引起緊密結構形成的肽的製作方法

2023-07-10 03:30:01

>肽底物*肽底物肽底物線性CGTIVTMEYRIDRTRSFC環[CGTIVTMEYRIDRTRSFC]EFLIVKS-Ci2b插入片段-EFLIVKS親本肽2150.2/2151.0親本肽2149.8/2150.5親本肽3775.2/3775.1CGTIVTMEY1016.3/1016.44c[CGTIVTMEYRIDRTRSFC]H2O2168.3/2168.5-於環中單一切割EFLIVKSVGTIVTMEY1828.6/1828.98RIDRTRSF1050.6/1050.58CGTIVTMEY1016.3/1016.44RIDRTRSFVEFLIVKS1965.1/1965.14RIDRTRSFC1152.6/1153.54RIDRTRSFC1153.3/1152.6EFLIV或VEFLI620.2/620.37CGTIVTMEYRIDRTRSF2048.2/2048.0RIDRTRSF1050.6/1050.58VEFLI或EFLIV620.1/620.37(第二峰二者均可能存在)CGTIVTMEYRIDRT1658.0/1658.0EYRIDRT952.4/952.49RSFVEF784.4/784.4CGTIVTM724.2/724.34KSVGTIVTM935.4/935.52EYRIDRTRSFC1444.9/1445.7EYRIDRT952.4/952.49VTMEYRIDRTRSF1673.8/1673.84MEYRIDRTRSFC1576.9/1576.74MEYRIDRT1083.6/1083.53TIMEYRIDRT1184.6/1184.57*呈現為肽片段/觀察到的單種同位素質量/預計的單種同位素質量實施例9利用受約束的環肽進行氘交換實驗通過溶解目的肽至pH5的水中，並在t=0時稀釋此肽10倍至D2O中進行氘交換實驗。對於最初的檢測構建體來說，稀釋於D2O後的肽濃度在10μM範圍內。對於其它的時間點，通過在0℃或25℃添加含1％甲酸的2.5倍過量1∶1H2O∶MeCN淬滅部分肽溶液試樣並立即注入質譜儀中。此酸性pH的升高減慢了用溶劑交換醯胺鍵中氫的速率。對於選定時間點，將注入頭2分鐘的質量與稍後2分鐘的質量比較，以評估回交的顯著性，它通常是1個質子或更少。可交換質子的總數用以下步驟得到1)最初溶解肽於DMSO中，淬滅前直接稀釋其於D2O中並在數分鐘後檢測肽的新質量；2)將溶解於5％DMSO的肽稀釋10倍至D2O中；或3)在100℃加熱稀釋於D2O中的肽溶液15分鐘。其中涉及DMSO，因為在預備實驗中將低水平的DMSO加入肽水溶液中似乎大大加速了質子的交換。用EFLIVKS-VGTIVTMEYRIDRTRSFV-EFLIVKS進行3種方法實驗，它們的結果相同。總交換質子的計算包括對稀釋於D2O中後存在的10％體積的H2O進行校正。對於1mM範圍內可溶的肽，來自pH5的10倍D2O溶液的樣品被直接注入質譜儀中，無需淬滅。通過將質量高於全質子化形式的增益隨時間的進程擬合成單指數函數，得到氘交換的速率常數和幅度。相對於暴露於表面的殘基，當它們埋藏於蛋白質內部(水不可接觸時)或包含於穩定的氫鍵中時，用氘化水進行的肽和蛋白質的醯胺主鏈質子交換將更慢[Englander等，蛋白質科學6:1101-1109(1997)]。質譜已用於檢查各種不同蛋白質的氫交換特性(見Chung等，蛋白質科學6:1316-24(1997)和Smith等，質譜雜誌32:135:146(1997)中最近的例子)，以及慢交換質子的存在已用於推斷三級結構的存在[McKnight等，分子生物學雜誌12:126-34(1996)]。此處的氘交換研究於pH5的條件下進行，因為在pH4.5以下受約束的環看起來不保持用園二色性測定的結構(參見下文)。為了檢測二聚作用肽受限制的Ci2b環肽的緊密度，測定通過稀釋至D2O中時摻入氘的速率和化學計量。多種不同構建體的結果總結於表4。表4．受約束的Ci2b肽插入片段和其它肽插入片段的氘交換速率和幅度11數據表示的是二聚化物-插入片段-二聚化物形式的肽；除如提到的之外，二聚化物序列在N-和C-末端是相同的。218mer標準插入片段是Ci2b序列-VGTIVTMEYRIDRTRSFV-3快階段幅度計算為最快的交換數據，最多持續約1小時測定氘交換構建體EFLIVKS-VGTIVTMEYRIDRTRSFV-EFLIVKS-醯胺中質子的動力學(數據未顯示)。通過完全的質子交換將總共66.5Da加到肽的零時刻質量中。在質子交換的快階段，交換了29個質子；如果暴露於水中，預計大約33個側鏈、N-和C-末端質子可在此pH被快速交換。另有16個質子以中等速率交換，速率常數為0.054/小時。這樣留下了21個質子，它們的交換被認為比以此時間標準可觀察到的更慢。來自與EFLIVKS中發現的質子最近鄰的兩類質子交換速率均慢於所檢測到的表面暴露質子交換速率[Bai等，蛋白質結構、功能和遺傳學67:75-86(1993)]。這些對照質子在pH5時以6-60/小時範圍內的速度常數被氘交換。對附著於18mer插入片段同一末端的反向二聚作用肽序列得到相似的結果。對此18mer插入片段，明顯更強的二聚作用肽EEFLIVKKS(表3)附著於插入片段的各端，還獲得相似的結果。在這種情況下，1小時內70個可交換質子中有39個被氚交換，8個質子的交換速率常數為0.15/小時，而餘下的23個質子交換得比這慢。此類似物中總共31個慢交換質子比親代肽的37個質子稍少，顯示在兩構建體間有一些細微的結構改變。對於具與親代肽N-端融合之賴氨酸6-甘氨酸4-的肽類似物(設計成增強肽的溶解力)，1小時內除約5個質子外幾乎交換所有質子。此N-端的融合體因此可使該結構不穩定或至少使其更易移動。通常位於此肽第4位的異亮氨酸側鏈在獲自高溫分子動力學軌跡(參閱下文)的低能構象體中似乎被埋於摺疊肽內。因此我們建立了在各二聚作用肽第4位的單點突變(得到EFLKVKS)，並通過氘交換檢測此突變對18mer插入片段的影響。如果此突變以重要方式破壞該結構，慢交換質子的數目可能會減少。在檢測氘交換動力學時，1小時內除1個質子外幾乎所有質子被交換。我們還檢查了當EFLIVKS或其類似物與這些插入片段兩端融合時，這些不同於Ci2b的插入片段對整個肽之交換動力學的影響。一插入片段STKSIPPQS代表了蛋白酶抑制劑環[CTKSIPPQC]的類似物[Gariani和Leatherbarrow，肽研究雜誌49:467-75(1997)]。在加熱時，此短構建體具有36個可交換質子，其中33個在1小時內交換。因此如果此肽具有摺疊結構，它應只包含一些慢交換質子。第二個插入片段包括旗幟表位標記(flagepitopetag)DYKDDDDK，為了提高其柔性，兩端側翼有4個甘氨酸，以便表位與抗旗幟標記抗體結合。將它與MGEFLIVKS-在N-端、與-EFLIVKSGPP在C-端融合。此肽具有36個可交換質子，其中35個在1小時內被交換。用流感紅凝素表位標記替代旗幟標記，合成由於存在7個甘氨酸而預期也有稍許柔韌性的相似構建體。在約1小時內所有的質子被交換成氘。因此短插入片段或在各端具多個甘氨酸以保證其柔韌性的插入片段不具有慢交換質子。實施例10肽構建體模型迄今為止測定的具慢交換質子的二聚作用肽構建體還未有在毫摩爾濃度範圍內可溶的，因此利用nmr進行結構測定不易完成。為了得到所選結構的工作模型，可大致與來自園二色性的二級結構內容相比，我們利用高溫分子動力學產生構象體[Brooks,Chem.Scripta29A:165-169(1989)；Bruccoleri和Karplus，生物聚合體29:1847-62(1990)；Auffinger和Wipff,J.Comput.Chem.11:190(1990)]，並隨後徹底最小化至能量等級不同的構象體。然後比較最低的5-7千卡/摩爾能量帶寬的構象體。此「淬滅分子動力學」的方法已用於一種腫瘤表面八肽和不同蛋白質的肽片段(Brooks，見上文)、吞噬作用激素及其環狀類似物[O』Connor等，J.Med.Chem.35:2870-81(1992)]，以及線性和環狀促黑激素[Al-Obeidi等，肽以及雜誌51:420-31(1998)]。同時此方法也已應用於諸如抗體高變環中70個殘基之類較大系統中[Bruccoleri和Karplus，生物聚合體29:1847-62(1990)]，對於這樣大的系統未產生足夠用於提供完全構象覆蓋度的構象異構體[Dill，生物化學24:1501-9(1985)]。因而當此方法應用於32mer肽時，將只能檢查一些預期的低能構象，從而只能獲得對整體摺疊的粗略認識。它仍可顯著覆蓋環18mer或兩線性7mer肽的構象空間。我們首先將此方法學應用於二硫鍵受限制的環18mer肽，環[CGTIVTMEYRIDRTRSFC]，它被認為是彈性蛋白酶和其它蛋白酶的亞nM抑制劑(Leatherbarrow和Salacinski，見上文)。對於此環肽作為與Ci2b具相似效力的抑制劑，推測它應具有與Ci2b抑制劑環相似的結構和剛性的低能構象體。在其游離狀態或與枯草桿菌蛋白酶Novo[MoPhalen和James，生物化學26:261-9(1987)]的複合體中，抑制劑環的整體主鏈大致是平面的，R65、R67和F69側鏈填充於環的內部。進入枯草桿菌蛋白酶結合位點內部的邊緣是一不規則的β摺疊，I56、T58、M59和Y61的側鏈伸展入溶液中或結合複合物的枯草桿菌蛋白酶中，當與枯草桿菌蛋白酶複合時M59的側鏈顯著地從溶液結構中彎曲出來。測定此天然環的結構和此環肽最小化構象異構體(兩個軌道，5.4ns,2700個結構)的能量分配(數據未顯示)。