檢測人類受試者中的毛滴蟲感染的試劑盒的製作方法

2023-07-10 11:15:36

專利名稱：檢測人類受試者中的毛滴蟲感染的試劑盒的製作方法
本申請是申請號為03812303.7(國際申請號為PCT/US03/09474)、申請日為2003年3月27日、發明名稱為「毛滴蟲檢測的方法和裝置」(後變更為「檢測人類受試者中的毛滴蟲感染的試劑盒」)的中國專利申請的分案申請。
發明領域 本發明涉及一種檢測毛滴蟲感染的免疫測定方法和試劑盒。
參考文獻
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背景技術：
毛滴蟲是感染人和動物的原生動物寄生蟲。存在15種以上的毛滴蟲。陰道毛滴蟲(T.vaginalis)是能引起男性和女性滴蟲病病症(或」trichomonosis」或」trich」)的毛滴蟲的一種。該寄生蟲通過性傳播並且是目前世界上最普遍的非病毒性性傳播疾病(STD)動因。據估計，在美國每年有5至8百萬婦女患滴蟲病，有25％的性活躍期婦女可以在任何特定的時間被感染。
在男性中，據估計滴蟲病佔非衣原體、非淋球菌尿道炎的17％。在婦女中，臨床症狀多種多樣，從無症狀攜帶到症狀明顯的陰道炎；並且感染能夠不確定地持續。嚴重的症狀包括帶有惡臭排洩物的腹痛並伴隨有疼痛和不適感，類似於陰道酵母菌感染。男性則多傾向於平均4個月持續無症狀狀態，而在受感染的男子中有文獻記載的疾病包括尿道炎、前列腺炎、陰莖頭包皮炎以及其他疾病。
人受到毛滴蟲感染會導致嚴重的健康後果。毛滴蟲分泌一種能降解陰道抗體、保護性細胞層和免疫應答細胞的蛋白酶，因而增加了受感染婦女對其他性傳播疾病的易感性。研究顯示，感染陰道毛滴蟲的女性患HIV的危險是原來的2-10倍，男性精子中HIV和毛滴蟲均為陽性的比例是HIV為陽性的6倍，因此增加了感染同伴的可能性(Wasserheit，1992)。並且，毛滴蟲感染增加了患子宮頸癌的危險，並且能反過來影響受精和懷孕(Yap et al.，1995；Zhang et al.1995)。幸運的是，如果寄生蟲感染能夠被成功的檢測的話，則在多數病人能夠得到治療。
目前，毛滴蟲病的診斷依賴於對從女性陰道腔或男子尿道中提取的活體組織進行的檢測和形態學識別。識別通過顯微檢測鹽水溼塗片(Mount)標本，直接目測活生物體而完成。儘管當陽性時高度特異，在無症狀或輕微症狀患者中或之前的24小時內進行過衝洗的婦女中，溼塗片法檢測常常為陰性。溼塗片顯微鏡法的整體靈敏性或可靠性為58％(Weise et al.)，並且可低至30％。溼塗片顯微鏡法也可以嘗試使用尿液樣品，然後用離心方式濃縮沉澱中的所有毛滴蟲，然後重懸收集的毛滴蟲並檢測。當用溼塗片顯微鏡法對尿液樣品進行檢測時，效率極低，靈敏性低至7％(與培養法的40％相比較)(van der scheec.，et al.j.clin microbial.1999 dec；37(12)4127-30)。此外，對於任何描述過的樣品類型，使用溼塗片顯微鏡法的檢測是主觀的、煩瑣的、費時的，並且需要經過專門訓練的人員參與。
通過泌尿生殖器樣品的培養可以提高被檢測的數量。遺憾的是，該步驟需要幾天才能完成(典型的為2-5天)並且必須在專門的實驗室和由受過培訓的人員進行操作。此外，這兩種方法都要求樣品中的寄生蟲在被檢測之前是活體，因此限制了某些樣品類型的適宜性。比如，尿液對於以培養為基礎的毛滴蟲診斷就是不適當的樣品培養基，儘管比起溼塗片法具有更高的敏感度(Mohamed etal.Sex.Transmitted Infect.，2001.77(1)78-9)。利用PCR，人們進行了諸多嘗試來改進對尿液以及其它樣品類型中毛滴蟲的診斷技術。儘管PCR比起溼塗片或培養法具有更具潛力的靈敏性(根據上述文獻為87％)，但在什麼樣的引物序列是毛滴蟲特異方面仍然缺乏科學的一致性(PCR不是FDA允許的診斷方法)。並且，在差異樣本和臨床汙染樣本中的假陽性問題也阻礙了該技術的應用。高度擴增的樣本可以提供陽性結果但並非指示了實際的感染，而是當作代表了先前感染的痕量。此外，PCR是具有許多操作和程序控制的高技術工序，需要昂貴的設備，並且不能進行即時(point of care)診斷；所有這些因素妨礙其作為一種對毛滴蟲進行實際診斷方法的適宜性。
一種通過溶解樣品中的微生物並且釋放出其中的核苷酸的毛滴蟲感染檢測方法已經被披露。毛滴蟲的存在通過將釋放的核苷酸同探針雜交而得以確定。該方法涉及大量操作和貴重的儀器設備，其靈敏度低於溼塗片顯微鏡法。
毛滴蟲的高頻感染與不能及時處理導致不利後果的可能性相結合，解釋了對於快速、靈敏和精確診斷測試毛滴蟲感染以及評價治療效果能力的需求。診斷測試方法應該適用於各種被估計包含毛滴蟲樣品，無論該樣品是否包含活體，尤其是，應該允許對尿液(取樣自男子和女性)和陰道拭子(Swab)樣品進行檢測。此外，該方法應該具有高度可靠性，如對感染個體產生陽性結果。
發明概述 一方面，本發明包括一種檢測受試者陰道毛滴蟲感染的方法。在實踐該方法的過程中，獲得受試體的體液樣品，如尿液或陰道拭子樣品，使之與針對毛滴蟲粘附素多肽的特異性抗體接觸，如果該受試體感染了毛滴蟲，則會形成抗體-粘附素多肽複合體。當臨床樣品是陰道拭子樣品，則以複合體存在或不存進行的檢測具有至少80％的可靠性，有代表性的可靠性可達90％，當臨床樣品是尿液的可靠性大於40％。
更廣泛地講，本發明可用於檢測哺乳動物的毛滴蟲感染，如母牛或其他家養動物。例如，母牛中的Tt.foetus感染，使用抗陰道毛滴蟲粘附素蛋白的抗體或抗來自感染種類，比如Tt.foetus的同源粘附素蛋白的抗體作為抗體試劑。
用於檢測人類陰道毛滴蟲感染的典型粘附素蛋白是陰道毛滴蟲AP65，AP51，AP33，AP23粘附素蛋白，及其免疫學反應的片段，尤其是AP65和AP33粘附素蛋白。同樣的，示例性的抗體是抗AP65抗體，例如，由細胞系DM116和C55細胞系產生的抗體，用於非人測定的典型多肽是衍生自感染的毛滴蟲動物的同源粘附素多肽。
在一個優選的測定模式中，接觸步驟包括將樣品放置在乾燥條的樣品應用帶上，所述乾燥條沿上遊到下遊的方向具有樣品應用區、反應帶和檢測帶，所述反應帶中含有特異性抗毛滴蟲粘附素多肽的非固相化標記抗體，所述檢測帶含有特異性抗所述複合體中毛滴蟲粘附素多肽的固相化抗體，其中(i)樣品在所述的乾燥條上沿下遊方向朝反應帶移動，(ii)樣品中的粘附素多肽分析物與反應帶的非固相化標記抗體反應而形成移動的標記的粘附素多肽一抗體複合體，和(iii)複合體向檢測帶移動，(iv)所述的複合體與檢測帶的固相化抗體反應而在檢測帶形成固相化標記複合體，以及(v)非複合體的固相化標記抗體移動到檢測帶的下遊。檢測步驟包括檢測檢測帶的固相化的標記複合體的存在或缺失。
在另一個測定模式中，所獲樣品是陰道抹片，該樣品被固定(例如使用乙醇或甲醇)。該陰道抹片可以是常規的陰道抹片或者流質試樣，示例性的是通過Cytyc製備的thin-prep陰道抹片。該樣品在檢測粘附素蛋白的被標記抗體存在下製備，所述粘附素蛋白受到了固定程序的變性條件的影響。一個示例性的抗體是AP33抗體。該方法可以包括對thin prep的處理從而移走未結合標記抗體。
另一方面，本發明包括檢測人類受試體陰道毛滴蟲感染的試劑盒。該試劑盒包括具有使被應用液體通過毛細作用而流動的乾燥條，在該乾燥條內，通過毛細作用從上遊的樣品應用帶，經過反應帶，到下遊檢測帶。反應帶包含特異性針對毛滴蟲粘附素多肽的非固相化的被標記抗體，能有效形成一個移動的粘附素蛋白-抗體複合體，檢測帶包含特異性針對複合體中毛滴蟲粘附素多肽的固相化抗體。體液樣品置於樣品應用帶之後(i)樣品在乾燥條上向下遊方向的反應帶移動，(ii)樣品中的粘附素多肽分析物與反應帶的非固相化捕捉抗體反應而形成移動的、標記的粘附素多肽-抗體複合體，(iii)複合體向檢測帶移動，(iv)該複合體與檢測帶固相化抗體反應而在檢測帶形成固相化標記複合體，以及(v)非複合的固相化標記抗體移動到檢測帶的下遊。受試體毛滴蟲感染的存在或缺乏通過檢測帶可檢測標記的存在或缺乏而得以確定。
