用於癒合創傷的方法和藥物組合物的製作方法

2023-08-07 21:20:36 3

專利名稱：用於癒合創傷的方法和藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於誘導和/或加速細胞增殖和/或細胞分化並因此而加速創 傷(wounds)的癒合過程的方法和藥物組合物。更具體而言，本發明涉及經調節的絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶，也稱為PKC的表達和/或活化，例如由膜運輸和活化引起的，用於誘導和 /或加速細胞增殖和/或細胞分化和/或細胞遷移從而加速創傷的癒合過程的用途。根據 本發明的教導，這種表達的調節可以通過下述作用實現(i)用PKC表達構建體轉化創傷細 胞；(ii)用順式作用元件轉化創傷細胞，該元件將被插入到創傷細胞內源PKC基因上遊鄰 近位置；(iii)給予胰島素以誘導創傷細胞中PKC的表達和/或活化；(iv)用胰島素表達構 建體轉化創傷細胞，其產生的表達的和分泌的胰島素可作為PKC的表達和/或活化的上調 劑；(v)用順式作用元件轉化創傷細胞，該元件將被插入到創傷細胞內源胰島素基因上遊 鄰近位置，被表達和分泌的胰島素可作為PKC的表達和/或活化的上調劑；(vi)向創傷中 植入胰島素分泌細胞；(vii)用反式作用因子，例如PDX1轉化創傷細胞，以誘導內源胰島素 產生和分泌，所述胰島素可作為PKC的表達和/或活化的上調劑；以及(viii)給創傷施用 PKC調節劑。本發明正如任何上述方法所實現的那樣，也可離體實施，以產生皮膚移植物。
背景技術：
創傷治療最主要的目的是使創傷閉合。張開的皮膚創傷代表了一類主要的創傷， 包括燒傷，神經性潰瘍，褥瘡性潰瘍，靜脈淤滯性潰瘍，和糖尿病性潰瘍。張開的皮膚創傷通常經過這樣的過程癒合，包括六個主要要素(i)發炎；(ii) 成纖維細胞增殖；(iii)血管增殖；(iv)結締組織合成；(V)形成上皮；和(vi)創傷 收縮。當這些要素，無論是單獨的還是作為整體，不能正確發揮作用的時候，則破壞了 創傷的癒合。有多種因素都可以影響創傷癒合，包括營養不良，感染，藥理學試劑(例 如放線菌素和類固醇)，高齡和糖尿病[參見Hunt andGoodson, Current Surgical Diagnosis&Treatment(Way ；Appleton&Lange)，pp. 86-98(1988)]。就糖尿病而言，糖尿病的特徵就在於胰島素信號傳導(signaling)受到損傷，血 漿葡萄糖升高，以及在幾種特定組織上發生慢性的併發症的易感性。在所有糖尿病的慢性 併發症中，導致足部潰爛的受損的創傷癒合是研究最少的。然而糖尿病患者的皮膚潰瘍花 費了大量人力和財力(29，30)。而且，足部潰爛以及而後的下肢截斷是最常見的糖尿病患者 住院的原因(30-33)。在糖尿病中，創傷癒合過程受到破壞，癒合的創傷的特徵在於傷口強 度減小。組織修復的缺陷與幾種因素有關，包括神經病，血管病和感染。但是，尚不明了其 它機制，通過該機制，與胰島素信號傳導異常相關的糖尿病狀態破壞創傷的癒合並改變皮 膚生理。
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還有一個普遍存在的問題是身體的各個部分的外科手術之後的創傷癒合，手術成 功但是創傷切口不癒合。皮膚是分層的鱗狀的上皮，其中正在進行生長和分化的細胞被嚴格隔開。在生理 狀態，增殖只限於附著於基底膜上的基底細胞。分化是一種空間過程，其中基底細胞失去與 基底膜的附著，停止DNA合成並經歷一系列形態學的和生物化學的變化。最終的成熟步驟 是產生角質層，其形成皮膚的保護屏障(1，2)。在基底細胞開始分化的時候觀察到的最早的 變化與基底細胞從基底膜分離和遷移的能力有關(3)。創傷的癒合過程也有類似的變化，其 中細胞遷移到創傷部位，增殖能力也增加。這些過程是皮膚層的重建和誘導表皮層正確分 化所必需的。小鼠和人角質化細胞培養系統的開發大大方便了對表皮細胞生長和分化調節機 制的分析(2，4)。在體外，角質化細胞可以保持為具有高生長速度的基底增殖細胞。而且， 遵循表皮在體內的成熟模式可以在體外誘導分化。早期事件包括半橋粒組分的喪失(3， 5)和a604整聯蛋白的選擇性喪失以及細胞與基質蛋白的附著的選擇性喪失。這表明整 聯蛋白表達的變化是角質化細胞分化中的早期事件。早期的半橋粒接觸(hemidesmosomal contact)的喪失導致角質化細胞向基底層上遷移，並且與培養的角質化細胞中以及皮膚中 角蛋白1(K1)的誘導有關(1，3，6)。向顆粒層表型的進一步分化與和04整聯蛋白的 表達的下調，與所有基質蛋白的附著潛力的喪失有關，然後就是角質化包膜的形成和細胞 死亡。分化細胞最終從培養皿上脫落成為成熟鱗屑(2，7)。這種體外分化過程是嚴格遵循 體內表皮成熟模式進行的。最近對於角質化細胞生物學的研究突出了蛋白激酶C(Pr0teinKinase C)途徑的 貢獻，其調節皮膚增殖和分化。絲氨酸-蘇氨酸激酶的蛋白激酶C(PKC)家族在多種生物現 象中都起著重要的調節作用(8，9)。PKC家族由至少12個單獨的同種型(isoform)構成， 其屬於3個不同的類別(i)傳統同種型(a，01，02，Y)，其被磷脂酶C在胞內釋放的 Ca2+，佛波酯和二醯甘油激活；(ii)新同種型(6，￡，n, e)，其也可以被佛波酯和二醯甘 油激活，但不能被Ca2+激活；(iii)家族的非典型性((，A, t)成員，其不能被Ca2+，佛波 酯或二醯甘油激活。當被激活的時候，大部分但不是所有同種型被認為會從細胞質遷移到質膜上。同 種型的類型和分布模式在不同的組織中各不相同，也會隨表型而變化。由於PKC在多種激 素作用的細胞終點中的重要性，已有多項研究闡明了其結構和功能。在體內和培養物中已 識別了皮膚中的五種PKC同種型-a，S，e，n和4。近來的研究表明PKC信號傳導途徑 是分化反應的主要胞內調節劑(10，11)。而且，PKC的藥理學活化劑是體內和體外角質化細 胞分化的強有力的誘導劑(4，12)，PKC抑制劑能防止分化標誌物的表達(10)。在構思本發明時，猜測PKC同種型的過表達和/或活化可能會有助於加速創傷愈 合過程。由於難以有效地用傳統方法向原代細胞中引入外源基因，因而對各個PKC同種型 在皮膚細胞增殖和/或分化中的作用的研究受到了限制。生命期短，存在分化可能以及不 能分離到穩定的轉化體都使得外源基因不能有效轉導入原代皮膚細胞。現有技術描述了胰島素作為創傷癒合的治療劑的潛在應用。美國專利5，591，709， 5，461，030和5，145，679描述了將胰島素局部施用於創傷以促進創傷癒合。但是，這些專利 所描述的都是將胰島素和葡萄糖組合使用，因為胰島素的功能是增加葡萄糖的吸收，因而促進創傷癒合。美國專利申請09/748，466和國際專利申請PCT/US98/21794描述了局部施用於皮 膚以促進皮膚健康或治療較淺的皮膚損傷的含有胰島素的組合物。但是，這些專利申請並 沒有教導使用胰島素治療慢性的，II度(Grade II)或較深的創傷。國際專利申請PCT/US01/10245描述了將氰基丙烯酸酯聚合物密封劑與胰島素或 銀組合使用以使創傷癒合。但是，在此申請中既沒有教導也沒有暗示胰島素和另一種生物 活性試劑組合使用可以調節PKC的表達和/或活化。國際專利申請PCT/US85/00695描述了局部施用胰島素以治療糖尿病。但是，該專 利申請並沒有教導使用胰島素治療與糖尿病無關的創傷。國際專利申請PCT/US92/03086描述了可以含有胰島素的治療用微乳製劑。但是， 其公開的內容沒有教導使用胰島素製劑使創傷癒合。美國專利4，673，649和4，940，660描述了用於人角質化細胞和表皮細胞體外無性 系生長的組合物，其中含有表皮生長因子和胰島素。這些專利教導了將胰島素用於培養的 皮膚細胞的發育，所述細胞可用於移植。但是，這些專利並未教導將胰島素在體內用於創 傷。上述引用的現有技術參考文獻並未教導或暗示將胰島素用於調節PKC的表達和/ 或活化，從而加速創傷的癒合過程。而且，現有技術並未教導或暗示使用核酸構建體或基因 轉化技術向創傷提供胰島素，從而加速創傷的癒合過程。目前普遍意識到需要，並且為了便利之目的也需要能加速創傷癒合相關過程的新 方法。此外，還普遍意識到需要，並且為了便利之目的也需要能將重組基因插入到皮膚細胞 中的有效方法，其將加速細胞增殖和/或分化過程和創傷癒合。

發明內容
當實施本發明的時候，發明人發現將胰島素單獨施用到創傷處會產生不良的副 作用例如過度血管生成，發炎，上皮細胞增生和疤痕形成(見下文實施例部分的實施例 23)。本發明人進一步發現將胰島素和一種或多種能在定居於創傷部位的細胞(cells colonizing thewound area)中調節PKC的表達和/或活性的試劑組合使用可有效避免胰 島素引起的副作用，並且同時顯著加速創傷癒合過程。本發明提供了高效治療創傷並且沒有不良副作用的新方法和組合物，包括向創傷 部位提供有效量的胰島素和/或其它能在創傷部位的細胞中調節PKC的表達和/或活性並 與胰島素有協同作用的試劑以加速創傷癒合的過程。因此，根據本發明的一個方面，提供了一種誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的 癒合過程的方法，所述方法包括給損傷的皮膚或皮膚創傷施用治療有效量的調節PKC產生 和/或PKC活化的試劑的步驟。根據本發明的另一個方面，提供了一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的 癒合過程的藥物組合物，所述藥物組合物包括，作為活性成分的，治療有效量的至少一種調 節PKC產生和/或活性的試劑；和藥學可接受的載體。根據本發明的另一個方面，提供了一種誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合 過程的方法，所述方法包括給損傷的皮膚或皮膚創傷施用治療有效量的胰島素和至少一種與胰島素有協同作用的其它試劑的步驟，以誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程。根據本發明的另一個方面，提供了一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的 癒合過程的藥物組合物，所述藥物組合物包括，作為活性成分的，治療有效量的胰島素，至 少一種能與胰島素協同作用的其它試劑，以及設計用於所述藥物組合物局部施用的藥學可 接受的載體。根據本發明的另一個方面提供了一種誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合 過程的方法，所述方法包括給損傷的皮膚或皮膚創傷施用單次劑量的治療有效量的胰島素 的步驟，從而誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程。根據本發明的另一個方面提供了一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的 癒合過程的藥物組合物，所述藥物組合物包括，作為活性成分的，所選擇的能誘導或加速損 傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的單一劑量單位的胰島素，以及設計用於所述藥物組合物 局部施用的藥學可接受的載體。根據本發明的另一個方面提供了一種誘導或加速陳舊皮膚創傷(old skin wound)的癒合過程的方法，所述方法包括給陳舊皮膚創傷施用單次劑量的治療有效量的胰 島素的步驟，從而誘導或加速陳舊皮膚創傷的癒合過程。根據本發明的另一個方面，提供了一種誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合 過程的方法，所述方法包括向損傷的皮膚或皮膚創傷植入治療有效量的胰島素分泌細胞的 步驟，從而誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程。根據本發明的另一個方面，提供了一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的 癒合過程的藥物組合物，所述藥物組合物包括，作為活性成分的胰島素分泌細胞，以及設計 用於所述藥物組合物局部施用的藥學可接受的載體。根據本發明的另一個方面，提供了一種誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合 過程的方法，所述方法包括轉化損傷的皮膚或皮膚創傷的細胞以產生和分泌胰島素的步 驟，從而誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程。根據本發明的另一個方面，提供了一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的 癒合過程的藥物組合物，所述藥物組合物包括，作為活性成分的，設計用於轉化損傷的皮膚 或皮膚創傷處細胞以產生和分泌胰島素的核酸構建體，以及設計用於所述藥物組合物局部 施用的藥學可接受的載體。根據本發明的另一個方面，提供了一種誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合 過程的方法，所述方法包括轉化損傷的皮膚或皮膚創傷處細胞以產生蛋白激酶C的步驟， 從而誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程。根據本發明的另一個方面，提供了一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的 癒合過程的藥物組合物，所述藥物組合物包括，作為活性成分的，設計用於轉化損傷的皮膚 或皮膚創傷處細胞以產生蛋白激酶C的核酸構建體，以及設計用於所述藥物組合物局部施 用的藥學可接受的載體。根據本發明的另一個方面，提供了一種誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合 過程的方法，所述方法包括給損傷的皮膚或皮膚創傷施用治療有效量的PKC活化劑的步 驟，從而誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程。
根據本發明的另一個方面，提供了一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的 癒合過程的藥物組合物，所述藥物組合物包括，作為活性成分的，治療有效量的PKC活化 劑，以誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程，以及藥學可接受的載體。根據本發明的另一個方面，提供了一種誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合 過程的方法，所述方法包括給損傷的皮膚或皮膚創傷施用治療有效量的共聚物-1的步驟。根據本發明的另一個方面，提供了一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的 癒合過程的藥物組合物，所述藥物組合物包括，作為活性成分的，治療有效量的共聚物-1， 以及設計用於所述藥物組合物局部施用的藥學可接受的載體。根據本發明的另一個方面，提供了一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的 癒合過程的藥物組合物，所述藥物組合物包括，作為活性成分的，治療有效量的共聚物-1， 以及設計用於所述藥物組合物局部施用的藥學可接受的載體。根據本發明的另一個方面，提供了一種誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合 過程的方法，所述方法包括調節定居於損傷的皮膚或皮膚創傷處真皮細胞中的至少一種 PKC同種型的表達和/或活性；給所述真皮細胞施用治療有效量的至少一種選自激素，生長 因子，脂肪細胞激素，PKC 6 RACK和GW9662的其它試劑以及調節所述PKC同種型的表達和/ 或活性，從而誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程。根據本發明的另一個方面，提供了一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷 的癒合過程的藥物組合物，所述藥物組合物包括，作為活性成分的，治療有效量的調節至 少一種PKC同種型的表達或活性的物質，和至少一種選自激素，生長因子，脂肪細胞激素， PKC 6 RACK和GW9662的其它試劑，以及藥學可接受的載體。根據下述的發明的優選實施方案的其它特徵，所述創傷選自潰瘍，糖尿病相關的 創傷，燒傷，曬傷，老化皮膚創傷，角膜潰爛創傷，炎性胃腸道疾病創傷，腸炎性疾病創傷， 克羅恩氏病創傷，潰瘍性結腸炎，痔瘡，大皰性表面松解症創傷，皮膚起皰創傷，牛皮癬創 傷，saborehic皮炎創傷，動物皮膚創傷，動物糖尿病創傷，視網膜病創傷，口腔創傷(黏膜 炎)，陰道黏膜炎創傷，牙齦病創傷，裂傷(laceration)，手術切口創傷和手術後粘連創傷 (adhesis wound)0根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述潰瘍是糖尿病性潰瘍，褥瘡，靜脈性潰 瘍，胃潰瘍和HIV相關潰瘍。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述胰島素是重組的。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述胰島素是天然來源的。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述其它試劑是血小板衍生的生長因子。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述其它試劑是PKC-a抑制劑。根據所述的優選實施方案的其它特徵，給藥是單次施用。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述陳舊皮膚創傷是至少2天齡(2day sold)的。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述胰島素濃度為0. lyM到10yM。根據 所述的優選實施方案的其它特徵，胰島素的劑量單位是在0. 01-0. 2ml的藥物組合物中的 0. 001 到 5nM。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述胰島素的劑量為在0. 01-0. 2ml的藥物組合物中的0. 01到0. 5nM。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述藥物組合物選自水溶液，凝膠，乳劑， 糊劑，洗劑，噴霧，懸液，粉末，分散劑，油膏劑和軟膏劑。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述藥物組合物含有固體支持物。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述細胞被轉化以產生和分泌胰島素。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述細胞被重組PDX1基因轉化，從而使得 所述細胞產生和分泌天然的胰島素。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述細胞被順式作用元件序列轉化，該序 列整合到所述細胞的內源胰島素基因的上遊，從而所述細胞產生和分泌天然胰島素。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述胰島素分泌細胞能夠形成分泌顆粒。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述胰島素分泌細胞是內分泌細胞。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述胰島素分泌細胞是人源的。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述胰島素分泌細胞是組織相容性人化動 物來源的。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述胰島素分泌細胞分泌人胰島素。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述胰島素分泌細胞是自體細胞。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述細胞選自成纖維細胞，上皮細胞和角 質化細胞。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述細胞被轉化以產生蛋白激酶C轉錄激 活劑，從而使得所述細胞產生天然的蛋白激酶C。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述細胞被順式作用元件序列轉化，該序 列整合到所述細胞的內源蛋白激酶C的上遊，從而使得所述細胞產生天然的蛋白激酶C。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述細胞被重組蛋白激酶C基因轉化，從 而使得所述細胞產生重組蛋白激酶C。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述蛋白激酶C選自PKC-0 1，PKC-32， PKC- y，PKC- 0，PKC-入，禾口 PKC- x。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述蛋白激酶C選自PKC- a，PKC- 6， PKC- e，PKC- n 禾口 PKC_ ^。根據所述的優選實施方案的其它特徵，在適於局部施用的藥物組合物中含有共聚 物-1。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述PKC同種型選自PKC-a，PKC-旦， PKC- 8，禾口 PKC- ^。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述激素是胰島素。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述生長因子選自IL-6，KTO和TNFa。根據所述的優選實施方案的其它特徵，所述脂肪細胞激素是adipsin或脂聯素 (adiponectin) 0本發明成功解決了現有的已知技術的缺點，提供了用於對抗損傷的皮膚或皮膚創 傷的新的治療方法。