這大致是高斯形式的，如對於環促黑激素類似物所示一樣(Al-Obeidi等，見上文)。對模擬此環的環肽尋找到的低能構象體似乎比天然抑制劑環明顯地更緊密和球狀化(數據未顯示)，且它們對於18mer抑制劑環的主鏈原子均方根差分別為6.22、6.12、5.46、6.31、5.72、5.69和5.64埃。形成大部分枯草桿菌蛋白酶接觸區並圍繞抑制劑環活性位點(甲硫氨酸7-穀氨酸8)的殘基3-10相對於天然環中相同殘基的重原子均方根差分別為5.65、6.40、3.95、5.54、5.20、5.07和4.59埃。此外，R65、R67和F69的側鏈不埋入這些低能構象體任何之一的環區中。在與Ci2b抑制環比較時，這些結果與低能構象異構體顯著不同的結構一致。這些重要的結構差異符合未觀察到此環18mer肽對彈性蛋白酶的抑制作用的結果。其次，我們應用淬滅分子動力學來研究二聚化時EFLIVKS的低能構象體。這些氣相計算可能與質譜觀察到的肽二聚體低能形式尤其有關。通過大約在它們的質量中心將兩肽粘連起來，或在開始構象搜尋前將不同的平行和反向平行起始構象(見方法部分)在氣相中結合在一起，構建肽二聚體。總共運行7個軌道，包含5250個最小化結構和10.5ns(數據未顯示)，並進行來自所有軌道的14個最低能二聚體的主鏈重疊，包含最低的7千卡/摩爾能量帶寬(數據未顯示)。通過二聚作用肽之一的所有主鏈原子的最小平方重合完成這一點。兩肽似乎都採取轉角構象，但沿二聚體間軸並不對稱。除了將各構象異構體主鏈原子與每個其它構象異構體主鏈原子比較的、14個最低能構象異構體的一簇圖表外，還建立了RMSD偏差(A)(數據未顯示)。如果它們的RMSD差異在0-1埃範圍內，則兩構象異構體最為相似。看來存在一主要的低能構象異構體家族，以及數個其它的獨特構象(數據未顯示)。對於所有肽來說，在這些模擬中帶電荷的二聚體第一個肽的N-和C-末端似乎都與第二個肽的N-和C-末端接近。因為每個肽有兩個酸性和兩個鹼性基團，所以存在許多不同的二聚體內可能的離子對。檢測在所有14個低能構象異構體中的所有可能二聚體間離子對的距離顯示，最穩定的離子對是a)肽1肽2的N末端穀氨酸1側鏈羧基；b)肽1肽2的賴氨酸6ε-氨基穀氨酸1側鏈羧基；和c)肽2肽1C-末端賴氨酸6ε-氨基。所有的肽均在其自身N-和C-末端之間形成稍微穩定的分子內離子對。淬滅分子動力學還用於檢查在各端與EFLIVKS融合的Ci2b18mer檢測插入片段的低能結構(數據未顯示)。此肽對彈性蛋白酶相對惰性，具有37個慢交換質子，且用質譜觀察時未顯示更高級別的聚合體(數據未顯示)。從動力學軌道的12.3ns收集總共6900個不同的結構。這些結構以高斯形式分布(數據未顯示)。兩個構象異構體比所有其它的能量至少低7千卡/摩爾(數據未顯示)。兩構象異構體看來是緊密和球狀的，與以上其它實驗結果一致。正如用以上示範的EFLIVKS二聚體一樣，附著於18mer插入片段的各末端EFLIVKS看來形成了轉角，它們的N-和C-末端在3.8-4.3埃之間。不過，與EFLIVKS二聚體的結構不同，它們現與18mer插入片段融合的第二末端不繞回分子中心，而在兩構象異構體中分隔11.5-15埃。此距離顯著大於天然Ci2b結構(4.1埃)和環肽低能構象異構體(平均6.88埃)中的可比較距離，這顯示二聚作用肽，至少與此插入片段一起時，形成具相當寬基面的「環」。此18mer插入片段似乎還包含顯著比例的轉角結構，與園二色性測量一致。實施例11肽構建體的園二色性研究、NMR測量和肽構象搜尋園二色性測量在裝配有Peltier溫度控制裝置的AVIV62ADSCD分光偏振計(Lakewood,NJ,USA)上記錄CD光譜。用NeslabCFT-33冷卻循環水浴維持儀器溫度恆定於20℃以下。按製造商的推薦用(+)-10-樟腦磺酸的銨鹽周期性地校準設備。在25℃記錄250和195nm之間0.2nm間隔的光譜，時間常數是1s。從5次獨立的掃描中收集數據並用IBMPS/2計算機平均。光程0.1cm的圓筒形石英杯用於此光譜範圍內，所用的樣品濃度按胺基酸分析測定是0.02-0.05mM。除了指出之外，用含100mMKF的10mMKPO4緩衝液，pH7.5製備肽母液(1mM)。為了進行pH滴定實驗，在添加以上肽母液前，用0.1MHCl或0.1MNaOH將緩衝液的pH小心調到需要值。通過以下方程式獲得平均殘基橢圓率(MRE)，以deg.cm2.dmol-1表示MRE(λ)=(λ)/10/cn其中(λ)是波長λ時的橢圓率(以度表示)，1是光路長度(cm)，c是濃度(M)，而n是肽/蛋白質中的殘基數[Schmidt，蛋白質結構實用方法，IRL出版社，紐約，第251-285(1989)]。將收集自各個實驗的原始數據轉換成ASCII形式，並用MicrosoftExcel軟體包如前所述作圖[Gururaja和Levine，肽研究9:283-289(1996)]。從含20uM肽的樣品獲得熱變性數據(樣品溶於含100mMKF的10mMKPO4緩衝液，pH7.5)。在220nm4-98℃的範圍內測定熱變性，每步溫度提高2℃,2分鐘的平衡時間和60秒的信號平均時間。以220nm處的CD信號一次導數的最大值計算表觀Tm，為T-1。用軟體將CD光譜消卷積。用軟體Dichroprotv.2.4將CD光譜消卷積，該軟體使用了Johnson的可變選擇方法。NMR檢測用於NMR實驗的所有氘化溶劑，如D2O(99.96％D)和DC1(99.5％D)均購自CambridgeIsotopeLaboratories(Andover,MA)。通過將合成肽溶於0.7mlH2O:D2O90:10(v/v)或100％D2O中製備樣品(～1mM)。通過溶解HPLC純化肽並用HCl或DCl調節pH至4.0，製備水溶液樣品。室溫檢測所有的pH值；此處所報導的值是表觀pH值，並未為氘同位素作用而校正。TSP[3(三甲基甲矽烷基)丙-2,2,3,3-d4酸，鈉鹽]用作內部的化學轉移標準。在如前所述裝配有Sunsparcstation5的VarianUnityINOVA-500分光計上25℃進行1HNMR實驗[Naganagowda等，生物分子結構動力學雜誌16:91-107(1998)]。用超複數的方法[States等，J.Magn.Reson.,48:286-292(1982)]以純狀態吸收形式t1度積分檢測完成二維雙量子過濾相關光譜學(TwodimensionalDoubleQuantumFilteredCorrelatedSpectroscopy,DQF-COSY)[Rance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.117:479-485(1983)]、總相關光譜學(TotalCorrelationSpectroscopy,TOCSY)[Bax和Dayis,J.Magn.Reson.65:355-360(1985)]、迴轉臺極化增強光譜學(RotatingframeOverhauserenhancementSpectroscopy,ROESY)[Bothner-By等，J.Am.Chem.Soc.106:811-813(1984)]及核極化增強光譜學(NuclearOverhauserEnhancementSpectroscopy,NOESY)[Macura和Ernst，分子物理學41:95-117(1980)]實驗。載體被放於水中介中以使在NOESY實驗的弛豫延遲階段(1.5-2.5秒)和混合時間內水能被照射到。對於TOCSY光譜，MLEV-17序列被使用，自旋鎖閉時間(spinlocktime)是50-85毫秒。對於ROESY實驗使用200和250毫秒的自旋轉鎖閉時間，而對於NOESY，使用200和300毫秒的混合時間。各維的水中的1HNMR光譜具有5400Hz的光譜寬度。在D2O溶劑中，醯胺質子完全交換後，通過降低各維的光譜寬度至3000Hz記錄光譜。用1024或2048個據點得到256或512t1增量。通過溶解樣品於D2O中並立即記錄1D和TOCSY光譜而鑑定慢交換醯胺質子。為進行醯胺質子的溫度係數測定，在25-50℃間完成1D和TOCSY實驗，每步溫度變化5℃。對於DQF-COSY和TOCSY光譜一般收集16或32個掃描圖，對於ROESY和NOESY光譜收集64個掃描圖。在進行傅立葉變換前，自由感應衰減(freeinductiondecay,FID)在各維都零填充一次。為了加工DQF-COSY光譜，各維均使用變換90°的鐘形窗口正弦平方函數(squaredsine-bellwindowfunction)，而對於TOCSY、ROESY和NOESY光譜，使用變換90度和45度的鐘形窗口正弦平方函數對數據進行分別加工。從用水裡混合時間200毫秒獲得的2D-NOESY光譜中的NOE交叉峰(crosspeak)強度推斷結構測定的1H-1H距離。對於距離幾何學計算，通過比較交叉峰的體積計算質子間距離的範圍並分為三類，1.8-2.5埃(強)，2.5-3.5埃(中等)，3.5-5.0埃(弱)。從NMR研究中得到各殘基的鄰近偶聯常數3JNH-CαH並用於通過Karplus關係式估計可能的扭轉角度[Karplus，生物物理學雜誌30:11-15(1959)]:3JNH-CαH=Acos2θ-Bcosθ+C，其中-θ=｜Ф--60°｜。由文獻Pardi等，分子生物學雜誌180:741-751(1984)提出的A、B和C常數值分別是6.4、1.4和1.9。用於獲得構象數據的技術將只略述於此，因為這些已詳述於其它地方。來自NMR技術的構象描述純粹基於用高磁場強度下獲得的二維NMR數據進行的沿多肽鏈的扭轉角測定值。更具體地說，為了分配通過鍵偶聯的質子，進行TOCSY實驗。