試劑盒中的示例性的非固相化抗體是免疫特異性抗AP65、AP51、AP33和AP23粘附素蛋白，及其免疫學反應片段，其中優選的是AP65。試劑盒中的示例性抗體是由DM116細胞系製備的抗體。
另一方面，檢測受試人體毛滴蟲感染的方法包括從受試體中獲得體液樣品，例如唾液或者血液；將樣品與毛滴蟲粘附素多肽接觸，如果受試體受到毛滴蟲的感染則會形成抗體-粘附素多肽複合體；檢測複合體的存在或缺失可以確定受試體存在或缺乏毛滴蟲感染。
示例性的粘附素多肽是AP65、AP51、AP33、AP23粘附素蛋白，及其免疫學反應的片段。
在一個測定模式中，將樣品放置在乾燥條的樣品應用帶上，所述乾燥條沿上遊到下遊的方向具有樣品應用區、反應帶和檢測帶，反應帶包括標記的非固相化毛滴蟲粘附素多肽，其可有效地與存在於毛滴蟲感染個體中的抗毛滴蟲抗體反應以形成移動的抗體-粘附素多肽複合體，檢測帶包括特異性針對人體抗體的固相化捕捉抗體。樣品加入之後，(i)樣品在所述的乾燥條上沿下遊方向朝反應帶移動，(ii)樣品中的粘附素多肽分析物與反應帶的非固相化標記抗體反應而形成移動的標記的粘附素多肽一抗體複合體，和(iii)複合體向檢測帶移動，(iv)所述的複合體與檢測帶的固相化抗體反應而在檢測帶形成固相化標記複合體，以及(v)非複合體的固相化標記抗體移動到檢測帶的下遊。試劑盒中的示例性固相化抗體是由C55細胞系製備的抗體。通過檢測帶上標記複合體的存在或缺失確定固相化標記複合體的存在或缺乏。
當閱讀了下面的本發明的詳細說明以及所附附圖，將會對本發明的這些以及其他目的和特點有更全面的理解。
附圖簡述 附

圖1顯示根據本發明的毛滴蟲測定試劑盒的測試條俯視圖； 附圖2顯示附圖1測試條的側視圖。
附圖3是根據本發明的測定試劑盒的平面圖； 附圖4是附圖3的試劑盒的側視剖面圖； 發明詳述 1.定義 下面的術語具有下面所述的含義，除非在本說明書中另有說明。
這裡所用的術語「毛滴蟲」包括，但不限於毛滴蟲目，Ditrichomonas屬，毛滴蟲，Tritrichomonas，以及五鞭毛滴蟲的原生動物寄生蟲，包括感染人和動物的多個種。「毛滴蟲」涉及任何毛滴蟲種，舉例來說，涉及Tritrichomonas foetus(也稱作Trichomonasfoetus，Tt.fetus)，Tt.enteris，以及感染牛的T.pavlovi，Tt.suis，Tt.rotunda，以及感染豬的T.buttreyi，感染羊的Dt.ovis，感染馬的Tt.equi以及T.equibuccalis，感染鳥的T.anatis，Tt.eberthi，T.gallinae，以及T.gallinarum，感染齧齒動物的Tt.caviae，Ttmuris，Tt.wenoni，Tt.minuta，以及T.microti，感染狗和貓的T.canistomae和T.felistomae，以及感染生物樣品中的靈長類動物(包括人的)T.tenax，T.vaginalsi，Pt.Hominis，以及T.macacovaginae。在人類疾病中，「毛滴蟲」涉及但不限於陰道毛滴蟲(T.vaginalis)。「陰道毛滴蟲」涉及任何能夠感染人類的陰道毛滴蟲種。
這裡所用的術語「抗體」包括但不限於能特異結合和識別被分析物(抗原或抗體)的基本上是由免疫球蛋白基因編碼的多肽或免疫球蛋白基因或其片段。「抗體」還包括但不限於能特異結合和識別抗體的抗原特異性識別區(獨特型)，所述抗體由暴露於毛滴蟲抗原的宿主產生。例子包括多克隆的、單克隆的，嵌合的，人源化和單鏈抗體等等。免疫球蛋白的片段包括Fab片段和通過表達文庫產生的片段，包括噬菌體展示。參見，舉例來說.，Paul，FundamentalImmunology，3rdEd.，1993，Raven Press，New York，for antibodystructure and terminology。
術語「表位」指能夠特異結合抗體的抗原決定簇。表位通常由一組表面分子，如胺基酸或糖側鏈，以及通常具有特異三維結構特徵和具有特異帶電荷特徵的分子構成。
術語「特異結合於」和「與之特異免疫反應」指在蛋白異源群體和其他生物製劑存在下，決定於存在的目標分析物的結合反應。因此，在指定的測定條件下，特異結合部分優先地與特別的目標分析物結合，而並非大量地結合存在於測試樣品中的其他成分。在那種條件下與目標分析物進行特異結合就需要有對特異目標分析物具有特異性的結合部分。各種免疫測定模式可以用於選擇與特異抗原特異免疫反應的抗體。例如，固相ELASA免疫測定被常規的用於選擇與被分析物特異免疫反應的單克隆抗體。參見Harlow和Lane，AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Springs Harbor Publications New York，(1988)描述了能夠用於確定特異免疫反應的免疫測定模式和條件。典型的特異或選擇性反應將至少具有兩倍的信噪比，更典型的是具有超過10-100倍的信噪比。
「蛋白」指胺基酸或胺基酸類似物組成的生物高分子聚合物，一些典型的或所有20種常見L-胺基酸在生物蛋白中被發現。儘管「蛋白」通常是指相對較大的多肽，如包括100或更多的胺基酸，而「肽」是指相對較小的多肽，此處這些術語可以彼此交換使用。這就是說，術語蛋白可以指較大的多肽以及較小的肽，反之亦然。
蛋白的「免疫反應片段」是指與結合伴侶(partner)免疫反應的蛋白部分，如抗體，其與蛋白自身發生免疫反應。
當涉及本發明的測定方法時，「特異性」是指特異性檢測毛滴蟲感染的測定能力。
當涉及本發明的測定方法時，「可靠性」是指被檢測到的真陽性群體的百分比。例如，至少80％的可靠性是指該測定將檢測出根據例如通過培養或PCR確定的實際上受到毛滴蟲感染的受試體的至少80％為毛滴蟲感染。該術語也可以與「靈敏度」交換使用。
II.本發明的測定 藉助在毛滴蟲粘附素蛋白或其免疫反應片段與對該蛋白具有免疫特異性的抗體之間形成複合體，然後檢測該複合體的方法，毛滴蟲感染尤其是陰道毛滴蟲在人類的感染能夠被輕易地以高靈敏度檢測到，本發明正是建立在這一發現的基礎上。在一個概括的實施方式中，毛滴蟲感染可以通過機體樣品如尿液或陰道拭子樣品中的粘附素蛋白或其免疫反應片段的存在得以檢測。在該實施方式中，測定試劑是可標記的能夠與樣品中存在的粘附素蛋白形成可以檢測到的複合體的抗粘附素抗體。該測定的一個重要優點是那些粘附素蛋白被發現以可檢測到的量存在於陰道拭子樣品中，即來自於陰道管或子宮頸或子宮頸管的刮取或抹取的陰道分泌物中，或者實際上是通過本測定法檢測毛滴蟲感染的所有毛滴蟲感染婦女的陰道抹片中。類似的，粘附素蛋白被發現以可檢測的量存在於經本發明測定法測試毛滴蟲呈陽性男子和女性的尿液中。因此，該測定是高度靈敏的並且能夠很容易的藉助男子尿液樣品予以實施，同樣地，女性可以藉助尿液或陰道或宮頸塗片予以實施。
在另一個概括的實施方式中，毛滴蟲感染可以通過機體樣品抗體的存在而得以檢測，該機體樣品抗體與被標記的毛滴蟲粘附素蛋白測定試劑免疫反應。在該實施方式中，被標記的測定試劑是被標記的毛滴蟲粘附素蛋白，該粘附素蛋白能夠與存在於被感染個體中的抗粘附素抗體形成可被檢測到的複合體。
本發明的測定試驗建立在免疫結合反應的基礎上。免疫測定的一般程序的綜述，參見Basic and Clinical Immunology，7th版，D.Stitesand Terr，ed.，1991，該文獻據此引入作為參考。在一個本發明的實施方式中，該測定試驗檢測毛滴蟲免疫原的存在。在本發明的另一個實施方式中，測定試驗檢測產生了抗毛滴蟲抗體的宿主。生物樣品中毛滴蟲免疫原或宿主產生的抗毛滴蟲抗體的存在指示了毛滴蟲感染的發生。