本發明僅通過舉例方式並參考所附的附圖進行描述。現在具體參考附圖的細節， 應當指出所示出的細節僅僅是舉例方式，用於對本發明的優選實施方案進行舉例說明，而 且是為了提供對本發明的原理和概念最有用的和最容易理解的描述。從這一點來說，除了 對本發明有基本理解所必需的內容不會再對本發明進行更詳細的結構性細節描述，對於附 圖的描述可使所屬領域技術人員明了本發明的各種形式如何實施。在附圖中圖1證明了使用重組腺病毒載體可有效過表達PKC同種型左邊四天齡的原代 角質化細胞用0-gal腺病毒感染1小時。感染後48小時，固定細胞，通過誘導藍色反應 定量確定半乳糖苷酶蛋白的活化並與未感染的角質化細胞相比。右邊四天齡的原代 角質化細胞用重組同種型特異性PKC腺病毒感染1小時。二十四小時後，提取感染培養物 (Ad)和未感染對照培養物(C)的蛋白進行Westernblot分析，用下述實施例部分所述的同 種型特異性抗-PKC抗體分析樣品。圖2顯示了苔蘚蟲素1 (bryostatin 1)對PKC的激活誘導過表達的PKC同種型的 遷移。四天齡的原代角質化細胞用同種型特異性的重組PKC腺病毒感染1小時。感染後 二十四小時，細胞不進行處理(C)或用苔蘚蟲素1(B)刺激30分鐘，然後分級。將蛋白樣品 進行Westernblot，用同種型特異性抗-PKC抗體分析。圖3顯示了過表達的PKC同種型的天然形式具有活性。四天齡的原代角質化細胞 用同種型特異性重組PKC腺病毒感染1小時。感染後18個小時，將未感染的對照細胞(C) 和PKC同種型過表達細胞(0E)的細胞裂解物用同種型特異性抗PKC抗體進行免疫沉澱反 應。將免疫沉澱物用於進行PKC活性檢測，如下述實施例部分所述。圖4證明了過表達的特異性PKC同種型誘導原代角質化細胞中的明顯的形態學改 變。原代角質化細胞不進行處理(C)或者用重組PKCa，S，n，或(腺病毒感染。二十四 小時後，用亮場顯微鏡對培養物進行觀察並拍照(x20)。圖5顯示了過表達的PKC同種型在被感染的原代角質化細胞中的清楚定位。將原 代角質化細胞接種在層粘連蛋白5(laminin 5)塗覆的玻璃載玻片上。培養物不進行處理 或者用不同的重組PKC腺病毒感染。感染後二十四小時，固定細胞，洗滌並風乾。用同種型 特異性抗PKC抗體然後用FITC結合的二抗對培養物進行免疫螢光分析。用共聚焦顯微鏡 對細胞進行掃描，對典型視野進行拍照。圖6證明了 PKC同種型特異性調節a604整聯蛋白的表達。五天齡的原代小鼠 皮膚角質化細胞不進行處理或者用PKCS，PKCa，PKCn或PKC (重組腺病毒感染。感染後 四十八小時，用膜細胞組分進行SDS-PAGE電泳，轉至硝酸纖維素濾膜上，用抗a 6和抗3 4 抗體進行免疫印跡並用ECL進行分析。圖7顯示了過表達的PKC n和PKC 6誘導角質化細胞的增殖。五天的原代小鼠皮 膚角質化細胞不進行處理或者用PKC S，PKCa，PKC n或PKC (重組腺病毒感染。感染後 四十八小時，進行1小時的3H-胸苷摻入以分析細胞增殖，如實驗步驟中所述。結果表示為 cpm/培養皿，與半乳糖苷酶感染的角質化細胞相比較。各個值表示為3次獨立實驗中 三次重複測定值的平均值士標準差。圖8證明了 PKC同種型的過表達對a 6 3 4整聯蛋白的半橋粒定位的作用。原代角質化細胞接種在層粘連蛋白5塗覆的玻璃載玻片上，將角質化細胞培養物在低Ca2+的MEM 中保持48小時。然後培養物不進行處理(A)，或者被PKCa ,PKC6 ,PKCn或PKC (重組腺 病毒感染(分別是B-E)。感染後二十四小時，用4%多聚甲醛固定角質化細胞，然後用0.2% Triton-X-100溫和提取，用PBS洗滌並風乾，如實驗步驟中所述。用同種型特異性抗a 6抗 體然後用FITC結合的二抗對培養物進行免疫螢光分析，如實驗步驟中所述。圖9A-B顯示了過表達的PKC S和PKC 4在體外誘導角質化細胞的分離 (detachment)。(A)原代角質化細胞不進行處理(C)或者被重組PKC a，6 , n或4腺病 毒感染。感染後24小時和48小時分析細胞附著，提取細胞並且再次將它們接種到基質塗 覆的培養皿上。細胞數目表示為附著細胞的蛋白濃度(mg/個培養皿)。(B)原代角質化細 胞不進行處理(C)或者被重組PKCa，S，n或4腺病毒感染。感染後24小時收集培養 介質中的脫離的漂浮細胞，對細胞的分離進行分析。細胞數目表示為分離細胞的蛋白濃度 (mg/個培養皿)。圖10證明了在正在積極增殖的角質化細胞中表達PKCn。原代角質化細胞接種 (plate)在層粘連蛋白5塗覆的玻璃載玻片上。接種後四十八小時，將角質化細胞與BrdU 溶液培育1小時，然後用抗PKCn (紅色)和抗BrdU(綠色)抗體進行免疫螢光分析，如下 述的實施例部分所述。用共聚焦顯微鏡對細胞進行掃描，對典型視野進行拍照。圖11證明了 PKCn誘導，而PKCn突變體減少角質化細胞增殖。原代皮膚角質化 細胞被重組PKCn腺病毒或PKCn腺病毒的顯性失活突變體(DNPKCn或PKC DNn)感染 1小時。感染後四十八小時，進行1小時的3H-胸苷摻入以分析細胞增殖，如下述實施例部 分所述。結果表示為cpm/個培養皿。對照是未感染的細胞。圖12A-B證明了 PKC n和DNPKC n的過表達特異調節PKC的定位和細胞形態。原 代皮膚角質化細胞被重組PKCn腺病毒或PKCn腺病毒的顯性失活突變體(PKC DNn)感 染1小時。感染後四十八小時，固定角質化細胞並且(A)進行亮場照相(X20)以及⑶用 PKCn特異性抗體然後用FITC結合的二抗進行免疫螢光分析，如實驗步驟中所述。對照為 未感染的細胞。圖13A-B顯示了在增殖的角質化細胞中PKC n表達的抑制誘導角質化細胞的分 化。原代皮膚角質化細胞在低Ca2+的培養基中保持增殖或者在0. 12mM Ca2+的條件下分化 24小時。然後，用重組PKCn腺病毒或PKCn腺病毒的顯性失活突變體(PKC DNn)感染角 質化細胞1小時。感染後二十四小時，將角質化細胞保持在低Ca2+的培養基中或者轉至含 有0. 12mM Ca2+的分化培養基中再保持24小時。感染後四十八小時，提取角質化細胞並用 SDS-PAGE凝膠分析。用Western blotting分析PKC n (A)和角蛋白1(B)的表達。圖14證明了在小鼠的切割創傷中，體內PKCn的局部表達增加肉芽組織的形成並 加速創傷癒合。在裸鼠背部造成7mm的整塊皮膚的切口。在發生創傷後1天和4天局部 施用對照0_gal，PKCn和PKCa腺病毒懸液。將整塊皮膚創傷固定在4%多聚甲醛中，用 H&E染色以及亮場顯微鏡對皮膚切片進行組織學分析。E是表皮，D是真皮。圖15證明了在增殖的角質化細胞中胰島素，而不是IGF1特異地誘導PKC 6的遷 移。分離原代角質化細胞並接種，如下述實施例部分所述。在低Ca2+的培養基(0.05mM)中 保持增殖的角質化細胞5天，直至它們達到80%匯合。將細胞用10_7M胰島素(Ins)或10_8M IGFl(IGF)刺激15分鐘。如上所述溶解細胞，用刺激過的或者未刺激過的對照(Cont)細胞的20 y g膜或細胞溶質提取物進行SDS-PAGE並轉移。用針對每一個PKC同種型的特異性 多克隆抗體對印跡進行探測。圖16顯示了是胰島素而不是IGF1可誘導PKC 6的活性。為了確定PKC 6的活性， 將五天的角質化細胞培養物用10_7M胰島素(Ins)或10_8M IGFl(IGF)刺激指定的時間(1， 15，或30分鐘)。用特異性抗PKC 6抗體從膜(藍色條，mem)和細胞溶質(紫色條，cyto) 組分中將PKC S免疫沉澱出來。用體外激酶檢測分析PKCS免疫沉澱物的PKC活性，如實驗 步驟中所述。每一條表示3次獨立實驗中3個測定值的平均值士SE。各個值表示為pmol ATP/培養皿/分鐘。圖17A-B顯示了胰島素和IGF1對於角質化細胞增殖具有加和效果。增殖的角質 化細胞在低Ca2+的培養基(0. 05mM)中保持5天直至它們達到80%匯合。(A)五天的角質 化細胞培養物用指定濃度的胰島素或IGF1刺激24小時。(B)同時，將角質化細胞用10_7M 胰島素(Ins)和劑量增加的IGFl(IGF)刺激。在每個濃度，右條(條紋條)表示將兩個激 素一起加入觀察到的增殖。左條證明了 10_7M胰島素(紅色條)和濃度增加的IGF1 (灰色 條)單獨的效果。如實驗步驟中所述檢測胸苷的摻入。結果代表了六個實驗的結果。每一 條都是3次測定值的平均值士SE，表示為高於對照的未刺激的角質化細胞的百分數。圖18A-B證明了重組PKC腺病毒構建體的過表達。用含有野生型PKC 6 (WTPKC 6 )， 野生型PKC a (WTPKC a )，或顯性失活PKC 6突變體(DNPKC 6 )的重組腺病毒構建體感染角 質化細胞培養物。(A)感染後將細胞培養24小時，收集，對20i!g蛋白質提取物用特異性 抗PKCa或抗PKC S抗體進行Western blotting分析。印跡結果代表了 5次獨立實驗的 結果。(B)感染後二十四個小時，收集細胞，用體外激酶檢測分析PKCa或PKCS免疫沉澱 物。圖19顯示了 PKC過表達對於胰島素或IGF1誘導的增殖的作用。未感染的(淺藍 條)，或過表達WTPKC 6 (深藍條)或DNPKC 6 (斜線藍條)的細胞用10_7M胰島素(Ins)， 10_8M IGFl(IGF)或二者(Ins+IGF)處理24小時。如實驗步驟中所述檢測胸苷的摻入。每 一條表示用單獨的培養物進行的3次實驗的3個測定值的平均值士SE。各個值表示為基於 作為對照的每個實驗中同一培養物的未刺激的角質化細胞的百分數。圖20顯示了 PKC 6活性的抑制特異性消除胰島素誘導的角質化細胞的增殖。如下 述實施例部分所述培養原代角質化細胞。未感染的細胞或DNPKC S感染的角質化細胞用下 述濃度的生長因子刺激24小時:10_7M胰島素(Ins)，10_8M IGF1 (IGF)，10ng/ml EGF，10ng/ ml PDGF, lng/ml KGF或5ng/ml ECGF。如下述實施例部分所述檢測胸苷的摻入。每一條都 表示用單獨的培養物進行的3次實驗的3個測定值的平均值士SE。各個值表示為基於作為 對照的每個實驗中同一培養物的未刺激的角質化細胞的百分數。圖21顯示了過表達的PKC 6特異調節胰島素誘導的角質化細胞增殖。原代角質 化細胞如圖1所述那樣培養。未感染的細胞或用過表達的WTPKC S感染的角質化細胞用下 述濃度的生長因子刺激24小時:10_7M胰島素(Ins)，10_8M IGF1 (IGF)，10ng/ml EGF, 10ng/ ml PDGF, lng/ml KGF或5ng/ml ECGF。如下述實施例部分所述檢測胸苷的摻入。每一條都 表示用單獨的培養物進行的3次實驗的3個測定值的平均值士SE。各個值表示為基於作為 對照的每個實驗中同一培養物的未刺激的角質化細胞的百分數。圖22A-B證實了 PKC 6和PKC ^在體內皮膚創傷癒合過程中具有重要作用。使用新開發的同種型特異性PKC無效小鼠的體內小鼠模型，對PKCa，PKCS和PKC 4無效小鼠 和它們的野生型的同窩出生小鼠進行創傷癒合研究。麻醉小鼠並在小鼠背上通過穿刺活檢 造成直徑4mm的皮膚。在進行一周的跟蹤後取下小鼠皮膚，用破裂室方法對皮膚薄片進行 創傷強度測試以確定皮膚創傷的癒合。其值表達為破裂壓力，其代表在監測室內直至發生 破裂的最大壓力。結果為12-20小鼠的不同組的測定值。實驗重複至少3次。圖23確定了原代皮膚角質化細胞中STAT3和PKC 6之間的特異的相互作用。原 代角質化細胞不進行處理(上)或者用同種型特異性重組PKC腺病毒感染1小時(下)。 提取細胞用同種型特異性PKC抗體進行免疫沉澱(IP)。用抗PKC或抗STAT3抗體對免疫沉 澱物進行Western blot分析。圖24證明了 PKC 6的活化對於胰島素誘導的STAT 3的轉錄活化具有重要作用。 將原代角質化細胞接種在玻璃載玻片上，在低Ca++(0. 05mmol/l)的培養基中保持5天直 至它們達到80%匯合。細胞不進行處理(Cont，上)或者用5iiM Rottlerin預處理7分 鍾(R，下)，然後用10_7M胰島素處理5分鐘(Ins)。用甲醇固定細胞，洗滌並風乾。用抗磷 酸-Tyr-705-STAT3抗體然後用FITC結合的二抗免疫螢光以分析培養物。用共聚焦顯微鏡 掃描細胞。圖25證明了過表達DN PKC 6抑制PKC 6和STAT3的過表達誘導的角質化細胞的 增殖。原代角質化細胞用含有0 -Gal (作為對照)，PKC S，WT STAT3，DN STAT3的重組腺 病毒構建體感染1小時或用DN PKC 6，然後用STAT3進行雙重感染。感染後24小時，進行 1小時的3H-胸苷摻入以分析細胞增殖。結果表示為DPM/mg蛋白質。每一條都是用同一培 養物的平板(Plate)進行的三次測定的平均值。圖26證明了胰島素施用的濃度和頻率對於體內創傷癒合的作用。在8-10周齡的 C57BL小鼠背部切出創傷切口，用PBS (對照)處理或者以不同濃度和頻率進行胰島素處理 (也就是七天裡每天重複施用相對於單獨施用一次)。致創後七天將小鼠處死，檢測處理的 創傷部位。結果表示為mm2創傷部位，每一條都是六次重複的平均值士標準差(P < 0. 005)。圖27證明了胰島素施用的濃度和頻率對於體內創傷癒合的組織學效果。在8-10 周齡的C 57BL小鼠背部切出創傷切口，以不同濃度和頻率進行胰島素處理(也就是七天裡 每天重複施用相對於單獨施用一次)。致創後七天製備組織學創傷切片，分析表皮和真皮的 閉合(創傷收縮)。表皮的閉合用Keratin 14(K14)抗體染色(左)檢測，如果創傷的整個 裂口都是染色陽性，則視為陽性。如果真皮創傷的兩邊在光學顯微鏡下在xlOO的放大倍數 下在一個視野中都能看見(右)，則真皮的閉合視為陽性。結果表示為創傷閉合相對於對照 的百分數，每一條都是六次重複的平均值。圖28證明了胰島素和血小板衍生生長因子(platelet derivedgrowth factor, PDGF-BB)組合使用對於體內創傷癒合的協同作用。在8-10周齡的C57BL小鼠背部切出創 傷切口，用胰島素，PDGF-BB，或組合使用胰島素和PDGF-BB進行單次施用。致創後七天處死 小鼠，取活組織進行表皮和真皮閉合(創傷收縮)的組織學分析。表皮的閉合用Keratin 14(K14)抗體染色(左)檢測，如果創傷的整個裂口都是染色陽性，則視為陽性。如果真皮 創傷的兩邊在光學顯微鏡下在xlOO的放大倍數下在一個視野中都能看見(右)，則真皮的 閉合視為陽性。結果表示為條形圖，為創傷閉合相對於對照的百分數，每一條都是六次重複 的平均值。
圖29A-D是示出胰島素和PKCa抑制劑組合使用對體內創傷癒合的形態學作用 的照片。在8-10周齡的C57BL小鼠背部切出創傷切口，不進行處理(對照)或用胰島素 (H0/01)和PKCa抑制劑(H0/02)組合處理。致創後7天除下皮膚活組織進行形態學觀察。 圖29A-B顯示了對照創傷，圖29C-D顯示了處理的創傷。圖30是示出胰島素和PKC a抑制劑組合使用對真皮閉合(創傷收縮)的作用的 組織顯微照片。在8-10周齡的C57BL小鼠背部切出創傷切口，不進行處理(對照)或用胰 島素(H0/01)和PKCa抑制劑(H0/02)組合起來每天處理。致創後七天處死處理的小鼠。 製作組織學創傷切片並在光學顯微鏡下觀察。如果真皮創傷的兩邊在xlOO的放大倍數下 在一個視野中都能看見，則真皮的閉合視為陽性。未處理的對照切片(左)的張開的創傷 區域太大不能容納於一個xlOO放大的視野中，而處理的創傷切片(右)表現出真皮閉合陽 性。黃色斑點線標出了真皮的邊緣。圖31是示出胰島素和PKC a抑制劑組合使用對表皮閉合的作用的組織顯微照片。 在8-10周齡的C57BL小鼠背部切出創傷切口，不進行處理或用胰島素(H0/01)和PKC a抑 製劑(H0/02)組合起來每天處理。致創後七天處死處理的小鼠。製備創傷的組織切片，用 角蛋白14(指示基底角質化細胞)染色，在光學顯微鏡下觀察。未處理的對照切片(左) 中的張開的創傷區域(箭頭標出)太大不能容納於一個xlOO放大的視野中，而處理的創傷 切片(右)整個裂口表現出表皮閉合。圖32是示出胰島素和PKCa抑制劑組合使用對表皮細胞空間分化的作用的組織 顯微照片。致創小鼠(C57BL，8-10周齡)用胰島素(H0/01)和PKC a抑制劑(H0/02)組合 起來每天局部施用進行處理。致創後七天處死處理的小鼠。製備創傷的組織切片，用突出 顯示細胞空間分化的初始階段的keratin 1 (K1)抗體染色。未處理的對照切片(左)表現 出大的未分化的創傷區域(由箭頭標出)，而處理的創傷切片(右)中則觀察到大量的表皮 重建。圖33證明了胰島素和PKC a抑制劑組合使用對體內創傷癒合的定量作用。致創 小鼠(C57BL，8-10周齡)用胰島素(H0/01)和PKC a抑制劑(H0/02)組合起來每天局部施 用進行處理。致創後七天處死處理的小鼠。製備創傷的組織切片，進行真皮收縮，表皮閉合 和空間分化的分析，如上述圖30-32所述。條形圖顯示出了通過組織學分析得出的每一個 處理組中完全癒合的創傷的發生率(百分數)。圖34A-G是真皮細胞中PKCa的表達和/或活性的抑制和另一種PKC同種型的 表達和/或活性的調節，或者給真皮細胞施用激素對於體外皮膚創傷的閉合的組合效果 的示例照片。將培養的原代皮膚成纖維細胞用顯性失活(DN)的激酶失活的PKCa感染。 二十四小時後實施刮擦，培養物不進行處理(圖34A)，或者用野生型(WT)PKC 6 (圖34B)， PKC n (圖34C)，WT PKC 4 (圖34D)或WT PKC ￡ (圖34E)感染。另外，PKCa抑制的培養物 用adipsin(2ug/ml ；圖34F)或胰島素(6. 7X10_7M ；圖34G)處理。處理後24小時拍照。圖35A-H是真皮細胞中PKC a的表達和/或活性的抑制和另一種PKC同種型的表 達和/或活性的調節，或者給真皮細胞施用生長因子對於體外皮膚創傷的閉合的組合效果 的示例照片。將培養的原代皮膚成纖維細胞用顯性失活(DN)的激酶失活的PKCa感染。 二十四小時後實施刮擦，培養物不進行處理(圖35A)，或者用野生型(WT)PKC e (圖35D) ,WT PKC 4 (圖35E)或WT PKC n (圖35F)感染。或者，PKC a抑制的培養物用IL_6(每個培養皿1 y g ；圖 35B)，KGF (每個培養皿 1 P g ；圖 35C)，PKC 8 RACK (1(T7M ；圖 35H)或 TNF a (12 u g/ ml ；圖35G)處理。處理後24小時拍照。圖36A-B是真皮細胞中PKC (的表達和/或活性的抑制，和給真皮細胞施用生長 因子對於體外皮膚創傷的閉合的組合效果的示例照片。將培養的原代皮膚成纖維細胞用顯 性失活(DN)的激酶失活的PKC4 (DN4)感染。二十四小時後實施刮擦，培養物不進行處理 (圖36A)，或者用KGF (每個培養皿1 y g ；圖36B)處理。處理後24小時拍照。圖37A-D是真皮細胞中PKC (的表達和/或活性的抑制，和給真皮細胞施用生長 因子或激素對於體外皮膚創傷的閉合的組合效果的示例照片。將培養的原代皮膚角質化細 胞用顯性失活(DN)的激酶失活的PKC4 (DNO感染。二十四小時後實施刮擦，培養物不 進行處理(圖37A)，或者用IL-6 (每個培養皿1 P g ；圖37B)，TNF a (12 u g/ml ；圖37C)或 adiponectin (每個培養皿1 y g ；圖37D)處理。處理後24小時拍照。圖38A-E是真皮細胞中PKC0的表達和/或活性的抑制，和給真皮細胞施用生長 因子，胰島素或GW9662對於體外皮膚創傷的閉合的組合效果的示例照片。將培養的原代皮 膚成纖維細胞用顯性失活(DN)的激酶失活形式的PKC0 (DN0)感染。二十四小時後實施 刮擦，培養物不進行處理(圖38A)，或者用KFG (每個培養1 y g ；圖38B)，IL-6 (每個培養 11^;圖380，胰島素(6. 7X10_7M;圖38D)或GW9662 (每個培養皿1 ii g ；圖38E)處理。處 理後24小時拍照。圖39A-E是真皮細胞中PKC 6的表達和/或活性的抑制和另一種PKC同種型的表 達和/或活性的調節，或者給真皮細胞施用激素對於體外皮膚創傷的閉合的組合效果的示 例照片。將培養的原代皮膚角質化細胞用野生型(WT)的激酶形式的PKCS (DN6)感染。 二十四小時後實施刮擦，培養物不進行處理(圖39A)，或者用WT PKC ^ (PKC ^ ；圖39B)， WT PKC e (PKC e ；圖39C)或DN PKC a (PKC a ；圖39D)感染。或者，PKC S提高的培養物用 adipsin(2u g/ml ；圖39E)處理。處理後48小時拍照。圖40A-F是施用共聚物-1，胰島素，PKCa偽底物，或其組合對於體外皮膚創傷閉 合的效果的示例照片。培養的原代皮膚角質化細胞不進行處理(圖40A)，或者僅用胰島素 (6. 7 X 10_7M ；圖40B)，僅用共聚物-1 (55 u g/培養皿；圖40C)，胰島素和PKC a偽底物的混 合物(分別為6. 7 X 10_7M和107M ；圖40D)，共聚物-1和胰島素的混合物(分別為55 u g/培 養皿和6. 7 X 1(TM ；圖40E)，或共聚物-1，胰島素和PKC a偽底物的混合物(分別為55 u g/ 培養皿，6. 7X 1(T7M禾口 107M ；圖40F)處理。處理後48小時拍照。圖41A-D是共聚物-1，胰島素，PKCa偽底物，或其組合對於體內創傷癒合的效果 的示例照片。致創小鼠不進行處理(圖41A)或在4天裡每天局部施用共聚物-1(55 yg/ ml ；圖41B)，共聚物-1和胰島素的混合物(分別為55 u g/ml和1 y M ；圖41C)，或共聚物_1， 胰島素和PKC a偽底物的混合物(分別為55 u g/ml，1 y M和1 y M ；圖41D)。致創後4天拍 照。圖42A-H是接近創傷裂口的胸腺對於創傷癒合過程的效果的示例的組織顯微照 片。圖42A-B顯示了正常的成年齧齒動物的胸腺的200倍(x200)放大圖。圖42C顯示了 7 天齡創傷的40倍(x40)放大圖，在離創傷裂口非常接近的地方觀察到胸腺(紅色正方形， 放大200倍，圖42D)。創傷重新形成上皮，形成肉芽組織，真皮正在進行收縮。圖42E-F顯 示了放大40倍(圖42E)和200倍(圖42F)的STZ糖尿病小鼠的9天齡創傷，在創傷裂口附近沒有觀察到胸腺，沒有觀察到重新形成上皮，肉芽組織，或真皮收縮。圖42G顯示了放 大40倍的STZ糖尿病小鼠的9天齡創傷。將創傷用胰島素和PKCa偽底物的混合物處理。 在創傷裂口附近觀察到胸腺(紅色正方形，放大20倍，圖42H)。創傷重新形成上皮，形成肉 芽組織，真皮正在進行收縮。圖43是胰島素和PKCa抑制劑組合使用對創傷和損傷皮膚癒合的作用的示例照 片。在Large Whites&Landrace家養豬的背部形成縱向創傷切口，在15天中每天用PBS (對 照)或1 P M胰島素和1 ii M PKC a偽底物(H0/03/03)的混合物處理。致創後30天對創傷 拍照。與緩衝液對照相比，H0/03/03處理的創傷完全癒合，沒有疤痕形成，顯著增加了皮膚 的美感。
