植物中富含丁香基的木質素的遺傳工程的製作方法

2023-07-10 01:29:51

專利名稱：植物中富含丁香基的木質素的遺傳工程的製作方法
相關申請交叉參考本申請要求2000年4月5日提請的美國臨時申請No.60/230,086的優先權，該申請在此併入參考。關於聯邦政府贊助的研究或開發的聲明本發明是在美國能源部能源生物科學計劃和美國農業部研究資金第USDA99-35103-7896，USDA0 1-03749和DOE DE-FG02-01ER15179號給予的美國政府支持下完成，美國政府在本發明中擁有一定權利。發明背景本發明涉及一種新的DNA序列，其編碼一種先前未鑑別的木質素生物合成途徑酶，芥子醇脫氫酶(SAD)，其調節植物中丁香基木質素的生物合成。本發明還提供了將此新SAD基因序列或與此SAD基因相似的序列導入植物基因組中以遺傳工程化植物中富含丁香基的木質素的方法。
木質素，一種複雜的酚聚合物，是大多數木本植物包括被子植物和裸子植物的支持結構的主要部分，所述木本植物是造紙和纖維素產品的纖維首要來源。木質素通常構成木材幹重的大約25％，使其成為地球上在纖維素之後第二豐富的有機化合物。木質素提供了木材的硬度，部分由於其對生物化學降解的抗性而使其非常適用。
儘管木質素對植物生長和結構具有重要性，但其在基於纖維素的木材/農作物收穫後加工生產纖維、化學品和能源生產等方面仍存在問題，因為必須花費很大地將木質素從纖維素中除去或降解。木質素的一些結構成分如愈創木基組分，促進單體交聯，提高木質素降解抗性(Sarkanen，1971；Chang和Sarkanen，1973；Chiang和Funaoka，1990)。在被子植物中，木質素由愈創木基和丁香基單木質醇(monolignols)的混合物組成，並可以在比裸子植物木質素相對低能量和化學成本下降解，所述裸子植物木質素幾乎全部由愈創木基組分組成(Freudenberg，1965)。如果丁香基木質素可以經遺傳摻入裸子植物愈創木基木質素或被子植物中，以提高丁香基木質素含量，估計與其野生型相比這種遺傳工程化植物的加工每年的節約僅在美國就在60億至100億美元範圍。因此，長期以來一直嘗試了解丁香基單木質醇(monolignol)的生物合成，以遺傳工程化植物使其含有更多的丁香基木質素，從而便於木材/農作物加工(Trotter，1990；Bugos等，1991；Boudet等，1995；Hu等，1999)。
儘管已知丁香基木質素得自愈創木基木質素，但只揭示了一部分丁香基單木質醇途徑及其編碼催化所述途徑步驟的酶的基因。這部分單木質醇途徑在松柏醛處與愈創木基途徑分開，是由分別編碼松柏醛5-羥化酶(CAld5H)(Osakabe等，1999)和S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)依賴性5-羥基松柏醛O-甲基轉移酶(AldOMT)(LI等，2000)的基因介導，形成芥子醛(見