本發明的測定是高度特異和靈敏的。如上所述，顯示出本發明對陰道毛滴蟲的特異性測定具有超過80％的靈敏度，溼塗片法測定的陰性病人的21％(28/131)被檢測為陰道毛滴蟲測試陽性(使用培養方法作為確認或分析方法)。該增加的靈敏度水平允許識別另外37％的毛滴蟲感染病人(103/75)。本發明的測定方法的整體特異性達到大約98％。
實施時，首先從受試者獲得體液樣品。如在優選實施方式中，受試者是人，適合的體液樣本是陰道拭子樣品，即刮取或者抹取女性陰道管或子宮頸或子宮頸管的陰道分泌物或者是女性的宮頸塗片，或者是女性或男性的尿液樣品。其他適合的體液，特別是當檢測抗毛滴蟲抗體時，包括血清、血液以及唾液。當受試者是獸類或家畜類動物時，可以選擇比如尿液和黏膜塗片作為其適合的體液。
可以選擇的，樣品可以由來自病人的細胞例如，或任何感染部位的細胞，包括但不限於子宮頸管，子宮，輸卵管，睪丸、肛門、咽喉、肺、皮膚、眼睛、胃消化管道或體腔。這些樣品能夠新鮮使用、或者經保存(冷凍、乾燥、冷藏，作為可供專用的)以備後用。樣品能夠以它們的天然形式(尿液)，或者經加工、提取、溶解或經過處理加以使用。樣品中的毛滴蟲可以是活體或死體，完整細胞或已破碎的，加工的或未加工的。
檢測毛滴蟲的免疫測定方法的研究進展不順利的很大原因是由於缺少穩定的，種依賴性抗原。本發明的成功在於部分地依賴於毛滴蟲粘附素蛋白的穩定性。毛滴蟲具有所展示出的驚人的抗原異源性(Alderete et al.，1985b；19862，1987a)。為了建立和維持感染，寄生蟲應具有抵擋泌尿生殖管的不利環境以及躲避免疫監控機制的能力，比如抵抗宿主的溶胞抗體和補體。寄生蟲進化了其進行表型變化的能力(alderte et al.，1986；Alderete et al.，1985)，表型變化是一個被許多寄生蟲用來逃避檢測的策略。已經觀察到在兩個不同時間從同一病人中提取的分離物展示出不同的表型(Alderete etal.，1987)。還觀察到寄生蟲進行表型變化以適應其周圍環境。比如，在體內環境中明顯的支持或選擇缺少特異表面免疫原(P270)表達的陰道毛滴蟲有機體，而在體外培養環境中，該寄生蟲回復為產生P270的相反的表型蛋白。在另一個實施例中，粘附素蛋白AP65在典型的培養環境中以低水平表達，而在宿主或類似體內環境中卻以較高水平表達。因此，在抗體外條件下培養的有機體的抗體可能對於與體內樣品含有的毛滴蟲結合併不有效。以通過典型的培養環境中生長的毛滴蟲表達水平為基礎，粘附素AP65蛋白並不能很好的適於用作診斷測定用的有力的分析物。此外，寄生蟲具有蛋白水解作用，也就是，具有分泌降解表面抗原和抗體的分泌蛋白酶的能力。作為上述防禦機制的結果，還沒有已知的在環境中穩定的免疫原用於發展抗毛滴蟲抗體。
毛滴蟲粘附素蛋白是典型的表面表達蛋白，與寄生蟲對排列於宿主動物泌尿生殖管道的上皮細胞的細胞粘附相關聯(Alderete andGarza，1988，Arroyo et al.，1992；Lehker et al.，1991)。此外，粘附素是功能性活性酶。
基於其是代謝酶並且在通常的培養環境中不表達的事實，粘附素蛋白並不是現有技術中被人們用來作為診斷使用的明顯的候選者。代謝酶在所有有機體中起著重要的作用，因而與普遍存在的宿主蛋白(例如其他代謝酶)具有高度的同源性。與通常發現的蛋白具有同源性的抗原一般並不適用於抗體產生以及在診斷測試中使用。它們通常是非免疫反應的，或者具有非常低的誘導強免疫反應的可能性。因此，那些抗原不太可能誘導有效地用於檢測的感染反應抗體，也不太可能產生用於抗原自身檢測的適宜的多克隆和單克隆抗體。也有報導稱粘附素看起來是免疫隱性的，這由在實驗動物中產生高滴度抗血清和單克隆抗體(mAbs)的困難性所證實(Alderete and Garza，1988；Arroyo etal.，1992，1993；Lehker et al.，1991)。此外，由於與來自宿主和其他共同病原體相似蛋白的反應，針對那些抗原的抗體有可能是低特異性的。事實上，粘附素與宿主蛋白的相似性(擬態)可以作為解釋病原體逃避防禦機制和免疫攻擊的原因。發明者確定某些粘附素蛋白在動物宿主中高度表達並且在特異體內環境像培養環境一樣具有免疫反應性；該粘附素也能夠以允許引起抗體產生的數量來表達。因此，該粘附素蛋白的選擇在抗原選擇方面代表了一種新的以免疫學為基礎的診斷測定策略。
關於人類寄生蟲陰道毛滴蟲的粘附素蛋白及其編碼序列在U.S.Patent No5922563中披露，該內容被引入作為參考。四個粘附素蛋白家族(AP65、AP51、AP33、AP23)被鑑別為特異性介導附著陰道上皮細胞的受體的粘附素。四個陰道毛滴蟲粘附素家族在其相對分子量(Mr)基礎上被分成組，AP65(65-KDa)，AP51(51-KDa)，AP33(33-KDa)和AP23(23-KDa)。至少有三個粘附素家族包括具有與眾不同的核酸參照的成員，該核酸參照可能是緊密相關的。因此，每個各自的粘附素是多基因家族的一個成員，如這裡所用到的，術語AP65、AP51、AP33、AP23將指明所有相關的Mr陰道毛滴蟲粘附素蛋白家族成員。此外，粘附素存在於以多拷貝形式存在於陰道毛滴蟲基因組中。
在本發明的一個具體實施方式
中，AP65粘附素蛋白家族被選作診斷測定的免疫原。儘管優選AP65，其它穩定的，粘附素蛋白也可以被選作免疫原用於診斷測定。編碼AP65的基因大約1.8Kb長。AP65粘附素蛋白家族包括六個已知成員，其中三個(AP65-1、AP65-2、AP65-3)在比如Alderete US.Patent No 5922563中詳細描述，該專利作為參考被引入。每一個成員由不同的AP65基因編碼。AP65-1、AP65-2的N末端序列非常相似，12個中有9個胺基酸是相同的。AP65-1、AP65-2、AP65-3的親水圖(Kyte and Doolittle)非常相似，只有很少的不同。AP65粘附素蛋白是只有陰道毛滴蟲才有的。以cDNA插入作為陰道毛滴蟲，T.suis(豬毛滴蟲)和Tt.foetus(牛毛滴蟲)的探針，通過雜交與同時進行的配體測定顯示由陰道毛滴蟲粘附素產生的血清不表現出與其他種類的雜交反應。
測定模式 本發明可以是直接的或競爭性的，在競爭性結合測定中，目標分析物例如陰道毛滴蟲粘附素蛋白與標記的分析物類似物競爭優選的固相化結合試劑中的特異結合位點，其中固相化結合試劑，例如，特異性結合粘附素蛋白的抗體被結合在適宜的固體表面，例如硝化纖維、尼龍、PVC或聚苯乙烯表面。結合於捕捉試劑的標記分析物的濃度同樣品中存在的游離分析物的量成反比關係，能夠以液體或結合形式進行定性分析或通過如對溶液中標記粘附素蛋白進行分光光度測定而進行定量檢測。
典型的直接測定法是夾心測定法，其中，目標分析物如陰道毛滴蟲粘附素蛋白既與標記結合試劑如標記抗體結合，又與固定捕捉抗體結合，從而形成一個能夠被檢測到的固定標記夾心複合體。測定的準確模式通常取決於所希望測定的靈敏度或特異性。在一些測定中，尤其是對於那些採用不穩定試劑的測定來說，可以增加對照試劑來確定標記或者捕捉試劑的有效性。
在另外一個直接結合測定模式中，特別是用於宮頸塗片的分析，來自女性受體的宮頸塗片被處理以去除幹擾物質，然後放置於固體上，塗片成分如陰道毛滴蟲粘附素蛋白通過如與處理過的玻璃固體表面結合的方式被固定下來。一種被標記的結合試劑例如螢光標記的抗粘附素抗體被應用到載玻片上，該試劑允許與免疫特異目標結合，接下來通過清洗移走未結合的抗體。於是塗片樣品中被分析物的存在或缺失可以通過玻片的螢光顯微檢測加以確定。例如，US.Patent Nos.6174742和5741662描述了收集和處理陰道拭子樣品材料以及檢測染色材料的方法。一個適宜的宮頸塗片測試模式是由Cytyc(參見http://www.cytyc.com)支持的Thin-Prep