具體實施例方式本發明是用於調節絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也稱為PKC的表達和/或活化，以誘 導和/或加速細胞增殖和/或細胞分化，從而加速創傷的癒合過程的方法和藥物組合物。 根據本發明的教導，這種表達的調節可以通過下述作用實現(i)用PKC表達構建體轉化創 傷細胞；(ii)用順式作用元件轉化創傷細胞，該元件將被插入到創傷細胞內源PKC基因上 遊鄰近位置；(iii)施用胰島素和其它能與胰島素協同作用的試劑以調節創傷細胞中PKC 的表達和/或活化；(iv)用胰島素表達構建體轉化創傷細胞，其產生的表達的和分泌的胰 島素可作為PKC的表達和/或活化的上調劑；(v)用順式作用元件轉化創傷細胞，該元件將 被插入到創傷細胞內源胰島素基因上遊鄰近位置，其產生的表達的和分泌的胰島素可作為 PKC的表達和/或活化的上調劑；(vi)向創傷中植入胰島素分泌細胞；(vii)用反式作用因 子，例如PDX1轉化創傷細胞，以誘導內源胰島素的產生和分泌，胰島素可作為PKC的表達和 /或活化的上調劑；以及(viii)給創傷施用PKC調節劑。參考附圖以及說明書可更好地理解本發明所述方法和藥物組合物的原理和操作。在詳細描述本發明的至少一個實施方案之前，應當理解本發明不限於下述說明書 中或實施例部分例示的具體的組分組成或排列。本發明能夠以其它實施方案或者以不同的 方式實施。而且，應當理解本文所使用的措辭和術語僅是為了描述使用，而不應當視為是限 制。成年人皮膚包括兩層角質化的成層的表皮層和在下面的厚層的富含膠原的真皮 層結締組織，提供支持和營養。皮膚作為保護屏障抵禦外界。因此任何皮膚的損傷或破裂 都必須被快速有效地修復。如上述背景技術部分所述，修復的第一個階段是通過形成血液 凝塊堵住最初的創傷來實現的。然後炎性細胞，成纖維細胞和毛細血管侵入血液凝塊形成 肉芽組織。後續階段包括創傷的上皮重建，其中基底角質化細胞必須失去與半橋粒的連接， 角質化細胞遷移到肉芽組織上，覆蓋住創傷。角質化細胞遷移以後，角質化細胞加速增殖， 其容許代替在損傷中損失的細胞。在創傷被單層的角質化細胞覆蓋之後，形成新成層的表 皮，重建新的基底膜(20-23)。已證明幾種生長因子參與該過程，包括生長因子的EGF家族， KGF，PDGF和TGF0 1 (22-24)。在這些生長因子中，EGF和KGF與表皮角質化細胞的增殖和 遷移的調節密切相關(25，26)。對於了解創傷癒合生物學而言很重要的是了解觸發創傷中 的細胞遷移、增殖、並在創傷裂口上鋪放新的基質的信號。為了便於理解下面公開的發明，如下述定義多個術語。
術語「創傷(wound)」泛指通過多種方式(例如長時間臥床休息造成的褥瘡，外傷 導致的創傷，切口，潰瘍，燒傷等)中的任意一種導致的皮膚和皮下組織的損傷，其特徵各 不相同。創傷根據創傷的深度典型地可分為四個等級中的一種(i) I級創傷只限於上皮； (ii)II級創傷延伸到真皮；(iii) III級創傷延伸到皮下組織；(iv) IV級(或全厚度創 傷)暴露出骨頭的創傷(例如骨頭突出的壓力點(bony pressure point)例如較大的轉 節或骶骨)。術語「部分厚度創傷」指包括I-III級的創傷；部分厚度創傷的實例包括燒傷，褥 瘡，靜脈淤滯潰瘍，和糖尿病潰瘍。術語「深度創傷」包括III級和IV級創傷。術語創傷「癒合」指例如通過形成疤痕修復創傷的過程。短語「誘導或加速皮膚創傷的癒合過程」指誘導創傷收縮的肉芽組織形成和/或 誘導上皮形成(也就是在上皮生成新細胞)。創傷癒合可方便地通過減小的創傷面積檢測。
本發明考慮了治療所有的創傷類型，包括深度創傷和慢性創傷。術語「慢性創傷」指在三十天內沒有癒合的創傷。短語「轉化細胞」指通過引入外源核酸暫時或永久地改變細胞的核酸，所述外源核 酸整合到細胞基因組中，從遺傳上改變所述細胞，或者保持未整合狀態。本文所用的術語「順式作用元件」是指作為DNA結合蛋白的附著位點的基因區域 (例如增強子，操縱子(operator)和啟動子)，從而影響同一個染色體上一個或多個基因的 活性。本文所用的短語「反式作用因子」是指與順式作用元件結合併調節其有關基因表 達的活性的因子。例如，PDX1是與胰島素基因啟動子結合併調節其活性的反式作用因子。本文所用的短語「轉錄活化劑」是指能增加基因表達的因子。反式作用因子是直 接轉錄活化劑的實例。本文所用的術語「活化劑」是指增強活性的分子。本文所用的短語「被調節的表達和/或活化」是指增強的或抑制的表達和/或活 化。PKC是一條主要的信號傳導途徑，其可以調節角質化細胞的增殖和分化。PKC同 種型a，S，￡，n和4在皮膚中表達(4，10)。在構思本發明時，設想PKC表達和/或活 化的調節可以誘導細胞增殖和/或細胞分化，從而加速創傷的癒合過程。當實施本發明的 時候大量實驗證明了這個理論，表明PKC表達和/或活化的調節確實誘導細胞增殖和細胞 分化並加速創傷的癒合過程。在進一步的具體描述中，採用了多種不同的方法調節PKC的 表達和/或活化，從而加速了創傷的癒合過程。基於這些實驗發現，設計了其它方法。當實 施本發明的時候發現了一個引人注目的新現象-胰島素可作為PKC表達和/或活化的調節 劑。因此，胰島素可作為調節PKC表達和/或活化的治療劑以加速創傷的癒合過程。不同的PKC同種型的特徵以及它們對於細胞增殖和/或分化的效果對於皮膚創傷 癒合生物學是非常重要的。使用PKC腺病毒構建體能夠鑑別各種PKC同種型對於體外和體 內創傷癒合過程的特定作用。所有同種型都能夠特定地影響角質化細胞生長和分化的不同 方面。兩個同種型，PKCS和PKC(能夠特定地調節整聯蛋白的調控(參見下述實施例6)， 與基底膜的附著(參見下述實施例9)和半橋粒的形成(參見下述實施例8)。發現兩種同種型，PKC 6和PKC n調節表皮角質化細胞的增殖潛力(參見下述實施例7和11)。另外， PKCn的顯性失活同種型(DNPKCn)特別能夠在積極增殖的角質化細胞中誘導分化(參見 下述實施例12)。最後，還在體內系統中證實了不同PKC同種型對於皮膚創傷癒合過程的作 用。使用其中不同PKC同種型的表達被破壞的PKC無效的小鼠，本文顯示了皮膚角質化細 胞的附著和遷移過程所必需的PKCS和PKC4對於動物模型中體內創傷癒合過程也是很重 要的。(參見實施例19)。PKC無效的皮膚的整個皮膚的全厚度活組織檢查表明PKCS和 PKC(而不是PKC a對於創傷的正確癒合是必需的。而且，下述實施例22顯示了 PKC a抑 製劑有效促進體內創傷癒合，因而表明PKCa同種型可能對創傷癒合具有拮抗作用。PKCn具有獨特的組織分布。它主要在上皮組織中表達(27，28)。原位雜交 研究和免疫組織化學研究證明PKCn在正在分化的和分化的(differentiating and differentiative)層中高度表達(27)。本文的結果表明根據細胞生理學PKC n可作為皮 膚增殖和分化的功能性調節劑。當角質化細胞在低Ca2+條件下維持在增殖狀態的時候， PKCn誘導增殖的速度為對照角質化細胞的五到七倍。但是，當通過增加Ca2+濃度誘導細 胞分化的時候，與對照細胞相比分化以更快和更高的速度被誘導(參見實施例12)。這可 以解釋PKC n顯著誘導創傷癒合以及肉芽組織形成的能力，因為增殖能力和分化層形成都 實現了。有趣的是，體內創傷癒合結果和PKCn在胚胎組織中的表達，其通常在成年期不以 高水平表達PKC n，表明PKC n在其它組織的增殖和組織結構中可能具有作用。這包括神 經以及真皮和肌肉組織，它們可在創傷的肉芽組織中有效癒合。而且，通過使用顯性失活 (dominantnegative)突變體在積極增殖的細胞中特別調節角質化細胞的分化和誘導正常 分化的能力使得特別可以操縱分化並控制創傷癒合過程中的過度增殖失調。本文舉例說明了在裸鼠背部產生的創傷上，PKCn的癒合能力是體內施加的。下 述實施例14表明在局部感染後四天，對創傷施用PKCn表達構建體導致肉芽組織的形成。總的來說，本文的結果證明了調節不同PKC同種型的表達和/或活化(膜遷移) 是對抗創傷的有效工具。相應地，可以通過增加同種型PKC 8 , PKC n和PKC (的表達和/ 或活性，或者通過抑制同種型PKC a的表達和/或活性促進創傷癒合。因此，根據本發明的一個方面，提供了一種誘導或加速皮膚創傷或損傷的癒合過 程的方法，所述方法通過給皮膚創傷施用治療有效量的至少一種調節PKC表達和/或活化 的試劑來實現。根據本發明的該方面，用於實施該方法的藥物組合物因此包括作為活性成 分的治療有效量的至少一種用於調節PKC表達和/或活化的試劑；和藥學可接受的載體。本文所用的短語「皮膚創傷」是指任何類型的上皮創傷，包括但不限於潰瘍，例如 糖尿病性潰瘍，褥瘡，靜脈潰瘍，胃潰瘍和HI V相關潰瘍，糖尿病相關的創傷，燒傷，曬傷，老 化皮膚創傷，角膜潰瘍創傷，炎性胃腸道疾病創傷，腸炎性疾病創傷，克羅恩氏病創傷，潰瘍 性結腸炎，痔瘡，大皰性表面松解症創傷，皮膚起皰創傷，牛皮癬創傷，動物皮膚創傷，動物 糖尿病創傷，視網膜病創傷，口腔創傷(黏膜炎)，陰道黏膜炎創傷，牙齦病創傷，裂傷，手術 切口創傷和手術後粘連創傷(adhesis wound) 0本文所用的短語「皮膚損傷」是指任何類型的皮膚損傷或狀況例如，皺紋(例如紫 外線照射導致的皺紋)，皮膚紋，裂縫，腫塊，大毛孔(例如與附件結構如汗腺管，皮脂腺，或 毛囊相關的)，或不平或粗糙，皮膚失去彈性(功能性皮膚彈性蛋白喪失和/或失活)，下垂 (包括眼部和下頌浮腫)，皮膚硬度(firmness)喪失，皮膚緊實度喪失，皮膚變形後的回覆能力喪失，變色(包括黑眼圈)，斑皰，膚色灰黃，色素過量皮膚區域例如老年斑和雀斑，角 質物，異常的分化，過度角質化，彈性組織變性，膠原蛋白的破壞，以及皮膚角質，真皮，表皮 層，皮膚血管系統(例如毛細血管擴張或多叉血管)，以及皮下組織，特別是靠近皮膚的皮 下組織中的其它組織變化。 皮膚不被認為是典型的胰島素反應性組織。因此胰島素在皮膚中的效果主要歸於 它激活緊密相關的IGFR的能力。已表明在角質化細胞中，胰島素和IGF1可以刺激受體，激 活類似的下遊效應子(34)。但是，本發明證明了雖然這兩個生長因子都能以劑量依賴的方 式誘導角質化細胞增殖，但是每種激素都是以不同的信號傳導途徑發揮作用。最初指出的 胰島素和IGF1對角質化細胞增殖的不同的調節由以下發現證實這些激素以每種激素的 最大增殖誘導濃度一起加入的時候對於角質化細胞增殖具有加和作用(參見實施例15)。 為了鑑別胰島素和IGF1信號傳導途徑在角質化細胞增殖的調控上的不同點，檢測了已知 的可以調節角質化細胞增殖並且作為胰島素信號傳導下遊效應子的元件。這些研究表明在 角質化細胞的增殖中胰島素信號傳導特別受到PKCS的調節(參見實施例17)。在PKC蛋白 家族中PKC 6是一種獨特的同種型，特別參與各種細胞類型的生長和成熟(35)。但是，雖然 PKC6被證明特別受到幾種生長因子包括EGF，血小板衍生生長因子和神經遞質的刺激的 調節，但是它的生理學作用已表明是參與了細胞生長包括細胞凋亡、分化和細胞循環延遲 或停止的生長因子抑制(36-41)。近來表明在培養的小鼠角質化細胞中在升高Ca2+濃度之 後12-24小時內，a 6 0 4整聯蛋白複合體的選擇性喪失與K1的誘導互相關聯(6)。a 6 3 4 蛋白表達的喪失是轉錄和翻譯後事件，包括對a6和0 4鏈的處理的增加，導致的。在初步 的研究中在PKC的活化和a 60 4整聯蛋白的處理和調節之間建立起了聯繫。這些結果與 有關PKCS以及PKC4對於a 60 4表達的喪失和誘導角質化細胞的分離的半橋粒形成的 作用的以前的結果是一致的。然而，本發明發現了 PKCS的另一個作用，就是作為胰島素誘 導的角質化細胞增殖的靶。下述實施例表明只有胰島素的刺激，而不是多種生長因子，包括 但不限於EGF，KGF，PDGF，ECGF和IGF1，能夠使PKC 6，而不是皮膚中表達的任何其它PKC 同種型遷移並使其活化。當EGF，KGF，PDGF，ECGF和IGF1的促有絲分裂刺激沒有被PKC 6 的顯性失活突變體阻斷的時候，PKC 6對胰島素刺激的重要性進一步得到證實，在角質化細 胞增殖的調節中胰島素似乎是這種PKC同種型的主要活化劑(參見實施例17)。但是，當 角質化細胞被WT PKC6角質化細胞感染的時候，EGF和KGF的促有絲分裂刺激增加。這表 明PKCS的活化對於通過上遊信號傳導途徑對其它生長因子的增殖性刺激也是必需的。而 且，鑑定了下遊元件，其在胰島素誘導的PKCS活化和角質化細胞增殖中起調節作用，而且 鑑定了 STAT3，一種參與此過程的轉錄活化劑。STAT (信號傳導和轉錄激活子)蛋白是一個 轉錄因子家族，包括多種細胞因子和生長因子。在七個已知的STAT家族成員中，STAT3是 獨特的。靶定破壞STAT3而不是其它STAT家族成員導致早期胚胎致死。特別地，當在皮膚 中有條件地去除STAT3的時候，皮膚的重建被嚴重破壞。一旦被激活，STAT蛋白形成同源 二聚體或異源二聚體，遷移到細胞核中，與靶基因的DNA反應元件結合以誘導轉錄。發現在 角質化細胞中，PKC 6而不是皮膚中表達的其它PKC同種型(PKCa，4，n和O與STAT3 組成型相關(參見實施例18)。而且，胰島素通過對PKCS的特異性激活調節STAT 3的磷 酸化，活化和核遷移。通過藥物抑制劑，卡馬拉素或者過表達顯性失活PKCS突變體導致的 對PKCS活性的抑制會阻斷胰島素誘導的STAT3活化和核移位。最終，顯性失活PKCS突變體的過表達會抑制STAT3的過表達誘導的角質化細胞增殖(參見實施例18)。這些結果表 明在皮膚角質化細胞增殖中胰島素誘導的PKCS活性對於STAT 3的轉錄激活的作用。由 於STAT3對於皮膚重建非常重要，是多種細胞因子和生長因子的下遊效應子，全部這些結 果表明PKCS的活化是通過多種皮膚生長因子介導角質化細胞增殖的主要下遊元件。特別 地，PKCS是糖尿病病人的缺陷性創傷癒合的發病機理的主要候選物。PKCS和創傷癒合之 間的聯繫也在體內得到了確證。使用新構建的PKCS無效小鼠，本文表明了缺少PKCS會 延遲小鼠皮膚的創傷癒合(參見實施例19)。在幾種其它系統中也確定了 PKC 6和胰島素 信號傳導之間的聯繫。例如，最近表明在肌肉培養物中，PKCS調節胰島素誘導的葡萄糖轉 運(42，43)。類似地，在過表達胰島素受體的細胞中，表明胰島素刺激與PKCS的活化有關 (44-46)。但是，雖然在這些研究中胰島素介導的PKCS的活化與胰島素的代謝效果有關， 這是第一個將PKCS與胰島素介導的細胞增殖聯繫起來的報導。鑑別了 PKCS在角質化細 胞的增殖和早期分化階段的控制中起的雙重作用，其中在所述早期分化階段中，細胞喪失 了與下面的基底膜之間的附著。這表明胰島素誘導的PKCS作為調節皮膚的增殖與分化之 間的生理平衡的主要候選者。因此，根據本發明的教導，通過使創傷細胞接觸胰島素來調節PKC表達和/或活 化。這可以通過多種方式實現，如下述的進一步例示。一種方式是直接將胰島素給予創傷。如下述實施例21和22所述，以0. 1-10 u M 的濃度對創傷局部施用胰島素有效促進表皮和真皮閉合以及隨後的創傷癒合。然而，令人 驚訝的和出乎意料的是，胰島素和PDGF-BB生長因子，或者和PKC a抑制劑組合施用比單獨 施用胰島素對創傷癒合過程產生了顯著的和協同性的促進。因此，根據本發明的另一個方面，提供了一種誘導或加速皮膚創傷或損傷的癒合 過程的方法。所述方法通過給皮膚創傷施用治療有效量的胰島素和至少一種與胰島素協 同作用的其它試劑來實現，以誘導或加速皮膚創傷或損傷的癒合過程。優選地，所述試劑 是PKC a抑制劑。進一步優選地，所述試劑是生長因子例如PDGF，EGF，TGF ^，KGF, ECGF或 IGF1，最優選地所述試劑是PDGF-BB。胰島素的直接給藥，或者單獨給藥或者與另一種試劑組合給藥，可以通過單次或 重複應用來實現。在實施本發明的時候，發明人驚訝地發現以lPM的濃度單次施用胰島素 對於創傷癒合比以類似濃度進行七次的每天重複給藥顯著更有效(參見下述實施例20)。因此，根據本發明的另一個方面，提供了一種誘導或加速皮膚創傷或損傷的癒合 過程的方法，包括給皮膚創傷施用單一劑量單位的治療有效量的胰島素。優選所述單一劑 量單位包括0. 001到5nM,優選0. 01到0. 5nM胰島素的，例如，水溶液，凝膠，霜劑，糊劑，洗 劑，噴霧，懸液，粉末，分散劑，油膏劑或軟膏劑製劑，其量足以覆蓋1cm面積的皮膚創傷，例 如 0. 01-0. 2ml。將胰島素施用在創傷上的時間安排可能很重要，如下述實施例部分中的實施例20 中所述。例如對4天的創傷單次施用胰島素產生有效的創傷癒合。因此，根據本發明的另 一個方面，提供了一種誘導或加速陳舊皮膚創傷的癒合過程的方法，包括給皮膚創傷施用 單一劑量的治療有效量的胰島素。本文所用的短語「陳舊皮膚創傷」是指至少一天的，至少兩天的，至少三天的，優選 至少四天的皮膚創傷。
根據本發明的另一個方面，用於誘導或加速皮膚創傷或損傷的癒合過程的藥物組 合物包括，作為活性成分的，治療有效量的胰島素，至少一種與胰島素協同作用的其它試 劑，以及設計用於藥物組合物的局部應用的藥學可接受的載體。優選地，所述試劑是PKCa 抑制劑或生長因子例如PDGF，EGF，TGF ^，KGF，ECGF或IGF1，最優選是PDGF-BB。藥學可接 受的載體可以是但不限於凝膠，霜劑(cream)，糊劑，洗劑，噴霧，懸液，粉末，分散劑，油膏劑 (salve)和軟膏劑，下文將進一步詳細描述。還可以使用固體支持物以對創傷延長釋放胰島 素。應當理解所述胰島素可以是天然的或者優選是重組的，可以是人源的或是任何其它合 適來源的。根據本發明的另一個方面，用於誘導或加速皮膚創傷或損傷的癒合過程的藥物組 合物可以包括所選擇的能夠誘導或加速皮膚創傷或損傷的癒合過程的單一劑量單位的胰 島素，以及設計用於藥物組合物的局部施用的藥學可接受的載體。優選地，所述單一劑量單 位的胰島素是在0. 01-0. 2ml製劑的劑量單位中的0. 001到5nM，優選0. 01到0. 5nM。在本發明的另一個實施方案中，將表達和分泌胰島素的細胞植入創傷，以誘導或 加速皮膚創傷或損傷的癒合過程。這種能產生胰島素的細胞可以是天然產生胰島素的細 胞，或者可以是被轉化以產生和分泌胰島素的細胞。所述細胞可以用例如重組PDX1基因 (參見 GeneBankAccession No. AH005712, AF035260, AF035259)轉化，該基因是產生和分泌 胰島素的反式作用因子。或者，所述細胞可以通過基因敲入的方式用順式作用元件序列轉 化，例如整合到所述細胞的內源胰島素基因上遊的強的組成型或誘導型啟動子，以轉化細 胞以過度產生和分泌天然胰島素。這是可以實現的，因為胰島素基因的上遊區域已經被克 隆(參見Accession No.EOOOll, NM000207)。另外，所述細胞可以用重組胰島素基因(例 如Accession No. J02547)轉化，因此使得所述細胞產生和分泌重組胰島素。因此根據本發明的該方面，用於誘導或加速皮膚創傷或損傷的癒合過程的藥物組 合物包括，作為活性成分的，胰島素分泌細胞，以及設計用於藥物組合物的局部施用的藥學 可接受的載體。有利的是，施用給創傷的胰島素分泌細胞能形成分泌顆粒，因而分泌所產生 的胰島素。所述胰島素分泌細胞可以是內分泌細胞。其可以是人源的或組織相容性人化的 動物來源的。最優選地，所述胰島素分泌細胞或者是轉化的，或者是自體來源的。由所述胰 島素分泌細胞分泌的胰島素優選是人胰島素或者具有人胰島素的胺基酸序列。所述胰島素 分泌細胞可以是成纖維細胞，上皮細胞或角質化細胞，前提是如上所述進行轉化以使這些 細胞產生和分泌胰島素。在另一個實施方案中，皮膚創傷的細胞被轉化以產生和分泌胰島素，以誘導或加 速皮膚創傷的癒合過程。因此根據本發明的該方面，用於誘導或加速皮膚創傷的癒合過程的藥物組合物包 括，作為活性成分的，設計用於轉化皮膚創傷細胞以產生和分泌胰島素的核酸構建體，以及 設計用於藥物組合物的局部施用的藥學可接受的載體。上述的任何一種轉化方法，例如用編碼胰島素的構建體轉化，用含有將通過基因 敲入的方式插入到內源胰島素基因下遊的順式作用元件的構建體轉化，以及用編碼反式作 用因子的構建體轉化以激活內源胰島素的產生和分泌，都可以用於本發明的實施方案中。由於生命期短，可能發生分化以及無法分離穩定的轉化子，很難用傳統方法將外 源基因有效引入原代細胞，從而阻礙了以前對於不同PKC同種型對於皮膚的效果的研究。為了克服這些障礙，使用病毒載體引入感興趣的基因。對病毒基因組進行修飾得到複製缺 陷型病毒形式的病毒載體。最廣泛使用的病毒載體是逆轉錄病毒和腺病毒，它們可用於實 驗目的和基因治療目的(13)。特別地，與逆轉錄載體相比，在不複製型細胞中腺病毒感染 的高效率，病毒的高滴度和轉導蛋白(transduced protein)的高表達使得該系統可非常有 利地用於原代培養物。由於腺病毒不整合到宿主基因組中，穩定的病毒滴度可以成為複製 缺陷型，因此該病毒構建體在人和動物模型中引起惡性腫瘤的危險最小(14)。至今為止， 在皮膚中，已經成功使用腺病毒構建體在離體和體內方法中進行高效感染(15，16)。在本 研究中使用由I.Saito和他的同事們開發的一種腺病毒載體(17)。粘粒盒(pAxCAwt)具 有幾乎是全長的腺病毒5基因組，但是不含有E1A，E1B和E3區域，使得該病毒為複製缺陷 型。它含有複合的CAG啟動子，由巨細胞病毒立即早期增強子，小雞肌動蛋白啟動子， 和兔球蛋白多聚腺苷酸化信號組成，可強烈誘導插入的DNA的表達(13，17)。感興趣 的基因插入到粘粒盒中，然後與腺病毒DNA末端蛋白複合體(TPC) —起共轉染到人胚胎腎 293細胞中。在表達E1A和E1B區域的293細胞中，在粘粒盒和腺病毒DNA-TPC之間發生 重組，以傳統方法的一百倍效率產生所需的重組病毒。這種高效率主要是由於使用腺病毒 DNA-TPC代替了蛋白質(proteinesecODNA。而且，較長同源區域的存在增加了同源重組的 效率。由於存在多個EcoT221位點，避免了複製型病毒的再生。應當注意，角質化細胞是用 不同的PKC重組腺病毒感染的，證明24小時後有效過表達PKC同種型(參見實施例1)。因此，根據本發明，另一種調節PKC表達和/或活化的方法是通過在皮膚創傷 細胞中誘導PKC過表達。這可以通過用順式作用元件序列轉化細胞來實現，所述順式作 用元件序列通過同源重組整合到細胞內源蛋白激酶C的上遊從而使所述細胞產生天然 蛋白激酶C。另外，這也可以通過用重組蛋白激酶C基因轉化細胞實現，例如但不限於 PKC-3 1 基因(Accession No. X06318，NM002738)，PKC-3 2 基因(Accession No. X07109)， PKC-y 基因(Accession No. L28035)，PKC- 0 基因(Accession No. L07032)，PKC-A 基因 (AccessionNo. D28577)，PKC-t 基因(Accession No. L18964), PKC- a 基因(Accession No. X52479)，PKC-S 基因(Accession No. L07860, L07861), PKC-e 基因(Accession No. X72974), PKC- n 基因(AccessionNo. Z15108)和 PKC-『 基因(Accession No. Z15108, X72973，NM002744)，從而使所述細胞產生重組蛋白激酶C。根據本發明的該方面，用於誘導或加速皮膚創傷的癒合過程的藥物組合物包括， 作為活性成分的，設計用於轉化皮膚創傷細胞以產生蛋白激酶C的核酸構建體，以及設計 用於所述藥物組合物局部施用的藥學可接受的載體。根據本發明，另一種調節PKC表達和/或活化的方法是用PKC活化劑，例如但不限 於Ca2+，胰島素或苔蘚蟲素1來實現的，以誘導或加速皮膚創傷的癒合過程。因此根據本發明的此方面，用於誘導或加速皮膚創傷或損傷的癒合過程的藥物組 合物包括，作為活性成分的，治療有效量的PKC活化劑，以誘導或加速皮膚創傷或損傷的愈 合過程，以及藥學可接受的載體。根據本發明，另一種調節PKC表達和/或活化的方法是下調PKC同種型的表達和
