太子參四倍體不定根誘導培養方法

2023-07-10 12:50:06 2

專利名稱：：太子參四倍體不定根誘導培養方法
技術領域：
：本發明涉及的是一種生物工程領域的方法，具體是一種太子參四倍體不定根誘導培養方法。
背景技術：
：太子參是我國的一味珍貴的滋補類中草藥，以根入藥，具有補氣健脾，增強人體免疫力的作用，《神農本草經》中列為上品。素有"老食人參，中食黨參，少食太子參"的說法。由於用量巨大，目前面臨著兩個危機:一是野生植物資源蘊藏量和產量普遍存在著下降趨勢；二是太子參需求量不斷增加，造成了對該藥用植物資源的超量採挖。傳統的太子參大田栽培一方面受"天時地利"的影響，產量質量波動大；另一方面不可避免地帶來農藥殘留汙染和植物病毒病等問題。另外，組織、細胞生物反應器培養具有生長迅速，易於控制的特點，從而可以逐漸取代大田栽培滿足市場的需要。MS培養基為Murashige和Skoog(1962)公開的培養基，其中1/2MS培養基為大量元素減半MS培養基。MS培養基在現有的生物以及農業等領域有著廣泛的應用。經對現有技術文獻的檢索發現，謝燕等在《資源與環境學報》上發表的"太子參快繁技術的優化及同源四倍誘導"，該文章中以生長點為外植體誘導四倍體，用這種方式誘導出來的四倍體多為嵌合體。該文中雖然給出了太子參組織培養方法的介紹，但四倍體來源的太子參不定根誘導和連續培養並沒有進行研究。
發明內容本發明的目的是針對上述現有技術中的不足，提出了一種太子參四倍體不定根誘導培養方法，本發明以太子參愈傷組織為材料，獲得純合四倍體個體，再從純合四倍體愈傷組織上誘導獲得不定根。本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括如下步驟-步驟一，用氯化汞溶液對太子參種子表面進行消毒，然後接種到種子萌發培4養基中，暗培養；步驟二，切取下胚軸接種到胚性愈傷組織誘導培養基中，進行愈傷組織誘導；步驟三，將步驟二生成的愈傷組織繼代2-4次，並將繼代後的愈傷組織在秋水仙鹼中浸泡，然後轉到分化培養基中，培養出再生植株；步驟四，對再生植株根尖的染色體進行檢測，根據染色體檢測結果選取四倍體植株，並用流式細胞儀篩選純合四倍體株系；步驟五，將純合四倍體株系的莖段接種到生根用愈傷組織誘導培養基中誘導愈傷組織；步驟六，將步驟五生成的愈傷組織接種到不定根誘導培養基中誘導不定根；步驟七，將步驟六誘導出的四倍體不定根接種到搖瓶中，然後放置在搖床上振蕩培養；步驟八，將振蕩培養後的不定根接種到反應器中進行間歇噴霧式培養。所述種子萌發培養基，為添加lmg/L赤黴素的MS培養基。所述胚性愈傷組織誘導培養基，為添加2mg/L萘乙酸，0.2mg/L2，4-氯化苯氧乙酸，0.2mg/L激動素的MS培養基。所述繼代，在不含激素的MS培養基中進行，每次20-40天。所述分化培養基，為添加3%血紅素、0.2mg/L毒莠錠、1.0mg/L赤黴素、大量元素減半且不含硝酸銨的MS培養基。所述生根用愈傷組織誘導培養基，為添加2mg/L萘乙酸的MS培養基。所述不定根誘導培養基，為添加3.0mg/L吲哚丁酸、0.lmg/L6-苄氮基嘌呤、50克每升蔗糖且大量元素減半的MS培養基。所述放置在搖床上振蕩培養，其時間為5天-10天。所述間歇噴霧式培養，其使用的反應器為噴霧式反應器，反應器中使用的培養基為添加1.5mg/LIBA、0.05mg/L6-BA、30g/L蔗糖且大量元素減半的MS培養基。具體條件為通氣速率為0.3vvm，灌注速率為每天50%(體積百分比)，噴霧持續時間為一次5分鐘，噴霧周期為4次每小時，培養溫度為25°C，暗培養。