相繼的分配，例如Hα(ⅰ)-NH(i+1)，是基於NOESY和ROESY實驗，其中觀察到空間上密切接近相關性，這是構象的指示。肽構象搜索不同肽構建體的低能構象異構體產生如下。用InsightⅡ95.0(MolecularSimulationsInc.，聖地哥，CA)和cff91力場[Maple等，J.Comp.Chem.15:162-182(1994)]建立肽構建體的顯原子模型。肽被模擬為兩性離子，除N-末端氨基和C-末端羧基之外，賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸和穀氨酸也被完全離子化。通過利用線性距離依賴型介電常數模擬水性溶劑環境和平衡離子屏蔽的作用。時間步幅1fs的Verlet運算法則[Verlet,Phys.Rev.159:98-103(1967)]被用於對運動方程式積分；這是按Discover2.9.7的默認跳步算法(defaultleapfrogalgorithm)進行的。一15A的臨界值被用於非鍵的相互作用。用5千卡/摩爾/rad2的扭轉約束力受限制肽鍵在高溫下為反式構象。在動力學方法中，基於對Mackay等人[Mackey等，蛋白質結構的預測和蛋白質構象的原理，(Fasman，編輯；紐約，PlenumPress)第317-358頁(1989)]所寫的方法的修改，首先用300步最速下降法和1000步或如結合梯度最小化所需步驟數將起始肽結構最小化，以使最大能量偏差小於0.1千卡/A，從而去除分子構建中產生的高能結構。用dseed變量指定肽原子的隨機起始速率，並將肽在2ps的時間加熱到900K。繼續各個軌跡，時間變化從400ps-3ns，每1-2ps收集各個結構一次用於隨後的最小化作用。各收集的結構平衡於900K50fs，經5ps冷卻至300K，並用300步最速下降的運算法則將其最小化，然後用所需的步驟進行Fletcher-Reeves結合梯度最小化，以使最大能量偏差小於0.001千卡/摩爾/A。將各肽的最小化總能量對各5千卡/摩爾範圍內的構象異構體數目作圖。選擇最低能量以上5千卡/摩爾範圍內的構象異構體用於進一步的分析[O』Connor等，J.Med.Chem.35:2870-81(1992)]。不同肽的起始結構按如下步驟獲得。對於二聚化EFLIVKS，以平行或反平行方式排列伸展的結構，其中Ile4的Cγ1間距離約7A，得到4個不同的起始結構。當兩肽的異亮氨酸4之Cγ1間距離在1.5-12A範圍外時，用100千卡/摩爾的能量罰分將兩伸展結構(平行和反平行)粘連起來。對於推認的蛋白酶抑制劑環[CGTIVTMEYRIDRTRSFC]來說，起始結構是右手α螺旋和β摺疊的混合體，從而可在兩末端半胱氨酸間形成二硫鍵。第二輪循環以第一次結構的部分最小化形式開始。對於受肽二聚體約束的構建體EFLIVKS-VGTIVTMEYRIDRTRSFV-EFLIVKS來說，使用了幾種不同的起始結構。一種結構起始自18mer插入片段之以Ci2b為基礎的結構(PDB文件2CI2)，它是通過從晶體結構中除去除抑制環之外的所有殘基，並突變個別殘基產生Leatherbarrow和Salacinski(見上文)報導的18mer序列而得到的。伸展構象中的EFLIVKS融合於肽的各端並如上所述最小化所產生的構建體。第二種結構起始於作為β摺疊融合於18merCi2b插入片段各端的EFLIVKS。第三種結構起始於作為右手α螺旋融合於18merCi2b插入片段各端的EFLIVKS。第四種結構起始自整個構建體的伸展構象，第五種結構起始自部分不同的伸展構象。由整個構建體作為β摺疊起始第六個結構。既然此處研究的肽可以大大低於nmr結構測定所需之毫摩爾濃度的水平溶於中性或近中性pH中，我們用園二色性(CD)檢查它們的溶液結構。園二色性測定對肽和蛋白質的二級結構均靈敏，並已被廣泛用於檢測二者的構象[Bloemendal和Johnson,Pharm.Biotechnol.7:65-100(1995)；Woody，酶學方法246:34-71(1995)；Greenfield，生化分析235:1-10(1996)]。在此這些測定被用於檢測二級結構形成和穩定性的pH依賴性，比較不同二聚作用肽對插入片段結構的作用，檢查二聚作用肽中突變的影響，並查看不同插入片段序列對受二聚作用肽約束的環整體結構的作用。當這些測定與蛋白水解敏感性、氘交換和構象搜索的結果測定結合時，它們給出了整體結構和此處檢測的微環摺疊的信息。EFLIVKS二聚化的9mer插入片段檢測的第一個插入片段是EFLIVKS-STKSIPPQS-EFLIVKS。該9mer插入片段代表蛋白酶抑制劑環[CTKSIPPQC]的類似物(Gariani和Leatherbarrow，見上文)。記錄pH3.5-8.5之間的CD光譜(數據未顯示)。觀察二級結構的pH-依賴型轉換。pH3.5時，在201nm處可見具強最小值的二級結構。而此接近於195-197nm的預期隨機纏繞最小值[Greenfield和Fasman，生物化學8:4108-4116(1969)]，光譜的形狀也與短肽中觀察到的1型β轉角的光譜相似[Perczel等，Int.J.PeptideProtein41:223-236(1993)]。低pH結構的1H-NMR測定因為可在確定條件下觀察到許多其它插入片段的CD光譜，且因為此肽可很好地溶解於低pH，故我們用nmr檢查此結構。用標準的連續排列步驟完成在水中9mer插入片段之1H-NMR光譜的共振排列[wuthrich，《蛋白質和核酸的NMR》，紐約，Wiley-Interscience,pp166ff(1986)]。通過2D-TOCSY和2D-NOE光譜的聯合分析完成1H共振的排布。還在多種溫度(25-50℃)記錄2D-TOCSY光譜以分辨明確排布的重疊連通性，且還用於測定NH化學移動的溫度係數。通過記錄100％D2O中的光譜排布埋藏於水信號(在90％H2O中)下的共振。所有排布質子的化學移動列於表5中。NH化學轉移的溫度係數、醯胺基團的1H/2H交換速率、JNH-CαH值和一套特徵性的強、中等和弱NOE連通性已被用作標準檢查肽在水溶液中是否具有任何優選主鏈構象。發現所有醯胺共振的溫度係數是0.004ppm/K(數據未顯示)，表明主鏈NH基團暴露於溶劑中並不參與任何分子內氫鍵相互作用。因為對所有主鏈醯胺共振觀察到1H/2H交換速率較快，進一步顯示醯胺基團不參與任何分子內氫鍵。在缺乏任何可觀察到的dNNNOE相互作用情況下，強dαN(i,i+1)和弱dαN(i,i)NOE以及弱和中等dβ(i,i)和dαβ(i,i)NOE連續伸展的優勢表明主鏈二面角主要在Ф,ψ-空間的未摺疊伸展區[Rance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.117:479-485(1983)；Pardi等，分子生物學雜誌180:741-751(1984)]。除絲氨酸-7之外，對於所有殘基，表5中提供的JNH-CαH值均在6.5-8.4Hz範圍內。對於規則的β-鏈，預期JNH-CαH值為～9Hz，而對於α-螺旋則是～4.0Hz[Rance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.117:479-485(1983)；Pardi等，分子生物學雜誌180:741-751(1984)]。觀察到此肽偶聯常數為6.5-8.4Hz，顯示所具Ф值超過規則螺旋區、具可比較能量的未摺疊非氫鍵構象的存在。總之，NMR數據證實EFLIVKS-STKSIPPQS-EFLIVKS在水溶液中是未結構化的。表5．pH4.0時EFLIVKS-STKSIPPQS-EFLIVKS化學移動值的彙編pH4.5時，觀察到不同的二級結構，直至pH8.5它仍保持穩定。pH4.5-7.5時CD光譜在202nm處具有一弱很多的帶，表明了隨機螺旋有丟失。它們還在210-215nm處有一弱正性帶，及228-230nm附近有一負性帶，顯示存在β轉角[Brahms和Brahms，分子生物學138:149-178(1980)]。因為在pH5.0此構建體具有3個或更少個慢交換質子(表4)，肽在此pH可能是非摺疊的(即無三級結構)，但具有包含一些β轉角和明顯比pH3.5時更少的隨機纏繞的二級結構。或者，如果它摺疊並具有一些三級結構，主鏈是足夠可動的，以致無醯胺質子與溶劑隔離較長時間。當於225nm處觀察CD光譜時，pH7.5中存在的結構具有Tm為39.6+-1℃(數據未顯示)。EFLIVKS-VGTIVTMEYRIDRTRSFV-EFLIVKS用CD檢測的第二個構建體含Ci2b18mer插入片段，EFLIVKS-VGTIVTMEYRIDRTRSFV-EFLIVKS。測定此肽的CD光譜的pH依賴性(數據未顯示)。與以上測定的第一個肽不同，CD光譜不是pH依賴型的，且看來不具有大量的隨機纏繞。210nm附近的強最大值和225-230nm的強最小值符合在所有檢測轉角的pH值條件下的β轉角結構的顯著含量[Brahms和Brahms，分子生物學138:149-178(1980)]。在約200nm處觀察到的較小最小值與小百分比的隨機纏繞或Ⅱ型β轉角一致[Perczel等，Int.J.PeptideRes.41:223-236(1993)]。利用225nm處的信號，肽可隨溫度融化，Tm為39.85±1.6℃。具N-末端MG-和C-末端-GPP的構建體為了於活細胞中表達肽，將MG-加入許多肽構建體的N-末端，將-GPP加入C-末端，以阻斷細胞羧肽酶的蛋白水解[Vanhoof等，FASEBJ.9:736-44(1995)]。然後將這些肽的CD光譜在pH7.5時比較(數據未顯示)。