使其溫熱至室溫。加入氯化銨(200mL)飽和水溶液，用乙酸乙酯萃取混合物。用亞硫酸鈉飽和水溶液、鹽水洗滌有機層，乾燥(硫酸鎂)，減壓濃縮。用己烷/丙酮(5/1)作為洗脫劑通過柱層析純化殘餘物，獲得7.4g(81％)二甲基化合物；IR(NaCl，cm-1)2954，2930，2858，1725，1496，1287，1258，1150，1137，956，840；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.11(d，1H，J＝8.5Hz)，6.62(dd，1H，J＝2.4，8.5Hz)，6.55(d，1H，J＝2.1Hz)，2.81-2.78(m，2H)，2.36-2.28(m，1H)，2.20-1.38(m，，16H)，1.28(s，3H)，1.27(s，3H)，1.02(s，3H，18-Me)，0.97(s，9H)，0.18(s，6H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ177.79，153.33，137.62，132.62，132.62，125.99，119.90，117.14，93.66，48.67，47.24，43.65，39.06，37.74，34.79，31.96，31.56，29.50，27.73，27.61，27.42，26.01，25.65，25.55，23.26，18.11，14.42，-4.43。1，3，5(10)-雌三烯-3-醇-17(R)-螺-2』-(5』，5』-二甲基-6』-氧代)四氫吡喃(13)於0℃，在甲矽烷基醚12(7.1g，14.7mmol)的THF(300mL)溶液中滴加1M TBAF(17.6mL，17.6mmol)溶液，攪拌所述反應物15分鐘。加入冰水(200mL)沉澱所述化合物。將燒瓶置於旋轉蒸發器上減少THF體積，然後將其置於冰浴上。過濾收集沉澱物，用冷水洗滌，在烘箱(30℃)中乾燥24小時，獲得5.4g(100％)3-OH化合物；IR(NaCl，cm-1)3357，2932，2871，1695，1287，1158；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.14(d，1H，J＝8.4Hz)，6.63(dd，1H，J＝2.6，8.4Hz)，6.55(d，1H，J＝2.6Hz)，4.62(br.s.，1H，OH)，2.81-2.79(m，2H)，2.38-2.29(m，1H)，2.20-1.81(m，5H)，1.76-1.31(m，11H)，1.29(s，3H)，1.28(s，3H)，1.01(s，3H，18-Me)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ178.06，153.52，138.08，132.19，126.42，115.26，112.74，93.80，48.69，47.29，43.65，39.14，37.81，34.84，31.98，31.61，29.53，27.76，27.64，27.39，26.12，25.59，23.29，14.43。
實施例3合成EM-01667流程3 3-羥基-2-苯基亞硒基(selenenyl)-雌-1，3，5(10)-三烯-17(R)-螺-2』-(5』，5』-二甲基-6』-氧代)四氫吡喃(14)在Ar(g)下將3-羥基-雌-1，3，5(10)-三烯-17(R)-螺-2』-(5』，5』-二甲基-6』-氧代)四氫吡喃(406mg，1.10mmol)(13)和苯基亞硒醯氯(253mg，1.32mmol)的無水三氯甲烷(24mL)溶液在0℃下攪拌1小時，然後在室溫下過夜。將生成的黃色溶液傾入冰/水中，然後用二氯甲烷(3×)萃取。乾燥合併的有機相(棉塞)，然後旋轉蒸發獲得粗製泡狀物固體。用1∶9乙酸乙酯/己烷作為洗脫劑通過快速層析(二氧化矽)純化獲得7(353mg，61％)和4-異構體(86mg，15％)。化合物7[a]25D+77.7°(c 1.14，CHCl3)；IR v 3366，3050，2965，2928，2869，1709，1603，1576，1550，1458，1438，1384，1349，1310，1294，1262，1202，1157，1141，1114，1065，1017，984，892，845，736，689，665，593，555，498，460cm-1；1H NMR(CDCl3)δ1.02(3H，s)，1.27(9)(s，3H)，1.28(4)(s，3H)，1.27-1.80(11H，m)，1.88-2.28(6H，m)，2.87(2H，t，J＝4.8Hz)，6.24(1H，s，OH)，6.80(1H，s)，7.21(5H，br s)，7.52(5H，s)ppm；13C NMR(CDCl3)δ14.4，23.3，25.5，26.1，27.2，27.6，27.7，29.5，31.5，31.8，34.7，37.7，38.9，43.4，47.2，48.6，93.6，111.6，114.7，126.5，129.2(6)，129.3(4)，131.2，133.3，134.7，141.4，154.4，177.8ppm。2-氯-3-羥基-雌-1，3，5(10)-三烯-17(R)-螺-2』-(5』，5』-二甲基-6』-氧代)四氫吡喃(EM-01667)在Ar(g)、0℃下，將14(116mg，0.22mmol)和N-氯琥珀醯胺(44mg，0.33mmol)的無水三氯甲烷(15mL)溶液攪拌30分鐘。