編碼植物脫氧海普賴氨酸合成酶的dna，植物真核起始因子5a，轉基因植物和控制植物衰...的製作方法

2023-07-10 04:47:26

專利名稱：編碼植物脫氧海普賴氨酸合成酶的dna，植物真核起始因子5a，轉基因植物和控制植物衰 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有衰老誘導的表達的編碼植物多肽的多核苷酸。本發明還涉及含有反義方向的所述多核苷酸的轉基因植物和控制植物程序性細胞死亡，包括衰老的方法。更具體地講，本發明涉及一種衰老誘導的植物脫氧海普賴氨酸(deoxyhypusine)合成酶基因和衰老誘導的eIF-5A基因，其表達是通過包括衰老在內的程序性細胞死亡的開始誘導的，以及將脫氧海普賴氨酸合成酶基因和eIF-5A基因單獨或組合用於控制植物的程序性細胞死亡和衰老。
現有技術衰老是植物生命的生物學發育的終結期。它預示著死亡，並且在各種水平的生物學組構上發生，包括金植株、器官、花和果實，組織和單細胞。
衰老的開始可以由不同因素，包括內部和外部因素誘導。衰老是植物或諸如果實、花和葉的植物組織的生命中複雜的、高度調控的發育階段。衰老會導致細胞膜和大分子的協調的降解，以及隨後將代謝產物轉移到植物的其他部分。
除了在正常植物發育期間所發生的程序衰老之外，細胞和組織的死亡以及所引起的代謝產物的轉移是由於外部環境因子的協調作用而引起的。引起衰老提前開始(又被稱作壞死或程序死亡)的外部因子包括環境脅迫，如溫度、乾旱、光照不足或營養不良，以及病原體侵襲。受到環境脅迫的植物組織還能產生乙烯，通常稱之為脅迫乙烯(Buchanan，Wollaston，V.，1997，實驗植物學雜誌43，181-199；Wright，M.1974，植物，152063-69)。已知乙烯能在某些植物中導致衰老。
衰老不是一個被動的過程，相反，它是一個積極調控的過程，包括特定基因的調節表達。在衰老期間，總RNA水平降低並且很多基因的表達被關閉(Bate等，1991，實驗植物學雜誌42，801-11；Hensel等，1993，植物細胞，5，553-64)。不過，由越來越多的證據表明，衰老過程取決於從頭開始的核基因的轉錄。例如，衰老是受mRNA和蛋白合成抑制劑和去核化抑制的。將來自衰老葉片和綠色葉片的mRNA用於體外翻譯實驗的分子研究發現了衰老葉片中葉片蛋白產物的改變了的形式(Thomas等，1992，植物生理學雜誌，139，403-12)。利用視差篩選和扣除雜交技術業已從多種不同的植物中鑑定了代表衰老誘導基因的許多cDNA克隆，包括單子葉和雙子葉植物，如擬南芥屬、玉米、黃瓜、蘆筍、番茄、水稻和馬鈴薯。專門在衰老期間表達的基因的鑑定是衰老的發展需要從頭轉錄的有利證據。
在衰老期間所發生的事件似乎是高度協調的，以便能夠在壞死和死亡發生之前最大限度地利用細胞成分。複雜的相互作用包括對特殊信號的感知和必須發生的一連串基因表達的誘導，以便調控該過程。編碼衰老相關蛋白的基因的表達有可能是通過共同的活化蛋白調控的，而活化蛋白是通過激素信號直接或間接活化的。對有關該過程的起始信號或隨後的協調作用的機制所知甚少。
協調的基因表達需要與轉錄和翻譯相關的因子，包括起始因子。業已在包括植物在內的各種生物中分離並鑑定了翻譯起始因子基因。真核翻譯起始因子5A(eIF-5A)是大小為17KDa的一種重要的蛋白因子，它與真核細胞蛋白合成的開始相關。其特徵是存在海普賴氨酸(hypusine)[N-(4-氨基-2-羥基丁基)賴氨酸]，它是一種修飾過的胺基酸，已知其僅存在於eIF-5A中。海普賴氨酸是在翻譯之後通過將多胺、亞精胺上的丁基氨基基團轉移到eIF-5A上面的特定賴氨酸殘基的側鏈氨基基團上並羥化而形成的。eIF-5A的活化包括將亞精胺的丁胺殘基轉移到eIF-5A的賴氨酸上，形成海普賴氨酸並活化eIF-5A。在真核生物中，脫氧海普賴氨酸合成酶(DHS)能介導海普賴氨酸在eIF-5A中的翻譯後合成。不過，在植物中尚未鑑定相應的DHS基因，已知植物eIF-5A含有海普賴氨酸。用甲硫氨醯嘌呤黴素測定業已證實了海普賴氨酸的改性是eIF-5A活化所必需的。
海普賴氨酸僅存在於eIF-5A中，並且存在於所有真核生物、某些古細菌(似乎與真核生物相關)，但不存在於真桿菌中。另外，eIF-5A的胺基酸序列是高度保守的，特別是在海普賴氨酸殘基周圍的部分，這表明eIF-5A及其活化蛋白脫氧海普賴氨酸合成酶在真核細胞生理學中執行著在根本上很重要的步驟(Joe等，JBC，27022386-22392，1995)。業已從人、苜蓿、粘菌、粗糙鏈孢黴、菸草和酵母中克隆了eIF-5A。根據它是從兔網質紅細胞裂解物的核糖體中分離的這一事實及其在促進甲硫氨酸嘌呤黴素合成方面的體外活性最初將其確定為一種普通的翻譯起始因子。不過，最新的證據表明，eIF-5A不是球蛋白合成的翻譯起始因子，而是起著促進特殊mRNA群體的特徵的亞類的翻譯的作用。例如，有來自用動物細胞和酵母所做實驗的有利的證據表明，eIF-5A的一種或多種同種型在介導與細胞增殖相關的mRNA亞類的翻譯中起著重要的作用。在酵母中有兩種同種型，並且如果兩個基因都是沉默的，該細胞就不能夠分裂(Park等，生物學信號6，115-123，1997)。類似的，使能活化eIF-5A的酵母脫氧海普賴氨酸合成酶的表達沉默，能抑制細胞分裂。實際上，業已開發了脫氧海普賴氨酸合成酶的抑制劑，它很可能在過度增殖的症狀的治療中起重要作用(Wolff等，JBC，27215865-15871，1997)。其他研究業已證實，eIF-5A的另一種同種型是HIA-1複製的Rev功能或HTLLVV複製的Rex功能所必需的(Park等，生物學信號6115-123，1997)。在菸草中至少也有兩種表達的eIF-5A基因。基因專一性檢測表明，儘管這兩種基因在所有檢查過的組織中都能表達，但每一種基因具有不同的表達形式，它有可能調控特定轉錄物的翻譯(Chamot等，核酸研究20625-669，1992)。
業已從大鼠睪丸、HeLa細胞、粗糙鏈孢黴和酵母中純化了脫氧海普賴氨酸合成酶。脫氧海普賴氨酸合成酶的胺基酸序列是高度保守的，並且來自不同物種的這種酶具有類似的物理特性和催化特性，並且表現出與異源eIF-5A前體的交叉物種反應性(Park等，生物學信號6115-123，1997)。
植物多胺與多種生理學作用相關，包括花的誘導、胚胎發生、病原體抗性、細胞生長、分化和分裂(Evans等，1989，植物生理學植物分子生物學年度綜述40，235-269；和Galston等，1990，植物生理學94，406-10)。業已證實，eIF-5A是一種中間介體，通過它多胺發生其作用(Chamot等，1992，核酸研究，20，4，665-69)。
業已鑑定了來自菸草的編碼eIF-5A的同種型的兩種基因(NeIF-5A1和NeIF-5A2)(Chamot等，1992，核酸研究，20，4，665-69)。業已證實這兩種基因非常相似。不過，它們具有不同的表達方式。其中的一個基因似乎在mRNA水平上是組成型表達的，而另一種基因的表達形式與光合作用活性的存在或缺乏相關。根據基因結構和基因組Southern作圖業已發現，在菸草中存在NeIF-5A基因的多基因家族。有可能存在一種eIF-5A同種型，它調控著衰老/壞死專一性mRNA轉錄物亞型的翻譯。
目前，還沒有能廣泛應用的用來控制由內部因子或諸如環境脅迫的外部因子所導致的程序性細胞死亡(包括衰老)開始的方法。因此，人們有興趣開發衰老調節技術，該技術適用於所有類型的植物，並且在導致衰老的一連串事件的最初階段是有效的。
發明概述本發明基於編碼番茄衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶(DHS)的完整長度cDNA克隆，以及源於擬南芥屬葉片和香石竹花瓣的完整長度衰老誘導的DHS cDNA克隆的發現和克隆。本文披露了有關核苷酸序列和相應的胺基酸序列。
本發明還部分基於源於番茄、擬南芥屬和香石竹的編碼衰老誘導的eIF-5A基因的完整長度cDNA克隆的發現和克隆。本文披露了每一種eIF-5A cDNA克隆的核苷酸序列和相應的胺基酸序列。
本發明提供了一種對植物進行遺傳學修飾以便控制衰老開始的方法，所述衰老是與年齡相關的衰老或環境脅迫誘導的衰老。將本發明的衰老誘導的DHS核苷酸序列，其片段或所述片段的組合沿反方向導入植物細胞，以便抑制內源衰老誘導的DHS基因的表達，從而降低內源衰老誘導的DHS蛋白的含量，並降低和/或抑制eIF-5A的活化，並導致介導衰老的基因的表達。
在本發明的另一方面，本發明的衰老誘導的eIF-5A核苷酸序列、其片段或所述片段的組合沿反方向導入植物細胞，以便抑制內源衰老誘導的eIF-5A基因的表達，從而降低內源衰老誘導的eIF-5A蛋白的含量，並降低和/或抑制導致能介導衰老的基因的表達。另外，可以同時使用DHS和eIF-5A序列，以便降低內源DHS和eIF-5A蛋白的含量。
在另一方面，本發明涉及一種對植物進行遺傳學修飾以便控制衰老開始的方法，所述衰老是與年齡相關的衰老或環境脅迫誘導的衰老，該方法是這樣實現的將組合的本發明的衰老誘導的eIF-5A核苷酸序列和本發明的衰老誘導的DHS核苷酸序列沿反方向導入植物細胞，以便抑制內源衰老誘導的eIF-5A基因和衰老誘導的DHS基因的表達，從而降低內源衰老誘導的DHS蛋白的含量，並降低和/或抑制eIF-5A的活化，並導致能介導衰老的基因的表達。
利用本發明方法生產了轉基因植物，並監測其生長、發育，以及自然的或提前誘導的衰老。選擇由於衰老誘導的DHS、衰老誘導的eIF-5A或這兩者的含量降低而表現出較長的壽命或貨架壽命(例如，花的延長的壽命，果實或蔬菜腐爛的減少，增加了的生物物質，提高了的種子產量，減弱了的種子老化和/或減弱了的葉片黃化)的植物或植物的分離部分(例如，結穗、花、蔬菜、果實、種子或葉片)作為具有改善了的特性的理想產品，所述特性包括減弱了的葉片黃化、減弱了的花瓣脫落、在運輸和儲存期間減弱了的果實和蔬菜的腐爛。繁殖上述優良植物。類似地，選擇對環境脅迫具有較高抗性，例如，受低溫(冷害)、乾旱、感染等的影響較小和/或對病原體具有較高抗性的植物作為優良產物。
在一方面，本發明涉及一種編碼衰老誘導的DHS的分離的DNA分子，其中，該DNA分子能與SEQ ID NO1雜交，或者能與SEQ ID NO1雜交的所述分離的DNA分子的功能性衍生物。在本發明這一方面的一種實施方案中，所述分離的DNA分子具有SEQ ID NO1的核苷酸序列，即與SEQ ID NO1具有100％的互補性(序列相同性)。
本發明還涉及一種編碼衰老誘導的DHS的分離的DNA分子，其中，該DNA分子能與SEQ ID NO9雜交，或者能與SEQ ID NO9雜交的所述分離的DNA分子的功能性衍生物。在本發明這一方面的一種實施方案中，所述分離的DNA分子具有SEQ ID NO9的核苷酸序列，即與SEQID NO9具有100％的互補性(序列相同性)。
本發明還涉及一種編碼衰老誘導的eIF-5A的分離的DNA分子，其中，該DNA分子能與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15雜交，或能與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15雜交的所述分離的DNA分子的功能性衍生物。在本發明這一方面的一種實施方案中，所述分離的DNA分子具有SEQ ID NO11、SEQ ID NO13或SEQ ID NO15的核苷酸序列，即與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13或SEQ ID NO15具有100％的互補性(序列相同性)。
在本發明的另一種實施方案中，提供了一種由上述DNA分子所編碼的分離的蛋白，或其功能性衍生物。一種優選的蛋白具有SEQ ID NO2的胺基酸序列，或者是它的功能性衍生物。另一種優選的蛋白具有SEQID NO10的胺基酸序列，或者是它的功能性衍生物。本發明的其他優選的蛋白具有SEQ ID NO12、SEQ ID NO14或SEQ ID NO16的胺基酸序列。
本發明還提供了一種編碼RNA分子的反義寡核苷酸或多核苷酸，它互補於上文所述DNA分子的RNA轉錄物的相應部分，其中，所述寡核苷酸或多核苷酸能與所述RNA轉錄物雜交，以便改變內源衰老誘導的DHS的表達。在本發明這一方面的另一種實施方案中，所述反義寡核苷酸或多核苷酸是能與上文所述DNA分子的RNA轉錄物的相應部分雜交的RNA分子，以便改變內源衰老誘導的eIF-5A的表達。所述反義寡核苷酸或多核苷酸可以是完整長度的，或者優選具有大約6-大約100個核苷酸。
所述反義寡核苷酸或多核苷酸可以大體上互補於編碼衰老誘導的DHS的DNA分子的一股鏈的相應部分，其中，編碼衰老誘導的DHS的DNA分子能與SEQ ID NO1、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9或其組合雜交，或者基本上互補於由編碼衰老誘導的DHS的DNA分子所編碼的RNA序列的至少一個相應部分。在本發明的一種實施方案中，所述反義寡核苷酸或多核苷酸基本上互補於核苷酸SEQ ID NO1、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9的一股鏈的相應部分或其組合雜交，或由SEQ ID NO1、SEQ ID NO5或SEQ ID NO9或其組合轉錄的RNA轉錄物。在另一種實施方案中，所述反義寡核苷酸基本上互補於編碼衰老誘導的DHS的DNA分子的一股鏈的5』非編碼部分或3』部分的相應部分，其中，所述DNA分子能與SEQ ID NO1、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9或其組合雜交。
另外，所述反義寡核苷酸或多核苷酸可以基本上互補於編碼衰老誘導的eIF-5A的DNA分子的一股鏈的相應部分，其中，編碼衰老誘導的eIF-5A的DNA分子能與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15或其任意組合雜交，或者基本上互補於由SEQ ID NO11、SEQ IDNO13或SEQ ID NO15轉錄的RNA序列的至少一個相應部分。在本發明的一種實施方案中，所述反義寡核苷酸或多核苷酸基本上互補於核苷酸SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15或其組合的一股鏈的相應部分，或者所編碼的RNA轉錄物基本上互補於由編碼衰老誘導的eIF-5A的DNA分子所編碼的RNA序列的相應部分。在另一種實施方案中，所述反義寡核苷酸基本上互補於編碼衰老誘導的eIF-5A的DNA分子的一股鏈的5』非編碼或3』非編碼區的相應部分，其中，所述DNA能與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15或其組合雜交。