/或活性。PKC同種型的活性的下調可以使用PKC偽底物同種型抑制劑，例如PKCa，PKC4或 PKCn偽底物抑制劑(CalbioChem，California USA)，或者另一種PKC同種型抑制劑例如藥用月太 LY379196(Elly Lilly，USA)。或者，PKC同種型的活性的下調可以用顯性失活(DN)PKC腺病毒構建體來實現，如 下述實施例部分所述。PKC同種型的表達的下調可以使用小幹擾RNA(siRNA)分子。RNA幹擾是一個兩步 過程。第一步，定義為起始步驟，可能是通過Dicer，dsRNA特異性核糖核酸酶的RNase III 家族的成員的作用，以依賴於ATP的方式處理(切割)dsRNA(直接引入或通過轉基因或病 毒)，將輸入的dsRNA消化為21-23個核苷酸(nt)的小幹擾RNA(siRNA)。後續切割將會 將RNA降解為19-21bp的雙鏈(siRNA)，每個都有2，-核苷酸3，突出端[Hutvagner and Zamore Curr. Opin. Genetics andDevelopment 12:225-232(2002)；禾口 Bernstein Nature 409 363-366(2001)]o在效應步驟中，siRNA雙鏈與核酸酶複合體結合形成RNA誘導的沉默複合體 (RISC)。RISC的激活需要siRNA雙鏈以ATP依賴的方式解旋。然後活性RISC通過鹼 基對的相互作用靶定同源轉錄物，從siRNA的3』末端將mRNA切割成12個核苷酸的片 段[Hutvagner andZamore Curr. Opin. Genetics and Development 12 -.225-232 (2002)； Hammond et al. (2001) Nat. Rev. Gen. 2 110-119 (2001)；禾口 SharpGenes. Dev. 15 : 485-90 (2001)]。雖然切割的機制還有待闡明，研究表明每個RISC含有一個單個的 siRNA 禾口 RNAase[Hutvagner andZamore Curr. Opin. Genetics and Development 12: 225-232(2002)]。由RNAi的顯著效力，表明RNA i途徑中具有擴增步驟。可以通過拷貝輸入的 dsRNA，這會產生更多的siRNA，或者通過複製形成的siRNA來擴增。另外或此外，可以 通過 RISC 的多轉換事件(multipleturnover events)實現擴增[Hammond et al. Nat. Rev. Gen. 2 110-119(2001), Sharp Genes. Dev. 15 485-90(2001) ；Hutvagnerand Zamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232(2002)]。要獲得更多關於 RNAi 的 信息，參見下述綜述 TuschlChemBiochem. 2 :239_245 (2001) ；Cullen Nat. Immunol. 3 597-599(2002)；禾口 Brant1 Biochem. Biophys. Act. 1575 15—25(2002)。可以如下所述合成適用於本發明的RNAi分子。首先，在PKC同種型mRNA序列的 AUG起始密碼子的下遊尋找AA 二核苷酸序列。每個AA和3』附近19個核苷酸的出現計錄 為潛在的siRNA靶位點。由於在調控蛋白結合位點中更富含不翻譯區(UTR)，優選siRNA靶 位點選自開放閱讀框架。UTR結合蛋白和/或翻譯起始複合物會干擾siRNA核酸內切酶復 合物的結合[Tuschl ChemBiochem. 2 :239_245]。應當理解，針對不翻譯區的siRNA也是有 效的，由GAPDH證明，其中針對5』 UTR的siRNA介導細胞GAPDH mRNA減少大約90 %，完全 破壞了蛋白水平(www, ambion. com/techlib/tn/91/912. html)。其次，用任何序列比對軟體，例如NCB I伺服器上的BLAST軟體(www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)將潛在的靶位點與合適的基因組資料庫(例如人，小鼠，大鼠等)相比較。 篩選出與其它編碼序列具有顯著同源性的推定的靶位點。選擇合格的靶序列作為siRNA合成的模板。優選的序列是具有低的G/C含量的那 些，這是因為這種序列已證明與那些G/C含量高於55%的序列相比能更有效地介導基因沉 默。優選沿著靶基因的長度選擇幾個靶位點進行評價。為了更好地評價所選的siRNA，優選 同時使用負對照。負對照siRNA優選與所述siRNA具有同樣的核苷酸成分，但是與基因組沒有顯著的同源性。因此，優選使用siRNA的混雜核苷酸序列，前提是它不會與任何其它基 因具有任何顯著的同源性。根據本發明，合適的siRNA可以是，例如，能抑制PKCa表達的 siRNA，例如SEQ ID NO :1_6的任何核酸序列。另一種能下調PKC同種型的試劑是能特異性切割PKC同種型的mRNA轉錄物或 DNA序列的DNA酶分子。DNA酶是能切割單鏈和雙鏈靶序列的單鏈多核苷酸(Breaker， R. R. and Joyce, G.Chemistry andBiology 1995 ；2 :655；Santoro, S. ff. &Joyce, G. F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997 ;943 :4262)。已提出了 DNA 酶的通用模型(「10-23」 模型)。 「 10-23」 DNA酶具有一個15個脫氧核糖核苷酸的催化結構域，側翼是兩個各自具有七個到 九個脫氧核糖核苷酸的底物識別結構域。這種類型的DNA酶可以在嘌呤嘧啶結合處有效 切割其底物 RNA (Santoro，S. ff. &Joyce, G. F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 199 ；DNA 酶的綜述 參見 Khachigian，LM[Curr Op in Mol Ther4 119-21 (2002) ]) 構建和擴增合成的、基因工程的能識別單鏈的和雙鏈的靶切割位點的DNA酶的例 子已在Joyce等的U. S. Pat. No. 6，326，174中公開。最近觀察到類似設計的針對人尿激酶受 體的DNA酶抑制尿激酶受體的表達，並成功抑制體內結腸癌細胞轉移(Itoh et al, 20002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther www.asgt.org)。在另一禾中應用中，互補於 bcr-abl致癌基因的DNA酶成功抑制白血病細胞中致癌基因的表達，在CML和ALL中減少自 體骨髓移植的復發率。PKC同種型的下調還可以使用能特異與編碼所述PKC同種型的mRNA轉錄物雜交的 反義多核苷酸來實現。可用於有效下調PKC同種型的反義分子的設計要考慮反義技術的兩個重要方面。 第一個方面是寡核苷酸向合適細胞的細胞質中的遞送，第二個方面是能以抑制其翻譯的方 式在細胞中特異結合指定mRNA的寡核苷酸的設計。現有技術給出了許多遞送策略，可用於將寡核苷酸有效遞送到多種細胞類 型中[參見，例如 Luft J Mol Med 76:75-6(1998) ；Kronenwett et al. Blood 91 852-62(1998) ；Rajur et al.Bioconjug Chem 8:935—40(1997) ；Lavigne et al. Biochem BiophysRes Commun 237:566—71(1997)禾口 Aoki et al. (1997)BiochemBiophys Res Commun 231 :540_5(1997)]。此外，根據能解釋靶mRNA和寡核苷酸中結構變化的能量的熱力學循環，鑑別與 它們的靶mRNA具有最高的預測的結合親和力的序列的算法也是可獲得的[參見，例如， Walton et al.Biotechnol Bioeng65 1—9 (1999)]。這些算法已成功用於實現細胞中的反義方法。例如，Walton et al.開發的算法 使得科學家成功設計出了兔球蛋白(RBG)和小鼠腫瘤壞死因子-a (TNFa)轉錄物的 反義寡核苷酸。同一個研究小組最近報導了針對三個模型靶mRNA (人乳酸脫氫酶A和B和 大鼠gpl30)合理選擇的寡核苷酸在細胞培養物中的反義活性，其是用證明在幾乎所有情 況下都有效的動態PCR方法評估的，包括用磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸化學對兩種細 胞類型中的三個不同靶的檢測。此外，還已公開了幾種用體外系統設計和預測特定寡核苷酸的效率的方法 (Matveeva et al. , Nature Biotechnology 16:1374-1375(1998))。幾個臨床實驗已證明反義寡核苷酸是安全性，可行性和活性。例如，適用於治療癌症的反義寡核苷酸已經成功使用[Holmund et al.，Curr Op in Mol Ther 1 372-85 (1999)]，而用靶定c-myb基因，p53和Bcl_2的反義寡核苷酸治療血液腫瘤也進入 了臨床實驗，已顯示被病人耐受[Gerwitz Curr Op in Mol Ther 1 =297-306 (1999) ] 最近，已報導了在小鼠模型中反義介導的人乙醯肝素酶(h印aranase)基因表達 的抑制可抑制人癌細胞的胸膜擴散[Uno etal.，Cancer Res 61 :7855_60 (2001)]。因此，目前的共識就是最近反義技術領域中的進展，如上所述，導致產生了高度精 確的反義設計算法和多種寡核苷酸遞送系統，使得普通技術人員能夠設計和實施適用於下 調已知序列的表達的反義方法而不需要過度的試驗和錯誤實驗。另一種能下調PKC同種型的試劑是能特異切割編碼PKC同種型的mRNA轉錄物的 核糖酶(ribozyme)分子。核糖酶越來越多地用於基因表達的序列特異性抑制，通過切割編 碼感興趣蛋白的 mRNA[Welchet al.，Curr Op in Biotechnol. 9 :486_96 (1998)]。能夠設 計用於切割任何特異靶RNA的核糖酶，這使得核糖酶成為基礎研究和治療應用中的很有價 值的工具。在治療領域，核糖酶用於在感染性疾病中靶定病毒RNA，在癌症中靶定優勢的致 癌基因以及在遺傳疾病中靶定特異的體細胞變異[Welch et al.，Clin Diagn Virol. 10 163-71(1998)]。最值得注意的是，有幾種用於H I V患者的核糖酶基因治療方案已經在 進行I期實驗。最近，核糖酶用於進行轉基因動物研究，基因靶的驗證和途徑的闡明。有 幾種核糖酶正在進行不同階段的臨床實驗。ANGI0ZYME是第一個化學合成的用在人臨床實 驗研究中的核糖酶。ANGI0ZYME特異性抑制VEGF_r (血管內皮生長因子受體)，一種血管 生成途徑中的關鍵成分的形成。Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.與其它公司證明了動 物模型中抗血管生成治療的重要性。HEPTAZYME，一種設計用於選擇性破壞C型肝炎病毒 (HCV)RNA的核糖酶，已發現在細胞培養物的檢測中有效減少C型肝炎病毒RNA (Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated-ffEB ijlt)。優選地，用於誘導或加速皮膚創傷或損傷的癒合過程的藥物組合物進一步 包括至少一種選自由以下成員構成的組的其它試劑激素，生長因子，脂肪細胞激素 (adipokine)，PKCSRACK和GW9662。合適的激素包括，但不限於胰島素。合適的生長因子 可以是但不限於白介素-6(IL_6)，角質化細胞生長因子(KFG)或腫瘤壞死因子a (TNF a )。 合適的脂肪細胞激素可以是但不限於adipsin或脂聯素(adiponectin)。在實施本發明的時候，發明人驚訝地和出乎意料地發現共聚物-1 (glatiremar acetate)能夠在體外和體內顯著促進創傷癒合(參見下述實施例部分的實施例26)。以前 已知共聚物-1是一種免疫調節劑，用於治療多發性硬化和中樞神經系統疾病(美國專利號 6，620，847，6，362，161，6，342，476，6，054，430，6，046，898，5，981，589 和 5，800，808 ；美國 申請序列號10/615865，10/666857和10/014477)，現有技術沒有描述或提示共聚物-1可用 於加速創傷癒合過程。因此根據本發明的另一個方面提供了一種用於誘導或加速皮膚創傷或損傷的愈 合過程的方法，所述方法包括給皮膚創傷或損傷施用治療有效量的共聚物-1，優選濃度範 圍為1到500 u g/ml。因此根據本發明的該方面用於實施該方法的藥物組合物包括，作為活 性成分的，治療有效量的共聚物-1和藥學可接受的載體。本發明的治療/藥學活性成分可以以其本身，或者與合適的載體和/或賦形劑混 合成藥物組合物施用給創傷。適用於本發明的藥物組合物包括其中含有有效量的能獲得預期治療效果的活性成分的那些組合物。這裡所用的「藥物組合物」指本文所述的一種或多種活性成分，蛋白質，化學品，核 酸或細胞，或其生理學可接受的鹽或藥物前體，與其它化學組分例如傳統藥物，生理學合適 的載體和賦形劑的製劑。藥物組合物的目的是便於將化合物或細胞給予生物體。本發明 的藥物組合物可以用本領域公知的方法製備，例如通過傳統的混合，溶解，制粒，包糖衣，粉 碎，乳化，製成膠囊，包埋或凍幹過程製備。在下文中，短語「生理學合適的載體」和「藥學可接受的載體」可互換使用，均指不 會對生物體引起顯著刺激以及不會破壞給藥的結合物(conjugate)的生物活性和性質的 載體或稀釋劑。本文中術語「賦形劑」是指添加到藥物組合物中以進一步方便所述活性成分的加 工和給藥的惰性物質。賦形劑的非限制性實例包括碳酸鈣，磷酸鈣，不同的糖和不同類型的 澱粉，纖維素衍生物，明膠，植物油和聚乙二醇。活性成分的配製和給藥技術可見「Remington's PharmaceuticalSciences, 」Mack Publishing Co.，Easton，PA的最後一版，在此引入作為參考。儘管活性成分可經不同的途徑給藥，如前所述，為本發明的目的，局部給藥方式是 優選的，助以局部載體。局部載體通常適用於活性成分的局部給藥，包括本領域公知的任何 這種材料。為將所述組合物製成所需形式可選擇局部載體，例如流體或非流體載體，洗劑， 霜劑，糊劑，凝膠，粉末，軟膏劑，溶劑，流體稀釋劑，滴劑等，並且可以包括天然存在的或合 成來源的物質。明顯所選的載體必須不能對局部製劑的活性試劑或其它成分產生不良影 響，對於局部製劑中的所有成分應是穩定的。可用於本文的合適的局部載體的實例包括水， 酒精和其它無毒的有機溶劑，甘油，礦物油，矽氧烷，凡士林，羊毛脂，脂肪酸，植物油，對羥 基苯甲酸酯，蠟等。本文中優選製劑是無色，無味的軟膏，流體，洗液，霜和凝膠。軟膏(ointment)是半固體製劑，典型地是以礦脂或其它石油衍生物為基質。本領 域技術人員知道，待使用的特定的軟膏基質能夠提供最佳的活性成分遞送，優選能夠提供 其它需要的特性以及例如軟化作用等。與其它載體或媒介物一樣，軟膏基質應是惰性的，穩 定的，無刺激性的不致敏的。如 Remington :The Science and Practice ofPharmacy, 19th Ed. (Easton, Pa. :Mack Publishing Co.，1995)的 1399-1404 頁中指出的，軟膏基質可分 為四類油質基質；可乳化基質；乳液基質；和水溶性基質。油質軟膏基質包括，例如植物 油，獲自動物的脂肪，以及從石油獲得的半固體碳氫化合物。可乳化軟膏基質，也稱為可吸 收軟膏基質，含少量或不含水，包括，例如羥基硬脂酸甘油硫酸酯，無水羊毛脂和親水礦脂 (petrolatum)。乳液軟膏基質是油包水(W/0)或水包油(0/W)乳液，包括，例如十六烷醇， 單硬脂酸甘油酯，羊毛脂和硬脂酸。優選的水溶性軟膏基質是用不同分子量的聚乙二醇制 備的；此夕卜，進一步的信息參考 Remington :TheScience and Practice of Pharmacy。洗液是用於皮膚表面並且不用摩擦的製劑，通常是流體或半流體製劑，其中固體 顆粒，包括活性試劑，存在於水或酒精基質中。洗液通常是固體懸液，可含有水包油類型的 流體油狀乳液。洗液是本文中優選用於治療身體大面積的製劑，這是由於更具流動性的組 合物容易施用。通常洗液中的不溶物質必需磨碎。洗液典型地包括懸浮試劑以更好地分 散，以及用於使所述活性試劑局部化和保持與皮膚接觸的化合物，例如甲基纖維素，羧甲基 纖維素鈉等。
含有選定的活性成分的霜劑(creams)，如本領域公知的，是粘性流體或半固體的 乳液，是水包油或油包水的。霜劑基質是可水洗的，含有油相，乳化劑和水相。油相，有時也 稱為「內部」相，通常包括礦脂和脂肪醇例如十六烷醇或十八烷醇；水相通常，但不是必需 的，體積超過油相，通常含有溼潤劑。霜劑中的乳化劑，在Remington，上文中有解釋，通常是 非離子的，陰離子的，陽離子的或兩性的表面活性劑。凝膠製劑優選應用於頭皮。在局部活性成分製劑領域工作的技術人員知道，凝膠 是半固體，懸液類型的系統。單相凝膠含有基本上均勻分布於載體流體中的有機大分子，典 型地是水性的，但是優選還含有酒精以及任選的，油。核酸載體包括但不限於脂質體，包括靶定的脂質體，核酸絡合劑，病毒包被等。但 是也可以使用裸露核酸轉化。本發明的局部製劑中可以包含本領域技術人員公知的各種添加劑。例如，可以用 溶劑溶解某些活性成分物質。其它任選的添加劑包括皮膚滲透增強劑，遮光劑，抗氧化劑， 膠凝劑，增稠劑，和穩定劑等。如上所述的，根據本發明，用於治療創傷的局部製劑可以含有傳統用於治療這 種創傷的其它藥學活性試劑或成分。包括免疫抑制劑，例如環孢黴素，抗代謝物，例如氨 甲喋呤，皮質類固醇，維生素D和維生素D類似物，維生素A或其類似物，例如依曲替酯 (etretinate)，焦油，煤焦油，抗癢和促角質化(keratoplasties)試劑，例如杜松油，角質層 分離試劑，例如水楊酸，軟化劑，潤滑劑，防腐劑和消毒劑，例如殺菌劑蒽三酚(也稱為蒽 啉)，光敏劑，例如補骨脂素和甲氧補骨脂素和UV輻射。還可以加入其它試劑，例如抗微生 物試劑，抗真菌試劑，抗生素和抗炎性試劑。還可以同時進行氧處理(高氧壓)。本發明的局部組合物還可以用傳統的皮膚貼片或用品遞送到皮膚上，其中所述活 性成分組合物包含於層狀結構中，其中層狀結構作為藥物遞送裝置固定於皮膚上。在這樣 一種結構中，所述活性成分組合物含於一層，或「儲庫(reservoir) 」中，其上面是表面墊層 (upperbacking layer)。所述層狀結構可含有單個儲庫，或者它可以含有多個儲庫。在一 個實施方案中，所述儲庫含有聚合物基質的藥學可接受的接觸粘附物質，以在活性成分遞 送期間將該系統固定於皮膚上。合適的皮膚接觸粘附物質的實例包括但不限於聚乙烯，聚 矽氧烷，聚異丁烯，聚丙烯酸酯和聚氨酯等。特定的聚合物膠粘劑的選擇取決於特定的活 性成分，媒介物等，也就是，所述膠粘劑必須與含有活性成分的組合物中的所有組分是相容 的。另外，含有活性成分的儲庫和皮膚接觸膠粘劑應當是獨立的和不同的層，膠粘劑在儲庫 之下，在這種情況下，儲庫可以是如上所述的聚合物基質，或者可以是液體或水凝膠儲庫， 或者可以是其它一些形式。這些層狀物中的墊層是作為該裝置的表面層，作為層狀結構的主要結構元件，並 給予該裝置以相當多的彈性。選擇作為墊層的材料應當是對所述活性成分和含有所述活性 成分的組合物中的任何其它組分都基本不能滲透的，從而防止任何組分通過該裝置的表面 層喪失。所述墊層可以是閉合的或是不閉合的，這取決於是否希望皮膚在活性成分遞送過 程中水化。墊層優選由優選柔韌的彈性材料的薄片或膜組成。適用於墊層的聚合物的實例 包括聚乙烯，聚丙烯和聚酯。在儲存過程中和使用前，所述層狀結構還包括釋放襯墊。立即使用前從所述裝置 上除去該層以使其基底面，或者是活性成分儲庫或者是獨立的接觸粘附層暴露，使得所述系統能夠固定於皮膚上。所述釋放襯墊應當用活性成分/載體不可透過的材料製成。該裝置可以用本領域公知的傳統技術製造，例如將膠粘劑，活性成分和載體的流 體混合物澆模於墊層上，然後使釋放襯墊成層。類似地，可以將膠粘劑混合物澆模於釋放襯 墊上，然後使墊層成層。或者，可以在沒有活性成分或賦形劑的情況下製備活性成分儲庫， 然後通過「浸吸(soaking)，，在活性成分/載體混合物中來載入。與本發明中的局部製劑一樣，包含於這些層狀系統的活性成分儲庫中的活性成分 組合物可以含有多種組分。在一些情況下，所述活性成分可以以「純(neat) 」的方式遞送， 即不含其它的流體。但是在大部分情況下，所述活性成分溶解，分散或懸浮於合適的藥學可 接受的載體，典型地是溶劑或凝膠中。其它可能含有的組分包括防腐劑，穩定劑和表面活性劑等。本文所述的藥物組合物還可以包含合適的固體或凝膠相載體或賦形劑。這種載體 或賦形劑的實例包括但不限於碳酸鈣，磷酸鈣，各種糖，澱粉，纖維素衍生物，明膠和聚合物