將所述溶液傾倒在冰/水上，然後用二氯甲烷(3×)萃取。乾燥(棉塞)合併的有機相後，旋轉蒸發獲得粗製固體。用1∶29→1∶19乙酸乙酯/甲苯作為洗脫劑經快速層析(二氧化矽)純化獲得EM-01667(51mg，57％)，為白色固體。Rf0.28(3∶7乙酸乙酯/己烷)；m.p.241℃；[a]25D+62.6°(c 1.09，CDCl3)；IR(v)3253(br.，OH)，2936，2873，1685(CO)，1608，1501，1458，1418，1388，1314，1300，1263，1223，1160，1016，987，884，844，737，673，598cm-1；1H NMR(CDCl3)δ1.01(3H，s)，1.28(6H，s)，1.25-1.75(11H，m)，1.85-2.28(6H，m)，2.80(2H，dd，J』＝8.7Hz，J」＝3.9Hz)，5.33(1H，br s，OH)，6.73(1H，s)，7.19(1H，s)ppm；13CNMR(CDCl3)(δ)14.4，23.3，25.6，26.1，27.2，27.7，27.8，29.0，31.6，31.8，34.8，37.8，38.8，43.4，47.2，48.6，93.6，116.0，117.1，125.6，133.5，137.1，149.0，177.8ppm。
實施例4合成EM-01728流程4 17-苄基-1，3，5(10)雌三烯-3，17β-二醇(15)在Ar(g)、0℃下，在雌酮(5.0g，18.5mmol)的無水THF(200mL)溶液中加入苯基氯化鎂(2 M的THF，65mL)並攪拌該溶液過夜。於0℃加入氯化銨飽和水溶液並用二氯甲烷萃取(3次)，用鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥，過濾，然後蒸發。所述產物經快速層析(RP-C18，30∶30∶40-10∶30∶60，水/甲醇/CH3CN)獲得為白色固體的1(4.0g，60％)和雌酮(1.5g，30％回收率)。化合物1Rf0.25(2∶98，甲醇/二氯甲烷)；IR(v)3284，2926，2856，1725，1686，1655，1606，1561，1499，1439，1378，1343，1321，1286，1252，1221，1156，1082，1029，1016，930，915，888，872，820，786，732，700，646，586 cm-1；1H NMR(CD3OD)(δ)0.94(3H，s，H18)，1.32-2.35(13H，m)，2.67(1H，d，J＝13.5Hz，CH-Ph)，2.78(2H，m，H6)，2.87(1H，d，J＝13.5Hz，CH-Ph)，6.49(1H，d，J＝2.4Hz，H4)，6.56(1H，dd，J＝8.3Hz，J』＝2.5Hz，H2)，7.10(1H，d，J＝8.3Hz，H1)，7.18-7.30(5H，m，Ph)ppm；13C NMR(CD3OD)(δ)15.3，24.1，27.7，28.8，30.8，32.4，32.8，41.4，43.6，45.2，50.9，84.5，113.7，116.1，126.9，127.2，128.7，132.3，136.6，138.8，140.3，155.9ppm。17-苄基-2-苯基亞硒基(selenyl)-1，3，5(10)雌三烯-3，17β-二醇(16)於0℃下在1(508mg，1.40mmol)的甲醇/三氯甲烷(1∶10，33mL)攪拌溶液中加入PhSeCl(322mg，1.68mmol)。2小時後，橙色溶液變為黃色溶液，將其傾倒在冰/水上，用二氯甲烷萃取，乾燥(硫酸鎂)，過濾，然後蒸發。粗製固體經快速層析(二氧化矽，1∶29乙酸乙酯/甲苯)獲得為淡棕色固體的2(456mg，63％)和4-苯基亞硒基異構體(71mg，10％)。化合物21H NMR(δ)1.00(3H，s，H18)，1.30-2.38(14H，m)，2.82(2H，dd，J＝78.1Hz，J』＝13.2Hz，CH2-Ph)，2.90-2.93(2H，m，H6)，6.26(1H，br s，OH)，6.85(1H，s，H1)，7.21-7.38(10H，m)，7.59(1H，s，H4)；13C NMR(δ)14.5，23.4，26.4，27.4，29.7，31.3，33.7，39.4，42.4，43.7，46.7，49.5，82.9，111.5，114.7，126.3，126.5，128.1，129.2，129.3，131.0，131.3，133.7，134.8，138.2，141.6，154.4ppm。17-苄基-2-氯-1，3，5(10)雌三烯-3，17β-二醇(EM-01728)於0℃、A(r)g下在2(155mg，0.30mmol)的三氯甲烷(15mL)攪拌溶液中加入N-氯琥珀醯胺(48mg，0.36mmol)。1小時後，與化合物2一樣處理反應物，並經快速層析(二氧化矽，1∶29→1∶19乙酸乙酯/甲苯)純化獲得白色固體(74mg，62％)的EM-01728。