宮頸測試。
一個優選的直接測定模式的具體實施方式
，乾燥條測定試劑盒將在第III部分詳細說明。在這一測定模式中，考慮到毛細作用，測試條是多孔的或含纖維的，包括從上遊到下遊方向的樣品應用帶、反應帶和檢測帶。樣品應用帶可以是條帶上的簡單區域，在該處加入樣品。反應帶包含具有結合樣品分析物例如粘附素蛋白的非固相化被標記試劑，從而形成標記的可移動複合體，也就是具有在測試條上移動能力的複合體，典型的是具有在毛細作用下沿下遊方向朝檢測帶方向流動能力的複合體。被分析物是粘附素蛋白，則標記試劑是典型的被標記抗粘附素抗體，具體如下面所述。分析物是抗毛滴蟲抗體，則標記試劑是標記粘附素蛋白。典型的，試劑以溶液形式被加到條帶上，使其乾燥，以便在變溼時，即將樣品加到乾燥條時，乾燥的試劑能夠進入液相併且經過條介質移動。下面給出詳細描述，包括實施例3。
檢測帶包含固相化的捕捉試劑，該試劑具有與可移動的複合體的分析物部分結合的能力，從而將標記的複合體固定在乾燥條上，而被標記但不是複合體的試劑和移動的樣品液體介質一起通過條帶。固定結合試劑可以與條帶基質共價結合或通過非共價連接緊密結合，例如靜電力或分散力。無論如何，當樣品液體流經檢測帶時，固定過程都應該足以保證結合試劑捕捉和固定標記複合體。分析物是粘附素蛋白，則優選的固定結合試劑是具有特異性結合粘附素表位能力的抗粘附素抗體，該表位在複合體形式分析物中是可以接近到的。也就是說，被標記的抗體和被固定捕捉抗體優先地識別粘附素蛋白中分離的和不同的表位。分析物是人類抗毛滴蟲抗體，優選的結合試劑是具有一般人體抗體免疫反應活性的非人源抗人抗體。
條帶可進一步包括第二捕捉帶，非複合的被標記試劑可以在此被捕捉，作為一個對照用以確定被標記試劑正在從反應帶釋放並沿條帶移動，並且被標記試劑正在被固定的捕捉試劑所捕捉。被標記試劑是被標記的抗粘附素抗體，則優選的對照捕捉試劑是與被標記的抗體起免疫反應的抗體。因此，例如，如果被標記的抗體是小鼠單克隆抗體，該對照捕捉試劑可以是兔抗小鼠抗體。
正如上面所見到的，通過使用被標記的試劑和捕捉試劑不同的組合，本發明的測定適用於毛滴蟲的免疫原或宿主產生的抗毛滴蟲抗體的檢測。其在動物的生物樣品中的存在表明了受到毛滴蟲感染。例如，針對毛滴蟲免疫原如陰道毛滴蟲的AP65粘附素蛋白的測定，被標記的結合部分和捕捉試劑是針對陰道毛滴蟲AP65產生的抗體，並且對被標記試劑不變區域(非表位)特異的抗體或抗原被用作對照試劑。針對於產生抗體如抗AP65抗體的宿主檢測的測定，被標記和捕捉試劑的結合部分是AP65粘附素蛋白。該粘附素蛋白可以是天然的、嵌合的、片段或AP65粘附素蛋白的重組形式。
類似的，本發明的測定是可以調整、改變的，可以通過使用針對不同毛滴蟲變體的標記和捕捉試劑而檢測不同的毛滴蟲變體。例如，當使用針對被dsRNA病毒感染的陰道毛滴蟲抗體時，該測定可以區分病毒感染的陰道毛滴蟲和非病毒感染的陰道毛滴蟲分離物。在另一個實施例中，診斷分析可以使用抗體以檢測分析物的存在或缺乏，該分析物賦予或者指示對毛滴蟲的藥物抗性或藥物敏感性。這樣的測定可以指導作出關於適合某一具體感染的特效劑量或藥物類型的決定。
有很多標記可以用於與結合部分(抗體或抗原)結合以形成被標記的試劑。標記的選擇取決於所需要的敏感性，與結合部分結合容易、穩定的要求，可得的使用儀器以及可用於支配的設備裝置。本發明的標記可以是可溶性的或粒子狀的，金屬性的，有機或無機的，也包括光譜標記比如綠色螢光蛋白，螢光染料(比如，螢光素及其衍生物，若丹明和及其衍生物，生物素，抗生物素蛋白和抗生物素蛋白鏈黴素)，化學發光化合物(例如蟲螢光素和發光氨)；和酶(例如辣根過氧(化)物酶，鹼性磷酸酶等)；光譜比色標記比如膠體金或碳粒子，或著色玻璃或塑膠(比如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠。
根據現有技術已知的方法，標記能夠直接或間接偶聯到結合部分的成分中，比如US.patent Nos 4863875和4373932中所描述的相關內容被引入作為參考。非放射性標記通常以間接方式得以附著上。一般地，配體分子(比如，生物素)以共價形式結合於結合部位。配體另外結合到抗配體(例如抗生物素蛋白鏈菌素)分子上，該抗配體分子可以被天然的檢測到或者以共價形式結合到信號系統比如可檢測酶，螢光化合物或化學發光化合物上。標記可以通過化學接頭附加到結合部位。典型的接頭區是多肽序列，比如，大約5到200個胺基酸之間的多聚甘氨酸序列。優選的接頭常常是柔性胺基酸亞序列。那些柔性接頭是本領域技術人員已知的。例如，多聚(乙二醇)是商業上可以得到的(Shearwater Polymers，Inc.Huntsville，Ala)。檢測部分可以通過與酶或螢光團結合而直接連接到產生信號的化合物上。
標記的存在可以通過視覺觀察或監測特定探針或探針結合物的檢測器而得以檢測到。典型的檢測器包括分光光度計，光電器、光電二極體，顯微鏡，閃爍計數器，照相機，膠片等等及其結合。適宜的檢測器實例可以廣泛地從本領域技術人員已知的各種商業渠道獲得。
為了本發明的目的，優選的標記是非放射性標記和不需使用複雜的儀器就能夠輕易檢測得到的標記。優選的是，該標記能在視覺觀察的基礎上或通過螢光檢測產生可以立即識別的可見信號。優選的標記包括那些可以被觀察到的1)化學發光(使用辣根過氧化物酶和/或帶有以產生光子作為分解產物的底物的鹼性磷酸酶)；2)顏色改變(伴隨免疫反應過程產生帶色沉澱物的膠體金)，和3)螢光(比如，使用螢光素和其他螢光標籤)。在本發明的一個優選實施方式中，膠體金被用作標記，並且該標記可直接與結合部分結合(抗體或抗原)。當膠體金被用作標記時，被標記的試劑分析物複合體與捕捉試劑反應導致出現紅色沉澱物。如本領域的技術人員所理解的那樣，在複合體與固定在捕捉帶上的捕捉試劑反應的基礎上顯現出的顏色將取決於所使用的標記。
在本發明的一個優選測定模式中，捕捉和對照捕捉試劑被固定在固相底物上。現有技術中已知有各種固相支持物適合於本發明的使用。例如，固相支持物可以是珠子、膜(比如，硝酸纖維素膜)，微量滴定孔(例如，PVC或聚苯乙烯)，帶、塑膠、條或任何抗體可以在其上固定或沉澱的固體表面。此外，多種有機或無機聚合體，天然的或合成的也可以用作固體表面材料使用。例證性的聚合體包括聚乙烯、聚丙烯，聚(4丁烯甲酯)，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯、聚(乙烯對苯二酸酯)，人造纖維，尼龍，聚(乙烯丁酸鹽)，聚偏二乙烯二氟化物(PVDF)，矽樹脂，聚甲醛、纖維素，醋酸纖維素，硝酸纖維素等等。其他可以使用的材料包括紙，玻璃，陶器，金屬，非金屬，半導體材料，接合劑等。此外，形成凝膠的基質比如蛋白質(例如明膠)，脂多糖，矽酸鹽，瓊脂糖和聚丙烯醯胺能夠被使用。形成幾種水相的聚合物比如右旋糖酐和聚烷二醇或表面活性劑，比如磷脂或長鏈(12-24碳原子)烷基銨鹽等等也適於使用。
將各種化合物和各種表面進行連接的方式是已知的，並且在文獻中有詳細描述。參見，例如，Immobilized Enzymes，IchiroChibate，Halsted Press，New York，1978，以及Cuatrecasas，1970.其中的披露被引入本發明作為參考。捕捉和對照試劑可以共價連接或通過非特異性連接而非共價附著。如果希望在組合物和表面之間的連接為共價連接，則表面通常是多功能或能夠被多功能化的。可以存在於該表面並且用於連接的功能基團包括羧基酸，乙醛，氨基，氰基，烯基，羥基，巰基等等。除了共價連接，各種非共價連接測定成分的方法也可以使用。典型的非共價連接是組合物對表面的非特異性吸附。有代表性的是，該表面被用第二種組合物封閉以防止非特異性結合被標記的測定成分。
在本發明的一個優選實施方式中，如實施例3所描述的，捕捉和對照試劑被非特異性吸附在硝酸纖維素膜上並由封閉緩衝液(0.5％BSA；PBS中4％蔗糖)封閉。