本發明還涉及一種用於轉化植物細胞的載體，包括(a)一種反義寡核苷酸或多核苷酸，它基本上互補於(1)編碼衰老誘導的DHS的DNA分子的一股鏈的相應部分，其中，所述編碼衰老誘導的eIF-5A的DNA分子能與SEQ ID NO1、SEQ ID NO5或SEQ IDNO9雜交，或(2)由編碼衰老誘導的DHS的DNA分子所編碼的RNA序列的相應部分；和(b)可操作地連接於所述反義寡核苷酸或多核苷酸上的調控序列，以便所述反義寡核苷酸或多核苷酸能在用它轉化過的植物細胞中表達。
本發明還涉及用於轉化植物細胞的載體，包括(a)一種反義寡核苷酸或多核苷酸，它基本上互補於(1)編碼衰老誘導的eIF-5A的DNA分子的一股鏈的相應部分，其中，所述編碼衰老誘導的eIF-5A的DNA分子能與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13或SEQ ID NO15雜交，(2)由編碼衰老誘導的eIF-5A的DNA分子所編碼的RNA序列的相應部分；和(b)可操作地連接於所述反義寡核苷酸或多核苷酸上的調控序列，以便所述反義寡核苷酸或多核苷酸能在用它轉化過的植物細胞中表達。
所述調控序列包括能在轉化過的植物細胞中起作用的啟動子，該啟動子可以是誘導型的或組成型的，所述調控序列可選擇性地包括一個聚腺苷酸化信號。
本發明還提供了一種用上文所述載體或所述載體的組合轉化過的植物細胞、由所述細胞所產生的小植株或成熟植株，或所述小植株或植株的植物部分。
本發明還涉及一種生產與未修飾過的植物相比具有較低含量的衰老誘導的DHS、衰老誘導的eIF-5A或這兩者的方法，包括(1)用上述載體或載體的組合轉化植物；(2)讓所述植物至少生長到小植株階段；
(3)評估轉化過的植株或小植株的改變了的衰老誘導的DHS活性和/或eIF-5A活性，和/或改變了的衰老和/或改變了的環境脅迫誘導的衰老和/或改變了的病原體誘導的衰老和/或乙烯誘導的衰老；和(4)篩選並生長與未轉化過的植物相比具有改變了的衰老誘導的DHS活性和/或減少了的eIF-5A和/或改變了的衰老和/或改變了的環境脅迫誘導的衰老和/或改變了的病原體誘導的衰老和/或乙烯誘導的衰老的植株。
按上述方法的植株或後代、雜交種、克隆或植物部分優選具有降低了的衰老誘導的DHS表達，降低了的衰老誘導的eIF-5A活性，或同時具備這兩者，以及推遲了的衰老和/或推遲了的脅迫誘導的衰老和/或病原體誘導的衰老和/或乙烯誘導的衰老。
本發明還涉及一種抑制植物細胞中內源衰老誘導的DHS表達的方法，該方法包括(1)將一種載體整合到植物基因組中，該載體包括(A)一種反義寡核苷酸或多核苷酸，它基本上互補於(i)編碼內源衰老誘導的DHS的DNA分子的一股鏈的至少一部分，其中，所述編碼內源衰老誘導的DHS的DNA分子能與SEQ ID NO1、SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO9雜交，或(ii)由內源衰老誘導的DHS基因所編碼的RNA序列的至少一部分；和(B)可操作地連接於所述反義寡核苷酸或多核苷酸上的調控序列，以便表達所述反義寡核苷酸或多核苷酸；和(2)生長所述植物，以便所述反義寡核苷酸或多核苷酸被轉錄並且轉錄物結合在所述內源RNA上，從而抑制所述衰老誘導的DHS基因的表達。
本發明還涉及一種抑制植物細胞中內源衰老誘導的eIF-5A表達的方法，該方法包括(1)將一種載體整合到植物基因組中，該載體包括(A)一種反義寡核苷酸或多核苷酸，它互補於(i)編碼內源衰老誘導的eIF-5A的DNA分子的一股鏈的相應部分，其中，所述編碼內源衰老誘導的eIF-5A的DNA分子能與SEQ ID NO11、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17或其組合雜交，或(ii)由所述內源衰老誘導的eIF-5A基因所編碼的RNA序列的至少一部分；和
(B)可操作地連接於所述反義寡核苷酸或多核苷酸上的調控序列，以便表達所述反義寡核苷酸或多核苷酸；和(2)生長所述植物，以便所述反義寡核苷酸或多核苷酸被轉錄並且轉錄物結合在所述內源RNA上，從而抑制所述衰老誘導的eIF-5A基因的表達。
附圖簡述

圖1表示從番茄葉片cDNA文庫獲得的衰老誘導的番茄葉片DHScDNA序列的核苷酸序列(SEQ ID NO1)以及衍生的胺基酸序列(SEQID NO2)。
圖2A表示通過將番茄DHS序列與擬南芥屬基因庫中的未鑑定的基因組序列進行排比所獲得的擬南芥屬DHS基因的核苷酸序列(http//genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/)(SEQ ID NO5)。胺基酸序列之間的缺口是推測的內含子。圖2B表示衍生的擬南芥屬DHS胺基酸序列(SEQ ID NO6)。圖2C表示通過PCR獲得的600個鹼基對的衰老誘導的擬南芥屬DHS cDNA的核苷酸序列。圖2D表示該衰老誘導的擬南芥屬DHS cDNA衍生的胺基酸序列。
圖3是衍生的完整長度番茄葉片衰老誘導的DHS胺基酸序列(SEQID NO2)和衍生的完整長度擬南芥屬衰老誘導的DHS胺基酸序列與人、酵母、真菌和古細菌的DHS蛋白序列的排比。在三種序列或四種中相同的胺基酸用方框標出。
圖4是番茄DHS cDNA的限制圖。
圖5是從番茄葉片中分離的並且用32P-dCTP標記的完整長度番茄衰老誘導的DHS cDNA檢測的基因組DNA的Southern印跡。
圖6是從不同發育階段的番茄花中分離的RNA的Northern印跡。圖6A是總RNA的溴化乙錠染色的凝膠。每一個泳道含有10微克RNA。圖6B是用32P-dCTP標記的完整長度番茄衰老誘導的DHS cDNA檢測的Northern印跡的放射性自顯影。
圖7是從各個成熟階段的番茄果實中分離的用32P-dCTP標記的完整長度番茄衰老誘導的DHS cDNA檢測的RNA的Northern印跡，每一個泳道含有10微克RNA。
圖8是從通過用2M山梨醇處理6小時而受到乾旱脅迫的番茄葉片中分離的RNA的Northern印跡。用32P-dCTP標記的完整長度番茄衰老誘導的DHS cDNA檢測該印跡。
圖9是從受到過冷害溫度的番茄葉片中分離的RNA的Northern印跡。圖9A是總RNA的溴化乙錠染色的凝膠。每一個泳道含有10微克RNA。圖9B是用32P-dCTP標記的完整長度番茄衰老誘導的DHS cDNA檢測的Northern印跡的放射性自顯影。圖9C表示相應的滲漏數據，是作為葉片擴散物的導電性測定的。
圖10是香石竹DHS完整長度(1384bp)cDNA克隆核苷酸序列(SEQID NO9)，不包括聚腺苷酸尾巴和5』末端非編碼區。衍生的胺基酸序列在核苷酸序列下面示出(373個胺基酸)(SEQ ID NO10)。
圖11是來自衰老的擬南芥屬葉片並用32P-dCTP標記的完整長度番茄衰老誘導的DHS cDNA檢測的總RNA的Northern印跡。放射性自顯影在上面，溴化乙錠染色的凝膠在下面。
圖12是從各個時期的香石竹花瓣中分離的總RNA的Northern印跡。印跡是用32P-dCTP標記的完整長度番茄衰老誘導的DHS cDNA檢測的。放射性自顯影在上面，溴化乙錠染色的凝膠在下面。
圖13是番茄果實衰老誘導的eIF-5A基因的核苷酸序列(頂部)(SEQID NO11)和衍生的胺基酸序列(底部)(SEQ ID NO12)。
圖14是香石竹衰老誘導的eIF-5A基因的核苷酸序列(頂部)(SEQID NO13)和衍生的胺基酸序列(底部)(SEQ ID NO14)。
圖15是擬南芥屬衰老誘導的eIF-5A基因的核苷酸序列(頂部)(SEQID NO15)和衍生的胺基酸序列(底部)(SEQ ID NO16)。
圖16是從各個發育階段的擬南芥屬植物葉片中分離的總RNA的Northern印跡。用32P-dCTP標記的完整長度擬南芥屬衰老誘導的DHScDNA和完整長度衰老誘導的eIF-5A檢測該印跡。放射性自顯影在上面，溴化乙錠染色的凝膠在下面。
圖17是從處在發育的生硬(BK)、紅-硬(RF)和紅-軟(RS)階段的番茄果實中分離的總RNA的Northern印跡。用32P-dCTP標記的完整長度衰老誘導的DHS cDNA和完整長度衰老誘導的eIF-5A檢測該印跡。與果實成熟吻合，在紅-軟果實中DHS和eIF-5A同時上調。放射性自顯影在上部，溴化乙錠染色的凝膠在下部。
圖18是從用山梨醇處理過的以便誘導乾旱脅迫的番茄葉片中分離的總RNA的Northern印跡。C是對照，S是山梨醇處理。用32P-dCTP標記的完整長度衰老誘導的DHS cDNA和完整長度衰老誘導的eIF-5A檢測該印跡。隨著乾旱脅迫，eIF-5A和DHS都被上調。放射性自顯影在上部，溴化乙錠染色的凝膠在下部。
圖19是從用番茄植物的花芽和開放的衰老的花中分離的總RNA的Northern印跡。用32P-dCTP標記的完整長度衰老誘導的DHS cDNA和完整長度衰老誘導的eIF-5A檢測該印跡。在開放的/衰老的花中eIF-5A和DHS都被上調。放射性自顯影在上部，溴化乙錠染色的凝膠在下部。
圖20是從用冷害損傷的番茄葉片中分離的總RNA的Northern印跡。用32P-dCTP標記的完整長度衰老誘導的DHS cDNA和完整長度衰老誘導的eIF-5A檢測該印跡。在回溫期間隨著冷害損傷的發展eIF-5A和DHS都被上調。放射性自顯影在上部，溴化乙錠染色的凝膠在下部。
圖21是3.1周齡擬南芥屬野生型(左)和表達沿反義方向的衰老DHS基因的3』末端(如圖36所述的序列)的轉基因植物的照片，在轉基因植物上表現出葉片大小的增加。
圖22是4.6周齡擬南芥屬野生型(左)和表達沿反義方向的衰老DHS基因的3』末端(如圖36所述的序列)的轉基因植物的照片，在轉基因植物上表現出葉片大小的增加。
圖23是5.6周齡擬南芥屬野生型(左)和表達沿反義方向的衰老DHS基因的3』末端(如圖36所述的序列)的轉基因植物的照片，在轉基因植物上表現出葉片大小的增加。
圖24是6.1周齡擬南芥屬野生型(左)和表達沿反義方向的衰老DHS基因的3』末端(如圖36所述的序列)的轉基因植物的照片，在轉基因植株上表現出大小的增加。
圖25是表示能表達沿反義方向衰老誘導的DHS基因的三個轉基因擬南芥屬植物品系組織產量提高的曲線圖。種子產量以種子體積形式表示。給出了野生型植物的n＝30的SE。
圖26是能表達沿反義方向的衰老DHS基因的3』末端(圖36所示序列)的轉基因番茄植物(左)和野生型植物(右)的照片，表示轉基因植物葉片大小的增加和植株大小的增加。該照片是在將小植株移栽到土壤中18天之後拍攝的。
圖27是能表達沿反義方向的衰老DHS基因的3』末端(圖36所示序列)的轉基因番茄植物(左)和野生型植物(右)的照片，表示轉基因植物葉片大小的增加和植株大小的增加。該照片是在將小植株移栽到土壤中32天之後拍攝的。
圖28-35是來自野生型的番茄果實(頂部照片)和能表達沿反義方向的完整長度衰老DHS基因的轉基因植物的番茄果實(底部照片)的照片。果實是在發育的生硬階段收穫的，並在生長箱中熟化。收穫後的天數在每一幅照片的左上角示出。
圖36是用於沿反義方向轉化植物的擬南芥屬衰老誘導的DHS基因的3』末端的核苷酸序列(頂部)(SEQ ID NO30)和衍生的胺基酸序列(底部)。
圖37是用於沿反義方向轉化植物的番茄衰老誘導的DHS基因的3』末端的核苷酸序列(頂部)(SEQ ID NO31)和衍生的胺基酸序列(底部)。
圖38是用於分離完整長度擬南芥屬基因的600bp擬南芥屬衰老誘導的DHS探針的核苷酸序列(頂部)(SEQ ID NO26)和衍生的胺基酸序列(底部)。
圖39是用於分離完整長度香石竹基因的483bp香石竹衰老誘導的DHS探針的核苷酸序列(頂部)(SEQ ID NO27)和衍生的胺基酸序列(底部)。
發明詳述提供了用於改變植物細胞中衰老誘導的DHS基因、衰老誘導的eIF-5A基因或這兩種基因的表達的方法和組合物。植物中衰老誘導的DHS和衰老誘導的eIF-5A表達的單獨的或組合的改變會導致衰老開始的推遲，並改善對環境脅迫和病原體的抗性，因此延長了該植物的貨架壽命和/或生長期。
業已通過逆轉錄酶介導的聚合酶鏈式反應(RT-PCR)分離了具有衰老誘導的表達的編碼番茄DHS基因的完整長度cDNA序列，用從冷害損傷的番茄葉片中分離的RNA作模板，並用RT-PCR產物篩選冷害損傷的、山梨醇處理過的番茄葉片cDNA文庫。利用相當於分離的番茄葉片cDNA序列的特定部分以及完整長度番茄葉片cDNA的多核苷酸探針確定編碼DHS基因的mRNA在環境脅迫的(冷害)番茄葉片、(脫水的)山梨醇處理過的番茄葉片、成熟的番茄果實和衰老的番茄花中的存在。
將由擬南芥屬DHS基因組克隆設計的引物用於製備聚合酶鏈式反應(PCR)產物，使用衰老的擬南芥屬葉片cDNA文庫作模板。擬南芥屬核苷酸序列和胺基酸序列分別與衰老誘導的番茄DHS的相應序列具有73％的相同性和81％的相同性。
本發明的衰老誘導的番茄DHS基因是通過RT-PCR分離的。用於分離番茄DHS基因的上遊引物是24個核苷酸的引物5』AG TCT AGA AGGTGC TCG TCC TGA T3』(SEQ ID NO3)；下遊引物含有34個核苷酸5』G ACT GCA GTC GAC ATC GAT(T)153』(SEQ ID NO4)。使用100皮摩爾的下遊引物通過標準RT-PCR分離cDNA的第一股鏈。然後將這第一股鏈用作RT-PCR的模板，使用上遊和下遊引物。在瓊脂糖凝膠上分離RT-PCR產物發現了大小在1.5kb至600bp範圍內的三條不同帶的存在。使用分別存在於上遊和下遊引物上的XbaI和SalI克隆位點將這三種片段亞克隆到質粒載體pBluescriptTM(Stratagene克隆系統，LaJolla，CA)上，並進行測序。比較所述片段的序列並與GeneBank資料庫中的序列進行排比。結果證實1.5kb和1kb的片段是番茄DHS序列。600bp的片段還與人、酵母和鏈孢黴屬DHS序列排比。
將600bp的RT-PCR片段用於篩選番茄(品種Match F1雜種)cDNA文庫，該文庫是用2M山梨醇處理了6小時以便誘導脫水的番茄葉片中獲得的RNA製備的。所述cDNA文庫是用λZapTM(Stratagene克隆系統，LaJolla，CA)cDNA文庫試劑盒構建的。獲得了三種相同的相應於衰老誘導的DHS基因的陽性完整長度cDNA克隆，並進行測序。衰老誘導的DHS cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。所述cDNA克隆編碼具有381個胺基酸的多肽(SEQ ID NO2)，其分子量為42.1.