完成對MGEFLIVKS-Ci2b插入片段-EFLIVKSGPP之CD光譜的pH依賴性測定(數據未顯示)，顯示與EFLIVKS-Ci2b插入片段-EFLIVKS相比，附加的5個殘基引起CD光譜顯著改變。208nm處的正帶不再清楚，而200nm處的負帶已消失。225nm附近的主要最小值(一些β轉角結構的特性)保留。因而這5個殘基的添加看來引起了明顯的構象改變，但不是結構的打開。其它插入片段序列的加入也導致了相當不同的CD光譜。由帶甘氨酸間隔子之旗幟表位標記-G4DYKDDDDKG4-組成的插入片段，設計成可用Western印跡探測細胞中的表達肽，得到含約202nm處的最小值和約220nm處的小最小值的CD光譜(數據未顯示)。基於此光譜與EFLIVKS-STKSIPPQS-EFLIVKS光譜的相似性，此肽在pH3.5-8.5時似乎主要是隨機纏繞。此構建體不具有慢交換質子，與其未摺疊結構一致。由帶甘氨酸間隔子之流感血凝素表位標記-G4YPYDVPDYASLG3-組成的插入片段的CD光譜在205-207nm處有最小值，在約220nm處有第二個較小的最小值(數據未顯示)。這可能是由於一些二級結構的不同組成，且可包括一些α螺旋(由於在205-207nm處的最小值)以及隨機纏繞或β轉角。因為此構建體也不具有慢交換質子(表4)，故此CD光譜可能反映只有二級結構的存在。對EFLIVKS序列的其它添加測定EFLIVKS序列中的突變對Ci2b膚插入片段CD光譜的影響(數據未顯示)。肽EEFLIVKKS-Ci2b肽插入片段-EEFLIVKKS尤其令人感興趣，因為它具有23個慢交換質子和8個中速交換質子(表4)，因而可能具有三級結構，還因為此二聚作用肽可能具有比EFLIVKS稍高的自親和力。除了它在202nm處的最小值缺少，在210nm處的最大值(對照肽)變成更近207nm外，它的CD光譜與對照肽相似。此肽看來具有β轉角結構和少於對照肽的隨機纏繞。為了提高結構的溶解性，將賴氨酸加入具甘氨酸間隔子的N-末端。至於構建體K6G4-EFLIVKS-Ci2b肽插入片段-EFLIVKS，得到與對照肽很不相同的CD光譜，在約220nm處有一寬的最小值(數據未顯示)。此光譜看來不是任一主要二級結構的特性，但可被消卷積成β摺疊和β轉角(58％)、α螺旋(14％)和餘下的隨機纏繞的混合體。既然此結構具有最多5個慢交換質子(表4)，加入N-末端的附加殘基似乎動搖了對照肽的三級結構，而產生了不同的二級結構。EFLIVKS序列中的突變在pH7.0檢測二聚作用肽序列的3個電荷改變。其中一種肽是在二聚作用肽之間轉換單個賴氨酸和穀氨酸，得到KFLIVKS-Ci2b插入片段-EFLIVES。第二種肽是將各二聚作用肽中的穀氨酸突變成賴氨酸，得到KFLIVKS-Ci2b插入片段-KFLIVKS。第三種肽是將各二聚作用肽中的賴氨酸突變成穀氨酸，得到EFLIVES-Ci2b插入片段-EFLIVES。各肽具有與對照肽EFLIYKS-Ci2b插入片段-EFLIVKS相似的CD光譜(數據未顯示)。在第二套突變中，二聚作用肽的疏水特性被改變。首先，兩EFLIVKS序列中的F2和I4突變成賴氨酸或絲氨酸，使Ci2b插入片段各末端的二聚作用肽序列為EKLKVKS或ESLSVKS。這導致CD光譜發生較大改變，在202-205nm處有大負帶出現，顯示隨機纏繞結構顯著增加，或變性(數據未顯示)。其次，在各二聚作用肽中只有I4突變成賴氨酸。這也以相似方式改變了CD光譜(數據未顯示)。此構建體最多具有1-2個慢交換質子，表明EFLIVKS序列疏水核心中的此單個改變足以破壞整個肽構建體的結構。序列表110RigelPharmaceuticals,Inc.120引起緊密結構形成的肽130FP-66103-1/DJB/RMS/SJR140PCT/US/99/073741411999-04-0215060/080,4441511998-04-02160150170PatentInVer.2.0210121111212PRT213水螅4001GluProProGlyGlySerLysValIleLeuPhe151021022116212PRT213水螅4002SerLysValIleLeuPhe1521032114212PRT213水螅4003ValIleLeuPhe121042117212PRT213水螅4004GluProProGlyGlySerLys1521052115212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的4005PheLeuIleValLys1521062117212PRT213人工序列220223人工序列描述220223人工序列描述合成的4006GluPheLeuIleValLysSer1521072117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的4007LysPheValLeuIleLysSer1521082117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的4008ValSerIleLysPheGluLeu1521092115212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的4009LeuIleValLysSer15210102116212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40010GluPheLeuIleValLys15210112116212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40011LysPheLeuIleValLys15210122117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40012PheGluSerIleLysValLeu15210132117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40013LeuLysSerIleValGluPhe15210142117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40014SerLysValIleLeuPheGlu152101521118212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40015CysGlyThrIleValThrMetGluTyrArgIleAspArgThrArgSer151015PheCys2101621132212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40016GluPheLeuIleValLysSerValGlyThrIleValThrMetGluTyr151015ArgIleAspArgThrArgSerPheValGluPheLeuIleValLysSer202530210172115212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的220221位點222(1)..(4)223X可以是A,V,I,L,W,F,M和Y.220221位點222(5)223X可以是K,R,D或E.40017XaaXaaXaaXaaXaa15210182115212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40018PheLeuIleValLys15210192116212PRT213人工序列220221位點222(1)223X可以是D,E,K或B.220230人工序列描述合成的40019XaaPheLeuIleValLys15210202116212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40020PheLeuIleValLysSer15210212117212PRT213人工序列221位點222(1)223x可以是Z,E,D或R.220223人工序列描述合成的40021XaaPheLeuIleValLysSer15210222117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40022LysPheLeuIleValLysSer15210232119212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40023GluGluPheLeuIleValLysLysSer15210242117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40024ValSerIleLysPheGluLeu15210252117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40025AlaPheLeuIleValLysSer15210262117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40026GluAlaLeuIleValLysSer15210272117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40027GluPheAlaIleValLysSer