Rf 0.18(1∶19乙酸乙酯/甲苯)；M.p.220℃；[a]25D+74.8°(c 0.96，丙酮-d6)；IR(v)3544(OH)，3284(br，OH)，3023，2931，2849，1601，1497，1454，1338，1285，1257，1201，1084，1015，979，918，885，796，755，702，675，642，560，532，504cm-1；1H NMR(CD3OH)(δ)0.95(3H，s，H18)，1.33-1.75(15H，m)，2.68(1H，d，J＝15.5Hz，CH-Ph)，2.76(1H，dd，J＝8.3Hz，J』＝3.6Hz，H6)，2.88(1H，d，J＝15.5Hz，CH-Ph)，6.60(1H，s，H4)，7.16(1H，s，H1)，7.17-7.31(5H，m，Ph)ppm；13C NMR(丙酮-d6)(δ)15.2，24.0，27.3，28.3，29.9，32.1，33.5，40.7，43.5，44.6，48.0，50.3，83.6，117.5，118.3，126.6，127.5，128.5，132.2，134.2，137.8，140.6，151.3ppm。
實施例5合成EM-01831和EM-01832流程5 16，16-二甲基-3-甲氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17-酮(17)於Ar(g)、室溫下在3-甲氧基-雌-1，3，5(10)三烯-17-酮(10.00g，35mmol)的無水THF(500mL)中加入NaH(60％的油，2.55g，105mmol)和碘甲烷(22mL，350mmol)。將溶液回流過夜。然後加入更多的NaH(2.55g，105mmol)和碘甲烷(22mL，350mol)，再將所述溶液回流24小時。用乙醇(100mL)，然後用冰水(300mL)驟冷獲得的溶液。用乙酸乙酯(2×300mL)萃取該溶液，用鹽水洗滌(2×300mL)，經硫酸鎂乾燥，減壓蒸發獲得黃色固體。用乙酸乙酯/己烷(1∶19)作為洗脫劑在矽膠上經快速層析純化，獲得3(10.19g，93％)，為白色固體。IR(v)2933，2869，1731(CO)，1609，1502，1467，1382，1315，1258，1240，1153，1037，1020，902，850，816，781cm-1；1H NMR(δ)0.94(3H，s，H18)，1.09(3H，s，16-Me)，1.22(3H，s，16-Me)，1.40-2.42(11H，m)，2.90(2H，dd，J＝8.0Hz，J』＝3.3Hz，H6)，3.79(3H，s，OMe)，6.65(1H，d，J＝2.7Hz，H4)，6.73(1H，dd，J＝8.4Hz，J』＝2.7Hz，H2)，7.21(1H，d，J＝8.5Hz，H1)ppm；13CNMR(δ)14.4，25.8，26.0，26.7，27.3，29.7，32.3，37.6，37.9，44.2，45.3，47.2，49.0，55.2，111.5，113.9，126.3，132.2，137.7，157.6，225.1ppm。16，16-二甲基-1，3，5(10)-雌三烯-3-醇-17-酮(18)將3-甲氧基-雌-1，3，5(10)三烯-17-酮-16-二甲基即17(6.00g，19mmol)和碘代三甲基矽烷(27mL，190mmol)的無水二氯甲烷(1000mL)溶液在At(g)下回流過夜。將生成的溶液傾倒在冰/水(600mL)上，用二氯甲烷(3×600mL)萃取，經硫酸鎂乾燥，過濾，然後減壓蒸發。用乙酸乙酯/甲苯(1∶9)作為洗脫劑在矽膠上通過快速層析純化粗製的棕色固體，獲得白色固體4(3.50g，62％)。IR(v)3361(br.s.，OH)，3027，2923，2876，1860(w)，1717(CO)，1620，1584，1499，1460，1355，1286，1248，1152，1099，1023，909，875，816，787，735，647，571，516cm-1；1HNMR(δ)0.91(3H，s，H18)，1.06(3H，s，16-Me)，1.18(3H，s，16-Me)，1.23-2.35(11H，m)，2.81(2H，t，J＝4.5Hz，H6)，6.56(1H，d，J＝2.3Hz，H4)，6.62(1H，dd，J＝8.5Hz，J』＝2.6Hz，H2)，7.09(1H，d，J＝8.4Hz，H1)ppm；13C NMR(δ)14.4，25.7，25.8，26.6，27.1，29.4，32.2，37.5，37.8，44.0，45.3，47.1，49.1，112.7，115.2，126.2，131.3，137.7，154.2，226.3ppm。16，16-二甲基-2-苯基亞硒基-1，3，5(10)-雌三烯-3-醇-17-酮(19)於0℃在18(2.00g，6.70mmol)的甲醇/三氯甲烷(1∶10，550mL)攪拌溶液中加入PhSeCl(1.56g，8.15mmol)。在室溫下攪拌該反應混合物過夜。然後將生成的黃色溶液傾倒到冰/水(500mL)中，用二氯甲烷(2×500mL)萃取，經硫酸鎂乾燥，過濾，然後減壓蒸發。用乙酸乙酯/甲苯(0.3∶9.7)在矽膠上通過快速層析純化產物，獲得白色泡沫狀物的5(2.44g，80％)和2-氯異構體(100mg，5％)。化合物51H NMR(δ)0.94(3H，s，H18)，1.08(3H，s，16-Me)，1.21(3H，s，16-Me)，1.24-2.36(11H，m)，2.92(2H，dd，J＝8.4Hz，J』＝3.6Hz，H6)，6.21(1H，s，OH)，6.82(1H，s，H4)，7.17-7.23(5H，m，Ph)，7.54(1H，s，H1)ppm。