根據所述基因在發育中的和受到脅迫的番茄花、果實和葉片中的表達形式，它與衰老相關。
將番茄DHS cDNA序列擬南芥基因組文庫(http//genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/)中的未鑑定的基因組序列進行排比。該結果表示了與一種未鑑定的擬南芥屬基因組序列(AB107060)的排比。利用該排比信息鑑定擬南芥屬序列上的開放讀框，並由此產生推測的胺基酸序列。所得到的排比擬南芥屬DHS基因的核苷酸序列和胺基酸序列分別被稱為SEQ ID NO5(圖2A)和SEQ ID NO6。
製備了基於鑑定的擬南芥屬DHS序列的短區域的兩種引物引物1，5』GGTGGTGTTGAGGAAGATC3』(SEQ ID NO7)；和引物2，5』GGTGCACGCCCTGATGAAGC3』(SEQ ID NO8)。在標準PCR用擬南芥屬衰老葉片cDNA文庫作以上兩種引物的模板。分離600bp的PCR產物並測序，並證實它具有與基因組DHS序列的相應片段相同的序列。
同樣將完整長度衰老誘導的DHS cDNA克隆用於分離完整長度衰老誘導的擬南芥屬和香石竹DHS cDNA克隆。所述擬南芥屬和香石竹DHScDNA克隆是通過用完整長度番茄DHS cDNA克隆作探針分別篩選衰老擬南芥屬葉片cDNA文庫和衰老的香石竹花瓣cDNA文庫分離的。然後對從cDNA文庫獲得的cDNA克隆進行測序。以這種方式分離的擬南芥屬完整長度cDNA克隆的核苷酸序列與通過與番茄cDNA序列排比確定為編碼擬南芥屬DHS的擬南芥屬基因組序列的編碼區相同(圖2A，SEQID NO5)。完整長度香石竹花瓣篩選衰老的DHS克隆核苷酸序列和衍生的胺基酸序列在圖10中示出(分別為SEQ ID NO9和SEQ ID NO10)。
因此，本發明的源於番茄、香石竹和擬南芥屬的編碼DHS的cDNA序列能以相似的方式用作探針從其他植物中分離DHS基因，然後利用這些基因改變轉基因植物的衰老。
衰老誘導的DHS基因似乎是DHS家族的一員。利用從雜交植物中提取的基因DNA進行番茄葉片DNA的基因組Southern印跡分析。所述DNA用各種限制酶進行裂解，所述酶能識別DHS基因的編碼區內的單一位點，或者不能識別DHS基因的開放讀框內的任何位點。番茄DHS限制圖如圖4所示。
用32P-dCTP標記過的完整長度番茄DHS cDNA檢測限制酶消化過的番茄葉片基因組DNA。在高嚴格條件下進行的雜交發現了所述完整長度cDNA探針與每一種限制酶消化過的DNA樣品的2-3種限制片段的雜交。特別要指出的是，當番茄葉片基因組DNA是用XbaI和EcoRI消化的時候，這兩種酶在DHS的開放讀框內有限制位點(圖4)，在Southern印跡中可以檢測到兩種以上的限制片段(圖5)。來自雜交品種Match F1和純合品系UCT5的基因組DNA能產生相同形式的限制片段。上述結果表明，在番茄植物中存在兩種或兩種以上DHS基因的同種型。如圖3所示，DHS基因在物種之間是高度保守的，因此可以預料在任何物種內的同種型之間存在明顯的保守性。
用完整長度番茄cDNA檢測的番茄花總RNA的Northern印跡表明，在番茄花中衰老誘導的DHS基因的表達被明顯誘導，但在芽中的表達勉強可以檢測到(圖6)。
在番茄果實各個發育階段的DHS表達的Northern印跡分析證實，在生硬的和粉紅色的果實中DHS基因以低水平表達，而DHS表達在紅色(熟的)番茄果實中明顯增強(圖7)。
Northern印跡分析還證實，衰老誘導的DHS基因是通過環境脅迫條件誘導的，例如，脫水(圖8)和冷害(圖9)。與未處理過的葉片相比，用2M山梨醇進行過處理以便誘導脫水的番茄葉片表現出在脫水葉片中DHS表達的誘導(圖8)。接觸過冷害溫度並回溫到環境溫度的植物表現出與冷害損傷症狀(例如，滲漏)的發展吻合的衰老誘導的DHS基因的誘導表達(圖9)。在番茄植物和各種植物組織，例如，葉片、果實和花中基因表達的總體形式表明，本發明的DHS基因與這些植物和植物組織的衰老的開始相關。
就DHS基因表達的誘導而言，在擬南芥屬葉片衰老和香石竹花瓣衰老的開始方面觀察到了相似結果。從各種年齡的植物中分離的擬南芥屬葉片總RNA的Northern印跡分析表明，衰老誘導的DHS基因的表達在幼苗期不明顯(5周齡植物)，但在大約6周時開始出現。到第7周時，DHS基因的表達被明顯誘導。Northern印跡分析表明，擬南芥屬DHS基因隨著植物的年齡明顯增強(圖11)。
Northern印跡分析還表明，DHS基因在諸如香石竹的顯花植物中是以類似方式調控是的(圖12)。從各種年齡的香石竹花瓣中分離的總RNA的Northern印跡分析證實，香石竹DHS的表達在來自具有年齡誘導的衰老症狀的花的花瓣中被明顯誘導，如花瓣捲曲，它是衰老的最初形態學證據，但在緊湊的花芽中的表達更低一些。來自將要開放的香石竹花的花瓣中DHS的表達明顯高於在緊湊花芽階段花中的表達，而完全開放的花的花瓣也表現出DHS的增強了的表達。
因此，預計通過明顯抑制或改變衰老誘導的DHS基因在植物組織中的表達，可以推遲腐爛和變質，延長易壞果實、花卉和蔬菜的貨架壽命，並使得植物及其組織更能耐受脅迫和更抗病原體。這一目的可以通過生產轉基因植物而實現，其中，DHS cDNA或其寡核苷酸片段能以反義構型在果實、花、葉片和營養組織中表達，優選使用諸如CaMV35S啟動子的組成型啟動子，或使用組織專一性或衰老/脅迫誘導型啟動子。
在本發明中還分離並測序了另一種基因eIF-5A，它參與誘導與植物形態改變相關的衰老，與DHS一樣，可將其用於改變植物的衰老和與衰老相關的過程，優選沿反義方向導入植物。分別從成熟的番茄果實，衰老的擬南芥屬葉片和衰老的香石竹花cDNA文庫中分離完整長度衰老誘導的eIF-5A cDNA克隆。每一種完整長度克隆的核苷酸序列和推測的胺基酸序列示於圖13(番茄衰老誘導的eIF-5A)、14(香石竹衰老誘導的eIF-5A)和15(擬南芥屬衰老誘導的eIF-5A)。上述每一種cDNA的核苷酸序列還表現為SEQ ID NO11(番茄)(圖13)、SEQ ID NO13(香石竹)(圖14)和SEQ ID NO15(擬南芥屬)(圖15)。所述每一種基因的衍生的胺基酸序列分別表示為SEQ ID NO12(圖13)SEQ IDNO14(圖14)和SEQ ID NO16(圖15)。
與本文所披露的DHS基因序列一樣，本發明的eIF-5A序列可用於從其他植物中分離eIF-5A基因。所分離的eIF-5A序列可用於改變植物的衰老和與衰老相關的過程。從植物中分離eIF-5A序列可以用已知方法根據物種之間至少大約70％的序列相似性完成。
在衰老期間，在植物中會同時發生eIF-5A和DHS的誘導。Northern印跡分析表明，在自然和脅迫誘導的衰老開始時，eIF-5A與DHS被同時上調(圖16-20)。例如，從各種年齡的擬南芥屬植物的葉片中分離的總RNA的Northern印跡分析表明，從植物上出現葉片衰老開始，eIF-5A的表達就被誘導，並且表達隨著衰老的發展明顯加強。在諸如番茄的結實植物中，在紅色-軟果實中eIF-5A和DHS被同時上調，與果實變軟和腐爛一致(圖17)。
Northern印跡分析還表明，在受到諸如乾旱(圖18)和冷害損傷(圖20)的環境脅迫的植物中eIF-5A和DHS被同時上調。類似的，在顯花植物中，在開放的花中eIF-5A和DHS被同時上調，並且兩種基因的表達在隨後的階段持續增強。
在沿反方向(反義)導入受組成型啟動子控制，如玄參花葉病毒35S啟動子、花椰菜花葉病毒啟動子CaMV35S、雙35S啟動子或MAS啟動子控制的克隆的衰老誘導的DHS基因、其片段或克隆的衰老誘導的eIF-5A基因或其片段、或eIF-5A和DHS序列的組合時，可用於對植物進行遺傳學修飾，並改變修飾過的植物的衰老。來自其他植物的與番茄、擬南芥屬或香石竹衰老誘導的DHS基因或衰老誘導的eIF-5A基因具有足夠的序列相同性的特定反義序列可用於實現類似的遺傳修飾。遺傳學修飾的一個結果是，內源可翻譯衰老誘導的DHS編碼mRNA、eIF-5A編碼mRNA或這兩者的含量的降低。因此，降低了植物細胞中所產生的衰老誘導的DHS和衰老誘導的eIF-5A的量，從而降低了活化eIF-5A的量，後者又降低了衰老誘導蛋白的翻譯，包括衰老誘導的脂酶，衰老誘導的蛋白酶和衰老誘導的核酸酶。由此抑制或推遲了衰老，因為衰老的開始需要從頭開始的蛋白合成。
例如，用能沿反義方向表達完整長度擬南芥屬衰老誘導的DHS基因(SEQ ID NO26)或3』部分(圖38)，受雙35S啟動子調控的載體轉化過的擬南芥屬植物與對照植物相比表現出較高的生物量，例如，較大的葉片體積和在生長的所有階段的總體上較大的植物生長，以及推遲了的葉片衰老，如圖21-24所示。
由於在轉基因擬南芥屬植物中沿反義方向表達完整長度的擬南芥屬衰老誘導的DHS基因或其3』編碼區所引起的衰老誘導的DHS基因的減弱了的表達的結果還被視為轉化過的植物的種子產量的增加。能表達擬南芥屬衰老誘導的DHS基因的反義3』非編碼區的擬南芥屬植物品系所產生的種子比野生型種子多6倍(圖25)。
用受雙35S啟動子調控的沿反義方向的番茄衰老誘導的DHS基因(SEQ ID NO27)的3』末端轉化過的番茄植物獲得了類似結果。與對照(未轉化過的)番茄植物相比，用反義方向的該基因的3』末端轉化過的植物表現出增加了的葉片大小和增加了的植株大小(圖26和27)。
與野生型植物相比，用反義方向的完整長度番茄衰老誘導的DHS轉化的番茄植物所產生的果實表現出推遲了的變軟和腐爛(圖28-35)。因此，本發明的方法和序列可用於推遲果實變軟和腐爛，以及用於從總體上增加植物的生物量和種子產量，推遲植物衰老。本發明的分離的核苷酸序列可用於從其他植物或生物中分離基本上互補的DHS和/或eIF-5A核苷酸序列。上述序列反過來又可用於轉化植物，並因此改變轉化過的植物的衰老。與使用本文所述分離的核苷酸序列的使用方法相同。
通過用DHS、eIF-5A、其片段或其組合轉化所實現的遺傳學修飾可以實現在植物中衰老誘導的DHS、eIF-5A或這兩者的含量的永久性改變，並可以通過自交或其他繁殖方法在後代植物中繁殖。將遺傳學改變過的植物用於產生新的植物品種或品系，其中，所述改變在世代之間被穩定傳遞。本發明首次提供了合適的DNA序列，該序列可用於實現對多種不同植物的衰老進行穩定的遺傳學修飾。
一般，為了鑑定並分離基因，使用本領域所公知的常規方法進行質粒DNA的製備、限制酶消化、DNA的瓊脂糖凝膠電泳、蛋白的聚丙烯醯胺凝膠電泳、PCR、RT-PCR、Southern印跡、Northern印跡、DNA連接和細菌轉化。例如，參見Sambrook，J.等，分子克隆，實驗室手冊，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，NY，1989，Sambrook披露了核酸雜交技術(同上)。
在本文中，術語「植物」是指全植株、植物部分、植物細胞或一組植物細胞。可用於本發明方法中的植物的類型不受限制，並且可以包括，例如，乙烯敏感型和乙烯不敏感型植物；結實植物，如杏、蘋果、橙、香蕉、葡萄、梨、番茄、草莓、顎梨等；蔬菜，如胡蘿蔔、豌豆、萵苣、甘藍、蘿蔔、馬鈴薯、花莖甘藍、蘆筍等；花卉，如香石竹、玫瑰、梅等；農業作用和森林植物，如玉米、水稻、大豆、和苜蓿等；並且總體上包括能攝取並表達本發明DNA分子的任何植物。它可以包括多種倍性水平的植物，包括半倍體、二倍體、四倍體和多倍體。所述植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。
轉基因植物在本文中被定義為通過某種方式進行過遺傳學修飾的植物，包括，但不限於在其基因組中整合了異源或同源衰老誘導的DHSDNA或修飾過的DNA或異源衰老誘導的DHS DNA或同源衰老誘導的DHS DNA的某些部分植物。另外，本發明的轉基因植物可以在其基因組中整合了異源或同源衰老誘導的eIF-5A DNA或修飾過的DNA或異源衰老誘導的eIF-5A DNA或同源衰老誘導的eIF-5A DNA的某些部分。本發明的轉基因植物可以在其基因組中整合了異源或同源衰老誘導的DHS和eIF-5A DNA或修飾過的DNA或異源衰老誘導的eIF-5A DNA或同源衰老誘導的DHS DNA的某些部分或異源和同源DHS和eIF-5A序列的組合。改變了的遺傳材料可以編碼一種蛋白，包括一種調控或控制序列，或者可以是或包括一種反義序列或編碼一種反義RNA，該RNA是與該植物的內源衰老誘導的DNA或eIF-5A DNA或mRNA序列或其部分反義的。「轉基因」或「轉基因序列」被定義為業已整合到轉基因植物中的外源基因或部分序列。
本文所使用的術語「雜交」一般被用於表示在適當嚴格的條件下核酸的雜交，本領域技術人員可以根據探針序列和靶序列的性質方便地確定所述合適條件。雜交和洗滌條件為本領域所熟知，根據所需要的嚴格度而進行的條件的調整可以通過改變培養時間、溫度和/或溶液的離子強度而方便地實現。例如，參見Sambrook J.等，分子克隆，實驗室手冊，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，NY，1989。條件的選擇是由被雜交的序列長度，特別是探針序列的長度，核酸的相對G-C含量和允許的錯配量決定的。當需要在具有較低程度的互補性的鏈之間進行部分雜交時，優選低嚴格條件。當需要完全或接近完全的互補性時，優選高嚴格條件。對於典型的高嚴格條件來說，雜交溶液含有6×SSC、0.01M EDTA、1×denhardt’s溶液和0.5％SDS。對於克隆DNA片段來說，雜交是在大約68℃下進行大約3-4小時，而對於總真核DNA來說，進行大約12-16小時。對於較低的嚴格條件來說，雜交溫度被降低到大約42℃，低於雙鏈體的解鏈溫度(Tm)。已知Tm受G-C含量和雙鏈體長度以及溶液的離子強度的影響。
在本文中，術語「明顯的序列相同性」或「明顯的同源性」被用於表示與另一種核苷酸或胺基酸序列有明顯的結構或功能相同性的核苷酸序列或胺基酸序列。具有明顯的序列相同性或結構同源性的序列之間的任何結構或功能的差異都不微不足道的；就是說這些差異不會影響該序列在所需要的用途中發揮預期作用的能力。例如，這些差異可能是由於在不同物種之間密碼子利用方面所固有的差異所導致。如果在兩種或兩種以上不同序列之間存在大量的序列重疊或相似性，或者如果不同的序列具有相似的物理特徵，即使這些序列在長度或結構上不同，其結構差異也被視為微不足道。例如，所述特徵包括在特定條件下雜交的能力，或者對於蛋白來說，免疫交叉反應性、類似的酶促活性等。上述每一種特徵可以由本領域技術人員通過本領域所公知的方法方便地加以確定。
另外，如果兩個核苷酸序列之間的序列相似性至少為大約70％，更優選80％，最優選大約90％的話，這兩種核苷酸序列就是「基本上互補的」。如果兩種多肽活性之間的相似性至少為50％，優選70％的話，這認為這兩種胺基酸基本是同源的。
在本文中，短語與DNA或RNA分子的相應部分雜交表示雜交的分子，例如寡核苷酸、多核苷酸、或任何核苷酸序列(有義或反義方向)能識別並與另一種核酸分子上的序列雜交，它們具有大體上相同的大小，並具有足夠的序列相似性，以便實現在合適條件下的雜交。例如，源於番茄DHS的3』編碼或非編碼區的100個核苷酸長度的反義分子能夠識別並與分別來自香石竹DHS基因或任何其他植物DHS基因的3』編碼或非編碼區的核苷酸序列的大約100個核苷酸的部分雜交，只要在這兩種序列之間具有大約70％或更高的序列相似性。可以理解的是，「相應部分」的大小允許在雜交中有某些錯配，因此，所述「相應部分」可以比要雜交的分子小或大，例如，大或小20-30％，優選大或小不超過大約12-15％。
術語核酸(或多核苷酸或寡核苷酸)的「功能性衍生物」在本文中被用於表示編碼衰老誘導的DHS或衰老誘導的eIF-5A的基因或核苷酸序列的片段、變體、同系物、或類似物。功能性衍生物可能至少保留了衰老誘導的DHS或eIF-5A編碼DNA的一部分功能，這使得它能用於本發明中。所述功能可以包括在低嚴格條件下與天然番茄、擬南芥屬或香石竹衰老誘導的DHS或eIF-5A或源於其他植物的編碼衰老誘導的DHS或eIF-5A的基本上同源的DNA或與其mRNA轉錄物雜交的能力，或在反義方向上抑制植物衰老誘導的DHS或eIF-5A mRNA轉錄和/或翻譯的能力等。
基因或DNA序列的「片段」是指任何分子的亞類，例如更短的多核苷酸或寡核苷酸。「變體」是指基本上類似於完整基因或其片段的分子，如具有一個或多個取代的核苷酸的核苷酸取代變體，不過它保留了與特定基因雜交的能力或編碼與能天然DNA雜交的mRNA轉錄物的能力。「同系物」是指來自不同植物屬或種的片段或變體序列。「類似物」是指基本上類似於完整分子、其變體或片段或以與之相關的方式起作用的非天然分子。
一種基因，例如，衰老誘導的DHS基因或衰老誘導的eIF-5A基因的「改變了的表達」或「修飾過的表達」是指以某種方式改變了所述基因的正常表達，例如，在未修飾過的結實、開花或其他植物中的表達的任何過程或結果。在本文中，基本表達的改變是衰老誘導的DHS基因或衰老誘導的eIF-5A基因或這兩者表達的完全或部分減弱，但還可以包括表達時序的改變，或其他狀態，其中，衰老誘導的DHS基因或衰老誘導的eIF-5A基因或這兩者的表達不同於在未修飾過的植物或栽培種中天然發生的表達。優選的改變是這樣的，與在未修飾過的植物中的產量相比，這種改變會導致衰老誘導的DHS產量、衰老誘導的eIF-5A產量或這兩者的降低。
在生產本發明的進行過遺傳學改變的植物時，優選根據所需形狀、總體上減弱了的衰老誘導的DHS表達或產量或減弱了的衰老誘導的eIF-5A表達或這兩者選擇單個的小植株或植株。例如，衰老誘導的DHS和衰老誘導的eIF-5A的表達可以通過觀察在轉基因植物上衰老的推遲或減弱來確定。還可以用已知測定方法定量相對對照(正常的非轉基因)植物而言，轉基因植物中DHS和/或eIF-5A的活性。
為了讓新插入的基因或DNA序列表達，導致它所編碼的蛋白的產生，或者對於要轉錄的反義DNA來說，導致反義RNA分子的產生，相對所述基因或DNA序列而言，應當在正確的位置上存在正確方向的正確的調控因子。所述調控區可以包括一個啟動子、一個5』-非翻譯前導序列和一個3』-聚腺苷酸化信號，以及增強子和其他調控序列。可用於與衰老誘導的DHS基因組合使用以便製備該基因的有義或反義轉錄物的啟動子調控因子包括常見的任何植物啟動子，更具體地講，包括組成型啟動子，如玄參花葉病毒35S啟動子，花椰菜花葉病毒啟動子，CaMV35S啟動子，或MAS啟動子，或組織專一性或衰老誘導的啟動子，如香石竹花瓣GST1啟動子或擬南芥屬SAG12啟動子(例如，參見J.C.Palaqui等，植物生理學，1121447-1456，1996；Morton等，分子育種，1123-132，1995；Fobert等，植物雜誌，6567-577，1994；和Gan等，植物生理學，113313，1997，被收作本文參考)。用於本發明的啟動子優選是組成型啟動子，最優選使用雙35S啟動子。
用於本發明的啟動子的表達水平可以用常規表達系統測定，例如，通過測定報導基因產物的含量，例如，導入了該啟動子/報導基因的轉基因植物的葉片、花、果實或其他組織的提取物中的蛋白或mRNA。
本發明提供了互補於編碼番茄衰老誘導的DHS、香石竹衰老誘導的DHS、擬南芥屬衰老誘導DHS的基因或互補於源於其他植物的能與番茄、香石竹或擬南芥屬衰老誘導的DHS基因在低至高嚴格條件下雜交的基因或基因片段的反義寡核苷酸或多核苷酸。本發明提供了互補於編碼番茄衰老誘導的eIF-5A、香石竹衰老誘導的eIF-5A、擬南芥屬衰老誘導eIF-5A的基因或互補於源於其他植物的能與番茄、香石竹或擬南芥屬衰老誘導的eIF-5A基因在低至高嚴格條件下雜交的基因或基因片段的反義寡核苷酸或多核苷酸。所述反義寡核苷酸的長度至少為大約6個核苷酸，以便提供最低的雜交專一性，並可互補於編碼衰老誘導的基因或其部分的一股DNA或mRNA，或互補於與調控衰老誘導的DHS或eIF-5A基因表達相關的基因組DNA上的旁側序列。所述反義寡核苷酸可以大到100個核苷酸或更大，並可以延伸到和超過反義的完整編碼序列的長度。所述反義寡核苷酸可以是DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物形式，它是單鏈的或雙鏈的。
所述反義寡核苷酸的作用可能會導致細胞中衰老誘導的DHS表達、衰老誘導的eIF-5A表達或這兩者的改變，主要是抑制。對反義的一般性描述可以參見Alberts等，細胞分子生物學，第2版，Garland出版公司，紐約，1989(特別是195-196頁，收作本文參考)。
所述反義寡核苷酸可以互補於衰老誘導的DHS或eIF-5A基因的任何相應部分。在一種實施方案中，所述反義寡核苷酸的長度可以是6-100個核苷酸，並可以互補於例如，衰老誘導的DHS或eIF-5A序列的5』非編碼序列或3』末端的序列。已知主要互補於5』非編碼序列的反義寡核苷酸是編碼轉錄因子基因表達的有效抑制劑，Branch，M.A.分子細胞生物學，134284-4290，1993。
優選的反義寡核苷酸基本上互補於編碼衰老誘導的DHS或衰老誘導的eIF-5A的mRNA的一部分，所述mRNA部分的大小大體上與該反義寡核苷酸相同。例如，將編碼衰老誘導的DHS或eIF-5A的完整長度cDNA克隆沿反義方向導入植物，預計會導致衰老誘導的DHS和/或eIF-5A基因表達的成功改變。另外，如圖21-35所示，將部分序列定嚮導入衰老誘導的DHS基因或衰老誘導的eIF-5A基因或這兩者的特定部分可能是同樣有效的。
本發明所需要的最低程度的同源性是足於產生足夠的互補性，以便能識別特定的靶RNA或DNA，並抑制或減弱其翻譯或功能而不影響其他RNA或DNA分子的功能以及其他基因的表達。儘管本發明的反義寡核苷酸包括互補於衰老誘導的DHS基因或衰老誘導的eIF-5A基因的RNA轉錄物的相應部分的序列，但絕對的互補性是沒有必要的，不過是優選的。雜交的能力可能取決於反義寡核苷酸的長度和互補程度。一般，雜交的核酸越長，與衰老誘導的DHS靶序列所包含的鹼基錯配就越多，但仍然能形成穩定的雙鏈體。本領域技術人員可以用標準方法確定錯配的允許程度，例如，通過測定雜交複合體的解鏈溫度。