例如聚乙二醇。劑量取決於病痛的類型，嚴重程度和表現形式，以及患者對於所使用的活性成分 和劑型的反應，特定綴合物的效力和所使用的給藥餘途徑。所屬領域普通技術人員能容易 地確定最佳的劑量，劑量給藥方法和重複率。正確的配方，給藥途徑和劑量可以由各個醫師 根據患者情況選擇(參見例如，Fingl, et al.，1975，in "The PharmacologicalBasis of Therapeutics，，，Ch. 1 p. 1)。因此，依賴於要治療的狀況的嚴重程度和反應性，劑量可以是單次或是重複給藥， 治療持續幾天到幾周，或者直至治癒或皮膚創傷減小。在本發明的某些方面中使用體內或離體(細胞)基因治療技術，其涉及細胞轉化 和基因敲入類型的轉化。本文所用的基因治療指將感興趣的遺傳物質(例如DNA或RNA)轉 入宿主中以治療或防止遺傳性的或獲得性的疾病或狀況或表型。所述感興趣的遺傳物質編 碼希望在體內產生的產品(例如蛋白質，多肽，肽，功能性RNA，反義RNA)。例如，所述感興 趣的遺傳物質可以編碼具有治療價值的激素，受體，酶，多肽或肽。其綜述一般可參見「Gene Therapy，，(Advanced inPharmacology 40，Academic Press，1997)原文。基因治療的兩種基本方法是(1)離體；和(ii)體內基因治療。在離體基因治療中 從患者中取出細胞或者從另一種來源衍生出細胞，培養並在體外治療。通常，將功能性的替 換基因通過合適的基因遞送載體/方法(轉染，轉導，同源重組等)和，如果需要時，表達系 統引入細胞，然後在培養物中使修飾的細胞擴增並使其返回宿主/患者中。這些遺傳上重 新植入的細胞已顯示在原位表達轉染的遺傳物質。在體內基因治療中，靶細胞不從受試者中取出，而是將要轉移的遺傳物質原 位，也就是在接受體中引入接受生物體的細胞中。在另一個實施方案中，如果宿主基 因是有缺陷的，所述基因在原位被修復(Culver，1998. (Abstract)Antisense DNA&RNA basedtherapeutics, February 1998，Coronado, CA)。這些遺傳上改變的細胞已顯示在原 位表達轉染的遺傳物質。所述基因表達載體能夠將異源核酸遞送/轉移到宿主細胞中。所述表達載體可以 包括能以細胞選擇性的方式控制所述核酸的靶定，表達和轉錄的元件，如本領域公知的。應 當注意到通常所述基因的5』UTR和/或3』UTR可被表達載體的5』UTR和/或3』UTR取代。
34因此，本文所述的表達載體可以，如果需要的話，不包括要轉移的實際基因的5』 UTR和/或 3』 UTR，只包括特定的胺基酸編碼區域。所述表達載體可以包括用於控制所述異源物質的轉錄的啟動子，所述啟動子可以 是組成型的或是誘導型的以允許選擇性轉錄。任選地可以包括獲得必要的轉錄水平所需的 增強子。增強子通常是任何不翻譯的DNA序列，臨近編碼序列起作用(以順式)以改變啟 動子所支配的基本轉錄水平。所述表達載體還可以含有如下文所述的選擇基因。載體可以以本領域公知的多種方法中的任何一種引入細胞或組織。這些方法 在 Sambrook et al.，Molecular Cloning :A LaboratoryManual，Cold Springs Harbor Laboratory, New York 1989，1992)，Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology, Johnffiley and Sons, Baltimore, Maryland 1989), Chang et al. SomaticGene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, MI 1995), Vega et al. , GeneTargeting,CRC Press, Ann Arbor MI (995), Vectors :A Surveyof Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston MA 1988)禾口 Gilboa et al. (Biotechniques 4(6) :504_512，1986) 中有描述，包括，例如穩定或暫時性的轉染，脂質體轉染(lipofection)，電穿孔和用重組病 毒載體感染。此外，參見美國專利4，866，042中的涉及中樞神經系統的載體以及美國專利 5，464，764和5，487，992中的正負選擇方法。通過感染引入核酸與其它所列出的方法相比具有幾個優點。由於感染特性因而能 夠獲得更高的效率。而且病毒是非常特化的，典型地可以感染並在特定的細胞類型中增殖。 因而，它們天然的特異性可以用於使載體在體內或在組織中或細胞的混合培養物中靶定特 異的細胞類型。病毒載體還可以用特異的受體或配體修飾以通過受體介導的事件改變靶的 特異性。用於引入和表達重組序列的DNA病毒載體的特定實例是腺病毒衍生的載體 Aden0p53TK。該載體表達皰疹病毒胸苷激酶(TK)基因，以提供正向或負向選擇，和所期望 的重組序列的表達盒。該載體可用於感染具有腺病毒受體的細胞，包括大部分上皮來源和 其它來源的組織。該載體和其它具有類似的所期望的功能的載體可用於處理混合群體的細 胞，包括，例如細胞的體外或離體培養物，組織或人受試者。還可以包含限制在特定細胞類型中表達的特徵。這種特徵包括，例如，對所希望的 細胞類型特異的啟動子和調控元件。此外，重組病毒載體可用於所希望的核酸的體內表達，這是由於它們可提供例如 橫向感染和靶定特異性的優點。橫向感染是例如逆轉錄病毒的生命周期中固有的，是單個 感染細胞產生許多子代病毒顆粒，釋放出並感染相鄰的細胞的過程。結果是大片區域迅速 被感染，其中大部分最初並沒有被原始的病毒顆粒感染。這與垂直類型的感染相反，其中感 染試劑只通過下一代子代傳播。也可以製造不能橫向傳播的病毒載體。如果目的是將特定 基因引入有限數目的靶細胞的話，該特徵可能是有用的。如上所述，病毒是非常特化的感染試劑，在許多情況下可以避開宿主的防禦機制。 典型地，病毒感染並在特定類型的細胞中增殖。病毒載體的靶定特異性是利用了它的天然 的特異性，特異性靶定預定細胞類型，因而將重組基因引入感染細胞中。本發明的方法和組 合物中使用的載體取決於所希望靶定的細胞類型，本領域技術人員均知道。可以構建逆轉錄病毒載體作為感染顆粒或只是進行起始一輪的感染。在第一種情況中，對病毒基因組進行修飾使其保持所有必需基因，調控序列和包裝信號以合成新的病 毒蛋白和RNA。這些分子一旦合成，宿主細胞會將所述RNA包裝成新的病毒顆粒，其能進行 下一輪的感染。還可以通過基因工程使所述載體的基因組編碼和表達所希望的重組基因。 在無感染性的病毒載體中，載體基因組通常進行突變以破壞將RNA包裝成病毒顆粒所必需 的病毒包裝信號。沒有這樣的信號，任何形成的顆粒都不含有基因組，因此不能進行下一輪 感染。載體的特定類型取決於預期的應用。實際的載體也是已知的，在本領域中可容易獲 得，或者可由本領域技術人員通過熟知的方法構建。重組載體可以幾種方式給藥。如果使用病毒載體，例如，給藥過程可以利用它們的 靶特異性，因而不用在疾病部位局部給藥。但是，局部給藥可以更快更有效地治療。包括敲入程序所用的同源重組在內的體內和離體細胞轉化過程如下述文獻中所 述，例如，UnitedStates Patents 5，487，992，5，464，764，5，387，742，5，360，735， 5，347，075,5，298，422,5，288，846,5，221，778,5，175，385,5，175，384,5，175，383, 4,736,866 以及 Burkeand Olson, Methods in Enzymology,194 251-2701991)； Capecchi, Science 244 1288-1292 1989) ；Davies et al. , Nucleic Acids Research, 20(11)2693-2698 1992) ；Dickinson et al. , Human Molecular Genetics,2(8) 1299-13021993) ；Duff andLincoln,"Insertion of a pathogenic mutation into a yeast artificial chromosomecontaining the human APP gene and expression in ES cells", Research Advances inAlzheimer' s Disease and Related Disorders,1995；Huxley et al. ， Genomics, 9 742-7501991) Jakobovits et al. ， Nature,362 255-2611993) ；Lamb et al. , Nature Genetics,5 :22_29 1993) ；Pearson and Choi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993). 90 10578-82 ；Rothstein, Methods in Enzymology, 194 281-3011991) ；Schedl et al. , Nature, 362 :258_261 1993) ；Strauss et al.，Science,259 :1904_19071993) 進一步，專利申請W0 94/23049, W093/14200, W0 94/06908，W094/28123 也提供了 部分信息。本領域普通技術人員可參考下述非限制性的實施例顯而易見地知曉本發明的其 它目的，優點和新的特徵。另外，上述的和下述權利要求部分的權利要求中所述的本發明的 每一個不同的實施方式和方面在下述實施例中都有實驗支持。
實施例參考下述實施例，與上述說明一起以非限制性的方式對本發明進行舉例說明。通常，本文所用的術語和本發明中所用的實驗程序包括分子，生物化學，微生物和 重組DNA技術。這些技術在文獻中已有詳細解釋。參見，例如，「 Molecular Cloning A Laboratory Manual " Sambrook etal., (1989) ； " Current Protocols in Molecular Biology " Volumes I-III Ausubel, R. M. , ed. (1994) ；Ausubel et al. , " Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley andSons, Baltimore, Maryland(1989) ；Perbal, " A Practical Guide to Molecular Cloning" ,John Wiley&Sons,New York(1988) ；Watson et al. ," Recombinant DNA" , ScientificAmerican Books, New York ；Birren et al. (eds)" Genome Analysis A LaboratoryManual Series「 , Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；方法如U. S. Pat. Nos. 4, 666, 828 ；4, 683, 202 ；4, 801, 531 ；5, 192, 659 and 5，272，057; 「 Cell Biology :A Laboratory Handbook" , Volumes I-IIICellis，J. E.， ed. (1994) ； " Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique" byFreshney, ffiley-Liss,N. Y. (1994),Third Edition ； " Current Protocols inlmmunology" Volumes I — III Coligan J. E. , ed. (1994) ；Stites et al. (eds), " Basic andClinical Immunology " (8th Edition), Appleton&Lange, Norwalk, CT(1994) ；Mishelland Shiigi(eds), " Selected Methods in Cellular Immunology" , W. H.Freeman andCo., New York(1980)；中所述；可獲得的免疫檢測方法廣泛描述於專利和科技文獻中，參見，例如U. S. Pat. Nos. 3，791，932 ；3，839，153 ；3，850，752 ；3，850，578 ；3，853，987 ； 3，867，517 ；3，879，262 ；3，901，654 ；3，935，074 ；3，984，533 ；3，996，345 ；4，034，074 ； 4, 098, 876 ； 4, 879, 219 ； 5, 011, 771 and 5, 281, 521 ； 「 01 ionuc 1 eo t i de Synthesis 「 Gait, M.J. , ed. (1984) ；"Nucleic Acid Hybridization 「 Hames, B. D., and Higgins S. J. , eds. (1985) ； " Transcription and Translation " Hames, B. D. , and Higgins S.J. , eds. (1984) ； " Animal Cell Culture " Freshney, R. I., ed. (1986) ； 「 Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986) ； 「 A Practical Guideto Molecular Cloning" Perbal, B. , (1984)and" Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press ； " PCR Protocols :A Guide To Methods And Applications", AcademicPress, San Diego, CA(1990) ；Marshak et al. , " Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual " CSHL Press (1996)；在此引入所有這些文獻的全文作為參考。本文中還提供了其它一般參考。其中所 述程序是本領域熟知的，是為讀者方便而提供的。其中包含的所有信息在此都引入作為參考。材料和實驗方法材料組織培養介質和血清購於Biological Industries (BeitHaEmek, Israel)。 強化化學發光(Enhanced Chemical Luminescence, ECL)的操作使用從 BioRad(Israel) 購買的試劑盒。單克隆抗P-tyr的抗體購於Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, NY, USA)。PKC同種型的單克隆和多克隆抗體購於Santa Cruz (California, USA)禾口 Transduction Laboratories (Lexington, KY)。 a 6 大鼠抗小鼠 mAb (GoH3)購於 Pharmingen (San Diego, CA)。a 6A細胞質結構域的抗體6844得自 Dr. V. Quaranta(Scripps Research Institute, La Jolla, CA)的饋贈。針對小鼠3 4的細胞外結構域(346-11A) Wi； U mAb U S Dr. S. J. Kennel (Oak Ridge National Laboratory, OakRidge, TN) ^^ 贈。針對磷酸化酪氨酸的大鼠mAB購自Sigma (St. Louis，M0)，兔抗磷酸化絲氨酸購自 Zymed(San Francisco, CA)。辣根過氧化物酶抗兔和抗小鼠IgG得自Bio-Rad (Israel)。 亮肽素，抑肽酶，PMSF，DTT，Na-原釩酸鹽，和抑胃肽購自Sigma Chemicals (St. Louis, M0)。胰島素(humulin R-重組人胰島素)購自 EliLillyFrance SA (Fergersheim, France)。 IGF1 得自 Cytolab (Israel)的饋贈。角蛋白 14 抗體購自 Babco-Convance (Richmond，CA)。 BDGF-BB購自R&D系統(Minneapolis)，十四醯化(myristolated)的PKC a偽底物購自 Calbinochem(San Diego, CA)。鼠角質化細胞的分離和培養如文獻中所述從新生皮膚上分離原代角質化細胞 (18)。在含有 8% 的 Chelex(Chelex-100，BioRad)處理的胎牛血清的 Eagle，s Minimal Essential Medium(EMEM)中培養角質化細胞。為了維持增殖的基底細胞的表型，將最終的 Ca2+濃度調節為0. 05mM。鋪板後五天到七天進行實驗。細胞提取物的製備和Western blot分析為得到膜組分粗提物，在含有10 u g/ ml 抑肽酶，10ii g/ml 亮肽素，2ii g/ml 抑胃肽(p印statin)，ImM PMSF, lOmM EDTA, 200 u M NaV04和lOmM NaF的PBS中破碎細胞，製備全細胞溶解物。經過勻漿和4次凍/溶循環後， 將溶解物置於微型離心機中以最大速度在4°C旋轉20分鐘。將含有可溶性細胞溶質蛋白組 分的上清液轉移至另一個管子中。將沉澱重懸於250 yl含有Triton X-100及蛋白酶 和磷酸酶抑制劑的PBS中，在4°C保溫30分鐘，在4°C在微型離心機中以最大速度旋轉。上 清中含有膜組分。用改進的Lowery檢測(Bio-Rad DC Protein AssayKit)測定蛋白質濃 度。如文獻中所述對細胞蛋白質組分進行Westernblot分析(6)。用於免疫沉澱的細胞溶解物的製備含有角質化細胞的培養皿用不含Ca2+/Mg2+的 PBS洗滌。用機械力使細胞分離，置於含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的混合物(20P g/ml亮肽 素，10 u g/ml 抑肽酶；0. ImMPMSF ； ImM DTT ；200 u M 原釩酸鹽；2 u g/ml 抑胃肽)的 RIPA 緩 衝液(50mM Tris HC1 pH 7. 4 ； 150mM NaCl ；ImM EDTA ；lOmM NaF ；1% TritonxlOO ；0. 1% SDS，1%脫氧膽酸鈉)中。將此製備物在4°C在微型離心機中以最大速度離心20分鐘。將 上清液用於免疫沉澱。免疫沉澱將300 u g 細胞溶解物與 25 ill 蛋白 A/G Sepharose (Santa Cruz, CA, USA)混合，將懸液在4°C連續旋轉30分鐘，進行溶解物的預處理。然後將製備物在4°C以最 大速度離心10分鐘，向上清液中加入30 u 1 A/G Sepharose以及針對個別抗原的特異性多 克隆或單克隆抗體(稀釋率1 100)。將樣品在4°C旋轉過夜。然後將懸液在4°C以最大 速度離心10分鐘，將沉澱用RIPA緩衝液洗滌。然後將懸液以15，000Xg再次離心(4°C， 10分鐘)，用TBST洗滌四次。加入樣品緩衝液(0.5M Tris -HC1 pH 6. 8 SDS 甘 油；4% 2-0 -巰基乙醇；0. 05%溴酚藍)，將樣品煮沸5分鐘，然後進行SDS-PAGE。附著檢測用PBS中的20iig/ml的基質蛋白對二十四孔皮氏培養皿(petri plates) (Greiner)進行塗層(250 yl/孔)，37°C保溫1小時。保溫後洗滌培養皿，並在室 溫與0. 1% BSA培育30分鐘以阻斷非特異性結合。角質化細胞培養物用0. 25%的胰蛋白 酶短暫消化，待分離後將細胞重懸，將角質化細胞(1X106)加到已塗層的孔中，在37°C培育 1小時。除去未附著的細胞，將孔用PBS漂洗兩次，將剩餘的細胞用1M NaOH提取。用改進 的Lowery檢測(Bio-Rad DCProtein Assay Kit)通過蛋白濃度確定細胞計數。結果計算 為相對於未處理對照的百分數。免疫螢光將原代角質化細胞接種於層粘連蛋白(laminin)5塗布的玻璃載玻片 上。用PKC腺病毒感染兩天大的角質化細胞一小時，用PBS洗滌兩次，保存在低Ca2+濃度 的MEM培養物中。感染後二十四小時；將細胞用4%多聚甲醛固定30分鐘，然後用0.2%