2-氯-16，16-二甲基-1，3，5(10)-雌三烯-3-醇-17-酮(EM-01831)在室溫以及Ar(g)下，在5(680mg，1.50mmol)的無水三氯甲烷(200mL)的攪拌溶液中加入N-氯琥珀醯胺(246mg，1.84mmol)。然後於-30℃攪拌該混合物1小時。用飽和氯化銨水溶液(300mL)猝滅反應，用二氯甲烷(2×300mL)萃取，經硫酸鈉乾燥，過濾，然後減壓蒸發。用甲醇/乙酸乙酯/己烷(0.5∶1∶9)作為洗脫劑通過快速層析純化粗產物，獲得黃色固體EM-01831(178mg，33％)。IR(v)3321(br，s，OH)，2922，2853，1724(CO)，1606，1502，1468，1414，1380，1340，1260，1215，1019，885，830，738，673，626cm-1；1H NMR(δ)0.93(3H，s，H18)，1.08(3H，s，16-Me)，1.21(3H，s，16-Me)，1.26-1.35(11H，m)，2.84(2H，dd，J＝9.0，J』＝4.3Hz，H6)，5.33(1H，s，OH)，6.75(1H，s，H4)，7.20(1H，s，H1)ppm；13C NMR(δ)14.4，25.7，26.0，26.5，27.3，29.0，32.2，37.5，37.6，43.9，45.3，47.1，49.0，116.0，117.2，125.7，133.4，137.0，149.1，225.0ppm。2-氯-16，16-二甲基-1，3，5(10)-雌三烯-3，17β-二醇(EM-01832)在-78℃、Ar(g)下向EM-01831(200mg，0.60mmol)的無水THF(20mL)的攪拌溶液中加入LiAlH4(33mg，0.86mmol)。在24小時內使反應物溫度緩慢地回升至室溫。使反應物冷卻至0℃，加入更多的LiAlH4(23mg，0.60mmol)，再攪拌混合物2小時。用1M羅謝爾鹽水溶液(50mL)驟冷反應混合物，然後用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。用鹽水(50mL)洗滌有機層，經硫酸鎂乾燥，過濾，然後減壓蒸發。用乙酸乙酯/甲苯(1∶19)作為洗脫劑在矽膠上經快速層析純化純化產物，獲得白色固體EM-01832(145mg，72％)。IR(v)3557(s，OH)，3388(s，OH)，3186(br，s，OH)，2921，2861，1602，1576，1486，1454，1430，1409，1382，1344，1256，1207，1128，1069，1029，981，880，798，733，677，584，534cm-1；1H NMR(δ)0.81(3H，s，H18)，1.01(3H，s，16-Me)，1.06(3H，s，16-Me)，1.24-2.20(11H，m)，2.74(2H，dd，J＝8.4Hz，J』＝3.7Hz)，3.23(1H，s，H17)，6.59(1H，s，H4)，7.13(1H，s，H1)ppm；13C NMR(δ)11.5，25.3，26.2，27.2，29.1，32.3，37.7，37.9，39.0，41.2，43.8，45.4，46.8，89.8，115.9，117.0，125.7，134.0，137.3，148.9ppm。
實施例52-氰基-1，3，5(10)-雌三烯-17-螺-(二甲基-δ-內酯)的3-羥基衍生物流程5 實施例5A2-甲醯基-1，3，5(10)-雌三烯-3-醇-17(R)-螺-2』-(5』，5』-二甲基-6』-氧代)四氫吡喃(20)將內酯13(1.0g，2.72mmol)在氬氣氛下溶解於無水1，2-二氯乙烷(9mL)中。連續加入SnCl4(0.16mL，1.37mmol)和Bu3N(0.52mL，2.18mmol)。在室溫下攪拌該混合物20分鐘。加入甲醛(0.23g，7.84mmol)，並在回流下攪拌該混合物6小時。將反應混合物傾倒入酸水溶液(pH＝2)中，用二氯甲烷萃取。用鹽水溶液洗滌有機層，乾燥(硫酸鈉)，過濾，真空濃縮。用(95∶5-80∶20)己烷-丙酮洗脫，在矽膠上經快速層析純化粗產物，獲得0.74g(69％)所述產物；IR(NaCl，cm-1)3164，2937，2872，1716，1652，1571，1487，1466，1386，1298，1152，1017，914，731；1H NMR(CDCl3)1.00(s，3H)，1.26(s，6H)，1.23-2.40(m，17H)，2.80-2.90(m，2H)，6.66(s，1H)，7.39(s，1H)，9.79(s，1H)，10.77(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ14.3，23.2，25.4，25.9，26.8，27.6，27.7，30.0，31.4，31.6，34.6，37.7，38.6，42.9，47.0，48.5，93.4，116.9，118.9，130.3，132.2，147.8，159.2，177.7，196.0。實施例5B2-羥亞氨基-1，3，5(10)-雌三烯-3-醇-17(R)-螺-2』-(5』，5』-二甲基-6』-氧代)四氫吡喃(21)在氬氣氛下，將化合物20(215mg，0.54mmol)的無水乙醇-吡啶1-1(4mL)溶液用羥基胺鹽酸鹽(56.6mg，0.814mmol)處理並在室溫下攪拌25分鐘。