在一個優選的實施方式中，該試驗檢測了毛滴蟲特異免疫原，例如陰道毛滴蟲的AP65粘附素蛋白。標記和捕捉試劑的結合部分是針對或基本上直接針對免疫原表位的抗體。該試驗進一步包括了能夠內對照和外對照的對照試劑。內對照由抗-抗體組成，所述抗-抗體來自與產生捕捉或標記試劑的抗體的種不同的種，也就是，如果標記試劑和捕捉試劑獲自兔子，那麼沉澱於對照區域的抗體可以是山羊抗小鼠IgG，綿羊抗小鼠IgG，豬抗小鼠IgG等等。那些抗體的產生在下面進行討論。外對照由來自毛滴蟲的細胞純化物或粗提物的抗原，或者是被標記試劑和捕捉試劑將與之結合的重組蛋白組成。
抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，優選的是單克隆抗體。單鏈抗體和抗體片段作為結合部分也是有用的。因此，用於此處的術語「抗體」包括由整個抗體修飾產生的或使用重組DNA方法學重新合成的單鏈抗體和抗體片段。
用於本發明測定的抗體可以通過常規的抗體培育技術獲得。例如，參見Harlow and lane，eds Antibodies；A LaboratoryManual，Coldspring Habor Laboratory，Coldspring，N.Y.用於製備抗體的適宜的接種體包括但不限於天然蛋白，重組蛋白，寄生蟲的未加工膜製備物或未加工製備物。適宜的抗體應該在水和離子和非離子洗滌緩衝液條件下是免疫反應性的。
多克隆抗體可以如Harbor and lngild，Scand.J.Immun.2(Suppl，1)，p.161-164，(1973)所描述的進行製備。更具體的說，多克隆抗體能夠通過接種任何宿主動物，包括但不限於兔子、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等等，並在適宜的佐劑中，比如弗氏不完全或完全佐劑，結合上面描述的接種體而獲得。接種可以在適當的時間間隔伴隨著一次或多次輔佐劑注射(例如一或兩周至一個月的間隔)。動物被有規律的放血，例如一周一次，並且將抗體與血清分離。
優選的，單克隆抗體通過使用雜交瘤細胞系製備(例如Kohler andMilstein，Nature 256，1975，p.495 or U.S.Patent No4707442 toAlderete所描述的)。一些骨髓瘤細胞系可以用於製備融合細胞雜種，包括P3/X63-Ag8，P3/NSI/1-Ag4-1，Sp2/10-Ag14和S194/5.XXO.BUT.1。在一個典型的融合程序中，來自被免疫動物的抗選擇抗原的脾淋巴細胞被與骨髓瘤細胞融合。得到的雜交瘤細胞然後在一系列分離培養試管中或微滴定平板孔中被分散，對產生所需要的抗體的培養物進行篩選。陽性培養物被進一步稀釋以獲得產生自單個細胞(克隆)的克隆。克隆再被篩選以產生所需的抗體。用於製備單克隆抗體的雜交瘤細胞可以生長在體外或動物體腔中。單克隆抗體可以分離或純化自培養的雜交瘤細胞的上清液或使用比如離心過濾、沉澱、層析或與其結合的常規程序從腹水中獲得。
在本發明的一個優選實施方式中，結合抗體由陰道毛滴蟲的AP65粘附素蛋白產生並且通過DM116和C55細胞系製備。這些以及其他抗粘附素Mab被保存於University of Texas Health Science Center，SanAntonio，TX.的雜交瘤保存庫。使用上面引述過的文獻所披露的兩種方法中的任一種，那些抗體可以以很大的可能性和預見性而得到製備，所引述文獻被引入這裡作為參考。
在第一個概括的方法中，動物，比如小鼠被用來自陰道毛滴蟲的完整細胞或膜蛋白進行注射(參見，例如Alderete，1986)。來自小鼠的抗體產生細胞被永生化，永生化細胞產生的Mabs被用於與比如培養物中的陰道毛滴蟲反應的篩選。Mabs然後被進一步用於抗一種或多種粘附素蛋白的篩選。要識別與同一種粘附素蛋白的不同表位反應的兩種Mabs，該蛋白要能夠分為比如有10-25個胺基酸殘基的分離的重疊片段，這些片段進一步被用於免疫反應性的篩選以挑出兩種或多種與不同個體粘附素片段具有免疫反應性的上述被識別的兩種或多種Mabs。可以選擇的是，標準競爭性結合研究能夠被用於檢測與同一粘附素的不同表位結合的Mabs對。
在另一個概括的方法中，粘附素蛋白或蛋白片段，通過例如上面引述的U.S Patent No5922563所披露的陰道毛滴蟲粘附素編碼序列重組表達而製備。分離的粘附素蛋白或蛋白片段然後被直接用作免疫原，例如在小鼠中，用於產生雜交瘤細胞系。細胞系產生的Mabs然後被用於抗粘附素蛋白免疫反應的抗體的篩選。使用上面所披露的方法之一鑑別一種或多種與該粘附素蛋白不同表位發生免疫反應的Mabs。
使用各種不同的方法在多種場合製備粘附素抗體。例如，分泌抗AP65抗體的雜交瘤細胞系通過對小鼠接種完整毛滴蟲有機體，毛滴蟲膜製備物、純化的天然AP65，重組AP65和甲醛化和pgluteraldehyde固相化的完整毛滴蟲有機體，以及佐劑包括弗氏佐劑，丙烯醯胺(在使用膠純化蛋白的情況下)以及融合至AP65的嵌合蛋白的非AP65部分而產生。產生免疫反應抗體的細胞系代表性產量是產生自雜交瘤融合體的總細胞系的5-10％，該比率與產生其他非粘附素抗體細胞系的代表性比率相一致。
標記和捕捉試劑的結合部分是毛滴蟲粘附素蛋白，例如陰道毛滴蟲粘附素蛋白，如陰道毛滴蟲AP65，AP51，AP33，AP23粘附素蛋白以及其免疫原性反應片段，尤其是AP65粘附素蛋白以及其免疫原性反應片段。為在本發明的測定中使用，毛滴蟲粘附素蛋白可以是天然的，化學合成的或重組產生的整個分子或片段。在一個實施方式中，粘附素蛋白通過重組方式製備。製備至少包括一個免疫反應表位的重組免疫原的方法是本領域技術人員已知的；U.S.Patent.No5876985和No5922563中披露的內容被引入作為參考。簡要的說，重組免疫原能夠通過使用包含抗原編碼基因的表達載體而製備。該編碼基因可以通過用由目的抗原的粗製備物產生的多克隆抗體來篩選目標毛滴蟲的cDNA表達文庫來獲得。來自那些表達目的抗原的表達質粒的cDNA插入片段然後被亞克隆和測序。編碼不同免疫原家族成員或一些非相關免疫原的抗原編碼插入片段被集中然後克隆到表達載體並被用於轉化大腸桿菌或者其他適宜的宿主細胞。各種陰道毛滴蟲粘附素蛋白的典型的編碼序列在上面引述的美國專利中給出。在本發明的一個實施方式中，免疫原是陰道毛滴蟲粘附素蛋白家族AP65，重組抗原從六個幾乎同樣的具有保守表位的AP65粘附素基因表達盒中表達。獲得的重組抗原是高度保守的並且對抗體的產生是穩定的。但是，可以理解的是，不同基因或基因片段可以包含在產生重組抗原混合物的表達盒中，適宜的基因和基因片段的選擇在本領域技術人員掌握的知識範圍內。
為選擇具有所希望的親本或天然粘附素蛋白的免疫反應性的免疫片段，可以通過例如蛋白水解消化而對蛋白進行片段化並檢測結合到針對天然蛋白的抗體的片段。有限的結合片段的N末端或C末端胺基酸分析能夠用於鑑別感興趣的結合片段。可以選擇的是，在重組表達裝置中，粘附素編碼序列能夠通過常規的方式片斷化以形成能夠具有編碼在25-300胺基酸長度之間的粘附素片段能力的片段。通過針對被標記的抗粘附素抗體的選擇，如此編碼的片段能夠在標準表達系統，例如gt10或gt11表達系統中用於常規分析。
III.乾燥條測定試劑盒 本發明的試劑盒，上面被稱作乾燥條水平流動測定試劑盒，提供了一種對生物樣品中存在的毛滴蟲分析物(粘附素蛋白或抗毛滴蟲抗體)進行檢測的一步水平流動測定法。如上面所述，該試劑盒通常包括由材料組成的基質，所述材料允許樣品溶液在毛細作用下沿流動路徑進行的流動，該基質界定出一條樣品應用帶，一條反應帶，一條檢測帶和可選擇的一條對照捕捉帶。