15210282117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40028GluPheLeuAlaValLysSer15210292117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40029GluPheLeuIleAlaLysSer15210302117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40030GluPheLeuIleValAlaSer15210312117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40031GluPheLeuIleValLysAla15210322117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40032GluPheLeuLysValLysSer15210332117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40033SerLysValIleLeuPheGlu15210342117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40034GluPheLeuIleValGluSer15210352117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40035ValSerIleLysPheGluLeu15210362117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40036PheGluSerIleLysValLeu15210372117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40037LeuLysSerIleValGluPhe15210382114212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40038ProProGlyGly1210392115212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40039GlySerGlyGlySer15210402114212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40040GlyGlyGlySer12104121117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的220221位點222(8)..(10)223x可以是任何胺基酸40041GluPheLeuIleValLysSerXaaXaaXaaGluPheLeuIleValLys151015Ser2104221116212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的220221位點222(7)..(9)223x可以是任何胺基酸40042LysValLeuIleLysSerXaaXaaXaaGluPheLeuIleValGluSer1510152104321117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的220221位點222(8)..(10)223x可以是任何胺基酸40043ValSerIleLysPheGluLeuXaaXaaXaaValSerIleLysPheGlu151015Leu2104421113212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的220221位點222(6)..(8)223x可以是任何胺基酸40044LeuIleValLysSerXaaXaaXaaLeuIleValLysSer15102104521115212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的220221位點222(7)..(9)223x可以是任何胺基酸40045GluPheLeuIleValLysXaaXaaXaaGluPheLeuIleValLys1510152104621117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的220221位點222(8)..(10)223x可以是任何胺基酸40046PheGluSerIleLysValLeuXaaXaaXaaPheGluSerIleLysVal151015Leu2104721117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的220221位點222(8)..(10)223x可以是任何胺基酸40047LeuLysSerIleValGluPheXaaXaaXaaLeuLysSerIleValGlu151015Phe2104821131212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40048GluPheLeuIleLysSerValGlyThrIleValThrMetGluTyrArg151015IleAspArgThrArgSerPheValGluPheLeuIlePheLysSer2025302104921118212PRT213大麥40049ValGlyThrIleValThrMetGluTyrArgIleAspArgThrArgSer151015PheVal2105021131212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40050GluPheLeuIleLysSerValGlyThrIleValThrMetGluTyrArg151015IleAspArgThrArgSerPheValSerLysValIleLeuPheGlu2025302105121132212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40051SerLysValIleLeuPheGluValGlyThrIleValThrMetGluTyr151015ArgIleAspArgThrArgSerPheValGluPheLeuIleValLysSer2025302105221132212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40052SerLysValIleLeuPheGluValGlyThrIleValThrMetGluTyr151015ArgIleAspArgThrArgSerPheValSerLysValIleLeuPheGlu2025302105321132212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40053LysPheLeuIleValLysSerValGlyThrIleValThrMetGluTyr151015ArgIleAspArgThrArgSerPheValLysPheLeuIleValLysSer2025302105421131212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40054LysPheLeuIleValLysSerValGlyThrIleValMetGluTyrArg151015IleAspArgThrArgSerPheValGluPheLeuIleValGluSer2025302105521132212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40055GluPheLeuIleValGluSerValGlyThrIleValThrMetGluTyr151015ArgIleAspArgThrArgSerPheValGluPheLeuIleValGluSer2025302105621133212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40056GluLysLeuIleLysValLysSerValGlyThrIleValThrMetGlu151015TyrArgIleAspArgThrArgSerPheValGluLysLeuLysValLys202530Ser2105721132212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40057GluSerLeuSerValLysSerValGlyThrIleValThrMetGluTyr151015ArgIleAspArgThrArgSerPheValGluSerLeuSerValLysSer2025302105821134212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40058GluPheLeuIleLysValLysSerValGlyThrIleValThrMetGlu151015TyrArgIleAspArgThrArgSerPheValGluPheLeuIleLysVal202530LysSer2105921136212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40059GluGluPheLeuIleValLysLysSerValGlyThrIleValThrMet151015GluTyrArgIleAspArgThrArgSerPheValGluGluPheLeuIle202530ValLysLysSer352106021137212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40060MetGlyGluPheLeuIleValLysSerValGlyThrIleValThrMet151015GluTyrArgIleAspArgThrArgSerPheValGluPheLeuIleVal202530LysSerGlyProPro352106121142212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40061LysLysLysLysLysLysGlyGlyGlyGlyGluPheLeuIleValLys151015SerValGlyThrIleValThrMetGluTyrArgIleAspArgThrArg202530SerPheValGluPheLeuIleValLysSer35402106221110212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40062LysLysLysLysLysLysGlyGlyGlyGly15102106321139212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40063LysLysLysGlySerGlySerGluPheLeuIleValLysSerValGly151015ThrIleValThrMetGluTyrArgIleAspArgThrArgSerPheVal202530GluPheLeuIleValLysSer35210642117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40064LysLysLysGlySerGlySer152106521123212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40065GluPheLeuIleValLysSerSerThrLysSerIleProProGlnSer151015GluPheLeuIleValLysSer202106621135212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40066MetGlyGluPheLeuIleValLysSerGlyGlyGlyGlyGluTyrLys151015AspAspAspAspLysGlyGlyGlyGlyGluPheLeuIleValLysSer202530GlyProPro35210672118212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40067AspTyrLysAspAspAspAspLys152106821138212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的40068MetGlyGluPheLeuIleValLysSerGlyGlyGlyGlyTyrProTyr151015AspValProAspTyrAlaSerLeuGlyGlyGlyGlyGluPheLeuIle202530ValLysSerGlyProPro352106921111212PRT213流感病毒40069TyrProTyrAspValProAspTyrAlaSerLeu1510210702117212PRT213猴病毒40070ProLysLysLysArgLysVal15210712116212PRT213人40071AlaArgArgArgArgPro152107221110212PRT213人40072GluGluValGlnArgLysArgGlnLysLeu1510210732119212PRT213人40073GluGluLysArgLysArgThrTyrGlu152107421120212PRT213爪蟾40074AlaValLysArgProAlaAlaThrLysLysAlaGlyGlnAlaLysLys151015LysLysLeuAsp202107521131212PRT213人40075MetAlaSerProLeuThrArgPheLeuSerLeuAsnLeuLeuLeuLeu151015GlyGluSerIleLeuGlySerGlyGluAlaLysProGlnAlaPro2025302107621121212PRT213人40076MetSerSerPheGlyTyrArgThrLeuThrValAlaLeuPheThrLeu151015IleCysCysProGly202107721151212PRT213人40077ProGlnArgProGluAspCysThrProArgGlySerValLysGlyThr151015GlyLeuAspPheAlaCysAspIleTyrIleTrpAlaProLeuAlaGly202530IleCysValAlaLeuLeuLeuSerLeuIleIleThrLeuIleCysTyr354045HisSerArg502107821133212PRT213人40078MetValIleIleValThrValValSerValLeuLeuSerLeuGlyVal151015ThrSerValLeuLeuCysPheIlePheGlyGlnHisLeuArgGlnGln202530Arg2107921137212PRT213人40079ProAsnLysGlySerGlyThrThrSerGlyThrThrArgLeuLeuSer151015GlyHisThrCysPheThrLeuThrGlyLeuLeuGlyThrLeuValThr202530MetGlyLeuLeuThr352108021114212PRT213雞病毒40080MetGlySerSerLysSerLysProLysAspProSerGlnArg15102108121126212PRT213人40081LeuLeuGlnArgLeuPheSerArgGlnAspCysCysGlyAsnCysSer151015AspSerGluGluGluLeuProThrArgLeu20252108221120212PRT213未知220223未知生物描述來自視紅紫質40082GluGlnPheArgAsnCysMetLeuThrSerLeuCysCysGlyLysAsn151015ProLeuGlyAsp202108321119212PRT213人40083LeuAsnProProAspGluSerGlyProGlyCysMetSerCysLysCys151015ValLeuSer2108421136212PRT213未知220223未知生物描述來自Lamp-1的溶酶體膜蛋白40084MetLeuIleProIleAlaGlyArgArgAlaLeuAlaGlyLeuValLeu151015IleValLeuIleAlaTyrLeuIleGlyArgLysArgSerHisAlaGly202530TyrGlnThrIle352108521135212PRT213未知220223未知生物描述來自Lamp-1的溶酶體膜蛋白40085LeuValProIleAlaValGlyAlaAlaLeuAlaGlyValLeuIleLeu151015ValLeuLeuAlaTyrPheIleGlyLeuLysHisHisHisAlaGlyTyr202530GluGlnPhe352108621127212PRT213酵母40086MetLeuArgThrSerSerLeuPheThrArgArgValGlnProSerLeu151015PheSerArgAsnIleLeuArgLeuGlnSerThr20252108721125212PRT213酵母40087MetLeuSerLeuArgGlnSerIleArgPhePheLysProAlaThrArg151015ThrLeuCysSerSerArgTyrLeuLeu20252108821164212PRT213酵母40088MetPheSerMetLeuSerLysArgTrpAlaGlnArgThrLeuSerLys151015SerPheTyrSerThrAlaThrGlyAlaAlaSerLysSerGlyLysLeu202530ThrGlnLysLeuValThrAlaGlyValAlaAlaAlaGlyIleThrAla354045SerThrLeuLeuTyrAlaAspSerLeuThrAlaGluAlaMetThrAla5055602108921141212PRT213酵母40089MetLysSerPheIleThrArgAsnLysThrAlaIleLeuAlaThrVal151015AlaAlaThrGlyThrAlaIleGlyAlaTyrTyrTyrTyrAsnGlnLeu202530GlnGlnGlnGlnGlnArgGlyLysLys3540210902114212PRT2l3未知220223未知生物描述來自鈣