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明以太子參愈傷組織為材料，獲得純合四倍體個體，再從純合四倍體愈傷組織上誘導獲得不定根。本發明5獲得的太子參四倍體不定根不但生長速率快，其化學成份的含量高於大田種植生產的根。具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。本實施例的太子參種子來自中國藥科大學。本實施例所述MS培養基採用Murashige和Skoog(1962)公開的培養基，具體成分如下tableseeoriginaldocumentpage6所述1/2MS培養基為大量元素減半MS培養基。本實施例包括如下步驟步驟一，用質量百分比0.1%的升汞溶液對太子參種子表面消毒12分鐘後，接種到添加lmg/L赤黴素到MS培養基的種子萌發培養基(即MS+1.0mg/LGA3)中，獲得無菌材料，並於黑暗中培養一周；步驟二，切取1.Ocm長的下胚軸接種到胚性愈傷組織誘導培養基中誘導愈傷組織，胚性愈傷組織誘導培養基為添加2mg/L萘乙酸，0.2mg/L2，4-氯化苯氧乙酸，0.2mg/L激動素的MS培養基(即MS+2.Omg/LNAA+O.2mg/L2，4-D+0.lmg/LKT);步驟三，將步驟二生成的愈傷組織在不含激素的MS培養基上繼代2-4次，每次20天-40天，並將繼代後的愈傷組織在0.1%秋水仙鹼中浸泡5分鐘-30分鐘，然後無菌清洗3-6次，並轉到分化培養基中，兩個月後培養出再生植株，分化培養基為添加3%血紅素、0.2mg/L毒莠錠、1.0mg/L赤黴素、大量元素減半且不含硝酸銨的MS培養基(即不含硝酸銨的1/2MS+3。/。血紅素+毒莠錠0.2mg/L+GA3l.0，g/L);步驟四，對再生植株根尖的染色體進行檢測，根據染色體檢測結果選取染色體檢測結果為2n=4X=64的植株，即選取出四倍體植株，並用流式細胞儀篩選純合四倍體株系；步驟五，將純合四倍體植株的莖段接種到生根用愈傷組織誘導培養基中誘導愈傷組織一個月，生根用愈傷組織誘導培養基為添加2mg/L萘乙酸的MS培養基(即MS+NAA2.0mg/L);步驟六，將步驟五生成的愈傷組織接種到不定根誘導培養基中誘導不定根，不定根誘導培養基為添加3.Omg/L吲哚丁酸、0.lmg/L6-苄氨基嘌呤、50克每升蔗糖且大量元素減半的MS培養基(即1/2MS+3.Omg/LIBA+O.1mg/L6-BA+50g/L蔗糖)；步驟七，將步驟六生長出的不定根接種到搖瓶中，接種量為5%-12%(每100ml體積接種的鮮克數)，然後放置在搖床上於lOOrpm，25匸下振蕩培養，培養一周時間；步驟八，將振蕩培養後的不定根按8%-15%(每100ml體積接種的鮮克數)接種到4.8升的噴霧式反應器中培養，反應器中的培養基為添加1.5mg/LIBA、0.05mg/L6-BA、30g/L蔗糖且大量元素減半的MS培養基(即1/2MS+1.5mg/LIBA+O.05呢/L6-BA+30g/L蔗糖)，通氣速率為0.3vvm，灌注速率為50%(體積百分比)每天，噴霧時間為一次5分鐘，噴霧周期為4次每小時，培養溫度為25°C，暗培養。本實施例分別進行了太子參胚性愈傷組織誘導、體細胞胚植物再生、四倍體誘導與純合體篩選、純合四倍體植株不定根誘導與噴霧式生物反應器培養等實驗。結果太子參胚性愈組織誘導率這到100%，體細胞胚植物再生率達到30%，得到四倍體50株，得到12個純合體株系。