典型的測定裝置的基質是具有非吸水水平流動能力的多孔滲水材料。「非吸水水平流動」意味著所有液體中的溶解或分散的成分以基本上相同的速率被運輸，並且以相對並未受到削弱的流程水平流經膜，與優先滯留一種或多種成分成對比，比如，與發生在具有吸附或吸收一種或多種成分能力的材料中的情形成對比。
典型的非吸水材料是玻璃纖維濾紙。其它的非吸水膜比如聚碸多微孔膜，硝酸纖維素，醋酸纖維素膜，聚氯乙烯，多乙酸乙烯酯，乙酸乙烯和氯乙烯的共聚物，聚醯胺，聚碳酸酯，尼龍，晴綸，聚酯，聚苯乙烯等等，或它們的混合物也可以使用。具有所希望材料特性和流動速率的基質材料的選擇通常在本領域技術人員掌握的知識範圍內。
基質的規格大小和形狀並不是關鍵的並且可以變化多樣。通常，基質是矩形的並且流動路徑沿軸向進行。多孔滲水的基質通常由水密封支持物支持。該基質也可以被包含在或部分包含在典型的是由塑料或類似水抗性材料製成的室或容器中。
吸附帶通常被包含在本發明的裝置中。吸附帶位於捕捉帶的下遊。為了保持吸附作用下的流動沿著所希望的路徑進行，吸附帶作為從裝置的基質中移走多餘的樣品和未結合標記的手段。通常的，吸附帶包括吸附材料，比如濾紙，玻璃纖維過濾器等等。
流體樣品，典型的是被提取的子宮頸內或陰道內塗片，尿液或唾液，被加入到基質的樣品接收帶上。當製備的樣品流經檢測帶時，如果分析物存在於樣品中，則被標記的試劑結合目標分析物形成被標記試劑分析物複合體。當樣品流入捕捉帶，被標記的目標分析物將通過被固定的免疫球蛋白固定保留在捕捉帶。當樣品流入對照帶，攜帶樣品流體的被運載的多餘的被標記試劑將通過被對照試劑結合將非複合體標記保留在對照帶。
可視的標記積累可以通過視覺或通過光學檢測儀器確定。捕捉帶上標記的保留指示樣品中目標分析物的存在。對照帶中的標記保留指示足夠的液體流過標記的捕捉帶並且被標記試劑沒有由於保存、緩衝液成分以及樣品成分等變性或降解，以及指示該測定是有效的。
此外，積累的標記的可視強度與病人樣品中的分析物濃度和滴度(稀釋)相關。積累的標記可視強度與分析物濃度之間的相關性可以通過比較可視強度相對於標準參考值獲得。因此，分析物水平可以由本發明的裝置所決定。
附圖1和2顯示測試條10，作為本發明裝置的具體實施方式
對完成本發明的測定方法是非常有用的。測試條10包括由固相支持物13支持的伸長的多孔滲水的基質12，並具有上遊和下遊末端14，15。多孔滲水的材料墊16被安置在基質12的上遊部分。該墊包括樣品裝載或樣品接收帶或區域17，將包含粘附素多肽的樣品通過該區域置於乾燥條上，還包括樣品裝載帶下遊的包含移動的報告-標記的抗粘附素抗體的反應區或帶20。
如附圖2所示，墊16附著於基質12的上表面，並通過液體流動的毛細作用與之相通。因此，加到樣品應用墊上的樣品液體流入墊16，經過墊16進入反應區域。此時，樣品液體引起移動的抗體向溶液中釋放，並在其中與樣品粘附素反應，形成粘附素複合體，該複合體可以通過墊與鄰近基質的毛細作用，從墊轉移到基質12。
基質12依次包括安有捕捉試劑條的檢測帶22和安有對照試劑條的對照帶24。在這一具體的實施方式中，該捕捉試劑和對照試劑被置於橫穿基質12寬度的條帶上。但是，可以理解的是，捕捉和對照試劑可以被安排在任一適合的模式中。
在它的下遊末端覆蓋基質12的是一個吸收墊28。鋪在該吸收墊28上的帶提供了一個引人注目的用於測試條的表面或柄。墊28的目的是用作吸收池，繼續吸引樣品液體從應用帶通過檢測和對照帶。
基質12由玻璃纖維濾紙構成，該濾紙允許在樣品接收帶17接收的樣品在毛細作用下沿測試條10的縱軸流動。其他多孔滲水的材料，比如上面描述的非吸水基質材料可以被使用。固相支持物13由硝酸纖維素膜形成。其他適宜的材料，比如紙，尼龍膜，玻璃、塑料、金屬等等也可以使用。
在一個特別的實施方式中，測試條10被設計用於檢測陰道毛滴蟲粘附素蛋白AP65(分析物)，檢測帶有膠體金偶聯兔抗-AP65的IgG條和捕捉帶有抗-AP65的IgG條。製備測試條10的典型的程序在實施例1至6中描述。
測試條10可以被安放在小室內從而使處理該測試條更便利。圖3和圖4詳細說明測試條盒子50，它包括了在室52內裝入的測試條10。室52的設計更便於操作者控制該測定的進行。室52包括各自的頂部部分54和底部部分56。底部部分56包括用於接收測試條10的槽58。頂部部分56包括兩個窗60和62。窗60適合於接收液體樣品。窗62用於觀察測定結果，在頂部部分54提供了一個銷子64，它在槽58上定位用於將測試條錨定在槽裡。這兩個部分用角釘保持在一起呈直線，比如在部分56的釘66被釘入相應的孔，比如在部分56的孔68。
室52可以用任何有足夠強度的防水材料製成，例如任何塑料材料，比如聚乙烯，聚苯乙烯等等。如果使用塑料材料，小室52可以通過任意常規的制模技術製備。
盒子50能夠容易地進行安裝，先將測試條10放入底部部分56的槽58而得，然後將頂部部分54置於底部部分上，窗60和樣品裝載帶17被定位，窗62和檢測(捕捉)和對照帶22，24被定位，銷子64與吸收墊28接觸。通過將釘子旋入孔，兩部分能夠被扣在一起 本發明的試劑盒可以包括如上描述的單個測定條，或多個測試條。多個測試條可以被設計用於複測試或用於測試不同毛滴蟲種，分離物或藥物抗性標記的存在，或被設計用於檢測一組另外的疾病劑比如其他STDs(例如Chlamydia)，或者其他陰道致病劑(例如Candida yeastand Gaardenerella bacteria)，或者能夠檢測多種動物毛滴蟲種的設計裝置。該試劑盒可以包括取樣工具，比如用於獲得子宮頸內樣品的消毒棉籤以及樣品過濾和濃縮裝置。該試劑盒也可以包括樣品製備溶液，比如中和樣品或提取/溶解毛滴蟲抗原至溶液中的緩衝液。其他完成本測定的有用的材料也能夠包括在該試劑盒中，包括測試試管，移液管等等。這些裝置和試劑多種多樣取決於所進行的測試的類型並且通常在本領域技術人員的知識範圍內。
在一個優選的實施方式中，該試劑盒用於檢測陰道毛滴蟲。該裝置包括包含在檢測帶內的一個針對粘附素蛋白家族AP65的膠體金偶聯抗體DM116，還包括C55抗體或其片段，它們固定在捕捉帶內能特異的結合到與DM116結合截然不同的AP65表位。在另一個優選的實施方式中，該試劑盒包括具有pH值大約為4.0-9.0的緩衝溶液。優選的，該緩衝液是樣品溶解緩衝液，在雙蒸餾水中包含大約0.5％TritonX-100；0.1％BSA。該裝置、溶液試劑、容器和取樣工具通常包含在一起並且對於免疫測定試劑盒的包裝類型是常規的，比如盒子，袋子，圓筒，收縮性薄膜包裝卡等等。可選擇的，該試劑盒可以進一步包括闡明本發明方法步驟的書面說明。任何標準緩衝水溶液，比如磷酸鹽，Tris，或包含Triton X-100，BSA和蒸餾水的緩衝液，在大約4.0-9.0之間的pH值都能夠被用於製備用於分析的生物樣品。適宜的緩衝液選擇在本領域技術人員的知識範圍內。
尿液是生物樣品，該樣品可以是天然尿液，被分餾的天然尿液或者其他被處理形式，比如過濾或濃縮或稀釋的形式。一個用於最佳的，單一步驟過濾和尿液測試樣品測試的代表性裝置包括用作檢測和對照抗體的支持媒介的過濾底物。當液體流經過濾底物時抗原或抗原/被標記抗體複合體與之接觸。流經診斷裝置的那些介質是現有技術中已知的並且其方法與本發明的方法一致。任何緩衝溶液可以用於稀釋天然尿液，大約4.0-9.0之間的pH值，Triton X-100或磷酸鹽緩衝液是優選的。天然尿液的液體部分和微粒部分可以被分別進行分析。天然尿液的兩部分可以通過任何現有技術已知的固-液分離方法，比如沉澱，離心或過濾，液體和粒子被分別收集。微粒然後可以被重懸於緩衝液比如Triton X-100緩衝液以溶解或提取感興趣的分析蛋白。懸浮液然後用於分析物存在的分析。分離的尿液的液體部分可以用於同樣的分析或分析前的預處理。預處理可以包括濃縮，稀釋或中和。
在另一個實施方式中，陰道拭子樣品是生物樣品，該包含在塗片中的生物流體首先被溶解，然後提取到緩衝溶液中。典型的提取程序在實施例4中記載。優選的緩衝液包括0.5％Triton X-100；0.1％BSA和雙蒸水的緩衝液。任何其他緩衝溶液，例如具有大約4-9之間的pH值的磷酸鹽緩衝液可以被使用。
被製備的流體樣品(尿液或陰道拭子樣品)然後被用於本發明裝置之一，例如測試條10或檢測盒50(附圖1和3)。如果一個測試條被使用，該測試條可以被用作吸取樣品流體的量液器。如果測試盒50被使用，可以使用移液管轉移流體樣品，然後樣品被置於樣品接收窗60。該被接收的流體在毛細作用下沿多孔滲水的基質向檢測帶、捕捉帶、對照帶方向流動。測試結果能夠從捕捉帶和對照帶上被捕捉的標記直接讀出。在捕捉帶和對照帶上的帶色(如果該標記是膠體金，則紅色)線指示毛滴蟲感染檢測的陽性結果。在對照帶上的帶色線僅僅指示陰性結果和測試無效。無帶色線則指示測試無效。
根據前述，將認識到本發明滿足了多種目的和特徵。該測定簡單，快速和易於依醫生的工作室或家庭裝置作調整。根據本發明的一個重要的特徵，該測定高度靈敏，能夠挑出受試者中實際上所有的感染陰道毛滴蟲的陽性個體(參見下面的實施例4和5)。用於檢測陰道毛滴蟲感染的本發明的測定方式的特徵從一組複合的標準參考樣品(CRS)中得到確定。該組樣品是表現有陰道病症的206個病人陰道樣品的集合。這些樣品通過溼塗片顯微法和本發明的設計被用於測試陰道毛滴蟲的存在。兩種測定間的差別通過培養方法獲得解釋(In-pouch-TvTMculture，BioMed，Inc.，San Jose，CA)。
可以顯示出，本發明測試裝置體現出的測定方式，鑑定出所有溼塗片法測試為陽性的病人(75)和溼塗片法鑑定出的陰性病人的21％(28/131，通過培養方法確定)是陰道毛滴蟲陽性。該測定法的靈敏度被報導在大約100％。該測定的整體特異性據報導在98％。利用該檢測原理獲得如此高靈敏度和特異性的能力在本應用報導之前的工作中是不能夠被預見的。該結果詳細記載在實施例5。
此外，該測定優勢的特徵可見於通過使用尿液作為體液樣品，允許方便的和私人的樣品收集，以及測定男性和女性的樣品。類似的，該測定方法的免疫反應試劑可被方便地應用於陰道抹片測試或來自於陰道抹片殘留流體的測試，允許該測定包含在一種或多種其它測定中，這些測定通常作為陰道抹片的一部分而進行。此外，該測定的免疫反應試劑可以方便的應用於其他快速測定模式，比如流動類型的測試，其間樣品流經膜或過濾底物。
下面的實施例描述了本發明的幾個特別的方面，以詳細說明本發明並且也提供一種方法的說明，該方法能夠用於鑑別和測試樣品中的毛滴蟲存在，幫助本領域技術人員理解和實踐本發明。這些實施例不應該被用於以任何方式限制本發明。
實施例1 單克隆抗體的提純 單克隆抗毛滴蟲抗體(Mabs)如U.S.Patent No.4707442 toAlderete所描述的進行製備。Mabs可以從培養物上清液或腹水中經提純獲得或通過蛋白A型瓊脂糖凝膠色譜提純獲得(Coding，J ImmunolMeth(1976)4217)(Pharmacia LKB)。大約2到6mL來自於適宜的雜交瘤的腹水液體與結合緩衝液一起稀釋到1∶1，結合緩衝液包含1.5M氨基乙酸、pH調整到8.9的3M Nacl。DM116Mab腹水於室溫透析過夜。用結合緩衝液以0.5mL/分鐘的速率，將透析的Mab腹水從蛋白A型瓊脂糖CL-4B親和膠層析柱上洗脫。洗脫通過確定每個樣品在280nm處的吸收值而進行監控，直至吸收值低於0.001 O.D。然後，用pH調至大約4.0的0.1M檸檬酸緩衝液將IgG從柱中洗脫，通過確定每個樣品在280nm處的吸收值對免疫球蛋白的洗脫進行監控。
實施例2 單克隆抗體膠體金偶聯物的製備 含有100mL超純水的細頸瓶被加熱到大約80-85℃。然後，伴隨著輕微攪拌，將1mL的1％AuCl(2*0.5mL)和1.75mL的1％檸檬酸鈉(2*0.5，然後0.75mL等分試樣)連續的加入到熱水中。溶液進一步被加熱到80-85℃直至顏色從淡黃色變到亮黑色到櫻桃酒色。
在玻璃試管中，200μl新鮮製備的100mM的碳酸鹽(100mM)加入到如上製備的10mL的1∶1.75膠體金溶液中。該溶液渦旋振蕩3秒鐘。然後加入300μl的DM116IgG(1m/mL)，該溶液再振蕩3秒鐘。將該試管溫浴30分鐘，在室溫下，伴隨著3秒鐘的振蕩100μl偶聯封閉溶液被加入，接著以8000rpm離心30分鐘。離心在沒有使用阻斷系統情況下達到完全停止。偶聯封閉溶液由大約25mM的磷酸鉀(pH7.4-7.6)，大約5％牛血清白蛋白和大約0.10％蔗糖組成。上清液被吸走留下剩餘的大約300μl體積。濃縮的偶聯物然後被轉移到新的容器中，並確定它的體積。濃縮的偶聯物通過加入偶聯重懸溶液而稀釋10倍。偶聯重懸溶液包括25mM磷酸鉀(pH7.4-7.6)，1％牛血清白蛋白和大約0.10％蔗糖。被加入的偶聯重懸溶液的量通過總的膠體金溶液被(10-轉移到新容器的濃縮偶聯物的體積)除而得以確定。單克隆抗體膠體金偶聯物可以保存在冰箱中，優選的在大約2-8℃條件下直至使用。
實施例3 A.製備測定乾燥條 添加固相化抗體到乾燥條 1mg/ml兔抗陰道毛滴蟲IgGs製備物在由pH值為9.6的50mM碳酸鹽-重碳酸鹽緩衝液組成的包被緩衝液中於室溫下透析過夜。IgGs然後被上樣於X-Y-Z Dispensing Platform(BIO.DOT INC)上，儀器由程序控制以1μl/cm遞送液體至硝酸纖維膜上。該膜然後在室溫至37℃下乾燥大約3小時。封閉緩衝液(0.5％BSA；PBS中4％蔗糖)然後被噴灑在膜上，然後該膜在室溫下乾燥過夜。隨後該膜保存在大約2-8℃且沒有潮氣的條件下。
B.反應帶上的膠體金偶聯物DM116抗體的應用 將玻璃纖維濾紙浸到膠體金墊預處理緩衝液中(0.5％(w/v)多醇；0.71％(w/v)磷酸氫二鈉；0.1％(v/v)；Triton X-100；0.5％BSA(w/v)；DDW；pH7.4)。該玻璃纖維濾紙在40-50℃的溫箱中乾燥大約3小時，或在空氣中乾燥過夜。膠體金偶聯物DM116抗體被應用到處理過的玻璃纖維濾紙上，接下來或者在空氣中室溫條件下乾燥過夜或者在37℃的溫箱中乾燥直至該墊乾燥。隨後該墊保存在大約2-8℃且沒有潮氣的條件下。
C.測試條裝配 A部分製備的抗體包被的硝酸纖維素膜以頂部有1mm重疊的方式放置於Whatman/Gelman濾紙(2.5cm*30.0cm)條上。B部分製備的膠體金偶聯物墊以底部有1mm被重疊的方式放置，膠體金偶聯物墊底部1mm用第二條Whatman/Gelman濾紙覆蓋。該裝配通過一層膠粘塑料帶保持適當的位置。該裝配然後被剪成大約2mm寬的小條，並保存在大約2-8℃且沒有潮氣的條件下。
實施例4 測試程序和結果 使用本發明測試條的測試程序如下 1.用消毒棉籤從病人陰道管中收集測試樣品。收集樣品後儘可能快的對棉籤進行處理。但是，由於本發明並不要求用活組織進行，樣品拭子可以以乾燥形式加以保存和傳送。在提取和測試之前，該拭子樣品也可以保存在2-8℃至24小時。另外一種選擇是，拭子樣品被提取，提取的樣品保存在2-8℃至24小時。
2.蘸取樣品溶於大約1mL樣品溶解緩衝液(0.5％TritonX-100；0.1％BSA；DDW)中。通過貼著容器側面用力旋轉棉籤對溶液進行強力混合至少10次(浸沒時)。當樣品被從溶液中充分提取時可以獲得測試結果。再次混合之前使棉籤在樣品緩衝液中浸透1分鐘。當棉籤收回時，貼著在試管一側擠壓和攪拌棉籤以儘可能多的擠出液體。然後丟棄棉籤。
3.插入實施例7製備的dipstick測試條至裝有混合樣品溶液的小瓶中。
4.10分鐘時讀結果(一些陽性結果可能更早顯示)。如果十分鐘後測試顯示陰性，在確定測試結果之前，再等十分鐘直到所有背景顏色都消失。