蒸發該反應混合物，用水稀釋，用二氯甲烷萃取3次。用鹽水洗滌合併的有機相，經硫酸鈉乾燥，過濾，蒸發獲得肟113(217mg，98％)；1H NMR(300MHz，CDCl3)1.02(s，3H)，1.29(s，6H)，1.43-1.70(m，10H)，1.89-2.12(m，6H)，2.22-2.37(m，1H)，2.80-2.87(m，2H)，6.69(s，1H)，7.05(s，1H)，8 15(寬峰，s，1H)，8.20(s，1H)，9.61(s，1H)。實施例5C3-乙醯氧基-2-氰基-1，3，5(10)-雌三烯-17(R)-螺-2』-(5』，5』-二甲基-6』-氧代)四氫吡喃(22a)將化合物21(180mg，0.44mmol)和乙酸酐(125μl，1.32mmol)的吡啶(3.5mL)溶液回流1小時。蒸發該反應混合物，用二氯甲烷稀釋並水洗滌3次、用飽和碳酸氫鈉洗滌1次以及用鹽水洗滌1次。有機相經硫酸鎂乾燥，過濾並蒸發。通過快速層析(二氯甲烷到二氯甲烷-乙酸乙酯19-1)純化粗混合物，獲得乙酸酯22a(145mg，76％)IR(CHCl3)2933，2872，2229，1773，1718，1613，1494，1183cm-1；1HNMR(300MHz，CDCl3)δ1.02(s，3H)，1.28(s，6H)，1.34-1.89(m，11H)，1.94-2.33(m，6H)，2.37(s，3H)，2.89-2.94(m，2H)，6.95(s，1H)，7.55(s，1H)。實施例5D2-氰基-1，3，5(10)-雌三烯-3-醇-17(R)-螺-2』-(5』，5』-二甲基-6』-氧代)四氫吡喃(22b)用10％碳酸鉀(0.5mL)處理化合物22a(60mg，0.14mmol)的甲醇(5mL)溶液，並攪拌30分鐘。用1N鹽酸酸化該反應混合物至pH2，用二氯甲烷萃取3次。用水、飽和碳酸氫鈉和鹽水洗滌合併的有機相，經硫酸鎂乾燥，過濾，蒸發。在乙醇水溶液中重結晶粗混合物，獲得所述酚22b(28mg，52％)。IR(CDCl3)3334，2932，2868，1692，1312，1206，1159cm-1；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.97(s，3H)，1.29(s，6H)，1.26-2.14(m，16H)，2.21-2.28(m，1H)，2.82-2.86(m，2H)，6.69(s，1H)，6.91(s，1H)，7.35(s，1H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ 14.41，23.30，25.62，26.92，27.69，27.78，29.84，31.62，31.79，34.82，37.84，38.70，43.18，47.23，48.67，93.52，97.01，116.29，116.69，129.44，133.69，144.86，155.73，177.88。實施例5E3-烷氧基-2-氰基-1，3，5(10)-雌三烯-17(R)-螺-2』-(5』，5』-二甲基-6』-氧代)四氫吡喃(22c)在氬氣氛下將化合物22b、烷基碘(5 equiv)和碳酸銫(1.5equiv)的無水乙腈(1％W/V)懸浮液攪拌16小時，必要時回流。用鹽水驟冷反應混合物並用二氯甲烷萃取3次。用鹽水洗滌合併的有機相，經硫酸鎂乾燥，過濾，蒸發。通過快速層析(二氯甲烷到二氯甲烷-乙酸乙酯10-1)和重結晶(甲醇)純化粗混合物，獲得化合物22c(例如EM-1396，R＝(CH2)2OCH3，75％)IR(CDCl3)3013，2941，2881，2229，1710，1610，1500，1304，1136cm-1；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.01(s，3H)，1.28(s，6H)，1.20-1.75(m，10H)，1.80-2.20(m，6H)，2.20-2.35(m，3H)，2.80-2.95(m，2H)，3.47(s，3H)，3.79(t，J＝4.8Hz，2H)，4.17(t，J＝4.8Hz，2H)，6.67(s，1H)，7.44(s，1H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ14.41，23.25，25.58，25.90，26.96，27.66，27.74，30.24，31.59，31.78，34.79，37.80，38.68，43.16，47.20，48.60，59.55，68.78，70.71，93.43，99.55，112.80，116.98，130.72，133.31，144.09，158.29，177.70。實施例6
藥用組合物實施例以下所述的是利用優選的活性化合物EM-2330(3型3α-HSD抑制劑)的幾種藥用組合物，這僅僅是舉例說明而不是限制本發明。本發明的其它化合物或其組合物可代替(或除此之外)EM-02318和EM-02200。活性成分的濃度可以與本文所述的優選劑量的寬範圍一致，而且取決於優選的給藥頻度。其中可使用的其它成分的數量和類型是本領域周知的。
實施例A適用於注射的組合物
實施例B適宜用作局部應用洗劑的組合物
實施例C適宜用作局部應用凝膠的組合物
實施例D片劑
實施例E明膠膠囊
實施例F適宜用作局部應用凝膠的組合物