38Triton透化(permeabilizati0n)5分鐘。為進行分析，將對照和PKC感染的角質化細胞用 PBS漂洗，與稀釋在含有1 % BSA的PBS中的PKC抗體(Santa Cruz)在4°C培育過夜。培 育後，載玻片用PBS洗滌兩次10分鐘，與生物素化的抗兔的二抗培育20分鐘，用PBS洗滌 兩次，與str印avidin-FITC培育20分鐘。為分析a 6 0 4的染色，將玻璃載玻片用0. 2% Triton X-100在冰上處理5分鐘，然後在甲醇中固定5分鐘。將載玻片與抗a 6或抗3 4 的抗體培育過夜，然後分別與生物素化的抗兔的二抗培育20分鐘，用PBS洗滌兩次，與 str印avidin-FITC培育20分鐘。用PBS洗滌兩次後，用含有1 %對苯二胺(Sigma)的甘油 緩衝液處理(mount)載玻片，用雷射掃描共聚焦成像顯微鏡(MRC1024，BiO-Rad，m)檢測熒 光。腺病毒構建體重組腺病毒載體如文獻所述構建(19)。小鼠PKC的顯性失活突變 體是通過用丙氨酸取代ATP結合位點的賴氨酸殘基產生的。用EcoR I從SRD表達載體上 切下突變體的cDNA，連接到pAxCAlw粘粒盒上，構建Ax載體。其自體磷酸化活性的破壞證 明了所述基因的顯性失活活性。用PKC同種型基因轉導角質化細胞吸出培養基，用含有PKC重組腺病毒的病毒上 清液感染角質化細胞培養物一小時。然後用MEM洗滌所述培養物兩次並重新培養。感染後 十小時，將細胞轉移至不含血清的低Ca2+的MEM中24小時。來自對照的和用胰島素處理的 或用IGF1處理的培養物的角質化細胞用於進行增殖檢測，86Rb吸收，或者提取並分級成細 胞溶質和膜組分進行免疫沉澱，免疫螢光和Westernblotting。PKC活性在用經適當處理後的角質化細胞培養物新鮮製備的免疫沉澱物中測定 特異的PKC活性。這些細胞溶解物製備於不含NaF的RIPA緩衝液中。用SigmaTECT Protein Kinase C Assay System(Promega, Madison, WI, USA)測定活性，根據製造商的說明操作。 在這些研究中用PKCa偽底物作為底物。細胞增殖在24孔板中用[3H]胸苷摻入測定細胞增殖。細胞用[3H]胸苷(1 u Ci/ ml)脈衝過夜。培育後細胞用PBS洗滌五次，將5%TCA加入每個孔30分鐘。除去溶液，將 細胞溶於1 % Triton X-100中。在Tricarb液體閃爍計數器的3H窗口中對摻入細胞的標 記的胸苷進行計數。Na+/K+泵活性Na+/K+泵活性通過測量全細胞在1ml含有2mM RbCl和2. 5 i Ci的 86Rb的並且不含K+的PBS中對86Rb的烏巴因敏感(ouabain-sensitive)的吸收(uptake) 來確定。15分鐘後吸去培養液終止Rb的吸收，然後將細胞在冷的4°C的不含K+的PBS中快 速漂洗四次，並溶於Triton X-100中。在閃爍瓶中將培養皿上的細胞加入到3ml H20 中。在Tricarb液體閃爍計數器的3H窗口中對樣品進行計數。特定地與Na+/K+泵活性相 關的Rb吸收是通過將在缺乏抑制劑的條件下測定的吸收值減去在存在10_4M烏巴因的條件 下積累的cpm來確定。PKC免疫激酶檢測純化的和標準化的PKC同工酶由Dr. P. Blumberg(NCI, NIH， U. S.)禾口Dr. Marcello G. Kazanietz(University of Pennsylvania,School of Medicine) 慷慨提供。收集原代角質化細胞於500 ill 1% Triton Lysis緩衝液(1 % TritonX-100, 10 u g/ml 抑肽酶和亮肽素，2 u g/ml 抑胃肽，ImM PMSF, ImM EDTA, 200 u M Na2V04, lOmM NaF 在lx PBS中)中。胞溶產物在4°C培育30分鐘，在4°C以16，000Xg旋轉30分鐘。將上 清液轉至新鮮管中。用5ii g/個樣品的抗a 6/GoH3 (PharMingen)和30 yl/個樣品的蛋白A/G-plus agarose slurry (Santa Cruz)在4°C對細胞溶解物進行免疫沉澱過夜。珠子 用RIPA緩衝液洗滌一次，用50mM Tris/HCl pH 7. 5洗滌兩次。向每個檢測中加入35 yl 反應緩衝液(ImM CaCl2,20mMMgCl2,50mM Tris *HC1 pH 7.5)。對於每個檢測，向淤漿中加 入5. 5 ill/個檢測的含有DMS0或10mM TPA的磷脂囊泡懸液，以及標準化量的特異PKC同 工酶。加入 10 P 1/ 個檢測的 125mM ATP(1. 25 u Ci/ 個檢測[Y _32P]ATP，Amersham)起始 反應，在30°C繼續10分鐘。珠子用RIPA緩衝液洗滌兩次。加入30iU/個樣品的蛋白質 加樣染料(proteinloading dye) (3xLaemmli，5% SDS)，將樣品在水浴中煮沸5分鐘。用 SDS-PAGE在8. 5%的凝膠上分離蛋白質，轉移到Protran膜(Schleicher&Schuell)上，用 放射自顯影顯像。組蛋白的磷酸化和PKC底物肽的磷酸化用作PKC活性的對照。實驗結果實施例1用重組腺病毒載體有效過表達PKC同種型用重組0 -半乳糖苷酶腺病毒獲得高的感染率，超過90%的培養的角質化細胞群 體表達重組蛋白。重組半乳糖苷酶腺病毒感染不會影響細胞的生存力或細胞生長。進 一步，半乳糖苷酶的表達持續長達兩周的培養，在下面的實驗中可用作對照感染。檢測 了重組PKC腺病毒構建體誘導蛋白表達和在小鼠角質化細胞培養物中正確活化的效率。如 圖1中的Western blotting所示，用重組PKC腺病毒構建體進行1小時的感染之後24小 時，觀察到特定PKC蛋白表達顯著增加，是該特定同種型內源表達水平的五到十倍。早在感 染後6小時在感染的角質化細胞培養物中就可檢測到重組蛋白，表達的峰值在24小時獲 得。在整個培養階段(長達十四天)中蛋白都持續表達。實施例2過表達的PKC同種型被PKC活化劑激活PKC同種型的重組蛋白典型地對PKC活化劑具有反應。如圖2所示，用苔蘚蟲素1 處理誘導PKCa和8蛋白向膜組分遷移，而對PKCn和(同種型效果較弱，用內源同種型 也得到相似結果，正如根據它們對輔因子的需要所預料的那樣。實施例3過表達的PKC同種型的天然形式是有活性的早在感染後18個小時，PKC激酶檢測就表明不同PKC同種型的免疫沉澱物不需要 進一步用PKC活化劑激活就具有酶促活性(圖3)。實施例4過表達的特定PKC同種型在原代角質化細胞中誘導不同的形態變化使用的每一種PKC腺病毒構建體在原代角質化細胞中均誘導特定的形態變化(圖 4)。未感染的原代小鼠角質化細胞培養物和半乳糖苷酶感染的細胞具有培養物中的增 殖的基底細胞的典型的立方形態特徵。無論同種型的特異性如何，所有的PKC過表達角質 化細胞都表現出了 PKC活化的典型的形態變化，包括細胞伸長，出現神經元樣的突起。但 是，PKC同種型中的每一個對於角質化細胞形態都具有獨特的效果。PKCa感染誘導角質化 細胞成層，具有典型的扁平形態。相反，PKC n表現為緊縮的細胞克隆，是快速增殖的基底細 胞的形態特徵(圖4)。所述同種型中的兩個似乎影響細胞基質以及細胞和細胞間的聯繫。 在PKCS感染後18-48小時，細胞伸長，伸出神經元樣的突起。然後是細胞逐漸從培養皿中喪失，這是在培養過程中逐漸發生的。過表達PKC(的角質化細胞表現為圓形的角質化細 胞簇，其鬆散地附著於培養皿上，在感染後幾天逐漸地喪失。實施例5在感染的原代角質化細胞中過表達的PKC同種型的不同定位由免疫螢光分析證明不同的形態變化與不同的細胞定位有關。在增殖的角質化細 胞中，PKCa，PKCS和PKC(在細胞質中以及質膜上表達。與內源蛋白表達類似，PKC n同 種型定位於角質化細胞的細胞核周區域(圖5)。PKCS和PKC4與分布的動態變化有關， 其中在細胞分離之後，PKC同種型表達主要定位於細胞膜(圖5)。實施例6PKC同種型對a 6 3 4表達的調控實驗結果檢測了特定PKC同種型調節那些對於增殖的基底層的基底表型特徵性的蛋白的 能力。由於整聯蛋白的下調是角質化細胞分化過程中發生的早期事件之一，評估了 不同PKC同種型調節a 60 4整聯蛋白，一種特別定位於基底層的半橋粒的整聯蛋白，的表 達的能力。由圖6的免疫雜交可看出，與對照角質化細胞中a 6 0 4整聯蛋白亞基水平相比， 只有PKC 6和PKC (同種型能夠下調a 6 0 4表達。同時，a 3或0 1整聯蛋白亞基的水平 沒有減少。相反，一致地，PKCa同種型的過表達導致a 60 4水平增大到對照表達的兩到三 倍(圖6)。PKCn的過表達不影響a 60 4蛋白的表達。要分化的細胞與幾個特徵有關，其 在a 60 4蛋白下調後，包括增殖速度的降低，新的角蛋白的合成，細胞分離，喪失與基底膜 組分的附著。沒有觀察到不同PKC同種型的過表達導致角蛋白表達的變化。這包括K5和 K14，基底增殖角質化細胞的特徵物，和K1和K10，棘狀分化(spinous differentiation)早 期的特徵物，的表達。此外，當用3H_胸苷摻入分析增殖速度的時候，在a 60 4表達喪失和 增殖潛力之間沒有相關性。實施例7過表達的PKC n和PKC 6在體外誘導角質化細胞增殖PKC n和PKC 6的過表達分別顯著誘導角質化細胞以對照五倍和兩倍的水平增殖 (圖7)。PKC 4和PKC a不會影響細胞增殖。實施例8過表達的PKCS和(在體外誘導角質化細胞分離研究了 PKCS和；過表達的角質化細胞的附著特性。與對照角質化細胞相比，與 特定的基質蛋白包括層粘連蛋白1，層粘連蛋白5，纖連蛋白和膠原蛋白的附著能力沒有變 化(數據未顯示)。但是，在過表達PKCS和PKC(同種型的細胞中，細胞與培養皿之間的 接觸的喪失與角質化細胞逐漸從培養皿上的分離有關(圖4)。實施例9PKC同種型的過表達對a 6 0 4整聯蛋白的半橋粒定位的影響由於a 60 4表達對於半橋粒附著複合體的形成是必需的，檢測了下調以 及細胞分離與a 60 4向半橋粒的定位之間的關係。圖8顯示了 a 60 4與半橋粒複合體之 間的關係的免疫螢光分析。如圖8所示，與對照感染角質化細胞相比，在過表達PKCa的 角質化細胞(圖6)中a 60 4整聯蛋白表達的上調與a 60 4向半橋粒複合體整合的增加有關。過表達PKCn的細胞也誘導a604整聯蛋白與半橋粒複合體的結合，雖然比過表達 PKCa的細胞中觀察到的少。正如所料，在PKCS和PKC4過表達的角質化細胞中a 63 4 整聯蛋白的顯著下調與a 60 4向細胞半橋粒複合體整合的減少有關(圖8)。這些結果表 明a 6 0 4整聯蛋白在細胞_基質聯繫和角質化細胞向下面的基底膜的錨定中起著重要作 用。而且，PKCS和(介導的a 63 4的下調，使角質化細胞開始以一種不同於角質化細胞 分化過程的途徑分離。最後，為了將PKC介導的CI604下調，減少的半橋粒上的a604的 整合和特定的形態變化與角質化細胞的分離聯繫起來，檢測了在培養期間附著和分離的過 表達不同PKC同種型的細胞的量的變化。在圖9中，在PKC腺病毒感染後24和48小時對培 養物中附著的細胞進行計數。能清楚觀察到PKCS和PKC(在體外誘導細胞喪失。同時， 培養物細胞的喪失與培養基中漂浮的細胞的增加有關。這些結果表明PKCS和PKC4對於 控制與細胞分化和遷移早期相關的分離步驟非常重要。實施例10PKC n在生理條件下有差別地調控角質化細胞的增殖和分化。從圖7中可明顯看出，過表達PKC n同種型的細胞以加速的速度增殖，為對照的未 感染細胞五到七倍，也比過表達其它PKC同種型的角質化細胞培養物高。但是增殖的誘導 取決於角質化細胞的分化狀態，這是通過調節培養基中Ca2+的濃度決定的。在保持在低Ca2+ 濃度(0.05mM)的增殖的角質化細胞中內源PKCn定位於大多數增殖細胞的細胞核周區域 (圖10)。在這些條件下，PKC n的過表達誘導角質化細胞增殖的顯著增加(圖11)。但是， 當將Ca2+濃度增加到0. 12mM使角質化細胞分化的時候，PKCn的過表達並不誘導增殖而是 進一步刺激角質化細胞分化。這些結果表明過表達PKCn僅在進行生理性增殖的細胞中誘 導增殖，而並不幹涉細胞的分化。在體內也觀察到PKCn表達的調控作用的差異。在積極 增殖的皮膚以及胚胎神經元細胞中鑑別到PKC n的表達，而在成熟的成人腦部沒有觀察到 PKC n，在表皮中PKC n定位到皮膚的粒層。實施例11PKC n和DNPKC n的過表達特別調控PKC的定位和細胞形態為了進一步確證支持PKC n在角質化細胞的增殖狀態或分化狀態都具有積極作 用的結果，通過研究感染對於增殖的和分化的角質化細胞的效果分析了激酶失活的顯性失 活腺病毒PKCn構建體的作用。如圖12所示，在增殖狀態和分化狀態PKCn和DNPKCn的腺 病毒感染都是高效的。正如所預測的那樣，在增殖的角質化細胞中DNPKC n誘導角質化細 胞的分化，同時使細胞形態發生巨大變化包括細胞變得扁平，細胞和細胞之間的邊界消失， 正與Ca2+誘導的分化伴隨的形態改變類似(圖12A-B)。而且，這些變化伴隨著角質化細胞 增殖的停止(圖11)和分化標記包括角蛋白1，角蛋白10，兜甲蛋白(loricrin)和纖維聚合 蛋白(filaggrin)的顯著誘導，其量增加到與體內正常皮膚中類似的水平(圖13A-B)。同 時，隨著分化程序的開始，DNPKC n的過表達不破壞Ca2+誘導的分化。這些結果表明PKCn 和DNPKC n可用於在生理條件下有差別地調控角質化細胞的增殖和分化。實施例12體內實驗為了檢測PKC n在體內有差別地調控細胞增殖和分化的能力，評價了 PKC n誘導 裸鼠背部完全切開的創傷(full incisional wounds)癒合的能力。用對照0-gal腺病毒驗證了角質化細胞表達外源重組蛋白的能力。如圖14所示，感染後兩周，在體外角質化細 胞和體內皮膚都持續有0-gal表達。有趣的是，當用對照，PKCa和PKCn腺病毒構建體 局部感染後檢查小鼠的創傷癒合過程的時候，只有PKCn早在局部感染後四天就誘導肉芽 組織形成。這還包括肌肉，脂肪和真皮層的有組織的形成。同時在對照和PKCa感染的皮 膚中，沒有觀察到緻密的肉芽組織，沒有觀察到創傷閉合(圖14)。因此，PKC n可以視為是 在誘導創傷癒合過程中調控皮膚增殖和分化的一個主要候選物。實施例13胰島素在增殖的角質化細胞中特異誘導PKC 6的遷移已發現皮膚中表達的兩種PKC同種型影響角質化細胞的增殖PKC n和PKC S。為 了嘗試和鑑別激活特定的調節皮膚增殖的PKC同種型的內源因子，評價了幾種已知促進角 質化細胞增殖的生長因子以生長依賴的方式激活特定PKC同種型的能力，包括EGF，KGF， 胰島素，PDGF和IGF1。PKC同種型a，S，e，n和4在皮膚中表達。由於PKC同種型的 激活與它們向膜組分的遷移有關，因此檢查了這些生長因子對於不同PKC同種型從細胞溶 質向膜遷移的作用。如圖15所示，早在刺激後5分鐘，胰島素就特異誘導PKCS從細胞質 向膜組分遷移。胰島素刺激後PKCS在膜上的表達維持數小時。相反，IGF1減少了 PKCS 在膜上的表達，而增加了其在細胞質組分中表達的相對水平。沒有其它生長因子顯著影響 PKC6的遷移和定位。其它PKC同種型在被任何生長因子包括IGF1和胰島素刺激以後都沒 有觀察到分布上的變化。實施例14胰島素在增殖的角質化細胞中特異誘導PKC 6的活化為了確定PKC 6的遷移是否足以使其活化，測定了來自胰島素和IGF1處理的角質 化細胞中細胞質和膜組分的PKC免疫沉澱物的激酶活性。如圖16所示，胰島素而不是IGF1 增加膜組分中PKCS的活性。在細胞質組分中沒有觀察到PKCa活性的提高。胰島素誘導 的活化是對PKCS特異性的，在胰島素刺激後長達30分鐘都沒有觀察到PKCa，￡，n或 (的活化。總而言之，這些結果表明胰島素而不是I GF1選擇性刺激PKCS的活化。實施例15胰島素和IGF1對於角質化細胞增殖具有加和作用為了分析PKCS的特異性活化是否意味著在角質化細胞中特定的胰島素誘導的 促有絲分裂途徑，通過研究胰島素和IGF1誘導角質化細胞增殖的能力檢查了它們的促有 絲分裂作用，通過胸苷摻入檢測。如圖17A所示，胰島素和IGF1以劑量依賴的方式刺激胸 苷摻入，分別在10_7和10_8M的時候達到最大誘導值。在每個濃度，IGF1的最大刺激值都比 胰島素高。有趣的是，在所有濃度，當兩種激素一起使用的時候，具有加和的促有絲分裂作 用(圖17B)。這些結果表明胰島素通過一種和IGF1誘導的角質化細胞增殖無關的不同途 徑調控角質化細胞的增殖。實施例16胰島素誘導的PKCS活化和胰島素誘導的角質化細胞增殖之間的關係為了直接研究胰島素誘導的PKC 6活化和胰島素誘導的角質化細胞增殖之間的 關係，用重組PKC腺病毒構建體過表達野生型PKCS (WTPKC 6 )以及PKC的激酶失活的顯性 失活突變體，其破壞了內源PKC 6活性(DN PKC 6 ) 0檢查了 WT PKC 6和DN PKC 6的過表達對於胰島素誘導的角質化細胞增殖的作用。兩個構建體以及PKCa構建體都能在角質 化細胞中高效表達(圖18A)。而且，用PKCS和PKCa感染都可以比對照水平高出幾倍地 誘導同種型特異性的PKC活性(圖18B)。正如所料，DN PKC 6的過表達不誘導PKC活性。 如圖19A所示，未轉染細胞用胰島素處理或不用胰島素處理的WT PKC6的過表達增加胸苷 摻入到大約相同的水平，是未處理的細胞，或是用PKCa轉導的細胞的二至三倍。而且，向 已經過表達WT PKC6的細胞中加入胰島素不會引起胸苷摻入的任何額外增加。IGF1在未 感染的細胞和過表達WT PKC6和PKCa的細胞中類似地增加胸苷吸收(圖19A)。進一步 通過破壞PKCS的活性證明PKCS直接參與胰島素誘導的增殖。如圖19B所示，在過表達 顯性失活PKC 6的細胞中基礎胸苷摻入輕微地，但顯著地(significantly)，低於未感染細 胞。DN PKC6的過表達完全消除了胰島素誘導的增殖，但是不影響IGF-1誘導的增殖。而 且，胰島素和IGF1的加和效果減至IGF1單獨的水平。實施例17PKC6活化對胰島素介導的途徑的特異性通過研究PKC 8和DN PKC 8對於針對多種生長因子包括IGF1，EGF，KGF，ECGF和 PDGF的促有絲分裂反應的作用來分析PKCS活化對胰島素介導的途徑的特異性。如圖20 所示，DN PKC6的過表達選擇性地消除胰島素誘導的增殖作用，但是不阻斷所檢測的任何 其它生長因子的作用。但是，PKCS的過表達模擬胰島素誘導的增殖但不影響IGF1誘導的 增殖。EGF和KGF的刺激誘導的增殖增加(圖21)。這些數據表明胰島素對PKC S的活化 通過涉及PKC 6的途徑介導角質化細胞的增殖，這個途徑位於EGF和KGF，兩種主要的已知 能調控角質化細胞增殖的生長因子的信號傳導途徑的上遊。總的來說，發現胰島素是PKCS 活性的特異性調節劑，其可能是在調控胰島素，EGF和KGF誘導的角質化細胞增殖中的特異 性候選物。實施例18胰島素誘導的PKC 6活性角質化細胞增殖是由STAT 3的轉錄激活介導的進一步研究PKC 6在胰島素信號傳導中的作用並發現其涉及STAT3介導的轉錄激 活的誘導。如圖23所示，在原代角質化細胞中，PKCS特別與STAT3相關。在胰島素刺激 後，PKC 6被活化，然後磷酸化並激活STAT3(圖24)。而且，用藥理學抑制劑(卡馬拉素) 破壞PKC 6的活性抑制STAT3的活化以及其核定位。進一步，如圖25所示，STAT3的過表 達誘導與胰島素誘導的和PKCS過表達誘導的類似的增殖，過表達顯性失活PKCS突變體 破壞PKCS活性，破壞了 STAT3誘導角質化細胞增殖的能力。這些結果總體表明胰島素和 PKC 6在與角質化細胞增殖相關的轉錄激活中發揮作用。實施例19PKC6和PKC4對於體內創傷癒合過程是必需的用同種型特異性PKC無效小鼠(PKC null mice)驗證PKC同種型在體內創傷癒合 過程中的重要性。如圖22A-B所示，當在PKC 6，PKC (，PKCa無效小鼠(基因敲除，K0)和 它們的野生型同窩出生鼠的背部造成全厚度創傷的時候，在PKCS和PKC4無效小鼠中觀 察到創傷癒合延遲，而PKCa無效小鼠沒有。這個結果表明甚至是在沒有糖尿病背景下，特 定的PKC同種型對於皮膚的創傷癒合過程也是必需的。實施例20