反義RNA寡核苷酸序列可以通過由外源導入的核酸序列轉錄而在細胞內產生。這種反義分子可以通過用一種載體轉化或轉染或感染而輸送到細胞內，如在它上面整合了編碼所述反義衰老誘導的DHS序列的DNA的質粒或病毒。所述DNA可操作地連接於合適的調控因子上，包括啟動子。所述外源DNA序列在細胞內表達，產生衰老誘導的DHS基因的反義RNA。
載體優選是質粒，或者可以是本領域已知的病毒或其他載體，以便在植物細胞或細菌細胞中複製並表達它所編碼的基因。所述載體被整合到染色體上，以便它能夠轉錄，產生所需要的反義衰老誘導的DHSRNA。所述質粒或病毒載體可以通過本領域的標準重組DNA技術構建，例如，所述載體可以是含有能夠在原核宿主中起作用的複製系統和本發明的反義寡核苷酸或多核苷酸的質粒載體。另外，所述載體可以是含有能在農桿菌屬中起作用的複製系統和本發明的反義寡核苷酸或多核苷酸的質粒。能夠在農桿菌屬中起作用的質粒為本領域所公知。參見Miki等，將外源DNA導入植物的方法，植物分子生物學和生物技術方法，B.R.Glick和J.E.Thompson著，CRC出版社，1993，67-83頁。
按以下方法將番茄DHS基因沿反義方向克隆到一種質粒載體上。PCD質粒是從pUC18主鏈構建而成的，並含有源於花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子，隨後是一個多克隆位點和一個章魚氨酸合成酶終止序列，將該質粒用於克隆番茄DHS基因。通過利用XhoI和SacI限制位點將完整長度番茄DHS基因沿反義方向亞克隆到pCD質粒上構建pCd-DHS(反義)質粒。
長度優選為大約6-100個核苷酸並互補於衰老誘導的DHS或衰老誘導的eIF-5A基因的寡核苷酸可以通過重組核苷酸技術製備或者由單核苷酸或較短的寡核苷酸合成。自動化合成儀可用於本發明寡核苷酸和多核苷酸的化學合成。用於構建本發明重組核苷酸分子的方法披露於Sambrook等的文獻中，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，NY，1989，該文獻被全文收作本文參考。編碼衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶序列的反義RNA的寡核苷酸可以用本領域所熟知的方法製備。有關該方法的細節披露於以下文獻中Maniatis，T.等，控制基因表達的分子機制，Nierlich等著，學術出版社，紐約，1976。
在本發明的另一種實施方案中，內源植物衰老誘導的DHS、衰老誘導的eIF-5A或這兩者的表達的抑制是通過導入植物細胞的外源衰老誘導的DHS或eIF-5A基因或基因片段或這兩者的超量表達的共抑制所導致的。在本發明的該實施方案中，以本文所披露的用於反義分子的相同方法將編碼衰老誘導的DHS、衰老誘導的eIF-5A或這兩者的載體沿有義方向導入細胞。所述衰老誘導的DHS或衰老誘導的eIF-5A優選可操作地與強的組成型啟動子可操作地連接，如玄參花葉病毒啟動子或CaMV35S或雙35S啟動子。
在本發明的另一種實施方案中，內源植物衰老誘導的DHS、衰老誘導的eIF-5A或這兩者的表達的抑制是通過使用核酶實現的。核酶是具有序列專一性內切核糖核酸酶活性的RNA分子。一種例子是錘頭核酶，它能裂解靶RNA上的UH(其中H是A、C或U殘基)識別位點，並含有鹼基配對區，它能引導核酶的催化域至底物RNA的靶位點。核酶是高度定向專一性的，並可以設計成使多基因家族的一個成員失活，或針對相關mRNA的保守區(參見Merlo等，植物細胞，101603-1621，1998)。可以通過用諸如質粒或病毒的載體轉化、轉染或感染將核酶分子輸送到細胞中，在所述載體上整合了可操作地與合適的調控因子，包括啟動子連接的核酶。所述核酶結構含有鹼基配對臂，該臂能將它引導至衰老誘導的DHS mRNA或衰老誘導的eIF-5A mRNA上的裂解位點，導致DHS或eIF-5A mRNA的裂解，並抑制衰老誘導的DHS和/或eIF-5A表達。
按照本發明生產的轉基因植物可以通過本領域所公知的任何植物轉化方法通過DNA轉化而製備。植物轉化方法包括用根癌農桿菌與植物、組織或細胞直接共培養或直接感染(Miki等，植物分子生物學和生物技術方法，1993)直接將基因轉入原生質體或原生質體吸收(Paszkowski等，EMBO雜誌，122717，1984)；電穿孔(Fromm等，自然，319719，1986)；粒子轟擊(Klein等，生物技術，6559-563，1988)；注射到幼苗和植物的分生組織中(De LaPena等，自然，325274-276，1987)；注射到培養細胞或組織的原生質體中(Reich等，生物技術，41001-1004，1986)。
一般，完整植株是通過轉化方法獲得的。植株是從原生質體、愈傷組織、組織部分或外殖體等再生的。本文所使用的「植物」的定義包括從再生植株獲得的植物部分，其中，衰老誘導DHS、衰老誘導的eIF-5A或這兩者的表達改變了，如葉片、花、果實和種子等。「植物」的定義還包括再生植物的後代，變體和突變體。
番茄、香石竹或擬南芥屬衰老誘導的DHS蛋白或其功能衍生物，和番茄、香石竹或擬南芥屬衰老誘導的eIF-5A蛋白或其功能衍生物優選是通過重組技術生產，選擇性地與化學合成方法組合。在本發明的一種實施方案中，衰老誘導的DHS是作為一種融合蛋白表達的，它優選包括與麥芽糖結合蛋白融合的衰老誘導的DHS。
本文所披露的衰老誘導DHS或衰老誘導的eIF-5A蛋白的「功能性衍生物」分別是衰老誘導DHS或衰老誘導的eIF-5A的片段、變體、類似物或化學衍生物，它至少保留了一部分衰老誘導DHS或eIF-5A活性或能與分別對衰老誘導DHS或衰老誘導的eIF-5A專一的抗體有免疫交叉反應性。衰老誘導DHS或衰老誘導的eIF-5A蛋白的片段是指所述分子的任何亞型。變體肽可以通過直接化學合成製備，例如，使用本領域所熟知的方法。衰老誘導DHS或衰老誘導的eIF-5A的類似物是指基本上與所述完整蛋白或其片段類似的非天然蛋白。衰老誘導DHS或衰老誘導的eIF-5A的化學衍生物含有正常情況下不是所述肽或肽片段的一部分的額外的化學部分。通過讓能夠與特定側鏈或末端殘基起反應的有機衍生劑與所述肽的特定胺基酸殘基反應將修飾引入這種肽或其片段。
本發明的衰老誘導DHS或老誘導的eIF-5A蛋白或肽可以這樣生產培養用本發明的核苷酸序列(有義方向)轉化過的細胞，讓所述細胞合成所述蛋白，然後根據所使用的克隆方法以游離蛋白形式或融合蛋白形式從培養基或從細胞提取物中分離所述蛋白。另外，所述蛋白可以在無細胞系統中產生。Ranu等，酶學方法，60459-484，1979。
已經對本發明作了一般性說明，通過結合下面的實施例可以更好地理解本發明，這些實施例是用於說明目的的，而不是要限定本發明的範圍。
實施例1mRNA分離從各種發育階段的番茄花和番茄果實中並且從葉片中分離總RNA(未處理過或者在冷害或山梨醇處理之後)。簡單地講，在液氮研磨組織(5克)。將磨碎的粉與30毫升胍緩衝液(4M異硫氰酸胍，2.5mM乙酸鈉，pH8.5，0.8％β-巰基乙醇)混合。混合物通過四層紗布過濾，並在4℃下以10000×g的速度離心30分鐘。然後將上清液放在氯化銫密度梯度上然後以26000×g的速度離心20小時。沉澱的RNA用75％乙醇漂洗，重新懸浮在600微升DEPC處理過的水中，並在-70℃下用0.75毫升95％乙醇和30微升3M乙酸鈉使RNA沉澱。在1.2％變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離10微克RNA，並轉移到尼龍膜上。在42℃下用隨機啟動的32P-dCTP標記的完整長度DHS cDNA(SEQ ID NO1)檢測該膜移液。然後用含有1％SDS的1×SSC在室溫下洗滌該膜1次，15分鐘，用含有0.1％SDS的0.2×SSC在65℃下洗滌3次，每次15分鐘。在-70℃下讓該膜對X光膠片進行曝光一夜。
用購自pROMEGA的PolyA+片段mRNA分離系統從總RNA中分離PolyA+mRNA。用PolyA+mRNA作模板利用購自Stratagene(La Jolla，加州)的ZAP ExpresscDNA合成系統進行cDNA合成。
番茄葉片cDNA文庫篩選將用從用2M山梨醇處理了6小時的Match F1雜交番茄葉片中分離的mRNA製備的cDNA文庫稀釋到大約5×106PFU/毫升。用32P標記過的600bp RT-PCR片段篩選該cDNA文庫。切除3個陽性cDNA克隆，並利用生產商說明書中推薦的方法將其重新環化pBK-CMV(Stratagene)噬菌粒。將完整長度pBK-CMV載體上。
質粒DNA分離，DNA測序利用Sambrook等(同上)所披露的鹼性裂解方法分離質粒DNA。用雙脫氧測序方法對完整長度陽性cDNA進行測序。Sanger等，美國科學院院報，745463-5467。利用BLAST檢索(GenBank，Bethesda，MD)編輯並分析開放讀框，五種最同源的蛋白與編碼基因的衍生胺基酸序列的排比是利用BCM Search LAUNCHER實現的多重序列排比方式誘導的多重排比方法(參見F.Corpet核酸研究1610881-10890，1987)。通過MultiFinder鑑定存在於衍生胺基酸序列上的功能基序。
番茄RNA的Northern印跡雜交在1％變性的甲醛瓊脂糖凝膠上分離從各種階段的番茄花(花芽和花以及充分展開或乾燥的衰老的花瓣)、番茄葉片、和各種成熟階段的番茄果實(生硬，即花色少於10％的綠色果實，粉紅，即整個果實是橘紅和粉紅色，和紅色，軟或硬)中分離的10微克總RNA，並固定在尼龍膜上。將利用隨機引物試劑盒(Boehringer Mannheim)通過32P-dCTP標記的完整長度番茄cDNA用於檢測該濾膜(7×107cpm)。在室溫下用1×SSC，0.1％SDS洗滌該濾膜1次，在65℃下用0.2×SSC，0.1％SDS洗滌該膜3次。讓該濾，膜乾燥並在-70℃下讓該膜對X光膠片進行曝光一夜。結果如圖6、7、8和9所示。
擬南芥屬RNA的Northern印跡雜交在1％變性的甲醛瓊脂糖凝膠上分離按上述方法從5周齡(泳道1)、6周齡(泳道2)和7周齡(泳道3)擬南芥屬植物的葉片中分離的總RNA，並固定在尼龍膜上。將利用隨機引物試劑盒(Boehringer Mannheim)通過32P-dCTP標記的完整長度擬南芥屬衰老誘導的DHS cDNA用於檢測該濾膜(7×107cpm)。在室溫下用1×SSC，0.1％SDS洗滌該濾膜1次，在65℃下用0.2×SSC，0.1％SDS洗滌該膜3次。讓該濾膜乾燥並在-70℃下讓該膜對X光膠片進行曝光一夜。結果如圖所示。
香石竹RNA的Northern印跡雜變在1％變性的甲醛瓊脂糖凝膠上分離按上述方法從在花的各種發育階段的香石竹植物花瓣，即緊湊的花芽(泳道1)、開始開放(泳道2)、完全開放的花(泳道3)、具有向內翻卷的花瓣的花(泳道4)中分離的總RNA，並固定在尼龍膜上。將利用隨機引物試劑盒(BoehringerMannheim)通過32P-dCTP標記的完整長度香石竹衰老誘導的DHS cDNA用於檢測該濾膜(7×107cpm)。在室溫下用1×SSC，0.1％SDS洗滌該濾膜1次，在65℃下用0.2×SSC，0.1％SDS洗滌該膜3次。讓該濾，膜乾燥並在-70℃下讓該膜對X光膠片進行曝光一夜。結果示於圖12中。
實施例2番茄衰老透導的DHS基因的山梨醇誘導在密封空間用2M山梨醇處理番茄葉片6小時。按以下方法從山梨醇處理過的葉片中提取RNA。
在液氮中研磨葉片(5克)。將磨碎的粉與30毫升胍緩衝液(4M異硫氰酸胍，2.5mM乙酸鈉，pH8.5，0.8％β-巰基乙醇)混合。混合物通過四層紗布過濾，並在4℃下以10000×g的速度離心30分鐘。然後將上清液放在氯化銫密度梯度上然後以26000×g的速度離心20小時。沉澱的RNA用75％乙醇漂洗，重新懸浮在600微升DEPC處理過的水中，並在-70℃下用0.75毫升95％乙醇和30微升3M乙酸鈉使RNA沉澱。在1.2％變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離10微克RNA，並轉移到尼龍膜上。在42℃下用隨機啟動的32P-dCTP標記的完整長度DHS cDNA(SEQ ID NO1)檢測該膜移液。然後用含有1％SDS的1×SSC在室溫下洗滌該膜1次，15分鐘，用含有0.1％SDS的0.2×SSC在65℃下洗滌3次，每次15分鐘。在-70℃下讓該膜對X光膠片進行曝光一夜。
結果如圖8所示。如圖所示，通過山梨醇在葉片中誘導的DHS的轉錄。
實施例3在衰老中的花中誘導番茄DHS基因採集番茄植物的緊湊的花瓣和開放的花、衰老的花，並按例2所述方法分離RNA。在1.2％變性的甲醛瓊脂糖凝膠上分離10微克RNA，並轉移到尼龍膜上。在42℃下用隨機啟動的32P-dCTP標記的完整長度DHScDNA(SEQ ID NO1)檢測該膜移液。然後用含有1％SDS的1×SSC在室溫下洗滌該膜1次，15分鐘，用含有0.1％SDS的0.2×SSC在65℃下洗滌3次，每次15分鐘。在-70℃下讓該膜對X光膠片進行曝光一夜。
結果如圖6所示。如圖所示，在衰老的花中誘導了DHS的轉錄。
實施例4在成熟的果實中誘導番茄DHS基因按例2所述方法從生硬、粉紅色和成熟果實中分離RNA。在1.2％變性的甲醛瓊脂糖凝膠上分離10微克RNA，並轉移到尼龍膜上。在42℃下用隨機啟動的32P-dCTP標記的完整長度DHS cDNA(SEQ ID NO1)(圖1)檢測該膜移液。然後用含有1％SDS的1×SSC在室溫下洗滌該膜1次，15分鐘，用含有0.1％SDS的0.2×SSC在65℃下洗滌3次，每次15分鐘。在-70℃下讓該膜對X光膠片進行曝光一夜。
結果如圖7所示。如圖所示，在導致腐爛的衰老即將開始之前DHS的轉錄在成熟的、紅色果實中最強。
實施例5通過冷害誘導番茄衰老誘導的DHS基因在生長箱中，在6℃下處理花盆中的番茄植物(7-8周齡)2天、3天或6天。將光照周期設定為8小時黑暗和16小時光照。通過將植物重新送回溫室進行回溫。不回溫的植物在從所述生長箱中取出後馬上收穫。按以下方法從葉片中提取RNA。在液氮中研磨葉片(5克)。將磨碎的粉與30毫升胍緩衝液(4M異硫氰酸胍，2.5mM乙酸鈉，pH8.5，0.8％β-巰基乙醇)混合。混合物通過四層紗布過濾，並在4℃下以10000×g的速度離心30分鐘。然後將上清液放在氯化銫密度梯度上然後以26000×g的速度離心20小時。沉澱的RNA用75％乙醇漂洗，重新懸浮在600微升DEPC處理過的水中，並在-70℃下用0.75毫升95％乙醇和30微升3M乙酸鈉使RNA沉澱。在1.2％變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離10微克RNA，並轉移到尼龍膜上。在42℃下用隨機啟動的32P-dCTP標記的完整長度DHS cDNA(SEQ ID NO1)檢測該膜移液。然後用含有1％SDS的1×SSC在室溫下洗滌該膜1次，15分鐘，用含有0.1％SDS的0.2×SSC在65℃下洗滌3次，每次15分鐘。在-70℃下讓該膜對X光膠片進行曝光一夜。
結果如圖9所示。如圖所示，通過接觸冷害溫度然後再回溫在葉片中誘導了DHS轉錄，並且增強了的轉錄與冷害損傷相關，這種損害是以膜滲漏形式測定的。
實施例6利用基於未鑑定的擬南芥屬基因組序列的引物製備擬南芥屬PCR產物利用一對由擬南芥屬基因組序列設計的寡核苷酸引物通過PCR由擬南芥屬cDNA模板製備部分長度衰老誘導的DHS序列。5』引物是十九聚體，其序列為5』-GGTGGTGTTGAGGAAGATCSEQ ID NO7)；3』引物是二十聚體，其序列為GGTGCACGCCCTGATGAAGC-3』(SEQ ID NO8)。利用擴增高保真PCR系統(Boehringer Mannheim)按照以下方法進行PCR，並用擬南芥屬衰老的葉片cDNA文庫作模板。
反應成分cDNA 1微升(5×107PFU)
dNTP(各10mM) 1微升氯化鎂(5mM)+10倍緩衝液5微升引物1和2(各100μM)2微升擴增高保真DNA聚合酶 1.75U反應體積 50微升反應參數94℃30分鐘94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃2分鐘，進行45輪72℃15分鐘。
實施例7基因組DNA的分離和Southern分析通過在液氮中將10克番茄葉片組織研磨成細粉從番茄葉片中提取基因組DNA。將預先加熱到60℃的含有25毫升勻漿緩衝液[100mMTris-HCl，pH8.0，100mM EDTA，250mM氯化鈉、1％十二烷基肌氨酸鈉，1％2-巰基乙醇，10微克/毫升RNase和12.5毫升苯酚]的37.5毫升混合物加入研磨過的組織中。搖動該混合物15分鐘。再將12.5毫升氯仿/異戊醇(24∶1)添加到該混合物中，並再搖動15分鐘。對該混合物進行離心，並用25毫升苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)和氯仿/異戊醇(24∶1)對水相進行再次提取。通過在室溫下用15毫升異丙醇沉澱回收核酸。將沉澱重新懸浮在1毫升水中。
按以下方法對基因組DNA進行限制酶消化。
讓10微克基因組DNA、40微升10倍反應緩衝液和100U限制酶(XbaI、EcoRI、EcoRV或HindIII)在400微升總反應體積中反應5-6小時。然後對該混合物進行苯酚提取並用乙醇沉澱。對消化過的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，在0.8％瓊脂糖凝膠上以15伏的電壓電泳大約5小時。將凝膠在變性緩衝液[87.66克氯化鈉和20克氫氧化鈉/升]中浸沒30分鐘，同時輕微振動，用蒸餾水漂洗，並浸沒在中和緩衝液[87.66克氯化鈉和60.55ke Tris-HCl，pH7.5/升]中，同時輕微振動，通過毛細吸印將DNA轉移到Hybond-N+尼龍膜上。
用1×106CPM/毫升32P-dCTP標記的完整長度DHS cDNA或DHScDNA克隆的3』非編碼區在42℃下進行雜交過夜。預雜交和雜交是在含有50％甲醯胺、6×SSC、5×denhardt’s溶液、0.1％SDS和100毫克/毫升變性的鮭魚精DNA的緩衝液中進行的。將所述膜預雜交2-4小時；雜交進行一夜。
在雜交結束之後，然後在室溫下用2×SSC和0.1％SDS漂洗膜，然後用2×SSC和0.1％SDS洗滌15分鐘，並用0.2×SSC和0.1％SDS洗滌15分鐘。然後在-80℃讓該膜對X光膠片曝光一夜。結果如圖5所示。
實施例8從擬南芥屬中分離衰老誘導的eIF-5A基因用擬南芥屬衰老的葉片cDNA文庫作模板通過PCR獲得在擬南芥屬葉片中表達的衰老誘導的eIF-5A基因的完整長度cDNA克隆。首先，利用與載體T7引物AATACGACTCACTATAG(SEQ ID NO18)配對的簡併上遊引物AAARRYCGMCCYTGCAAGGT(SEQ ID NO17)和與載體T3引物ATTAACCCTCACTAAAG(SEQ ID NO20)配對的簡併下遊引物TCYTTNCCYTCMKCTAAHCC(SEQ ID NO19)製備相應於該基因的5』和3』末端的PCR產物。將該PCR產物亞克隆到pBluescript上進行測序。然後用與3』-專一性引物AGAAGAAGTATAAAAACCATC(SEQ ID NO22)配對的5』-專一性引物CTGTTACCAAAAAATCTGTACC(SEQ ID NO21)獲得完整長度cDNA，並亞克隆到pBluescript上進行測序。
實施例9從番茄果實中分離衰老誘導的eIF-5A基因用番茄果實cDNA文庫作模板通過PCR獲得在番茄果實中表達的衰老誘導的eIF-5A基因的完整長度cDNA克隆。首先，利用與載體T7引物(SEQ ID NO18)配對的簡併上遊引物(SEQ ID NO17)和與載體T3引物(SEQ ID NO20)配對的簡併下遊引物(SEQ ID NO19)製備相應於該基因的5』和3』末端的PCR產物。將該PCR產物亞克隆到pBluescript上進行測序。然後用與載體T7引物(SEQ ID NO18)配對的5』-專一性引物AAAGAATCCTAGAGAGAGAAAGG(SEQ ID NO23)獲得完整長度cDNA，並亞克隆到pBluescript上進行測序。
實施例10從香石竹中分離衰老誘導的eIF-5A基因用香石竹衰老的花cDNA文庫作模板通過PCR獲得在香石竹花中表達的衰老誘導的eIF-5A基因的完整長度cDNA克隆。首先，利用與載體T7引物(SEQ ID NO18)配對的簡併上遊引物(SEQ ID NO17)和與載體T3引物(SEQ ID NO20)配對的簡併下遊引物(SEQ ID NO19)製備相應於該基因的5』和3』末端的PCR產物。將該PCR產物亞克隆到pBluescript上進行測序。然後用與3』專一性引物ACAAAACCTGTGTTATAACTCC(SEQ ID NO25)配對的5』專一性引物TTTTACATCAATCGAAAA(SEQ ID NO24)獲得完整長度cDNA，並亞克隆到pBluescript上進行測序。
實施例11從擬南芥屬中分離衰老誘導的DHS基因通過篩選擬南芥屬衰老葉片的cDNA文庫獲得在擬南芥屬葉片中表達的衰老誘導的DHS基因的完整長度cDNA克隆。用於篩選的探針的序列(SEQ ID NO26)如圖38所示。該探針是利用所述衰老葉片cDNA文庫作模板和由GeneBank中的未鑑定的基因組序列(AB017060)設計的引物(在圖38中表示為加下劃線的部分)通過PCR獲得的。將該PCR產物亞克隆到pBluescript上進行測序。