其它3型3α-羥基類固醇脫氫酶的抑制劑可替代上述製劑中的EM-2330。在某些實施方案中，可以同時包含兩種或多種3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑，(或一種3型3α-HSD抑制劑加上一種5型17β-HSD抑制劑)，在此情況下兩種抑制劑的總重量百分比優選2倍於以上單獨使用EM-2330的實施例所述的劑量，同時相應減少最主要賦形劑(例如水、乳糖、乙醇等)的重量百分比。其它本文優選組合的活性成分可以相似的方式加入。
用優選實施方案和實施例描述了本發明，但是本發明不受其限制。本領域技術人員容易了解只受限於本文權利要求書的更廣泛的本發明適用性和範圍。
權利要求
1.在需要這種抑制作用的患者抑制4-雄甾烯-3，17-二酮轉化為睪丸激素或抑制5α-雄甾烷-3，17-二酮轉化為二氫睪丸激素的方法，它包括給予所述患者有效治療量的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑。
2.權利要求1的方法，它還包括給予5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑。
3.抑制人3型3α-羥基類固醇脫氫酶活性的方法，它包括給予需要這種治療的患者治療有效量的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑，該抑制劑具有以下分子結構 其中所述虛線為任選π鍵；其中R3為選自以下的部分C1-C20烷氧基、C1-C10醯氧基、C1-C20烷氧基羰氧基、C1-C20烷氧基烷氧基、羥基、(N-烷基或-H)氨基甲酸酯和體內轉化為羥基的部分；其中R2和R4獨立選自氫、氰基、氟基、氯基、溴基和硝基(其中R2和R4不能同時為氫)。其中R17α選自氫、選自以下的基團取代的C2-C14碳部分氫、滷素、羧基、醯氨基、C1-C3烷氧基和C1-C5烷基，或者R17α和R17β一起構成C5-C7內酯環或為羰基氧；其中R17β為羥基醯氧基、烷氧基、鏈烯氧基、(N-烷基或H)醯氨基；或R17α和R17β一起構成C5-C7內酯環或為羰基氧；其中R16α和R16β獨立選自氫、低級烷基和苄基，或R16α和R16β一起構成C5-C6環烯。
4.權利要求3的方法，其中所述人3型3α-羥基類固醇脫氫酶的抑制劑具有以下分子結構 其中n為1-2的整數；其中所述虛線為獨立的任選π鍵；其中X和Y獨立選自-H、(C1-C3)烷基和(C2-C3)鏈烯基。
5.權利要求4的方法，其中R3為羥基。
6.權利要求4的方法，其中X或Y至少有一個為甲基。
7.權利要求4的方法，其中X和Y均為甲基。
8.權利要求4的方法，其中R2為氯或氰基。
9.權利要求3的方法，其中所述人3型3α-羥基類固醇脫氫酶的抑制劑具有以下分子結構 其中或者i)R17β為羥基，R17α為選自以下的基團取代的C2-C14碳部分氫滷素、羧基、醯氨基、C1-C3烷氧基和C1-C5烷基，而R16α和R16β為氫；或者ii)R17β為羥基，R17α為氫，而R16α和R16β為低級烷基、苄基或者它們一起為C5-C6環烷；或者iii)R17α和R17β一起為羰基氧，而R16α和R16β為低級烷基、苄基或者它們一起為C5-C6環烷。
10.權利要求9的方法，其中R17α為苄基。
11.權利要求10的方法，其中R3為羥基。
12.權利要求10的方法，其中R2為氯或氰基。
13.抑制人3型3α-羥基類固醇脫氫酶活性的方法，它包括對需要這種抑制劑的患者給予有效治療量的選自以下的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑
14.測定推定的抑制劑抑制4-雄甾烯-3，17-二酮轉化為睪丸激素以及5α-雄甾烷-3，17-二酮轉化為二氫睪丸激素的效能的方法，它包括測定在存在所述推定抑制劑的情況下3型3α-羥基類固醇脫氫酶的活性，以及確定效能與相對於缺乏所述推定抑制劑的所述脫氫酶活性的所述活性降低的關係。
15.權利要求14的方法，其中所述方法包括以下步驟a)為用重組載體轉化或轉染的重組宿主細胞提供培養基，所述載體含有啟動子序列和編碼人3型3α-羥基類固醇脫氫酶的核苷酸序列；b)在所述培養基中加入所述推定抑制劑和底物，在缺乏所述抑制劑的情況下所述底物被3型3α-羥基類固醇脫氫酶轉化；和c)測定所述轉化作用。
16.藥用組合物，它含有藥學上可接受的稀釋劑或載體和有效治療量的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶的抑制劑，該抑制劑具有以下分子結構 其中R3為選自以下的部分C1-C20烷氧基、C1-C10醯氧基、C1-C20烷氧基羰氧基、C1-C20烷氧基烷氧基、羥基、(N-烷基或-H)氨基甲酸酯和體內轉化為羥基的部分；其中R2和R4獨立選自氫、氰基、氟基、氯基、溴基和硝基(其中R2和R4不能同時為氫)；其中所述虛線為任選π鍵；其中R17α選自氫、選自以下的基團取代的C2-C14碳部分氫、滷素、羧基、醯氨基、C1-C3烷氧基和C1-C5烷基，或者R17α和R17β一起構成C5-C7內酯環或為羰基氧；其中R17β選自羥基、醯氧基、烷氧基、鏈烯氧基、(N-烷基或H)醯氨基；或R17α和R17β一起構成C5-C7內酯環或為羰基氧。
17.權利要求16的藥用組合物，其中R17α為苯基或丙基。
18.權利要求16的藥用組合物，其中R3為羥基。