用於體內創傷癒合的胰島素的單次應用與多次應用通過切割在8-10周齡C57BL小鼠背部造成創傷，然後進行如下處理(i)在7天 中每天施用胰島素0. 1 y M ； (ii)在7天中每天施用胰島素1 P M ； (iii)在7天中每天施用 胰島素10 y M ； (iv)在致創後4天一次性施用胰島素1 P M ；以及(v)在7天中每天施用載 體(PBS)對照。所有小鼠都在致創後七天處死，測量它們的張開的創傷的面積。如圖26所 示，以lyM的濃度每天用胰島素處理顯著地比用更低(0. lyM)或更高(10yM)濃度的胰 島素每天處理更有效。令人驚訝地是，以1 P M的濃度單次施用胰島素比用相同濃度的胰島 素每天施用重複七天處理明顯更有效。由於觀察到的創傷被疤痕組織覆蓋，很難正確評價創傷的實際閉合和重建的表皮 的形成。因此用組織學參數來確定胰島素對於創傷組織的表皮和真皮的閉合的效果。創傷 的表皮閉合是通過用角蛋白14抗體(K14，Babco-Convance，Richmond，CA，USA)對創傷切片 (sections)染色來確定的，它能夠突出顯示創傷裂口上基底細胞的形成。如果真皮創傷的 兩邊在xlOO倍放大的光學顯微鏡下在一個視野中都能看見，則創傷的真皮閉合視為陽性。如圖27所示，所有胰島素處理都能有效促進表皮和真皮閉合。與圖26所示的結 果類似，每天用1 P M濃度的胰島素處理顯著比用0. 1 y M或10 y M濃度的胰島素每天處理 更有效。此外，用1PM濃度的胰島素單次施用比用相同濃度的胰島素每天施用重複七天處 理明顯更有效。因此，由形態學和組織學參數得到的這些結果顯然證明胰島素對於體內創傷癒合 的治療效果。這些結果令人驚訝地表明確定胰島素施用的最佳數目和/或頻率是正確治療 創傷的關鍵步驟。實施例21組合使用胰島素和血小板衍生生長因子(PDGF-BB)用於體內創傷癒合通過切割在8-10周齡C57BL小鼠背部造成創傷，致創4天後進行如下處理(i)載 體(PBS)對照；(ii)胰島素 luM;(iii)PDGF-BB 10uM(R&D Systems,Minneapolis,USA)； 和(iv)胰島素IpM+PDGF-BB 10 u M0處理後三天處死所有小鼠，對處理的創傷從組織學上 分析表皮和真皮閉合，如上述實施例20中所述。如圖28所示，單獨用胰島素或PDGF-BB處理對於表皮閉合(比對照高30_40% ) 和真皮閉合(比對照高10-20% )都是部分有效。但是用胰島素和PDGF-BB組合處理產生 了明顯更高的表皮閉合(大約比對照高80%)以及真皮閉合(大約60%)。因此，這些結 果表明組合使用胰島素和PDGF-BB能以協同作用的方式影響創傷癒合。這些結果還表明可 將胰島素和其它生長因子或轉化因子例如EGF，TGF0，KGF組合使用用於創傷的治療性處 理。實施例22組合使用胰島素和PKCa抑制劑用於體內創傷癒合通過切割在8-10周齡C57BL小鼠背部造成創傷，用載體(PBS)對照或0. 67 y M胰 島素(H0/01 ；Humulin, Eli Lilly, USA)和 PKC a 抑制劑(H0/02 ；十四醯化的 PKCa 偽底 物；Calibiochem，San Diego, CA, USA)的組合每天處理連續7天。致創後7天處死所有小 鼠，對被處理的創傷分析其創傷閉合，表皮閉合，真皮閉合，和表皮細胞的空間分化。測定張 開的創傷區域以確定創傷閉合。如果真皮創傷的兩邊在xlOO倍放大的光學顯微鏡下在一個視野中都能看見，則創傷的真皮閉合視為陽性。用突出顯示創傷裂口上基底細胞的形成 的kl4抗體對創傷切片進行染色來確定創傷的表皮閉合。表皮細胞的空間分化通過用突出 顯示新形成的表皮細胞的kl抗體對創傷切片進行染色來確定。如圖28-32所示，組合使用胰島素和(H0/01)和PKC a抑制劑(H0/02)顯著能促 進創傷閉合(圖29A-B)，真皮閉合(圖30)，表皮閉合(圖31)，和表皮細胞的空間分化(圖 32)。如圖33所示，與載體對照相比，組合使用胰島素H0/01和PKC a抑制劑H0/02進行處 理可分別將創傷表皮閉合從大約15%提高到70%，將真皮閉合從大約15%提高到50%，將 表皮細胞的空間分化從大約15%提高到50%。因此，這些結果表明組合使用胰島素和PKC a抑制劑對創傷進行治療性處理有效 促進表皮閉合，真皮閉合，表皮細胞的空間分化，和隨後的創傷癒合。實施例23組合使用胰島素和PKCa抑制劑可防止單獨使用胰島素處理引起的不良的副作 用通過切割在8-10周齡C57BL小鼠背部造成創傷，用載體(PBS)對照或1 y M胰島 素(Humulin，Eli Lilly, USA)或者 liiM 胰島素禾P 1 u M PKC a 偽底物(Calibiochem，San Diego, CA，USA)的混合物每天處理連續7天。致創後7天處死全部小鼠，對被處理的創傷 從組織學上分析其表皮的增殖能力(PCNA)，血管生成，炎症，表皮細胞和創傷裂口的重建過程。如下述表1所示，與緩衝液對照相比，僅用胰島素處理會在創傷部位引起異常血 管生成的大幅增大(分別為60%和25% )。由於創傷癒合過程涉及快速增殖的表皮細胞， 因此血管生成的增加也可能會增加引發癌症發展的危險。另一方面，當組合使用胰島素和 PKCa抑制劑的時候，在被處理的創傷部位沒有觀察到血管生成。表 1單獨使用胰島素和組合使用胰島素和PKCa抑制劑對創傷部位的血管生成的嚴 重程度的影響 此外，僅用胰島素進行處理會導致炎症增加，表皮細胞增生，表皮細胞棘層分化延 遲和疤痕增加。當PKCa抑制劑和胰島素組合在一起的時候沒有觀察到使用胰島素單獨進 行處理導致的不良副作用。實施例24PKC a抑制劑減少創傷炎症創傷處晚期的和嚴重的炎症反應可能會抑制癒合過程，因此防止這種炎症發生可 促進創傷癒合過程。相應地，在下面的實驗中檢驗了 PKCa抑制劑和胰島素對創傷炎症的 作用。通過切割在C57BL小鼠背部造成創傷，每天進行如下處理連續7天(i)PBS，對照； (ii)luM PKC a抑制劑(十四醯化的偽底物；Calibiochem，USA) ； (iii) 1 P M胰島素(Eli Lilly, USA)；或liiM PKC a抑制劑和1 y M胰島素的混合物。致創後7天處死所有小鼠， 在顯微鏡下觀察被處理創傷的炎症。在創傷部位觀察到的嚴重炎症的發生率總結在下述表 la中。表 la 結果表明與對照相比，給創傷施用PKCa抑制劑可使嚴重創傷炎症的發生率實質 (33.3%)減少。在實驗條件下單獨使用胰島素沒有抗炎性效果。這些結果表明PKC a抑制劑可用於控制創傷的嚴重炎症的治療。已證明的PKC a 抑制劑的減少炎症的能力與它能促進表皮閉合，真皮閉合和表皮細胞的空間分化的能力 (參見上述實施例22)，使得它可能成為創傷癒合的最有效的治療劑。實施例25調節真皮細胞中特定PKC同種型的表達和/或活性和給細胞施用不同試劑對加速 體外創傷閉合的組合效果材料和方法試劑因子D(Adipsin)人，CalbioChem, California USA;重組 TNFa 小鼠，R&D Systems, Minneapolis USA ；Gff 9662，Caymanchemical, USA ；蛋白激酶 C a 偽底物抑制劑， CalbioChem, CaliforniaUSA ；蛋白激酶 C 4 偽底物抑制劑，CalbioChem, California USA ； 蛋白激酶 Cn 偽底物抑制劑，CalbioChem, California USA ；PDGF-BB, Cytolab, Israel ； IL-6, Cytolab, Israel ；KGF/FGF-7, Cytolab, Israel ；IGF-1, Cytolab, Israel ；TGF旦 2, Cytolab, Israel ；表皮生長因子(EGF),小鼠，Chemicon international, California USA ；PKC 8 RACK, Ana Spec, California USA ；羅格列酮(Rosiglitazon)，CalbioChem. California USA ；月旨聯素(Adiponectin), MBL, Massachusetts USA and Copaxone , TEVA. Israel。體外創傷閉合檢測在皮氏培養皿(5cm i. d.)中將角質化細胞和成纖維細胞(真 皮細胞)培養五天，然後用200 yl的移液管頭在每個培養皿中形成人工的交叉劃痕。將培 養的細胞用能調節特定PKC同種型的表達和/或活性的腺病毒構建體感染。相應地，用野 生型(WT)PKC腺病毒構建體活化特定的PKC，用顯性失活(DN)PKC腺病毒構建體抑制特定的 PKC。向培養的細胞中進一步加入下述試劑中的一種胰島素(6.7XKTM)，脂聯素(每培 養 1 ii g)，adipsin (2 u g/ml)，IL-6 (每培養皿 1 ii g)，GW9662 (每培養皿 1 y g)，KGF (每培 養皿 1 u g), TNF a (12u g/m 1)，TGF3，rosiglitazone, SRC 抑制劑，PKC 8 RACK(1(T7M)和 PKC a偽底物抑制肽(107M)。在處理後24-48小時確定得到的創傷閉合水平，用從0(不閉 合)到10 (完全閉合)的指數值表示。結果組合治療對體外成纖維細胞創傷閉合的作用總結於下表2a_b和3a_b。結果表明 當配合adipsin或胰島素對細胞給藥的時候，成纖維細胞中PKCa表達和/或活性的抑制 顯著促進創傷閉合(創傷閉合的指數值分別為10和8)。在成纖維細胞中PKCa的抑制與 PKCn的抑制，PKC ￡的抑制，PKC S的活化，或PKC (的活化相組合也加速創傷閉合(創傷 閉合的指數值分別為9，9，9和7 ；圖34A-E)。此外，在成纖維細胞中PKC 4的抑制與KTO對 細胞的給藥相組合促進創傷癒合(創傷癒合指數值為7;圖36)。進一步另外，成纖維細胞中PKC0的抑制與胰島素，IL-6，KGF或GW9662的給藥相組合加速創傷閉合(創傷閉合指 數值分別為8，7，9和8 ；圖38A-E)。表 2a組合處理對體外創傷成纖維細胞閉合的效果1 1閉合的數值是0(不閉合)到10 (完全閉合)ND =未測定表 2b組合處理對體外創傷成纖維細胞閉合的效果1 1閉合的數值是0(不閉合)到10 (完全閉合)表 3a組合處理對體外創傷成纖維細胞閉合的效果1 1閉合的數值是0(不閉合)到10 (完全閉合)表 3b組合處理對體外創傷成纖維細胞閉合的效果1 1閉合的數值是0(不閉合)到10 (完全閉合)組合處理對於體外角質化細胞創傷閉合的效果總結於下表4a_b和5a_b中。結果 顯示當配合KGF，IL_6，TNFa或PKC S RACK肽對細胞給藥的時候，角質化細胞中PKC a表達 和/或活性的抑制顯著促進創傷閉合(創傷閉合的指數值分別為6，8，10和8 ；圖35A-C和 G)。角質化細胞中PKC a的抑制與細胞中PKC n，PKC ￡，或PKC 4的刺激相組合也增加創傷 閉合(創傷閉合的指數值分別為10，9和6 ；圖35A，D-F和H)。此外，角質化細胞中PKC 4 的抑制與IL-6，TNF_a或脂聯素對細胞的給藥相組合促進創傷閉合(創傷閉合指數值分別 為9，9和7 ；圖37A-D)。進一步另外，在角質化細胞中提高PKC S的活性和/或表達與細胞 中PKCe的激活，PKC 4的激活，或PKCa的抑制相組合，或者adipsin向細胞的給藥，加速 創傷閉合(創傷閉合指數值分別為7，8，8和8 ；圖39A-E)。表 4a組合處理對體外創傷角質化細胞閉合的效果1 1閉合的數值是0(不閉合)到10 (完全閉合)ND =未測定表4b組合處理對體外創傷角質化細胞閉合的效果1 1閉合的數值是0(不閉合)到10 (完全閉合)ND =未測定表 5a組合處理對體外創傷角質化細胞閉合的效果1 1閉合的數值是0(不閉合)到10 (完全閉合)ND =未測定表 5b組合處理對體外創傷角質化細胞閉合的效果1 1閉合的數值是0(不閉合)到10 (完全閉合)
ND =未測定因此，該結果表明當聯合生長因子例如IL-6，KGF，TNFa，激素例如胰島素，脂肪細 胞激素例如adipsin或脂聯素，PKC 6 RACK和/或GW9662對細胞的給藥時，調節創傷部位 的真皮細胞和表皮細胞中特定PKC同種型的表達和/或活性顯著加速創傷閉合。實施例26體外和體內施用共聚物-1用於創傷癒合材料和方法共聚物-1 共聚物-1 (Glatiramer acetate)是藥物Copaxone (Teva, Israel) 的活性成分，在臨床上用於治療多發性硬化。共聚物-1是髓鞘鹼性蛋白(MBP)的合成多 肽類似物，MBP是髓鞘的天然成分。從化學上來分析，共聚物-1是L-穀氨酸和L-丙氨酸， L-賴氨酸和L-酪氨酸的聚合物的乙酸鹽。它的結構式是(Glu, Ala, Lys, Tyr)x. X CH3C0 0H(C5H9N04 .C3H7N02 .C6H14N202 C9H11N03) x .XC2H40 2。glatiramer acetate 的平均分 子量是4，700-11, 000道爾頓。它的合成是將這四種胺基酸進行化學聚合形成平均分子量 為23，000道爾頓的產物(美國專利No. 3，849，550)。體外檢測基本按照上述實施例24中所述進行檢測。向培養的角質化細胞中加入 共聚物-1，濃度為每個培養55iig，單獨加入或與PKCa偽底物(liiM)和/或胰島素(1 y M) 一起加入。處理後48小時確定得到的創傷閉合水平，採用從0(不閉合)到10 (完全閉合) 的指數值。體內檢測通過切割在C57BL小鼠背部造成創傷(20mm)，致創4天後進行如下處 理⑴載體(PBS)對照；(ii)共聚物-1 (55 u g/ml) ； (iii)共聚物-1 (55 u g/ml)和胰島 素(1 P M)的混合物；(iv) PKC a偽底物抑制肽(1 P M)和胰島素(1 y M)的混合物；以及(v) 共聚物-1 (55 u g/ml)，PKC a偽底物抑制肽(1 u M)和胰島素(1 u M)的混合物。從形態學 上對創傷評估其(i)創傷閉合，(ii)痂的形成和(iii)創傷的出血/滲液。結果體外檢測給培養的角質化細胞施用共聚物-1促進體外創傷閉合，在指數值範圍 為0(不閉合)到10 (完全閉合)的尺度中達到指數值為8。將共聚物-1與PKCa偽底物 抑制肽組合，或與PKC a偽底物和胰島素的混合物組合，獲得相似的效果(創傷閉合指數值 分別為8和9 ；圖40A-F)。因此，這些結果表明共聚物-1本身能夠顯著加速體外創傷閉合。體內檢測與未處理的對照相比，給切開的創傷單獨施用共聚物-1，或與胰島素 和/或PKCa偽底物組合施用，能夠顯著減少創傷裂口區域並加速創傷中痂的形成。此外， 所有用共聚物-1進行的處理都有效防止創傷部位出血和滲液。因此，這些結果表明給創傷部位單獨施用有效量的共聚物-1或與胰島素和/或 PKC a偽底物抑制肽組合施用可以能夠顯著加速創傷癒合過程。實施例27胸腺分泌的物質對於創傷癒合過程的影響材料和方法在正常的成年齧齒動物或STZ糖尿病小鼠的上背部(靠近脖頸處)切出創傷。處 理後7或9天處死動物，從組織學對創傷分析創傷部位附近胸腺的存在，用上述實施例20 中所述的染色程序分析創傷的表皮和真皮閉合。
結果如圖42A-H所示，在創傷裂口緊鄰處胸腺的存在與創傷中加速的上皮化，組織的 粒化和真皮收縮有關。這些觀察結果表明胸腺分泌的物質可有效利於創傷的癒合過程。 相應地，胸腺衍生的物質例如胸腺素，0胸腺素(例如胸腺素0 4，胸腺素0 10，胸腺素 3 9，胸腺素3 12，胸腺素314)，a thimosin(例如胸腺素a，l/zadaxin，前胸腺素a , parathymosina)，胸腺肽，IGFI, IGFII，NGF，生長激素抑制素，甲狀腺球蛋白，副甲狀腺激 素和/或胸腺激素肽(THP)可用於加速創傷癒合過程的治療。應當理解在分開的實施方案中為清楚起見描述的本發明的特定特徵，也可以在單 個實施方案中組合提供。相反地，在單個實施方案中為簡潔起見描述的本發明的各個特徵， 也可以分開提供或者以任何合適的次組合提供。雖然本發明是結合特定的實施方案描述的，很明顯對於本領域技術人員來說有多 種替代方案，修改和變化都是顯而易見地。相應地，本發明意在包括落在本發明的附加的權 利要求的精神和範圍中的所有替代方案，修改和變化。說明書中提到的所有出版物，專利， 專利申請都將其全文引入說明書中作為參考，如同特別地和單獨指出每一個出版物，專利， 專利申請都被引入本文作為參考。此外，本申請中對任何參考文獻的引用或標識不應當理 解為承認這些文獻可作為本發明的現有技術。由數字標識的參考文獻(其它的文獻在文中引用)1. Hennings, H. , Michael, D. , Cheng, C. , Steinert, P. , Holbrook, K. , andYuspa, S. H. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermalcells in culture. Cell, 19 :245_254，1980.2. Yuspa, S. H. , Kilkenny, A. E. , Steinert, P. M. , and Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated byrestricted extracellular calcium concentrations in vitro.J. Cell Biol. , 109 :1207-1217,1989.3. Fuchs, E.Epidermal differentiation :the bare essentials. J. Cell Biol., 111 :2807-2814,1990.4. Yuspa, S. H. The pathogenesis of squamous cell cancer lessons learnedfrom studies of skin carcinogenesis—Thirty-third G. H. A. Clowes Memorial AwardLecture. Cancer Res. ,54 :1178-1189,1994.5. Hennings, H. and Holbrook, K. A. Calcium regulation of cell-cellcontact and differentiation of epidermal cells in culture. An ultrastructural study. Exp. Cell Res. ，143 :127_142，1983.6. Tennenbaum, T. , Li, L. , Belanger, A. J. , De Luca, L. M. , and Yuspa, S. H. Selective changes in laminin adhesion and a6^4 integrin regulation are associatedwith the initial steps in keratinocyte maturation. Cell Growth Differ. ，7 :615_628，1996.7. Tennenbaum, T. , Belanger, A. J. , Quaranta, V. , and Yuspa, S.H. Differential regulation of integrins and extracellular matrix binding in epidermaldifferentiation and squamous tumor progression. J. Invest. Dermatol.，1 157-161,1996.8. Nishizuka，Y. The molecular heterogeneity of PKC and its implicationsfor cellular regulation. Nature, 334 :661_665，1988.9. Nishizuka, Y.The family of protein kinase C for signal transduction. JAMA,262 :1826-1833，1989.10. Denning, M. F.，Dlugosz，A. A.，Williams, E. K.，Szallasi，Z.，Blumberg， P. M. , and Yuspa, S. H. Specific protein kinase C isozymes mediate the induction ofkeratinocyte differentiation markers by calcium. Cell Growth Differ.，6 149-157，1995.11. Dlugosz, A. A. ,Pettit,G. R. ,and Yuspa,S. H. Involvement of Proteinkinase C in Ca2+-mediated differentiation on cultured primary mouse keratinocytes. J. Invest. Dermatol.，94 :519_519，1990. (Abstract)12. Dlugosz, A. A. and Yuspa，S. H. Coordinate changes in geneexpression which mark the spinous to granular cell transition in epidermis are regulatedbyprotein kinase C. J. Cell Biol.，120 :217_225，1993.13. Kuroki , T. ， Kashiwagi , M. ， Ishino, K. ， Huh， N. , and Ohba, M.Adenovirus-mediated gene transfer to keratinocytes—a review. J. Investig. Dermatol.Symp. Proc.，4 :153-157，1999.14. Rosenfeld，M. A.，Siegfried，W.，Yoshimura，K.，Yoneyama，K.，Fukayama，M.， Stier，L E.，Paakko，P. K.，Gi，P.，Stratford—Perricaudet，M.，Jallet，J.，Pavirani， A.，Lecocq，J. P.，and Crystal, R.G. Adenovirus-mediated transfer of arecombinant al-antitrypsin gene to the lung epithelium in vivo. Science, 252 :431-434,1991.15. Setoguchi，Y.，Jaffe，H. A.，Danel，C.，and Crystal, R. G. Ex Vivo and invivo gene transfer to the skin using replication-deficient recombinant adenovirusvectors. J. Invest. Dermatol.，102 :415_421，1994.16. Greenhalgh, D. A. , Rothnagel, J. A.，and Roop, D. R. Epidermis :Anattractive target tissue for gene therapy. J. Invest. Dermatol. , 103 :63S_69S，1994.17. Miyake，S.，Makimura，M.，Kanegae，Y.，Harada，S.，Sato，Y.，Takamori，K.， Tokuda, C. ， and Saito, I.Efficient generation of recombinantadenoviruses using adenovirus DNA—terminal protein complex and a cosmid bearingthe full-length virus genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，93 :1320-1324，1996.18. Dlugosz, A. A.，Glick，A. B.，Tennenbaum，T.，Weinberg, W. C.，andYuspa， S. H. Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogeneresearch. In :P. K. Vogt and I. M. Verma (eds. )，Methods in Enzymology, pp. 3-20, New York Academic Press. 1995.19. Ohba, M. ， Ishino, K. ， Kashiwagi, M. ， Kawabe, S. ， Chida, K. ， Huh, N. H.， and Kuroki，T. Induction of differentiation in normal human keratinocytes byadenovirus-mediated introduction of the eta and delta isoforms of protein kinase C. Mol. Cell Biol.，18 :5199_5207，1998.