網蛋白的序列40090LysAspGluLeu12109121115212PRT213腺病毒40091LeuTyrLeuSerArgArgSerPheIleAspGluLysLysMetPro1510152109221119212PRT213人40092LeuAsnProProAspGluSerGlyProGlyCysMetSerCysLysCys151015ValLeuSer2109321115212PRT213未知220223未知生物描述香葉基化序列40093LeuThrGluProThrGlnProThrArgAsnGlnCysCysSerAsn151015210942119212PRT213未知220223未知生物描述破壞序列40094ArgThrAlaLeuGlyAspIleGlyAsn152109521120212PRT213人40095MetTyrArgMetGlnLeuLeuSerCysIleAlaLeuSerLeuAlaLeu151015ValThrAsnSer202109621129212PRT213人40096MetAlaThrGlySerArgThrSerLeuLeuLeuAlaPheGlyLeuLeu151015CysLeuProTrpLeuGlnGluGlySerAlaPheProThr20252109721127212PRT213人40097MetAlaLeuTrpMetArgLeuLeuProLeuLeuAlaLeuLeuAlaLeu151015TrpGlyProAspProAlaAlaAlaPheValAsn20252109821118212PRT213流感病毒40098MetLysAlaLysLeuLeuValLeuLeuTyrAlaPheValAlaGlyAsp151015GlnIle2109921125212PRT213人40099MetGlyLeuThrSerGlnLeuLeuProProLeuGluPhePheLeuLeu151015AlaCysAlaGlyAsnPheValHisGly202521010021110212PRT213人工序列220221位點222(8)..(10)223x可以是任何胺基酸220223人工序列描述合成的400100MetGlyXaaXaaXaaXaaGlyGlyProPro15102101012119212PRT213人工序列220221位點222(3)..(6)223x可以是任何胺基酸220223人工序列描述合成的400101MetGlyXaaXaaXaaXaaGlyProPro1521010221111212PRT213人工序列220221位點222(4)..(7)223x可以是任何胺基酸220223人工序列描述合成的400102MetGlyGlyXaaXaaXaaXaaGlyGlyProPro151021010321110212PRT213人工序列220221位點222(4)..(7)223x可以是任何胺基酸220223人工序列描述合成的400103MetGlyGlyXaaXaaXaaXaaGlyProPro151021010421127212PRT213人工序列220221位點222(18)..(20)223x可以是任何胺基酸220223人工序列描述合成的400104LysLysLysLysLysLysGlyGlyGlyGlyGluPheLeuIleValLys151015SerXaaXaaXaaGluPheLeuIleValLysSer20252101052114212DNA213未知220223未知生物描述啟動子序列400105caat42101062114212DNA213未知220223未知生物描述啟動子序列400106tata42101072116212DNA213未知220223未知生物描述mRNA聚腺苷酸化序列400107aataaa62101082117212DNA213未知220221miscdifference222(1)..(3)223n可以是任何胺基酸220223未知生物描述Kozak共有序列400108nnnatgg721010921123212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400109GluPheLeuIleValLysSerSerThrLysSerIleProProGlnSer151015GluPheLeuIleValLysSer2021011021132212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400110GluPheLeuIleValLysSerValGlyThrIleValThrMetGluTyr151015ArgIleAspArgThrArgSerPheValSerLysValIleLeuPheGlu2025302101112119212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400111CysGlyThrIleValThrMetGluTyr1521011221116212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400112GluPheLeuIleValLysSerValGlyThrIleValThrMetGluTyr1510152101132118212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400113ArgIleAspArgThrArgSerPhe1521011421116212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400114ArgIleAspArgThrArgSerPheValGluPheLeuIleValLysSer1510152101152119212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400115ArgIleAspArgThrArgSerPheCys152101162115212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400116GluPheLeuIleVal152101172115212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400117ValGluPheLeuIle1521011821117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400118CysGlyArgIleValThrMetGluTyrArgIleAspArgThrArgSer151015Phe21011921114212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400119CysGlyThrIleValThrMetGluTyrArgIleAspArgThr15102101202117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400120GluTyrArgIleAspArgThr152101212116212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400121ArgSerPheValGluPhe152101222117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400122CysGlyThrIleValThrMet152101232119212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400123LysSerValGlyThrIleValThrMet1521012421111212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400124GluTyrArgIleAspArgThrArgSerPheCys151021012521113212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400125ValThrMetGluTyrArgIleAspArgThrArgSerPhe151021012621112212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400126MetGluTyrArgIleAspArgThrArgSerPheCys15102101272118212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400127MetGluTyrArgIleAspArgThr1521012821110212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400128ThrIleMetGluTyrArgIleAspArgThr151021012921139212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400129LysLysLysGlySerGlySerGluPheLeuIleValLysSerValGly151015ThrIleValThrMetGluTyrArgIleAspArgThrArgSerPheVal202530GlySerGlySerLysLysLys3521013021137212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400130MetGlyGluPheLeuIleValLysSerGlyGlyGlyGlyTyrProTyr151015AspValProAspTyrAlaSerLeuGlyGlyGlyGluPheLeuIleVal202530LysSerGlyProPro352101312119212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400131SerThrLysSerIleProProGlnSer152101322119212PRT213未知220223未知生物描述蛋白酶抑制劑400132CysThrLysSerIleProProGlnCys152101332119212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400133MetGlyGluPheLeuIleValLysSer1521013421110212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400134GluPheLeuIleValLysSerGlyProPro151021013521116212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400135GlyGlyGlyGlyGluTyrLysAspAspAspAspLysGlyGlyGlyGly15101521013621118212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400136GlyGlyGlyGlyTyrProTyrAspValproAspTyrAlaSerLeuGly151015GlyGly2101372116212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的220221位點222(1)223x可以是E,D,K或R.220221位點222(6)223x可以是E,D,K或R.400137XaaPheLeuIleValXaa1521013821110212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400138GluTyrArgIleAspArgThrArgSerPhe15102101392116212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400139CysGlyThrIleValThr152101402118212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400140ThrIleValThrMetGluTyrArg1521014121113212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400141ThrMetGluTyrArgIleAspArgThrArgSerPheCys15102101422115212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400142CysGlyThrIleVal152101432115212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400143SerValGlyThrIle1521014421127212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400144GluPheLeuIleValLysSerValGlyThrIleValThrMetGluTyr151015ArgIleAspArgThrArgSerPheValGluPhe202521014521121212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400145GluPheLeuIleValLysSerValGlyThrIleValThrMetGluTyr151015ArgIleAspArgThr202101462118212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400146SerPheValGluPheLeuIleVal152101472117212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400147PheValGluPheLeuIleVal152101482115212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400148SerPheValGluPhe1521014921110212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400149SerPheValGluPheLeuIleValLysSer15102101502118212PRT213人工序列220223人工序列描述合成的400150ServalGlyThrIleThrTyrMet1權利要求1．至少含第一個二聚作用肽的組合物，其中所述肽包含不超過8個胺基酸長的序列NH2-X1-X2-X3-X4-X5-COOH，其中X1、X2、X3和X4選自胺基酸A、V、I、L、W、F、M和Y，而X5選自K、R、D和E。2．按權利要求1的組合物，其中進一步包含第二二聚作用肽，該肽包含不超過8個胺基酸長的序列NH2-X1-X2-X3-X4-X5-COOH，其中X1、X2、X3和X4選自胺基酸A、V、I、L、W、F、M和Y，而X5選自K、R、D和E。3．按權利要求1或2的組合物，其中至少所說的第一二聚作用肽包含序列NH2-FLIVK-COOH。4．按權利要求1、2或3的組合物，其中至少所說的第一二聚作用肽包含序列NH2-X0FLIVKX5-COOH，其中X0和X5選自胺基酸E、D、K和R。5．按權利要求1、2、3或4的組合物，其進一步包含第一蛋白質，其中至少所說的第一二聚作用肽與所說的第一蛋白質共價連接形成第一融合蛋白質。6．按權利要求5的組合物，其進一步包含共價連接於所說融合蛋白質上的第二二聚作用肽，其中所說的第二二聚作用肽包含不超過8個胺基酸長的序列NH2-X1-X2-X3-X4-X5-COOH，其中X1、X2、X3和X4選自胺基酸A、V、I、L、W、F、M和Y，而X5選自K、R、D和E。7．按權利要求6的組合物，其中所說的第一二聚作用肽與所說的第一蛋白質N-末端連接，所說的第二二聚作用肽與所說的第一蛋白質的C-末端連接。8．按權利要求6的組合物，其中所說第一二聚作用肽或第二二聚作用肽至少之一共價連接至所說蛋白質的內部位置。9．按權利要求5、6、7或8的組合物，其中所說的第一二聚作用肽或所說的第二二聚作用肽至少之一通過連接子與所說的第一蛋白質共價連接。10．按權利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9的組合物，其中進一步包含融合對象。11．含多個成員的分子文庫，其中每個成員包含按權利要求5、6、7、8、9或10的組合物，並且每個所說的成員包含不同的第一蛋白質。12．編碼權利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的組合物的重組核酸。13．含權利要求12之重組核酸的表達載體。14．含權利要求12之重組核酸的宿主細胞。15．產生權利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的組合物的方法，包括a)提供按權利要求14的細胞；及b)將所說的細胞放到一定的條件中，從而表達該組合物。16．篩選能改變細胞表型的組合物的方法，所說的方法包括a)將按權利要求12的重組核酸引入細胞群中；b)將所說的細胞群放於一定條件下，從而表達由所說核酸編碼的蛋白質；c)從所說的細胞群中篩選呈現改變表型的細胞。17．按權利要求16的方法，其中進一步包括分離呈現改變表型的所說細胞。18．按權利要求16的方法，其中進一步包括從所說細胞中分離核酸。19．按權利要求16的方法，其中進一步包括分離靶分子。全文摘要本發明涉及包括相互間具高度親和性的肽的組合物和方法,該肽與蛋白質連接時可幫助蛋白質摺疊成緊密結構。憑藉其穩定性和約束力,此支架可延長任何內含蛋白質序列在細胞蛋白酶和其他蛋白酶存在時的活性。該緊密結構可具有其它內含功能性序列,對於文庫篩選、建立結構偏性肽庫及定向於特異細胞內和細胞外區室,其優於線性和較少受限制的肽。本發明的組合物可展示於病毒、古細菌、原核和真核細胞表面上,用於文庫篩選、藥物篩選和展示。本發明的方法對於調節信號途徑的細胞內效應蛋白質體內篩選是有用的,並可用於體外鑑定相互作用的蛋白質。因此,本發明可用作基因治療的支架,用於新治療藥物的分離,並且對於在生理液中用作治療劑具有潛在利用價值。文檔編號C12P21/02GK1302305SQ99806463公開日2001年7月4日申請日期1999年4月2日優先權日1998年4月2日發明者D·安德森,T·格魯拉加申請人:裡格爾製藥公司