19.權利要求16的藥用組合物，其中R2為氯或氰基。
20.藥用組合物，它含有藥學上可接受的稀釋劑或載體和治療上可接受量的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶的抑制劑，該抑制劑具有以下分子結構 其中R100選自氫、羧基、醯氨基、C1-C5烷基、滷基、硝基、羥基和C1-C3烷氧基。
21.藥用組合物，它含有藥學上可接受的稀釋劑或載體和治療上可接受量的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶的抑制劑，該抑制劑選自
22.人3型3α-羥基類固醇脫氫酶的抑制劑，該抑制劑具有以下分子結構 其中R3為選自以下的部分C1-C20烷氧基、C1-C10醯氧基、C1-C20烷氧基羰氧基、C1-C20烷氧基烷氧基、羥基、(N-烷基或-H)氨基甲酸酯和體內轉化為羥基的部分；其中R2和R4獨立選自氫、氰基、氟基、氯基、溴基和硝基(其中R2和R4不能同時為氫)；其中所述虛線為任選π鍵；其中R17α選自氫、選自以下的基團取代的C2-C14碳部分氫、滷素、羧基、醯氨基、C1-C3烷氧基和C1-C5烷基，或者R17α和R17β一起構成C5-C7內酯環或為羰基氧；其中R17β選自羥基、醯氧基、烷氧基、鏈烯氧基、(N-烷基或H)醯氨基；或R17α和R17β一起構成C5-C7內酯環或為羰基氧；其中R16α和R17β獨立選自氫、低級烷基和苄基，或者R16α和R16β一起構成C5-C6環烯。
23.權利要求22的抑制劑，其中R17α為苯基或丙基。
24.權利要求22的抑制劑，其中R3為羥基。
25.權利要求22的抑制劑，其中R2為氯或氰基。
26.人3型3α-羥基類固醇脫氫酶的抑制劑，該抑制劑具有以下分子結構 其中R100選自氫、羧基、醯氨基、C1-C5烷基、滷基、硝基、羥基和C1-C3烷氧基。
27.治療或減小發生前列腺癌風險的方法，它包括對需要這種治療或減小這種風險的患者給予有效治療量的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶的17β-羥基類固醇脫氫酶活性的抑制劑，而不是17內酯衍生化合物。
28.權利要求27的方法，它還包括給予有效治療量的人5型17β-羥基類固醇脫氫酶的抑制劑。
29.權利要求27的方法，其中治療前列腺癌而且還包括給予有效治療量的LHRH激動劑(或拮抗劑)，以有效減少睪丸分泌類固醇性激素。
30.權利要求28的方法，其中治療前列腺癌，所述抑制劑還包括給予有效治療量的LHRH激動劑(或拮抗劑)，以有效減少睪丸分泌類固醇性激素。
31.權利要求29的方法，它還包括給予治療有效量的抗雄激素物質。
32.權利要求30的方法，它還包括給予治療有效量的抗雄激素物質。
33.權利要求27的方法，它還包括給予有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
34.權利要求28的方法，它還包括給予有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
35.權利要求29的方法，它還包括給予有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
36.權利要求30的方法，它還包括給予有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
37.權利要求31的方法，它還包括有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
38.權利要求32的方法，它還包括有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
39.權利要求27的方法，它還包括有效治療量的3型17β-羥基類固醇脫氫酶。
40.權利要求28的方法，它還包括有效治療量的3型17β-羥基類固醇脫氫酶。
41.權利要求29的方法，它還包括有效治療量的3型17β-羥基類固醇脫氫酶。
42.權利要求30的方法，它還包括有效治療量的3型17β-羥基類固醇脫氫酶。
43.權利要求31的方法，它還包括有效治療量的3型17β-羥基類固醇脫氫酶。
44.權利要求32的方法，它還包括有效治療量的3型17β-羥基類固醇脫氫酶。
45.權利要求35的方法，它還包括有效治療量的3型17β-羥基類固醇脫氫酶。
46.權利要求36的方法，它還包括有效治療量的3型17β-羥基類固醇脫氫酶。
47.權利要求37的方法，它還包括有效治療量的3型17β-羥基類固醇脫氫酶。
48.權利要求38的方法，它還包括有效治療量的3型17β-羥基類固醇脫氫酶。
49.權利要求27的方法，它還包括有效治療量的抗雄激素物質。
50.治療或減小發生良性前列腺增生風險的方法，它包括對需要這種治療或減小這種風險的患者給予有效治療量的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶的17β-羥基類固醇脫氫酶活性的抑制劑，而不是給予17-內酯衍生化合物。
51.權利要求50的方法，它還包括給予所述患者有效治療量5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑。
52.權利要求50的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的選自抗雌激素物質或芳香酶抑制劑的藥物。