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Tennenbaum, Tamar
Sampson, Sanford
Kuroki, Toshio
Alt, Addy
Shen, Shlomzion
用於癒合創傷的方法和藥物組合物
28181
16
PatentIn version 3.2
1
21
DNA/RNA
人工序列

SiRNA寡核苷酸
1
ggaccacaaa uucaucgcgt t21
2
21
DNA/RNA
人工序列

S iRNA寡核苷酸
2
cgcgaugaau uuguggucct t21
3
21
DNA/RNA
DNA/RNA人工序列SiRNA 寡核苷酸8ccguuuggau ccauagggat t 21921DNA/RNA人工序列SiRNA 寡核苷酸9acuuauuccu gaucccaagt t 211021DNA/RNA人工序列SiRNA 寡核苷酸10cuugggauca ggaauaagut t 211121DNA/RNA人工序列SiRNA 寡核苷酸11auccgcagug gaaugaguct t 211221DNA/RNA人工序列SiRNA 寡核苷酸12gacucauucc acugcggaut t 2113
21DNA/RNA人工序列SiRNA 寡核苷酸13agaccgacga cugucuguat t 211421DNA/RNA人工序列SiRNA 寡核苷酸14uacagacagu cgucggucut t 211521DNA/RNA人工序列SiRNA 寡核苷酸15ggaaccacaa gcaguauuct t 211621DNA/RNA人工序列SiRNA 寡核苷酸16gaauacugcu ugugguucct t 2權利要求
一種誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷癒合過程的方法，所述方法包括給所述損傷的皮膚或皮膚創傷施用治療有效量的胰島素和至少一種其它與所述胰島素協同作用的試劑以誘導或加速所述損傷的皮膚或皮膚創傷的所述癒合過程。
2.權利要求1的方法，其中所述施用是通過單次施用實現的。
3.權利要求1的方法，其中所述治療有效量的胰島素具有0.1 y M到10 y M的胰島素濃度。
4.權利要求1的方法，其中所述至少一種其它試劑是血小板衍生生長因子。
5.權利要求1的方法，其中所述至少一種其它試劑是PKC-a抑制劑。
6.權利要求1的方法，其中所述皮膚創傷選自潰瘍，糖尿病相關的創傷，燒傷，曬傷，老 化皮膚創傷，角膜潰爛創傷，炎性胃腸道疾病創傷，腸炎性疾病創傷，克羅恩氏病創傷，潰瘍 性結腸炎，痔瘡，大皰性表面松解症創傷，皮膚起皰創傷，牛皮癬創傷，動物皮膚創傷，動物 糖尿病創傷，視網膜病創傷，口腔創傷(黏膜炎)，陰道黏膜炎創傷，牙齦病創傷，裂傷，手術 切口創傷和手術後粘連創傷。
7.權利要求6的方法，其中所述潰瘍選自糖尿病性潰瘍，褥瘡，靜脈潰瘍，胃潰瘍和HIV 相關潰瘍。
8.權利要求1的方法，其中所述胰島素是重組的。
9.權利要求1的方法，其中所述胰島素是天然來源的。
10.權利要求1的方法，其中所述胰島素和至少一種其它試劑包含於適合於局部施用 的藥物組合物中。
11.權利要求10的方法，其中所述藥物組合物選自水溶液，凝膠，霜劑，糊劑，洗劑，噴 霧，懸液，粉末，分散液，油膏劑和軟膏劑。
12.權利要求10的方法，其中所述藥物組合物包括固體支持物。
13.一種誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷癒合過程的方法，所述方法包括向所述損 傷的皮膚或皮膚創傷中植入治療有效量的胰島素分泌細胞，從而誘導或加速所述損傷的皮 膚或皮膚創傷的所述癒合過程。
14.權利要求13的方法，其中所述皮膚創傷選自潰瘍，糖尿病相關的創傷，燒傷，曬傷， 老化皮膚創傷，角膜潰爛創傷，炎性胃腸道疾病創傷，腸炎性疾病創傷，克羅恩氏病創傷，潰 瘍性結腸炎，痔瘡，大皰性表面松解症創傷，皮膚起皰創傷，牛皮癬創傷，動物皮膚創傷，動 物糖尿病創傷，視網膜病創傷，口腔創傷(黏膜炎)，陰道黏膜炎創傷，牙齦病創傷，裂傷，手 術切口創傷和手術後粘連創傷。
15.權利要求14的方法，其中所述潰瘍選自糖尿病性潰瘍，褥瘡，靜脈潰瘍，胃潰瘍和 HIV相關潰瘍。
16.權利要求13的方法，其中所述細胞被轉化以產生和分泌胰島素。
17.權利要求16的方法，其中所述細胞被重組PDX1基因轉化，從而使所述細胞產生和 分泌天然胰島素。
18.權利要求16的方法，其中所述細胞被順式作用元件序列轉化，該序列整合到所述 細胞的內源胰島素基因的上遊，從而所述細胞產生和分泌天然胰島素。
19.權利要求16的方法，其中所述細胞被重組胰島素基因轉化，從而所述細胞產生和 分泌重組胰島素。
20.權利要求13的方法，其中所述胰島素分泌細胞能夠形成分泌顆粒。
21.權利要求13的方法，其中所述胰島素分泌細胞是內分泌細胞。
22.權利要求13的方法，其中所述胰島素分泌細胞是人源的。
23.權利要求13的方法，其中所述胰島素分泌細胞是組織相容性人化動物來源的。
24.權利要求13的方法，其中所述胰島素分泌細胞分泌人胰島素。
25.權利要求13的方法，其中所述胰島素分泌細胞是自體細胞。
26.權利要求13的方法，其中所述細胞選自成纖維細胞，上皮細胞和角質化細胞。
27.一種誘導或加速皮膚創傷的癒合過程的方法，所述方法包括轉化所述損傷的皮膚 或皮膚創傷的細胞以產生和分泌胰島素，從而誘導或加速所述損傷的皮膚或皮膚創傷的所 述癒合過程。
28.權利要求27的方法，其中所述創傷選自潰瘍，糖尿病相關的創傷，燒傷，曬傷，老化 皮膚創傷，角膜潰爛創傷，炎性胃腸道疾病創傷，腸炎性疾病創傷，克羅恩氏病創傷，潰瘍性 結腸炎，痔瘡，大皰性表面松解症創傷，皮膚起皰創傷，牛皮癬創傷，動物皮膚創傷，動物糖 尿病創傷，視網膜病創傷，口腔創傷(黏膜炎)，陰道黏膜炎創傷，牙齦病創傷，裂傷，手術切 口創傷和手術後粘連創傷。
29.權利要求28的方法，其中所述潰瘍選自糖尿病性潰瘍，褥瘡，靜脈潰瘍，胃潰瘍和 HIV相關潰瘍。
30.權利要求27的方法，其中所述細胞被重組PDX1基因轉化，從而所述細胞產生和分 泌天然胰島素。
31.權利要求27的方法，其中所述細胞被順式作用元件序列轉化，該序列整合到所述 細胞的內源胰島素基因的上遊，從而所述細胞產生和分泌天然胰島素。
32.權利要求27的方法，其中所述細胞被重組胰島素基因轉化，從而所述細胞產生和 分泌重組胰島素。
33.一種誘導或加速皮膚創傷的癒合過程的方法，所述方法包括轉化所述皮膚創傷的 細胞以產生蛋白激酶C，從而誘導或加速所述損傷的皮膚或皮膚創傷的所述癒合過程。
34.權利要求33的方法，其中所述皮膚創傷選自潰瘍，糖尿病相關的創傷，燒傷，曬傷， 老化皮膚創傷，角膜潰爛創傷，炎性胃腸道疾病創傷，腸炎性疾病創傷，克羅恩氏病創傷，潰 瘍性結腸炎，痔瘡，大皰性表面松解症創傷，皮膚起皰創傷，牛皮癬創傷，動物皮膚創傷，動 物糖尿病創傷，視網膜病創傷，口腔創傷(黏膜炎)，陰道黏膜炎創傷，牙齦病創傷，裂傷，手 術切口創傷和手術後粘連創傷。
35.權利要求34的方法，其中所述潰瘍選自糖尿病性潰瘍，褥瘡，靜脈潰瘍，胃潰瘍和 HIV相關潰瘍。
36.權利要求33的方法，其中所述細胞被轉化以產生蛋白激酶C轉錄活化劑，從而所述 細胞產生天然蛋白激酶C。
37.權利要求33的方法，其中所述細胞被順式作用元件序列轉化，該序列整合到所述 細胞的內源蛋白激酶C的上遊，從而所述細胞產生天然的蛋白激酶C。
38.權利要求33的方法，其中所述細胞被重組蛋白激酶C基因轉化，從而所述細胞產生 重組蛋白激酶C。
39.權利要求33的方法，其中所述蛋白激酶C選自PKC-0l,PKC-^2,PKC-y ,PKC- 0，PKC-入，和 PKC- i。
40.權利要求33的方法，其中所述蛋白激酶C選自PKC-a，PKC-6，PKC- e，PKC- n和 PKC- ^。
41.一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的藥物組合物，所述藥物 組合物包括，作為活性成分的治療有效量的胰島素，至少一種與所述胰島素協同作用的其 它試劑，以及設計用於所述藥物組合物局部施用的藥學可接受的載體。
42.權利要求41的藥物組合物，其中所述至少一種其它試劑是生長因子。
43.權利要求42的藥物組合物，其中所述生長因子是血小板衍生生長因子。
44.權利要求41的藥物組合物，其中所述至少一種其它試劑是PKC-a抑制劑。
45.權利要求41的藥物組合物，其中所述胰島素是重組的。
46.權利要求41的藥物組合物，其中所述胰島素是天然來源的。
47.權利要求41的藥物組合物，其中所述創傷選自潰瘍，糖尿病相關的創傷，燒傷，曬 傷，老化皮膚創傷，角膜潰爛創傷，炎性胃腸道疾病創傷，腸炎性疾病創傷，克羅恩氏病創 傷，潰瘍性結腸炎，痔瘡，大皰性表面松解症創傷，皮膚起皰創傷，牛皮癬創傷，動物皮膚創 傷，動物糖尿病創傷，視網膜病創傷，口腔創傷(黏膜炎)，陰道黏膜炎創傷，牙齦病創傷，裂 傷，手術切口創傷和手術後粘連創傷。
48.權利要求47的方法，其中所述潰瘍選自糖尿病性潰瘍，褥瘡，靜脈潰瘍，胃潰瘍和 HIV相關潰瘍。
49.權利要求41的藥物組合物，其中所述胰島素和至少一種其它試劑包含於適於局部 施用的製劑中。
50.權利要求49的藥物組合物，其中所述製劑選自水溶液，凝膠，霜劑，糊劑，洗劑，噴 霧，懸液，粉末，分散液，油膏劑和軟膏劑。
51.權利要求50的藥物組合物，其中所述藥物組合物包括固體支持物。
52.一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的藥物組合物，所述藥物 組合物包括，作為活性成分的胰島素分泌細胞，以及設計用於所述藥物組合物局部施用的 藥學可接受的載體。
53.權利要求52的藥物組合物，其中所述創傷選自潰瘍，糖尿病相關的創傷，燒傷，曬 傷，老化皮膚創傷，角膜潰爛創傷，炎性胃腸道疾病創傷，腸炎性疾病創傷，克羅恩氏病創 傷，潰瘍性結腸炎，痔瘡，大皰性表面松解症創傷，皮膚起皰創傷，牛皮癬創傷，動物皮膚創 傷，動物糖尿病創傷，視網膜病創傷，口腔創傷(黏膜炎)，陰道黏膜炎創傷，牙齦病創傷，裂 傷，手術切口創傷和手術後粘連創傷。
54.權利要求53的方法，其中所述潰瘍選自糖尿病性潰瘍，褥瘡，靜脈潰瘍，胃潰瘍和 HIV相關潰瘍。
55.權利要求52的藥物組合物，其中所述細胞被轉化以產生和分泌胰島素。
56.權利要求52的藥物組合物，其中所述細胞被重組PDX1基因轉化，從而所述細胞產 生和分泌天然胰島素。
57.權利要求52的藥物組合物，其中所述細胞被順式作用元件序列轉化，該序列整合 到所述細胞的內源胰島素基因的上遊，從而所述細胞產生和分泌天然胰島素。
58.權利要求52的藥物組合物，其中所述細胞被重組胰島素基因轉化，從而所述細胞產生和分泌重組胰島素。
59.權利要求52的藥物組合物，其中所述胰島素分泌細胞能夠形成分泌顆粒。
60.權利要求52的藥物組合物，其中所述胰島素分泌細胞是內分泌細胞。
61.權利要求52的藥物組合物，其中所述胰島素分泌細胞是人源的。
62.權利要求52的藥物組合物，其中所述胰島素分泌細胞是組織相容性人化動物來源的。
63.權利要求52的藥物組合物，其中所述胰島素分泌細胞分泌人胰島素。
64.權利要求52的藥物組合物，其中所述胰島素分泌細胞是自體細胞。
65.權利要求52的藥物組合物，其中所述細胞選自成纖維細胞，上皮細胞和角質化細胞。
66.一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的藥物組合物，所述藥物 組合物包括，作為活性成分的，設計用於轉化所述皮膚創傷的細胞以產生和分泌胰島素的 核酸構建體，以及設計用於所述藥物組合物局部施用的藥學可接受的載體。
67.權利要求66的藥物組合物，其中所述創傷選自潰瘍，糖尿病相關的創傷，燒傷，曬 傷，老化皮膚創傷，角膜潰爛創傷，炎性胃腸道疾病創傷，腸炎性疾病創傷，克羅恩氏病創 傷，潰瘍性結腸炎，痔瘡，大皰性表面松解症創傷，皮膚起皰創傷，牛皮癬創傷，動物皮膚創 傷，動物糖尿病創傷，視網膜病創傷，口腔創傷(黏膜炎)，陰道黏膜炎創傷，牙齦病創傷，裂 傷，手術切口創傷和手術後粘連創傷。
68.權利要求67的方法，其中所述潰瘍選自糖尿病性潰瘍，褥瘡，靜脈潰瘍，胃潰瘍和 HIV相關潰瘍。
69.權利要求66的藥物組合物，其中所述細胞被重組PDX1基因轉化，從而所述細胞產 生和分泌天然胰島素。
70.權利要求66的藥物組合物，其中所述細胞被順式作用元件序列轉化，該序列整合 到所述細胞的內源胰島素基因的上遊，從而所述細胞產生和分泌天然胰島素。
71.權利要求66的藥物組合物，其中所述細胞被重組胰島素基因轉化，從而所述細胞 產生和分泌重組胰島素。
72.一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的藥物組合物，所述藥物 組合物包括，作為活性成分的，設計用於轉化所述皮膚創傷的細胞以產生蛋白激酶C的核 酸構建體，以及設計用於所述藥物組合物局部施用的藥學可接受的載體。
73.權利要求72的藥物組合物，其中所述皮膚創傷選自潰瘍，糖尿病相關的創傷，燒 傷，曬傷，老化皮膚創傷，角膜潰爛創傷，炎性胃腸道疾病創傷，腸炎性疾病創傷，克羅恩氏 病創傷，潰瘍性結腸炎，痔瘡，大皰性表面松解症創傷，皮膚起皰創傷，牛皮癬創傷，動物皮 膚創傷，動物糖尿病創傷，視網膜病創傷，口腔創傷(黏膜炎)，陰道黏膜炎創傷，牙齦病創 傷，裂傷，手術切口創傷和手術後粘連創傷。
74.權利要求73的方法，其中所述潰瘍選自糖尿病性潰瘍，褥瘡，靜脈潰瘍，胃潰瘍和 HIV相關潰瘍。
75.權利要求72的藥物組合物，其中所述細胞被轉化以產生蛋白激酶C轉錄活化劑，從 而所述細胞產生天然蛋白激酶C。
76.權利要求72的藥物組合物，其中所述細胞被順式作用元件序列轉化，該序列整合到所述細胞的內源蛋白激酶C的上遊，從而所述細胞產生天然的蛋白激酶C。
77.權利要求72的藥物組合物，其中所述細胞被重組蛋白激酶C基因轉化，從而所述細 胞產生重組蛋白激酶C。
78.權利要求72的藥物組合物，其中所述蛋白激酶C選自PKC-0l,PKC-^2,PKC-y , PKC- 0，PKC-入，禾口 PKC- i。
79.權利要求72的藥物組合物，其中所述蛋白激酶C選自PKC-a，PKC-6 , PKC- e , PKC- n 和 PKC- ^。
80.一種誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的方法，所述方法包括給所述 皮膚創傷施用治療有效量的調節PKC表達或活化的試劑。
81.一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的藥物組合物，所述藥物 組合物包括，作為活性成分的，治療有效量的調節PKC表達或活化的試劑；和藥學可接受的 載體。
82.—種誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的方法，所述方法包括給所述 損傷的皮膚或皮膚創傷施用治療有效量的PKC活化劑，從而誘導或加速所述損傷的皮膚或 皮膚創傷的所述癒合過程。
83.一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的藥物組合物，所述藥物 組合物包括，作為活性成分的，治療有效量的PKC活化劑，以誘導或加速所述損傷的皮膚或 皮膚創傷的所述癒合過程，以及藥學可接受的載體。
84.一種誘導或加速離體皮膚細胞增殖的方法，所述方法包括給予所述皮膚細胞有效 量的調節PKC產生的試劑。
85.一種誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的方法，所述方法包括給所述 損傷的皮膚或皮膚創傷施用單一劑量的治療有效量的胰島素，從而誘導或加速所述損傷的 皮膚或皮膚創傷的所述癒合過程。
86.權利要求85的方法，其中所述皮膚創傷選自潰瘍，糖尿病相關的創傷，燒傷，曬傷， 老化皮膚創傷，角膜潰爛創傷，炎性胃腸道疾病創傷，腸炎性疾病創傷，克羅恩氏病創傷，潰 瘍性結腸炎，痔瘡，大皰性表面松解症創傷，皮膚起皰創傷，牛皮癬創傷，動物皮膚創傷，動 物糖尿病創傷，視網膜病創傷，口腔創傷(黏膜炎)，陰道黏膜炎創傷，牙齦病創傷，裂傷，手 術切口創傷和手術後粘連創傷。
87.權利要求86的方法，其中所述潰瘍選自糖尿病性潰瘍，褥瘡，靜脈潰瘍，胃潰瘍和 HIV相關潰瘍。
88.權利要求85的方法，其中所述胰島素是重組的。
89.權利要求85的方法，其中所述胰島素是天然來源的。
90.權利要求85的方法，其中所述胰島素包含於適於局部施用的藥物組合物中。
91.權利要求90的方法，其中所述藥物組合物選自水溶液，凝膠，霜劑，糊劑，洗劑，噴 霧，懸液，粉末，分散液，油膏劑和軟膏劑。
92.權利要求90的方法，其中所述藥物組合物包括固體支持物。
93.一種誘導或加速陳舊皮膚創傷的癒合過程的方法，所述方法包括給所述陳舊皮膚 創傷施用單一劑量的治療有效量的胰島素，從而誘導或加速所述陳舊皮膚創傷的所述癒合 過程。
94.權利要求93的方法，其中所述陳舊皮膚創傷是至少2天齡的。
95.權利要求93的方法，其中所述陳舊皮膚創傷選自潰瘍，糖尿病相關的創傷，燒傷， 曬傷，老化皮膚創傷，角膜潰爛創傷，炎性胃腸道疾病創傷，腸炎性疾病創傷，克羅恩氏病創 傷，潰瘍性結腸炎，痔瘡，大皰性表面松解症創傷，皮膚起皰創傷，牛皮癬創傷，動物皮膚創 傷，動物糖尿病創傷，視網膜病創傷，口腔創傷(黏膜炎)，陰道黏膜炎創傷，牙齦病創傷，裂 傷，手術切口創傷和手術後粘連創傷。
96.權利要求95的方法，其中所述潰瘍選自糖尿病性潰瘍，褥瘡，靜脈潰瘍，胃潰瘍和 HIV相關潰瘍。
97.權利要求93的方法，其中所述胰島素是重組的。
98.權利要求93的方法，其中所述胰島素是天然來源的。
99.權利要求93的方法，其中所述胰島素包含於適於局部施用的藥物組合物中。
100.權利要求99的方法，其中所述藥物組合物選自水溶液，凝膠，霜劑，糊劑，洗劑，噴 霧，懸液，粉末，分散液，油膏劑和軟膏劑。
101.權利要求99的方法，其中所述藥物組合物包括固體支持物。
102.一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的藥物組合物，所述藥物 組合物包括，作為活性成分的，所選擇的能誘導或加速所述損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合 過程的單一劑量單位的胰島素，以及設計用於所述藥物組合物局部施用的藥學可接受的載 體。
103.權利要求102的藥物組合物，其中所述單一劑量單位的胰島素是在0.01-0. 2ml的 所述藥物組合物中的0. 001到5nM。
104.權利要求102的藥物組合物，其中所述單一劑量單位的胰島素是在0.01-0. 2ml的 所述藥物組合物中的0. 01到0. 5nM。
105.權利要求102的藥物組合物，其中所述胰島素是重組的。
106.權利要求102的藥物組合物，其中所述胰島素是天然來源的。
107.權利要求102的藥物組合物，其中所述損傷的皮膚或皮膚創傷選自潰瘍，糖尿病 相關的創傷，燒傷，曬傷，老化皮膚創傷，角膜潰爛創傷，炎性胃腸道疾病創傷，腸炎性疾病 創傷，克羅恩氏病創傷，潰瘍性結腸炎，痔瘡，大皰性表面松解症創傷，皮膚起皰創傷，牛皮 癬創傷，動物皮膚創傷，動物糖尿病創傷，視網膜病創傷，口腔創傷(黏膜炎)，陰道黏膜炎 創傷，牙齦病創傷，裂傷，手術切口創傷和手術後粘連創傷。
108.權利要求107的方法，其中所述潰瘍選自糖尿病性潰瘍，褥瘡，靜脈潰瘍，胃潰瘍 和HIV相關潰瘍。
109.權利要求102的藥物組合物，其中所述胰島素包含於適於局部施用的製劑中。
110.權利要求109的藥物組合物，其中所述製劑選自水溶液，凝膠，霜劑，糊劑，洗劑， 噴霧，懸液，粉末，分散液，油膏劑和軟膏劑。
111.權利要求102的藥物組合物，其中所述藥物組合物包括固體支持物。
112.—種誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的方法，所述方法包括給所述 皮膚創傷施用治療有效量的共聚物-1。
113.權利要求112的方法，其中所述施用是通過單次施用進行的。
114.權利要求111的方法，其中所述治療有效量的共聚物-1是濃度為1到500u g/ml的共聚物-1。
115.權利要求111的方法，其中所述創傷選自潰瘍，糖尿病相關的創傷，燒傷，曬傷，老 化皮膚創傷，角膜潰爛創傷，炎性胃腸道疾病創傷，腸炎性疾病創傷，克羅恩氏病創傷，潰瘍 性結腸炎，痔瘡，大皰性表面松解症創傷，皮膚起皰創傷，牛皮癬創傷，動物皮膚創傷，動物 糖尿病創傷，視網膜病創傷，口腔創傷(黏膜炎)，陰道黏膜炎創傷，牙齦病創傷，裂傷，手術 切口創傷和手術後粘連創傷。
116.權利要求115的方法，其中所述潰瘍選自糖尿病性潰瘍，褥瘡，靜脈潰瘍，胃潰瘍 和HIV相關潰瘍。
117.權利要求111的方法，其中所述鹼性蛋白類似物包含於適於局部施用的製劑中。
118.一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的藥物組合物，所述藥物 組合物包括，作為活性成分的，治療有效量的共聚物-1，以及設計用於所述藥物組合物局部 施用的藥學可接受的載體。
119.權利要求118的藥物組合物，其中所述皮膚創傷選自潰瘍，糖尿病相關的創傷，燒 傷，曬傷，老化皮膚創傷，角膜潰爛創傷，炎性胃腸道疾病創傷，腸炎性疾病創傷，克羅恩氏 病創傷，潰瘍性結腸炎，痔瘡，大皰性表面松解症創傷，皮膚起皰創傷，牛皮癬創傷，動物皮 膚創傷，動物糖尿病創傷，視網膜病創傷，口腔創傷(黏膜炎)，陰道黏膜炎創傷，牙齦病創 傷，裂傷，手術切口創傷和手術後粘連創傷。
120.權利要求119的方法，其中所述潰瘍選自糖尿病性潰瘍，褥瘡，靜脈潰瘍，胃潰瘍 和HIV相關潰瘍。
121.權利要求111的藥物組合物，其中所述共聚物-1包含於適合於局部施用的製劑中。
122.權利要求121的藥物組合物，其中所述製劑選自水溶液，凝膠，霜劑，糊劑，洗劑， 噴霧，懸液，粉末，分散液，油膏劑和軟膏劑。
123.權利要求111的藥物組合物，其中所述藥物組合物包括固體支持物。
124.—種誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的方法，所述方法包括調節定 居於所述皮膚創傷的真皮細胞中的至少一種PKC同種型的表達和/或活性；給所述真皮細 胞施用治療有效量的至少一種選自激素，生長因子，脂肪細胞激素，PKC6 RACK和GW9662 的其它試劑以及調節所述PKC同種型的表達和/或活性，從而誘導或加速所述損傷的皮膚 或皮膚創傷的所述癒合過程。
125.權利要求124的方法，其中所述真皮細胞是成纖維細胞或角質化細胞。
126.權利要求124的方法，其中所述PKC同種型選自PKC-a，PKC-0，PKC-S，和 PKC- ^。
127.權利要求124的方法，其中所述激素是胰島素。
128.權利要求124的方法，其中所述生長因子選自IL-6，KTO和TNFa。
129.權利要求124的方法，其中所述脂肪細胞激素是adipsin或脂聯素。
130.一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的藥物組合物，所述藥物 組合物包括，作為活性成分的，治療有效量的調節至少一種PKC同種型的表達或活化的物 質，和至少一種選自激素，生長因子，脂肪細胞激素，PKC6 RACK和GW9662的其它試劑，以 及藥學可接受的載體。
131.權利要求130的藥物組合物，其中所述激素是胰島素。
132.權利要求130的藥物組合物，其中所述生長因子選自IL-6，KTO和TNFa。
133.權利要求130的藥物組合物，其中所述脂肪細胞激素是adipsin或脂聯素。
134.權利要求130的藥物組合物，其中所述皮膚創傷選自潰瘍，糖尿病相關的創傷，燒 傷，曬傷，老化皮膚創傷，角膜潰爛創傷，炎性胃腸道疾病創傷，腸炎性疾病創傷，克羅恩氏 病創傷，潰瘍性結腸炎，痔瘡，大皰性表面松解症創傷，皮膚起皰創傷，牛皮癬創傷，動物皮 膚創傷，動物糖尿病創傷，視網膜病創傷，口腔創傷(黏膜炎)，陰道黏膜炎創傷，牙齦病創 傷，裂傷，手術切口創傷和手術後粘連創傷。
135.權利要求134的藥物組合物，其中所述潰瘍選自糖尿病性潰瘍，褥瘡，靜脈潰瘍， 胃潰瘍和HIV相關潰瘍。
136.權利要求130的藥物組合物，其包含於適合於局部施用的製劑中。
137.權利要求136的藥物組合物，其中所述製劑選自水溶液，凝膠，霜劑，糊劑，洗劑， 噴霧，懸液，粉末，分散液，油膏劑和軟膏劑。
138.權利要求130的藥物組合物，其中所述藥物組合物包括固體支持物。
139.—種適於局部施用以誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的藥物組合 物，所述藥物組合物包含治療有效量的胰島素和至少一種與所述胰島素協同作用的其它試 劑，其中所述至少一種其它試劑是十四醯化PKC a偽底物肽。
140.一種適於局部施用以誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的藥物組合 物，所述藥物組合物由治療有效量的胰島素和至少一種與所述胰島素協同作用的其它試劑 組成，其中所述至少一種其它試劑是十四醯化PKC a偽底物肽。
全文摘要
一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的藥物組合物，所述藥物組合物包括，作為活性成分的治療有效量的胰島素和至少一種與所述胰島素協同作用的其它試劑，以及適合於所述藥物組合物局部施用的藥學可接受的載體。一種用於誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程的方法，所述方法包括對損傷的皮膚或皮膚創傷施用治療有效量的胰島素和至少一種與所述胰島素協同作用的其它試劑以誘導或加速損傷的皮膚或皮膚創傷的癒合過程。
文檔編號A61K38/45GK101850108SQ200910217138
公開日2010年10月6日 申請日期2004年7月15日 優先權日2003年7月15日
發明者A·阿爾特, S·森普森, S·沈, T·庫羅基, T·藤蘭鮑姆 申請人:巴爾-伊蘭大學