實施例12從香石竹中分離衰老誘導的DHS基因通過篩選香石竹衰老花瓣cDNA文庫獲得在香石竹花瓣中表達的衰老誘導的DHS基因的完整長度cDNA文庫。用於篩選的探針的序列(SEQID NO27)如圖39所示。該探針是利用衰老花瓣cDNA文庫作模板和簡併引物(上遊5』TTGARGAAGATYCATMAARTGCCT3』，SEQ ID NO28；下遊5』CCATCAAAYTCYTGKGCRGTGTT3』，SEQ ID NO29)通過PCR獲得的。將該PCR產物亞克隆到pBluescript上進行測序。
實施例13用反義方向的完整長度的擬南芥屬DHS或其3』片段部分轉化擬南芥屬用二元載體pKYLX71轉化農桿菌，該載體含有完整長度的衰老誘導的擬南芥屬DHS cDNA序列或該DHS基因的3』末端(SEQ ID NO30)(圖36)，這兩者都是以反義形式表達的，受雙35S啟動子的控制。通過真空滲濾用轉化過的農桿菌轉化擬南芥屬植物，並在氨苄青黴素上篩選來自所得到的T0植株的轉化的種子。
圖21-24是轉化過的擬南芥屬植物的照片，表示在轉化過的植物中DHS基因或其3』末端沿反義方向的表達會導致生物量的增加，例如，較大的葉片和較大的植物體積。圖25表示轉基因擬南芥屬植物具有較高的種子產量。
實施例14用反義方向的完整長度的番茄DHS或其3』片段部分轉化番茄植物用二元載體pKYLX71轉化農桿菌，該載體含有完整長度的衰老誘導的番茄DHS cDNA序列或該DHS基因的3』末端(SEQ ID NO31)(圖37)，用所述農桿菌產生番茄葉片外殖體，並製備轉化過的愈傷組織和小植株，通過標準組織培養方法篩選。在溫室條件下將轉化過的小植株生長成成熟的結實的T1植株。
圖26-35是照片，表示衰老誘導的番茄DHS基因在轉化過的植物中的減弱了的表達會導致較高的生物量，例如，較大的葉片和較大的植株，正如在轉化過的擬南芥屬植物中所看到的，以及番茄果實推遲了的軟化和腐爛。
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141
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221CDS222(54..1196)220
223DHS4001cgcagaaact cgcggcggca gtcttgttcc ctacataatc ttggtctgca ata atg 56Met1gga gaa gct ctg aag tac agt atc atg gac tca gta aga tcg gta gtt 104Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Ser Ile Met Asp Ser Val Arg Ser Val Val5 10 15ttc aaa gaa tcc gaa aat cta gaa ggt tct tgc act aaa atc gag ggc 152Phe Lys Glu Ser Glu Asn Leu Glu Gly Ser Cys Thr Lys Ile Glu Gly20 25 30tac gac ttc aat aaa ggc gtt aac tat gct gag ctg atc aag tcc atg 200Tyr Asp Phe Asn Lys Gly Val Asn Tyr Ala Glu Leu Ile Lys Ser Met
35 40 45gtt tcc act ggt ttc caa gca tct aat ctt ggt gac gcc att gca att 248Val Ser Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp Ala Ile Ala Ile50 55 60 65gtt aat caa atg cta gat tgg agg ctt tca cat gag ctg ccc acg gag 296Val Asn Gln Met Leu Asp Trp Arg Leu Ser His Glu Leu Pro Thr Glu70 75 80gat tgc agt gaa gaa gaa aga gat gtt gca tac aga gag tcg gta acc 344Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asp Val Ala Tyr Arg Glu Ser Val Thr85 90 95tgc aaa atc ttc ttg ggg ttc act tca aac ctt gtt tct tct ggt gtt 392Cys Lys Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Val100 105 110aga gac act gtc cgc tac ctt gtt cag cac cgg atg gtt gat gtt gtg 440Arg Asp Thr Val Arg Tyr Leu Val Gln His Arg Met Val Asp Val Val115 120 125gtt act aca gct ggt ggt att gaa gag gat ctc ata aag tgc ctc gca 488Val Thr Thr Ala Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu Ala130 135 140 145cca acc tac aag ggg gac ttc tct tta cct gga gct tct cta cga tcg 536Pro Thr Tyr Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Ser Leu Arg Ser150 155 160aaa gga ttg aac cgt att ggt aac tta ttg gtt cct aat gac aac tac 584Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr165 170 175tgc aaa ttt gag aat tgg atc atc cca gtt ttt gac caa atg tat gag 632Cys Lys Phe Glu Asn Trp Ile Ile Pro Val Phe Asp Gln Met Tyr Glu180 185 190gag cag att aat gag aag gtt cta tgg aca cca tct aaa gtc att gct 680Glu Gln Ile Asn Glu Lys Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Val Ile Ala195 200 205cgt ctg ggt aaa gaa att aat gat gaa acc tca tac ttg tat tgg gct 728Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asp Glu Thr Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala210 215 220 225tac aag aac cgg att cct gtc ttc tgt cct ggc ttg acg gat gga tca 776Tyr Lys Asn Arg Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser
230 235 240ctt ggt gac atg cta tac ttc cat tct ttc aaa aag ggt gat cca gat 824Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Lys Lys Gly Asp Pro Asp245 250 255aat cca gat ctt aat cct ggt cta gtc ata gac att gta gga gat att 872Asn Pro Asp Leu Asn Pro Gly Leu Val Ile Asp Ile Val Gly Asp Ile260 265 270agg gcc atg aat ggt gaa gct gtc cat gct ggt ttg agg aag aca gga 920Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Gly Leu Arg Lys Thr Gly275 280 285atg att ata ctg ggt gga ggg ctg cct aag cac cat gtt tgc aat gcc 968Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Val Cys Asn Ala290 295 300 305aat atg atg cgc aat ggt gca gat ttt gcc gtc ttc att aac acc gca 1016Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Phe Ala Val Phe Ile Asn Thr Ala310 315 320caa gag ttt gat ggt agt gac tct ggt gcc cgt cct gat gaa gct gta 1064Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val325 330335tca tgg gga aag ata cgt ggt ggt gcc aag act gtg aag gtg cat tgt 1112Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Gly Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys340 345 350gat gca acc att gca ttt ccc ata tta gta gct gag aca ttt gca gct 1160Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Ile Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala355 360 365aag agt aag gaa ttc tcc cag ata agg tgc caa gtt tgaacattga 1206Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gln Ile Arg Cys Gln Val370 375 380ggaagctgtc cttccgacca cacatatgaa ttgctagctt ttgaagccaa cttgctagtg1266tgcagcacca tttattctgc aaaactgact agagagcagg gtatattcct ctaccccgag1326ttagacgaca tcctgtatgg ttcaaattaa ttatttttct ccccttcaca ccatgttatt1386tagttctctt cctcttcgaa agtgaagagc ttagatgttc ataggttttg aattatgttg1446gaggttggtg ataactgact agtcctctta ccatatagat aatgtatcct tgtactatga1506
gattttgggt gtgtttgata ccaaggaaaa tgtttatttg gaaaacaatt ggatttttaa1566tttatttttt cttgtttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 16092102211381212PRT213番茄屬種(Lycopersicon sp.)220
223DHS4002Met Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Ser Ile Met Asp Ser Val Arg Ser Val1 5 10 15Val Phe Lys Glu Ser Glu Asn Leu Glu Gly Ser Cys Thr Lys Ile Glu20 25 30Gly Tyr Asp Phe Asn Lys Gly Val Asn Tyr Ala Glu Leu Ile Lys Ser35 40 45Met Val Ser Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp Ala Ile Ala50 55 60Ile Val Asn Gln Met Leu Asp Trp Arg Leu Ser His Glu Leu Pro Thr65 70 75 80Glu Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asp Val Ala Tyr Arg Glu Ser Val85 90 95Thr Cys Lys Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly100 105 110Val Arg Asp Thr Val Arg Tyr Leu Val Gln His Arg Met Val Asp Val115 120 125Val Val Thr Thr Ala Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu130 135 140Ala Pro Thr Tyr Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Ser Leu Arg145 150 155 160Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn165 170 175Tyr Cys Lys Phe Glu Asn Trp Ile Ile Pro Val Phe Asp Gln Met Tyr
180 185 190Glu Glu Gln Ile Asn Glu Lys Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Val Ile195 200 205Ala Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asp Glu Thr Ser Tyr Leu Tyr Trp210 215 220Ala Tyr Lys Asn Arg Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly225 230 235 240Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Lys Lys Gly Asp Pro245 250 255Asp Asn Pro Asp Leu Asn Pro Gly Leu Val Ile Asp Ile Val Gly Asp260 265 270Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Gly Leu Arg Lys Thr275 280 285Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Val Cys Asn290 295 300Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Phe Ala Val Phe Ile Asn Thr305 310 315 320Ala Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala325 330 335Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Gly Ala Lys Thr Val Lys Val His340 345 350Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Ile Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala355 360 365Ala Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gln Ile Arg Cys Gln Val370 375 380210321124212DNA213人工序列220
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223人工序列說明引物4004gactgcagtc gacatcgatt tttttttttt tttt 3421052112272212DNA213擬南芥屬種(Arabidopsis sp.)220
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ttg aag cta gat tgg aga ctg gct gat gaa act aca gta gct gaa gac 407Leu Lys Leu Asp Trp Arg Leu Ala Asp Glu Thr Thr Val Ala Glu Asp75 80 85tgt agt gaa gag gag aag aat cca tcg ttt aga gag tct gtc aag tgt 455Cys Ser Glu Glu Glu Lys Asn Pro Ser Phe Arg Glu Ser Val Lys Cys90 95 100aaa atc ttt cta ggt ttc act tca aat ctt gtt tca tct ggt gtt aga 503Lys Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Val Arg105 110 115gat act att cgt tat ctt gtt cag cat cat atg gtttgtgatt tttgctttat 556Asp Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His Met120 125caccctgctt ttttatagat gttaaaattt tcgagcttta gttttgattt caatggtttt 616tctgcag gtt gat gtt ata gtc acg aca act ggt ggt gtt gag gaa gat 665Val Asp Val Ile Val Thr Thr Thr Gly Gly Val Glu Glu Asp130 135 140ctc ata aaa tgc ctt gca cct aca ttt aaa ggt gat ttc tct cta cct 713Leu Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro145 150 155gga gct tat tta agg tca aag gga ttg aac cga att ggg aat ttg ctg 761Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu160 165 170 175gtt cct aat gat aac tac tgc aag ttt gag gat tgg atc att ccc atc 809Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro Ile180 185 190ttt gac gag atg ttg aag gaa cag aaa gaa gag gtattgcttt atctttcctt 862Phe Asp Glu Met Leu Lys Glu Gln Lys Glu Glu195 200tttatatgat ttgagatgat tctgtttgtg cgtcactagt ggagatagat tttgattcct 922ctcttgcatc attgacttcg ttggtgaatc cttctttctc tggtttttcc ttgtag 978aat gtg ttg tgg act cct tct aaa ctg tta gca cgg ctg gga aaa gaa 1026Asn Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly Lys Glu205 210 215atc aac aat gag agt tca tac ctt tat tgg gca tac aag gtatccaaaa 1075Ile Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys
220 225 230ttttaacctt tttagttttt taatcatcct gtgaggaact cggggattta aattttccgc1135ttcttgtggt gtttgtag atg aat att cca gta ttc tgc cca ggg tta aca 1186Met Asn Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr235 240gat ggc tct ctt ggg gat atg ctg tat ttt cac tct ttt cgt acc tct 1234Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg Thr Ser245 250 255ggc ctc atc atc gat gta gta caa ggtacttctt ttactcaata agtcagtgtg 1288Gly Leu Ile Ile Asp Val Val Gln260 265ataaatattc ctgctacatc tagtgcagga atattgtaac tagtagtgca ttgtagcttt1348tccaattcag caacggactt tactgtaagt tgatatctaa aggttcaaac gggagctagg1408agaatagcat aggggcattc tgatttaggt ttggggcact gggttaagag ttagagaata1468ataatcttgt tagttgttta tcaaactctt tgatggttag tctcttggta atttgaattt1528tatcacagtg tttatggtct ttgaaccagt taatgtttta tgaaca gat atc aga 1583Asp Ile Arggct atg aac ggc gaa gct gtc cat gca aat cct aaa aag aca ggg atg 1631Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys Lys Thr Gly Met270 275 280 285ata atc ctt gga ggg ggc ttg cca aag cac cac ata tgt aat gcc aat 1679Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn290 295 300atg atg cgc aat ggt gca gat tac gct gta ttt ata aac acc ggg caa 1727Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr Gly Gln305 310 315gaa ttt gat ggg agc gac tcg ggt gca cgc cct gat gaa gcc gtg tct 1775Glu Phe Asp Gly Set Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser320 325 330tgg ggt aaa att agg ggt tct gct aaa acc gtt aag gtc tgc ttt tta 1823Trp Gly Lys Ile Arg Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu335 340 345att tct tca cat cct aat tta tat ctc act cag tgg ttt tgagtacata 1872
Ile Ser Ser His Pro Asn Leu Tyr Leu Thr Gln Trp Phe350 355 360tttaatattg gatcattctt gcaggtatac tgtgatgcta ccatagcctt cccattgttg1932gttgcagaaa catttgccac aaagagagac caaacctgtg agtctaagac ttaagaactg1992actggtcgtt ttggccatgg attcttaaag atcgttgctt tttgatttta cactggagtg2052accatataac actccacatt gatgtggctg tgacgcgaat tgtcttcttg cgaattgtac2112tttagtttct ctcaacctaa aatgatttgc agattgtgtt ttcgtttaaa acacaagagt2172cttgtagtca ataatccttt gccttataaa attattcagt tccaacaaca cattgtgatt2232ctgtgacaag tctcccgttg cctatgttca cttctctgcg 22722106211362212PRT213擬南芥屬種(Arabidopsis sp.)4006Met Glu Asp Asp Arg Val Phe Ser Ser Val His Ser Thr Val Phe Lys1 5 10 15Glu Ser Glu Ser Leu Glu Gly Lys Cys Asp Lys Ile Glu Gly Tyr Asp20 25 30Phe Asn Gln Gly Val Asp Tyr Pro Lys Leu Met Arg Ser Met Leu Thr35 40 45Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Glu Ala Ile Asp Val Val Asn50 55 60Gln Met Phe Glu Phe Val Leu Lys Leu Asp Trp Arg Leu Ala Asp Glu65 70 75 80Thr Thr Val Ala Glu Asp Cys Ser Glu Glu Glu Lys Asn Pro Ser Phe85 90 95Arg Glu Ser Val Lys Cys Lys Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu100 105 110Val Ser Ser Gly Val Arg Asp Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His115120 125Met Val Asp Val Ile Val Thr Thr Thr Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu
130 135 140Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly145 150 155 160Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val165 170 175Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe180 185 190Asp Glu Met Leu Lys Glu Gln Lys Glu Glu Asn Val Leu Trp Thr Pro195 200 205Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asn Glu Ser Ser210 215 220Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Met Asn Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly225 230 235 240Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg245 250 255Thr Ser Gly Leu Ile Ile Asp Val Val Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn260 265 270Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu275 280 285Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn Met Met Arg290 295 300Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr Gly Gln Glu Phe Asp305 310 315 320Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys325 330 335Ile Arg Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu Ile Ser Ser340 345 350His Pro Asn Leu Tyr Leu Thr Gln Trp Phe355 360210721119212DNA213人工序列
220
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223人工序列說明引物4008ggtgcacgcc ctgatgaagc 2021092111660212DNA213石竹屬種(Dianthus sp.)220
223DHS220
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aag att gag ggt tat gat ttt aat caa ggt gta aac tat tcc aaa ctc 387Lys Ile Glu Gly Tyr Asp Phe Asn Gln Gly Val Asn Tyr Ser Lys Leu30 35 40ttg caa tct ttc gct tct aat ggg ttt caa gcc tcg aat ctt gga gat 435Leu Gln Ser Phe Ala Ser Asn Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp45 50 55 60gcc att gaa gta gtt aat cat atg cta gat tgg agt ctg gca gat gag 483Ala Ile Glu Val Val Asn His Met Leu Asp Trp Ser Leu Ala Asp Glu65 70 75gca cct gtg gac gat tgt agc gag gaa gag agg gat cct aaa ttc aga 531Ala Pro Val Asp Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asp Pro Lys Phe Arg80 85 90gaa tct gtg aag tgc aaa gtg ttc ttg ggc ttt act tca aat ctt att 579Glu Ser Val Lys Cys Lys Val Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Ile95 100 105tcc tct ggt gtt cgt gac aca att cgg tat ctc gtg caa cat cat atg 627Ser Ser Gly Val Arg Asp Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His Met110 115 120gtt gac gtg ata gta acg aca acc gga ggt ata gaa gaa gat cta ata 675Val Asp Val Ile Val Thr Thr Thr Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu Ile125 130 135 140aaa gga aga tcc atc aag tgc ctt gca ccc act ttc aaa ggc gat ttt 723Lys Gly Arg Ser Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe145 150 155gcc tta cca gga gct caa tta cgc tcc aaa ggg ttg aat cga att ggt 771Ala Leu Pro Gly Ala Gln Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly160 165 170aat ctg ttg gtt ccg aat gat aac tac tgt aaa ttt gag gat tgg atc 819Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile175 180 185att cca att tta gat aag atg ttg gaa gag caa att tca gag aaa atc 867Ile Pro Ile Leu Asp Lys Met Leu Glu Glu Gln Ile Ser Glu Lys Ile190 195 200tta tgg aca cca tcg aag ttg att ggt cga tta gga aga gaa ata aac 915Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Ile Gly Arg Leu Gly Arg Glu Ile Asn205 210 215 220
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223DHS40010Met Glu Asp Ala Asn His Asp Ser Val Ala Ser Ala His Ser Ala Ala1 5 10 15Phe Lys Lys Ser Glu Asn Leu Glu Gly Lys Ser Val Lys Ile Glu Gly20 25 30Tyr Asp Phe Asn Gln Gly Val Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Gln Ser Phe35 40 45Ala Ser Asn Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp Ala Ile Glu Val50 55 60Val Asn His Met Leu Asp Trp Ser Leu Ala Asp Glu Ala Pro Val Asp65 70 75 80Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asp Pro Lys Phe Arg Glu Ser Val Lys85 90 95Cys Lys Val Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Ile Ser Ser Gly Val100 105 110Arg Asp Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His Met Val Asp Val Ile115 120 125Val Thr Thr Thr Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu Ile Lys Gly Arg Ser130 135 140Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ala Leu Pro Gly145 150 155 160Ala Gln Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val165 170 175Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro Ile Leu180 185 190
Asp Lys Met Leu Glu Glu Gln Ile Ser Glu Lys Ile Leu Trp Thr Pro195 200 205Ser Lys Leu Ile Gly Arg Leu Gly Arg Glu Ile Asn Asp Glu Ser Ser210 215 220Tyr Leu Tyr Trp Ala Phe Lys Asn Asn Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly225 230 235 240Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg245 250 255Asn Pro Gly Leu Ile Val Asp Val Val Gln Asp Ile Arg Ala Val Asn260 265 270Gly Glu Ala Val His Ala Ala Pro Arg Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu275 280 285Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn Met Met Arg290 295 300Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr Ala Glu Glu Phe Asp305 310 315 320Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Ile Ser Trp Gly Lys325 330 335Ile Ser Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile340 345 350Ala Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala Lys Arg Glu Lys355 360 365Glu Arg Lys Ser Cys37021011211780212DNA213番茄屬種(Lycopersicon sp.)220
223eif-5A220
221CDS222(43)..(522)
40011aaagaatcct agagagagaa agggaatcct agagagagaa gc atg tcg gac gaa54Met Ser Asp Glu1gaa cac cat ttt gag tca aag gca gat gct ggt gcc tca aaa act ttc 102Glu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala Ser Lys Thr Phe5 10 15 20cca cag caa gct gga acc atc cgt aag aat ggt tac atc gtt atc aaa 150Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr Ile Val Ile Lys25 30 35ggc cgt ccc tgc aag gtt gtt gag gtc tcc act tca aaa act gga aaa 198Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys40 45 50cac gga cat gct aaa tgt cac ttt gtg gca att gac att ttc aat gga 246His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile Phe Asn Gly55 60 65aag aaa ctg gaa gat atc gtt ccg tcc tcc cac aat tgt gat gtg cca 294Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys Asp Val Pro70 75 80cat gtt aac cgt acc gac tat cag ctg att gat atc tct gaa gat ggt 342His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser Glu Asp Gly85 90 95 100ttt gtc tca ctt ctt act gaa agt gga aac acc aag gat gac ctc agg 390Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Ser Gly Asn Thr Lys Asp Asp Leu Arg105 110 115ctt ccc acc gat gaa aat ctg ctg aag cag gtt aaa gat ggg ttc cag 438Leu Pro Thr Asp Glu Asn Leu Leu Lys Gln Val Lys Asp Gly Phe Gln120 125 130gaa gga aag gat ctt gtg gtg tct gtt atg tct gcg atg ggc gaa gag 486Glu Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met Gly Glu Glu135 140 145cag att aac gcc gtt aag gat gtt ggt acc aag aat tagttatgtc532Gln Ile Asn Ala Val Lys Asp Val Gly Thr Lys Asn150 155 160atggcagcat aatcactgcc aaagctttaa gacattatca tatcctaatg tggtactttg 592