5.一條紅線，即使帶有不均勻的陰影，被認為是有效的結果。如果是中度或高度陽性的樣品，在測試線的後面也可以看到某些紅色。只要測試線和對照線可見，結果就有效。結果解釋如下 .兩條線-陽性。一條紅色測試線和一條紅色對照線對於檢測毛滴蟲抗原來說是陽性結果。注意紅色線可以含有任何顏色的陰影。
.一條線-陰性。一條紅色對照線但沒有紅色測試線是判定的陰性結果。
.無線條-測試無效。如果沒有紅色對照線可見或背景顏色導致不可能讀出紅色對照線，該結果無效。
本發明的測定性能特徵從一組複合的標準參考樣品(CRS)中得到確定。該組樣品是由206個顯示有陰道症狀的病人的陰道樣品中收集的。該樣品通過溼塗片顯微法和本發明的測定方法進行毛滴蟲測試。兩種方法間的差異通過培養法進行解釋(In-pouch-TvTMculture，BioMed，Inc.，San Jose，CA)參見Alonzo and Pepe(1999)。
對於在集合的標準參考樣品中的總共206個樣品來說，通過溼塗片顯微法鑑定出75個陽性和131個陰性。本發明設計鑑定出所有溼塗片顯微法的陽性樣品(75)和101個陰性樣品。並且，該裝置還鑑別出溼塗片法中剩餘陰性樣品中的呈現陰道毛滴蟲陽性的樣品。
通過培養法對131個溼塗片陰性樣品作進一步分析以解釋溼塗片法和本發明設計之間的差異。認為溼塗片法判斷為陰性而本發明測定為陽性的30個樣品中，經培養法測定28個被認為是陽性，另外2個是陰性。此外，還發現用溼塗片法和本發明測定方法都鑑定為陰性的101個樣品用培養法測定也是陰性。該結果列於下面表1。
表1 XENOSTRIP-Tv與溼塗片顯微法比較以及通過培養法分析
本發明測定性能與溼塗片顯微法比較並且通過培養分析如下 XenoStrip-TvTM靈敏度＝X(+)WM(+)+X(+)WM(-)C(+)/X(+)WM(+)+X(+)WM (-)C(+)+ X(-)WM(+)+X(-)WM(-)C(+) ＝75+28/75+28+0+0 ＝103/103 ＝100.0％(C1 100％-100％) XenoStrip-TvTM特異性＝X(-)WM(-)C(-)/X(-)WM(-)C(-)+X(+)WM(-)C(-) ＝101/101+2 ＝101/103 ＝98.1％(C1 95.4％-100％) NPV XenoStrip-TvTM＝X(-)WM(-)C(-)/X(-)WM(-)C(-)+X(-)WM(+)+X(-)WM (-)C(+) 101/101+0+0 ＝101/101 ＝1.000(C1 1.000-1.000) PPV XenoStrip-TvTM＝X(+)WM(+)+X(+)WM(-)C(+)/X(+)WM(+)+X(+)WM (-)C(+)+X(+)WM(-)C(-) ＝75+28/75+28+2 ＝103/105 ＝0.981(C1 0.955-1.000) 用於本發明測定的抗體試劑已經顯示出並不與普通的陰道菌群、其他性傳播劑(包括Gardenerella vaginalis和Candid species)、以及來自普通非感染個體的泌尿生殖器樣品進行反應。
本發明的抗體裝置檢測存在於陰道拭子樣品中的來源於10-1000個有機體的溶解抗原，其濃度低於所認為的病人排洩物的濃度。
溼塗片顯微法的分析結果與培養法以及本發明的性能相比較，培養法相對於溼塗片法以及溼塗片顯微法相對於培養法分別列表於表2和表3。
表2 溼塗片顯微法與培養法的比較
表3 培養法與溼塗片顯微法的比較
表4 XenoStrip-TvTM與培養法和溼塗片顯微法的比較
實施例5 附加測試 本發明的測定和裝置的評價在三個醫生工作室進行。每個試點的測試由具有不同教育背景的工作人員進行。每個測試點測試隨機編號的一組樣品，陰性(3)，弱陽性(3)，中度陽性(3)和高度陽性(3)。獲得的測試結果與所希望的結果具有100％的一致性。
儘管本發明的優選的實施方式已經被說明和加以描述，還應意識到在不脫離本發明範圍和精神意圖的情況下，可以進行各種變化。
權利要求
1、一種用於檢測人類受試者的尿液樣品中的毛滴蟲感染的試劑盒，其包含
(a)特異性抗毛滴蟲粘附素蛋白表位的抗體；和
(b)用於檢測包含(a)的抗體的抗原/抗體複合體的形成的抗體。
2、權利要求1的試劑盒，其中(a)的抗體對選自由下列成員構成的組的粘附素蛋白的表位具有特異性AP65粘附素蛋白，AP51粘附素蛋白，AP33粘附素蛋白，AP23粘附素蛋白及其免疫反應片段。
3、權利要求1的試劑盒，其中(a)的抗體是抗AP65抗體。
4、權利要求1的試劑盒，其中所述毛滴蟲粘附素蛋白是AP65粘附素蛋白。
5、權利要求1的試劑盒，其中
(a)該尿液樣品與特異性抗毛滴蟲粘附素蛋白表位的標記抗體相接觸，其條件是如果該受試者感染了毛滴蟲的話，抗原/抗體複合體將由此形成；和
(b)通過將(a)中形成的複合體與捕捉抗體相接觸來檢測所述抗原/抗體複合體的存在。
6、權利要求1的試劑盒，其中
(a)該尿液樣品與特異性抗毛滴蟲粘附素蛋白表位的捕捉抗體相接觸，其條件是如果該受試者感染了毛滴蟲的話，抗原/抗體複合體將由此形成；和
(b)通過將(a)中形成的複合體與標記抗體相接觸來檢測所述抗原/抗體複合體的存在。
7、權利要求5或6的試劑盒，其中所述標記抗體和捕捉抗體選自由DM116和C55構成的組。
8、權利要求1的試劑盒，其中(a)中的抗體是多克隆抗體，(b)中的抗體是單克隆抗體。
9、權利要求1的試劑盒，其中(a)中的抗體是單克隆抗體，(b)中的抗體是多克隆抗體。
10、權利要求1的試劑盒，其中(a)中的抗體是多克隆抗體，(b)中的抗體是多克隆抗體。
11、權利要求1的試劑盒，其中(a)中的抗體是單克隆抗體，(b)中的抗體是單克隆抗體。
12、權利要求5的試劑盒，其中所述捕捉抗體是對所述標記抗體具有免疫反應性的抗體。
13、權利要求5的試劑盒，其中所述捕捉抗體是特異性抗粘附素蛋白表位的抗體，並且該表位不同於所述標記抗體特異性針對的表位。
14、權利要求6的試劑盒，其中所述標記抗體是對所述捕捉抗體具有免疫反應性的抗體。
15、權利要求6的試劑盒，其中所述標記抗體是特異性抗粘附素蛋白表位的抗體，並且該表位不同於所述捕捉抗體特異性針對的表位。
16、一種用於檢測人類受試者的毛滴蟲感染的試劑盒，其包含
(a)毛滴蟲粘附素蛋白或其免疫反應片段；和
(b)用於檢測包含(a)的毛滴蟲粘附素蛋白或其免疫反應片段的抗原/抗體複合體的形成的抗體。
17、權利要求16的試劑盒，其中所述毛滴蟲粘附素蛋白或其免疫反應片段選自由下列成員構成的組AP65粘附素蛋白，AP51粘附素蛋白，AP33粘附素蛋白，AP23粘附素蛋白及其免疫反應片段。
18、權利要求16的試劑盒，其中所述毛滴蟲粘附素蛋白是AP65粘附素蛋白或其免疫反應片段。
19、權利要求16的試劑盒，其中
(a)來自所述受試者的樣品與所述毛滴蟲粘附素蛋白或其免疫反應片段相接觸，其條件是如果該受試者感染了毛滴蟲的話，抗原/抗體複合體將由此形成；和
(b)通過將(a)中形成的複合體與抗人抗體的捕捉抗體相接觸來檢測所述抗原/抗體複合體的存在。
20、權利要求16的試劑盒，其中(a)中的所述毛滴蟲粘附素蛋白或其免疫反應片段被標記。
21、權利要求16的試劑盒，其中(b)中的抗體被標記。
全文摘要
披露了一種檢測受試者陰道毛滴蟲感染的方法和試劑盒。在該方法中，從受試者中獲得體液樣本，比如陰道拭子樣品或尿液，使之與特異性針對毛滴蟲粘附素多肽的抗體接觸，如果受試者受到毛滴蟲感染，則形成抗體粘附素多肽複合體。複合體存在或不存分別證實了受試者毛滴蟲感染的存在、缺乏存在或缺乏，如果是陰道拭子樣品，可靠性至少為80％，如果是尿液樣品，可靠性至少是40％。優選的測試試劑盒使用了乾燥條、夾心測定法、模式。
文檔編號G01N33/571GK101358971SQ20081012948
公開日2009年2月4日 申請日期2003年3月27日 優先權日2002年3月30日
發明者J·P·阿爾德雷特, P·C·卡斯特拉 申請人:埃克森諾託普診斷公司