53.權利要求51的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的選自抗雌激素物質或芳香酶抑制劑的藥物。
54.權利要求52的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的抗雄激素物質。
55.權利要求53的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的抗雄激素物質。
56.權利要求54的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
57.權利要求55的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
58.權利要求52的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
59.權利要求53的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
60.權利要求52的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的5α-還原酶抑制劑和抗雌激素物質或芳香酶抑制劑。
61.權利要求53的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的5α-還原酶抑制劑和抗雌激素物質或芳香酶抑制劑。
62.權利要求52的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的5α-還原酶抑制劑、抗雄激素物質和抗雌激素物質或芳香酶抑制劑。
63.權利要求53的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的5α-還原酶抑制劑、抗雄激素物質和抗雌激素物質或芳香酶抑制劑。
64.治療或減小發生前列腺炎風險的方法，它包括對需要這種治療或減小這種風險的患者給予有效治療量的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶的17β-羥基類固醇脫氫酶活性的抑制劑。
65.權利要求64的方法，它還包括給予有效治療量的人5型17β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑。
66.權利要求64的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的抗雄激素物質。
67.權利要求65的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的抗雄激素物質。
68.權利要求64的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
69.權利要求65的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
70.權利要求66的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
71.權利要求67的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
72.治療或減小發生痤瘡、皮脂溢、多毛症或雄激素性脫髮風險的方法，它包括對需要這種治療或減小這種風險的所述患者給予有效治療量的人3型3α-羥基類固醇脫氫酶的人5型17β-羥基類固醇脫氫酶活性的抑制劑而不是給予17-內酯衍生化合物。
73.權利要求72的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的人5型17β-羥基類固醇脫氫酶的抑制劑。
74.權利要求72的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的抗雄激素物質。
75.權利要求73的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的抗雄激素物質。
76.權利要求72的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
77.權利要求73的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
78.權利要求74的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
79.權利要求75的方法，它還包括給予所述患者有效治療量的5α-還原酶抑制劑。
全文摘要
用3型3α－羥基類固醇脫氫酶的抑制劑或聯用其它活性藥物如5型17β－羥基類固醇脫氫酶的抑制劑,治療和/或抑制發生前列腺癌、良性前列腺增生、前列腺炎、痤瘡、皮脂溢、多毛症或雄激素性脫髮的新方法。還公開了新抑制劑和藥品。
文檔編號C07J1/00GK1322130SQ99811739
公開日2001年11月14日 申請日期1999年8月6日 優先權日1998年8月7日
發明者F·拉布裡, Y·梅蘭德, S·戈蒂爾, L·普羅文徹爾, V·盧－特 申請人:恩多研究公司