atatcactag attataaact gtgttatttg cactgttcaa aacaaaagaa agaaaactgc 652tgttatggct agagaaagta ttggctttga gcttttgaca gcacagttga actatgtgaa 712aattctactt tttttttttt gggtaaaata ctgctcgttt aatgttttgc aaaaaaaaaa 772aaaaaaaa 78021012211160212PRT213番茄屬種(Lycopersicon sp.)220
223eif-5A40012Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala1 5 10 15Ser Lys Thr Phe Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr20 25 30Ile Val Ile Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser35 40 45Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp50 55 60Ile Phe Asn Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn65 70 75 80Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile85 90 95Ser Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Ser Gly Asn Thr Lys100 105 110Asp Asp Leu Arg Leu Pro Thr Asp Glu Asn Leu Leu Lys Gln Val Lys115 120 125Asp Gly Phe Gln Glu Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala130 135 140Met Gly Glu Glu Gln Ile Asn Ala Val Lys Asp Val Gly Thr Lys Asn145 150 155 160
21013211812212DNA213石竹屬種(Dianthus sp.)220
223eif-5A220
221CDS222(67)..(546)40013ctcttttaca tcaatcgaaa aaaaattagg gttcttattt tagagtgaga ggcgaaaaat 60cgaacg atg tcg gac gac gat cac cat ttc gag tca tcg gcc gac gcc108Met Ser Asp Asp Asp His His Phe Glu Ser Ser Ala Asp Ala1 5 10gga gca tcc aag act tac cct caa caa gct ggt aca atc cgc aag agc 156Gly Ala Ser Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Ser15 20 25 30ggt cac atc gtc atc aaa aat cgc cct tgc aag gtg gtt gag gtt tct 204Gly His Ile Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser35 40 45acc tcc aag act ggc aag cac ggt cat gcc aaa tgt cac ttt gtt gcc 252Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala50 55 60att gac att ttc aac ggc aag aag ctg gaa gat att gtc ccc tca tcc 300Ile Asp Ile Phe Asn Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser65 70 75cac aat tgt gat gtt cca cat gtc aac cgt gtc gac tac cag ctg ctt 348His Asn Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Val Asp Tyr Gln Leu Leu80 85 90gat atc act gaa gat ggc ttt gtt agt ctg ctg act gac agt ggt gac 396Asp Ile Thr Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Asp95 100 105 110acc aag gat gat ctg aag ctt cct gct gat gag gcc ctt gtg aag cag 444Thr Lys Asp Asp Leu Lys Leu Pro Ala Asp Glu Ala Leu Val Lys Gln115 120 125
atg aag gag gga ttt gag gcg ggg aaa gac ttg att ctg tca gtc atg 492Met Lys Glu Gly Phe Glu Ala Gly Lys Asp Leu Ile Leu Ser Val Met130 135 140tgt gca atg gga gaa gag cag atc tgc gcc gtc aag gac gtt agt ggt 540Cys Ala Met Gly Glu Glu Gln Ile Cys Ala Val Lys Asp Val Ser Gly145 150 155ggc aag tagaagcttt tgatgaatcc aatactacgc ggtgcagttg aagcaatagt596Gly Lys160aatctcgaga acattctgaa ccttatatgt tgaattgatg gtgcttagtt tgttttggaa 656atctctttgc aattaagttg taccaaatca atggatgtaa tgtcttgaat ttgttttatt 716tttgttttga tgtttgctgt gattgcatta tgcattgtta tgagttatga cctgttataa 776cacaaggttt tggtaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 81221014211160212PRT213石竹屬種(Dianthus sp.)220
223eif-5A40014Met Ser Asp Asp Asp His His Phe Glu Ser Ser Ala Asp Ala Gly Ala1 5 10 15Ser Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Ser Gly His20 25 30Ile Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser35 40 45Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp50 55 60Ile Phe Asn Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn65 70 75 80Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Val Asp Tyr Gln Leu Leu Asp Ile85 90 95
Thr Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Asp Thr Lys100 105 110Asp Asp Leu Lys Leu Pro Ala Asp Glu Ala Leu Val Lys Gln Met Lys115 120 125Glu Gly Phe Glu Ala Gly Lys Asp Leu Ile Leu Ser Val Met Cys Ala130 135 140Met Gly Glu Glu Gln Ile Cys Ala Val Lys Asp Val Ser Gly Gly Lys145 150 155 16021015211702212DNA213擬南芥屬種(Arabidopsis sp.)220
223eif-5A220
221CDS222(56)..(529)40015ctgttaccaa aaaatctgta ccgcaaaatc ctcgtcgaag ctcgctgctg caacc atg 58Met1tcc gac gag gag cat cac ttt gag tcc agt gac gcc gga gcg tcc aaa 106Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser Lys5 10 15acc tac cct caa caa gct gga acc atc cgt aag aat ggt tac atc gtc 154Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr Ile Val20 25 30atc aaa aat cgt ccc tgc aag gtt gtt gag gtt tca acc tcg aag act 202Ile Lys Asn Arg Prc Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr35 40 45ggc aag cat ggt cat gct aaa tgt cat ttt gta gct att gat atc ttc 250Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile Phe50 55 60 65acc agc aag aaa ctc gaa gat att gtt cct tct tcc cac aat tgt gat 298
Thr Ser Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys Asp70 75 80gtt cct cat gtc aac cgt act gat tat cag ctg att gac att tct gaa 346Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser Glu85 90 95gat gga tat gtc agt ttg ttg act gat aac ggt agt acc aag gat gac 394Asp Gly Tyr Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Ser Thr Lys Asp Asp100 105 110ctt aag ctc cct aat gat gac act ctg ctc caa cag atc aag agt ggg 442Leu Lys Leu Pro Asn Asp Asp Thr Leu Leu Gln Gln Ile Lys Ser Gly115 120 125ttt gat gat gga aaa gat cta gtg gtg agt gta atg tca gct atg gga 490Phe Asp Asp Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met Gly130 135 140 145gag gaa cag atc aat gct ctt aag gac atc ggt ccc aag tgagactaac539Glu Glu Gln Ile Asn Ala Leu Lys Asp Ile Gly Pro Lys150 155aaagcctccc ctttgttatg agattcttct tcttctgtag gcttccatta ctcgtcggag 599attatcttgt ttttgggtta ctcctatttt ggatatttaa acttttgtta ataatgccat 659cttcttcaac cttttccttc tagatggttt ttatacttct tct 70221016211158212PRT213擬南芥屬種(Arabidopsis sp.)220
223eif-5A40016Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser1 5 10 15Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr Ile20 25 30Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys35 40 45Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile
50 55 60Phe Thr Ser Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys65 70 75 80Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser85 90 95Glu Asp Gly Tyr Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Ser Thr Lys Asp100 105 110Asp Leu Lys Leu Pro Asn Asp Asp Thr Leu Leu Gln Gln Ile Lys Ser115 120 125Gly Phe Asp Asp Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met130 135 140Gly Glu Glu Gln Ile Asn Ala Leu Lys Asp Ile Gly Pro Lys145 150 1552101721120212DNA213人工序列220
223人工序列說明引物40017aaarrycgmc cytgcaaggt202101821117212DNA213人工序列220
223人工序列說明引物40018aatacgactc actatag 172101921120
212DNA213人工序列220
223人工序列說明引物220
223″n″ bases represent a，t，c，g，other or unknown40019tcyttnccyt cmkctaahcc 202102021117212DNA213人工序列220
223人工序列說明引物40020attaaccctc actaaag172102121122212DNA213人工序列220
223人工序列說明引物40021ctgttaccaa aaaatctgta cc 222102221121212DNA213人工序列220
223人工序列說明引物40022agaagaagta taaaaaccat c 21
2102321123212DNA213人工序列220
223人工序列說明引物40023aaagaatcct agagagagaa agg 232102421118212DNA213人工序列220
223人工序列說明引物40024ttttacatca atcgaaaa 182102521123212DNA213人工序列220
223人工序列說明引物40025accaaaacct gtgttataac tcc 2321026211581212DNA213擬南芥屬種(Arabidopsis sp.)220
223DHS220
221CDS222(1)..(579)
40026ggt ggt gtt gag gaa gat ctc ara aaa tgc ctt gca cct aca ttt aaa 48Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys1 5 10 15ggt gat ttc tct cta cct gga gct tat tta agg tca aag gga ttg aac 96Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn20 25 30cga att ggg aat ttg ctg gtt cct aat gat aac tac tgc aag ttt gag 144Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu35 40 45gat tgg atc att ccc atc ttt gac gag atg ttg aag gaa cag aaa gaa 192Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe Asp Glu Met Leu Lys Glu Gln Lys Glu50 55 60gag aat gtg ttg tgg act cct tct aaa ctg tta gca cgg ctg gga aaa 240Glu Asn Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly Lys65 70 75 80gaa atc aac aat gag agt tca tac ctt tat tgg gca tac aag atg aat 288Glu Ile Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Met Asn85 90 95att cca gta ttc tgc cca ggg tta aca gat ggc tct ctt agg gat atg 336Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Arg Asp Met100 105 110ctg tat ttt cac tct ttt cgt acc tct ggc ctc atc atc gat gta gta 384Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg Thr Ser Gly Leu Ile Ile Asp Val Val115 120 125caa gat atc aga gct atg aac ggc gaa gct gtc cat gca aat cct aaa 432Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys130 135 140aag aca ggg atg ata atc ctt gga ggg ggc ttg cca aag cac cac ata 480Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile145 150 155 160tgt aat gcc sat atg atg cgc aat ggt gca gat tac gct gta ttt ata 528Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile165 170 175aac acc ggg caa gaa ttt gat ggg agc gac tcg ggt gca cgc cct gat 576Asn Thr Gly Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp
180185190gaa gc 581Glu21027211522212DNA213石竹屬種(Dianthus sp.)220
223DHS220