用純合體株系的莖段誘導生根用愈傷組織時，誘導率達了100%。將該愈傷組織(平均直徑為lcm)轉移到不定根誘導培養基中，l個月後每塊愈傷組織上平均分化了22條不定根。本實施例中將太子參純合四倍體不定根接種到噴霧式反應器中進行了培養，結果表明，在該培養條件下，最大平均生長率達到0.25±0.08每天，高於用氣升式反應器培養時的0.22±0.12每天。權利要求1、一種太子參四倍體不定根誘導培養方法，其特徵在於，包括如下步驟步驟一，用氯化汞溶液對太子參種子表面進行消毒，然後接種到種子萌發培養基中，暗培養；所述種子萌發培養基為添加1mg/L赤黴素的MS培養基；步驟二，切取下胚軸接種到胚性愈傷組織誘導培養基中，進行愈傷組織誘導，所述胚性愈傷組織誘導培養基為添加2mg/L萘乙酸，0.2mg/L2，4-氯化苯氧乙酸，0.2mg/L激動素的MS培養基；步驟三，將步驟二生成的愈傷組織繼代2-4次，並將繼代後的愈傷組織在秋水仙鹼中浸泡，然後轉到分化培養基中，培養出再生植株；所述分化培養基為添加質量百分比為3％的血紅素、0.2mg/L的毒莠錠、1.0mg/L的赤黴素、大量元素減半且不含硝酸銨的MS培養基；步驟四，對再生植株根尖的染色體進行檢測，根據染色體檢測結果選取四倍體植株，並用流式細胞儀篩選純合四倍體株系；步驟五，將純合四倍體株系的莖段接種到生根用愈傷組織誘導培養基中誘導愈傷組織；所述生根用愈傷組織誘導培養基為添加2mg/L的萘乙酸的MS培養基；步驟六，將步驟五生成的愈傷組織接種到不定根誘導培養基中誘導不定根；所述不定根誘導培養基為添加3.0mg/L的吲哚丁酸、0.1mg/L的6-苄氨基嘌呤、50g/L的蔗糖且大量元素減半的MS培養基；步驟七，將步驟六誘導出的四倍體不定根接種到搖瓶中，然後放置在搖床上振蕩培養；步驟八，將振蕩培養後的不定根接種到反應器中進行間歇噴霧式培養。2、根據權利要求1所述的太子參四倍體不定根誘導培養方法，其特徵是，所述繼代在不含激素的MS培養基中進行，每次20-40天。3、根據權利要求1所述的太子參四倍體不定根誘導培養方法，其特徵是，所述放置在搖床上振蕩培養，其時間為5天-10天。4、根據權利要求1所述的太子參四倍體不定根誘導培養方法，其特徵是，所述間歇噴霧式培養，其使用的反應器為噴霧式反應器，反應器中使用的培養基為添加1.5mg/LIBA、0.05mg/L6-BA、30g/L蔗糖且大量元素減半的MS培養基。5、根據權利要求1或4所述的太子參四倍體不定根誘導培養方法，其特徵是，所述間歇噴霧式培養，其具體條件為通氣速率為0.3vvm，灌注速率為每天50%，噴霧持續時間為一次5分鐘，噴霧周期為4次每小時，培養溫度為25'C，暗培養。全文摘要本發明涉及一種生物工程領域的太子參四倍體不定根誘導培養方法，用氯化汞對太子參種子表面進行消毒，然後接種到種子萌發培養基中培養；切取下胚軸接種到胚性愈傷組織誘導培養基中誘導愈傷組織；將愈傷組織繼代，並在秋水仙鹼中浸泡後轉到分化培養基中，培養出再生植株；對再生植株根尖的染色體進行檢測，用流式細胞儀篩選純合四倍體植株；將純合四倍體株系的莖段接種到生根用愈傷組織誘導培養基中誘導愈傷組織；將愈傷組織接種到不定根誘導培養基中誘導不定根；將不定根接種到搖瓶中，放置在搖床上振蕩培養；將振蕩培養的不定根接種到反應器中。本發明培養的太子參四倍體不定根具有生長快、有效成份含量高的特點。文檔編號A01H1/08GK101473788SQ20081020508公開日2009年7月8日申請日期2008年12月31日優先權日2008年12月31日發明者王貴榮,齊念民申請人:上海交通大學