221CDS222(3)..(521)40027ga aga tcc atc aag tgc ctt gca ccc act ttc aaa ggc gat ttt gcc47Arg Ser Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ala1 5 10 15tta cca gga gct caa tta cgc tcc aaa ggg ttg aat cga att ggt aat 95Leu Pro Gly Ala Gln Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn20 25 30ctg ttg gtt ccg aat gat aac tac tgt aaa ttt gag gat tgg atc att 143Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile35 40 45cca att tta gat aag atg ttg gaa gag caa att tca gag aaa atc tta 191Pro Ile Leu Asp Lys Met Leu Glu Glu Gln Ile Ser Glu Lys Ile Leu50 55 60tgg aca cca tcg aag ttg att ggt cga tta gga aga gaa ata aac gat 239Trp Thr Pro Ser Lys Leu Ile Gly Arg Leu Gly Arg Glu Ile Asn Asp65 70 75gag agt tca tac ctt tac tgg gcc ttc aag aac aat att cca gta ttt 287Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Phe Lys Asn Asn Ile Pro Val Phe80 85 90 95tgc cca ggt tta aca gac ggc tca ctc gga gac atg cta tat ttt cat 335Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His100 105 110tct ttt cgc aat ccg ggt tta atc atc gat gtt gtg caa gat ata aga 383
Ser Phe Arg Asn Pro Gly Leu Ile Ile Asp Val Val Gln Asp Ile Arg115 120 125gca gta aat ggc gag gct gtg cac gca gcg cct agg aaa aca ggc atg 431Ala Val Asn Gly Glu Ala Val His Ala Ala Pro Arg Lys Thr Gly Met130 135 140att ata ctc ggt gga ggg ttg cct aag cac cac atc tgc aac gca aac 479Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn145 150 155atg atg aga aat ggc gcc gat tat gct gtt ttc atc aac acc g 522Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr160 165 1702102821124212DNA213人工序列220
223人工序列說明引物40028ttgargaaga tycatmaart gcct242102921123212DNA213人工序列220
223人工序列說明引物40029ccatcaaayt cytgkgcrgt gtt 2321030211484212DNA213擬南芥屬種(Arabidopsis sp.)220
223DHS
220
221CDS222(2)..(112)40030t gca cgc cct gat gaa gct gtg tct tgg ggt aaa att agg ggt tct gct 49Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Ser Ala1 5 10 15aaa acc gtt aag gtc tgc ttt tta att tct tca cat cct aat tta tat 97Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu Ile Ser Ser His Pro Asn Leu Tyr20 25 30ctc act cag tgg ttt tgagtacata tttaatattg gatcattctt gcaggtatac 152Leu Thr Gln Trp Phe35tgtgatgcta ccatagcctt cccattgttg gttgcagaaa catttgccac aaagagagac 212caaacctgtg agtctaagac ttaagaactg actggtcgtt ttggccatgg attcttaaag 272atcgttgctt tttgatttta cactggagtg accatataac actccacatt gatgtggctg 332tgacgcgaat tgtcttcttg cgaattgtac tttagtttct ctcaacctaa aatgatttgc 392agattgtgtt ttcgtttaaa acacaagagt cttgtagtca ataatccttt gccttataaa 452attattcagt tccaacaaaa aaaaaaaaaa aa 48421031211559212DNA213番茄屬種(Lycopersicon sp.)220
223DHS220
221CDS222(1)..(156)220
223″n″ bases represent a，t，c，g，other or unknown40031ggt gct cgt cct gat gaa gct gta tca tgg gga aag ata cgt ggt ggt 48Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Gly1 5 10 15
gcc aag act gtg aag gtg cat tgt gat gca acc att gca ttt ccc ata 96Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Ile20 25 30tta gta gct gag aca ttt gca gct aag agt aag gaa ttc tcc cag ata 144Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gln Ile35 40 45agg tgc caa gtt tgaacattga ggaagctgtc cttccgacca cacatatgaa 196Arg Cys Gln Val50ttgctagctt ttgaagccaa cttgctagtg tgcagcacca tttattctgc aaaactgact 256agagagcagg gtatattcct ctaccccgag ttagacgaca tcctgtatgg ttcaaattaa 316ttatttttct ccccttcaca ccatgttatt tagttctctt cctcttcgaa agtgaagagc 376ttagatgttc ataggttttg aattatgttg gaggttggtg ataactgact agtcctctta 436ccatatagat aatgtatcct tgtactatga gattttgggt gtgtttgata ccaaggaaaa 496atgtttattt ggaaaacaat tggattttta atttaaaaaa aattgnttaa aaaaaaaaaa 556aaa 55921032211193212PRT213擬南芥屬種(Arabidopsis sp.)220
223DHS40032Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys1 5 10 15Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn20 25 30Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu35 40 45Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe Asp Glu Met Leu Lys Glu Gln Lys Glu50 55 60
Glu Asn Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly Lys65 70 75 80Glu Ile Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Met Ash85 90 95Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Arg Asp Met100 105 110Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg Thr Ser Gly Leu Ile Ile Asp Val Val115 120 125Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys130 135 140Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile145 150 155 160Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile165 170 175Asn Thr Gly Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp180 185 190Glu21033211173212PRT213石竹屬種(Dianthus sp.)220
223DHS40033Arg Ser Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ala Leu1 5 10 15Pro Gly Ala Gln Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu20 25 30Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro35 40 45Ile Leu Asp Lys Met Leu Glu Glu Gln Ile Ser Glu Lys Ile Leu Trp50 55 60
Thr Pro Ser Lys Leu Ile Gly Arg Leu Gly Arg Glu Ile Asn Asp Glu65 70 75 80Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Phe Lys Asn Asn Ile Pro Val Phe Cys85 90 95Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser100 105 110Phe Arg Asn Pro Gly Leu Ile Ile Asp Val Val Gln Asp Ile Arg Ala115 120 125Val Asn Gly Glu Ala Val His Ala Ala Pro Arg Lys Thr Gly Met Ile130 135 140Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn Met145 150 155 160Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr165 1702103421137212PRT213擬南芥屬種(Arabidopsis sp.)220
223DHS40034Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Ser Ala1 5 10 15Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu Ile Ser Ser His Pro Asn Leu Tyr20 25 30Leu Thr Gln Trp Phe352103521152212PRT213番茄屬種(Lycopersicon sp.)220
223DHS40035Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Gly1 5 10 15Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Ile20 25 30Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gln Ile35 40 45Arg Cys Gln Val50
權利要求
1.一種分離的編碼衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA分子，其中，所述DNA分子能在高嚴格條件下與SEQ ID NO9的互補序列雜交，其前提是，所述DNA分子不具有SEQ ID NO5的序列。
2.一種編碼衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶的分離的DNA分子，其中，其中所述DNA分子具有SEQ ID NO9的核苷酸序列。
3.一種由能在高嚴格條件下與SEQ ID NO9雜交的核苷酸序列所編碼的分離的衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶。
4.如權利要求3的衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶，其中，所述脫氧海普賴氨酸合成酶具有SEQ ID NO10的胺基酸序列。
5.一種衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶的反義寡核苷酸，其中所述脫氧海普賴氨酸合成酶具有SEQ ID NO9的核苷酸序列，並且其中所述寡核苷酸在植物細胞中表達時抑制內源衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶基因的表達。
6.SEQ ID NO9的反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸在植物細胞中表達時抑制內源衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶基因的表達。
7.如權利要求5或6的反義寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸包括大約6-100個核苷酸。
8.如權利要求5或6的反義寡核苷酸，其中，所述反義寡核苷酸互補於所述RNA轉錄物的5』非編碼區的相應部分。
9.如權利要求5或6的反義寡核苷酸，其中，所述反義寡核苷酸互補於所述RNA轉錄物的3』末端的相應部分。
10.如權利要求5或6的反義寡核苷酸，其中，所述反義寡核苷酸互補於擬南芥屬衰老誘導的DHS基因的3』末端。
11.如權利要求9的反義寡核苷酸，其中，所述反義寡核苷酸互補於SEQ ID NO30。
12.一種用於轉化植物細胞的載體，包括(a)權利要求6的反義核苷酸，和(b)可操作地連接於所述反義核苷酸序列上的調控序列。
13.一種用於轉化植物細胞的載體，包括(a)權利要求5的反義核苷酸序列，和(b)可操作地連接於所述反義核苷酸序列上的調控序列。
14.如權利要求12或13的載體，其中，所述調控序列包括一個啟動子和一個轉錄終止區。
15.如權利要求12或13的載體，其中，所述調控序列包括一個組成型啟動子。
16.如權利要求12或13的載體，其中，所述調控序列包括一個植物組織專一性啟動子。
17.如權利要求12或13的載體，其中，所述調控序列包括一個衰老誘導的植物啟動子。
18.如權利要求12或13的載體，其中，所述調控序列包括一個病毒啟動子。
19.如權利要求18的載體，其中，所述調控序列還包括一個組成型啟動子。
20.一種用於轉化植物細胞的載體，包括(a)一種編碼衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶的分離的DNA分子，其中，所述DNA分子能在高嚴格條件下與SEQ ID NO9的互補序列雜交；和(b)可操作地與所述DNA分子連接的調控序列。
21.一種用於轉化植物細胞的載體，包括(a)一種編碼衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶的分離的DNA分子，其中，所述DNA分子具有SEQ ID NO9的核苷酸序列；和(b)可操作地與所述DNA分子連接的調控序列。
22.一種用權利要求13、20或21中任一項的載體轉化過的細菌細胞。
23.一種用權利要求13、20或21中任一項的載體轉化過的植物細胞。
24.一種抑制植物中內源衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶表達的方法，該方法包括(1)將權利要求12或13的載體整合到植物基因組中；和(2)生長所述植物，以便所述反義核苷酸序列被轉錄並且結合在由內源衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶基因編碼的RNA序列上，從而抑制所述衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶基因的表達。
25.如權利要求24的方法，其中，所述反義核苷酸序列互補於SEQ IDNO30。
26.如權利要求24的方法，其中，所述抑制會導致植物衰老的改變。
27.如權利要求24的方法，其中，所述抑制會導致所述植物對環境脅迫誘導的和/或病原體誘導的衰老的抗性的增強。
28.如權利要求24的方法，其中，所述抑制會導致所述植物生物量的增加。
29.如權利要求24的方法，其中，所述抑制會導致所述植物果實變軟和腐爛的推遲。
30.如權利要求24的方法，其中，所述抑制會導致所述植物種子產量的增加。
31.如權利要求24的方法，其中，所述調控序列包括能在所述植物中起作用的組成型啟動子。
32.如權利要求24的方法，其中，所述調控序列包括能在所述植物中起作用的組織專一性啟動子。
33.如權利要求24的方法，其中，所述調控序列包括能在所述植物中起作用的衰老誘導的啟動子。
34.如權利要求24的方法，其中，所述植物選自下列一組結實植物、顯花植物、蔬菜、農業作物和林木。
35.如權利要求24的方法，其中，所述植物是番茄。
36.如權利要求24的方法，其中，所述植物是顯花植物。
37.一種抑制植物細胞中內源衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶基因表達的方法，該方法包括(1)將權利要求20或21的載體整合到植物的至少一個細胞的基因組中；和(2)生長所述植物，以便所述脫氧海普賴氨酸合成酶基因DNA分子超量表達，並且由外源衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶抑制內源衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶基因。
38.如權利要求37的方法，其中，所述調控序列包括一種組成型啟動子。
39.一種改變植物的與年齡相關的衰老和/或與環境脅迫相關的衰老的方法，該方法包括(1)將權利要求12或13的載體整合到植物基因組中；和(2)生長所述植物，以便所述反義核苷酸序列被轉錄並且結合在由內源衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶基因編碼的RNA序列上，從而抑制所述衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶基因的表達。
40.一種轉基因植物細胞，包括權利要求13、20、21中任一項的載體或所述載體的組合。
41.一種質粒，含有能在原核宿主中起作用的複製系統和權利要求5或6的反義寡核苷酸或多核苷酸。
42.一種質粒，含有能在農桿菌屬起作用的複製系統，和權利要求5或6的反義寡核苷酸或多核苷酸。
43.一種提高植物種子產量的方法，所述方法包括(1)將權利要求12或13的載體整合到植物基因組中；和(2)生長所述植物，以便所述反義核苷酸序列被轉錄並且結合在由內源衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶基因編碼的RNA序列上，從而抑制所述衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶基因的表達。
全文摘要
通過將編碼衰老誘導的脫氧海普賴氨酸合成酶、衰老誘導的eIF－5A的基因或基因片段或它們二者沿反義方向整合到植物基因組中，實現了對植物程序性細胞死亡的表達，包括衰老的調控。鑑定了編碼衰老誘導脫氧海普賴氨酸合成酶和衰老誘導的eIF－5A的植物基因，並將每一種基因的核苷酸序列單獨和組合用於改變轉基因植物的衰老。
文檔編號C12N7/00GK1624135SQ20041009620
公開日2005年6月8日 申請日期2000年7月6日 優先權日1999年7月6日
發明者J·E·湯普森, T·-W·王, D·L·盧 申請人:森尼斯科公司