圖1)。然而，芥子醛必須酶促轉變為芥子醇，即丁香基單木質醇，以在植物中生物合成丁香基木質素(見圖1)。編碼這種酶即芥子醇脫氫酶(SAD)的基因，從未被鑑別或克隆，其代表一種丟失基因，該基因在植物的丁香基木質素遺傳工程化中是必不可少的。因此，需要鑑別和分離這種關鍵基因(SAD)，以在植物中遺傳增加丁香基單木質醇生物合成及用於包含使用這種關鍵基因的遺傳操縱方法。
發明概述本發明提供了一種分離的完整DNA序列，其編碼一種新酶，芥子醇脫氫酶SAD，其是植物中丁香基木質素生物合成所必須的並發揮主要作用。SAD催化芥子醛轉化為芥子醇，即丁香基單木質醇。SAD的產生及因此丁香基單木質醇的產生，可以通過供應額外的SAD基因拷貝而提高，或者如果需要，通過將SAD基因或其一部分以反義方向插入植物基因組以使催化芥子醇的SAD數量減少而降低。
本發明一方面提供了含有提高丁香基木質素的產生及抑制愈創木基木質素的產生的基因的完整裸子植物。因此本發明提供了易於在製漿過程中脫木質化的裸子植物物種。
本發明另一方面提供了生產一種表達盒的方法，所述表達盒可插入裸子植物細胞中以在衍生自所述細胞的裸子植物中誘導丁香基木質素的形成。
本發明再一方面提供了修飾參與裸子植物物種中木質素生物合成的基因的方法，這樣丁香基木質素的產生增加而愈創木基木質素的產生被抑制。
本發明有利地鑑別、分離和/或克隆了被子植物中與丁香基木質素的產生相關的那些基因。本發明還有益地提供了編碼被子植物物種芥子醇脫氫酶(SAD)的多核苷酸的鑑別和分離，及這種多核苷酸在改變裸子植物中木質素生物合成中的應用。
附圖簡述圖1是產生松柏醇和芥子醇的植物單木質醇途徑的示意圖。
圖2示出了SAD多核苷酸DNA序列(SEQ ID NO1)及其相應的SAD胺基酸序列(SEQ ID NO2)，分別示於圖2A和圖2B。
圖3是白楊SAD和植物CAD的系統發生分析。
圖4示出白楊PtCAD和PtSAD的分子鑑定。
圖5示出重組PtCAD和PtSAD反應的HPLC-UV/MS分析。
圖6示出PtCAD和PtSAD的抑制動力學。
圖7示出白楊莖中愈創木基和丁香基木質素的定位。
圖8示出白楊莖中PtCAld5H和PtSAD蛋白的免疫學定位。
圖9示出各種植物中CAD和SAD蛋白質的免疫反應性。
發明詳述本發明涉及編碼芥子醇脫氫酶(SAD)的一種基因，所述酶是丁香基單木質醇生物合成中最後一個關鍵酶，本發明提供了編碼所述新酶SAD的分離的完整DNA序列。本發明還提供了改變植物中木質素組成即生產富含丁香基的木質素的方法，所述方法通過用所述SAD基因轉化植物進行，其中所述基因被表達並導致木質素聚合物的丁香基含量增加。
本發明對造紙和製漿業尤為有價值，因為含有較高丁香基單體含量的木質素更易於化學脫木質化。目前在脫木質化過程中需要大量的能源和時間。用活性SAD基因轉化的木本植物在常規造紙原料脫木質化過程中具有明顯優勢。相似地，通過插入和表達異源SAD基因改變草類中木質素組成，是提高該草類可消化性的一種獨特方法，而且對農場業和農業具有明顯的經濟利益。
本發明提供了用於轉化植物組織以改變木質素單體組成的基因和DNA構建體。根據本發明適於轉化的植物包括天然缺乏丁香基木質素的植物或以高愈創木基-丁香基比率累積木質素的那些植物。根據本發明也適於轉化的植物包括其木質素可以使用降低轉基因植物木質素的丁香基含量的反義轉化構建體改變的那些植物，如果這種改變是所需的。特別地，適當植物包括但非限於裸子植物，被子植物，草類，豆類，飼料作物等。
本說明書中所用術語一般具有在現有技術中，本發明文中和在使用其的具體場合中的普通含義。在下文或本說明書的其他段落描述了某些術語，為本領域技術人員提供了闡述本發明組合物和方法及怎樣使用它們的進一步指導。應意識到可以以一種以上的方式闡述相同的事情。因此，可以使用本文所討論的一或多個術語的替代術語和同義詞，本文討論的術語均沒有任何特殊意義。提供了一些術語的同義詞。引用一或多個同義詞不除外使用其它的同義詞。在本說明書任何之處的舉例應用，包括本文舉例揭示的任何術語，只是例證性的，而無任何限制本發明或任何舉例術語的範圍和含義之意。同樣，本發明不限於所述優選的實施方案。
如本文所用，「基因」是指表達一種特異蛋白質的一個核酸片段，包括在編碼區域或編碼序列之前的(5』非編碼序列)和之後的(3』非編碼序列)調節序列。「天然」基因是指在自然界中發現的具有其自身調節序列的基因。
「內源基因」是指通常在基因組中其天然位置中發現的天然基因。
「轉基因」是指通過基因轉移導入宿主生物中的基因。
「編碼序列」或「編碼區域」是指含有編碼多肽信息的基因部分。編碼序列的邊界由在5』(氨基)末端的起始密碼子和在3』(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可包括例如原核序列，來自真核mRNA的cDNA，基因組DNA，及甚至合成的DNA序列。
「啟動子」或「啟動子序列」是指在給定基因中的DNA序列，該序列通過提供RNA聚合酶的識別位點和正確轉錄所需的其它因子控制編碼序列的表達。大多數基因具有啟動子DNA序列，其調節基因表達。啟動子區域在原核和真核細胞中均典型見於編碼序列上遊的5』側翼DNA序列。啟動子序列提供了對下遊基因序列轉錄的調節，其典型地包括大約50一2000個核苷酸鹼基對。啟動子序列還含有調節序列如可影響基因表達水平的增強子序列。一些分離的啟動子序列可以提供異源DNA的基因表達，所述異源DNA即不同於天然同源DNA的DNA。啟動子序列還已知是強或弱或可誘導的。強啟動子提供了高水平基因表達，而弱啟動子提供了非常低水平基因表達。可誘導啟動子是這樣的啟動子，其應答外源添加的製劑或環境或發育刺激而引發或關閉基因表達。對異源DNA而言是強啟動子的一種分離的啟動子序列是有益的，因為其提供了足夠水平的基因表達以易於檢測和選擇轉化的細胞，並當需要時提供高水平基因表達。啟動子還可以含有參與蛋白質因子結合的DNA序列，其控制應答生理或發育條件的轉錄起始的效力。
「調節序列」是指位於編碼序列上遊(5』)，編碼序列內和/或編碼序列下遊(3』)的核苷酸序列，其控制與細胞的蛋白質生物合成裝置相關的編碼序列表達。調節序列包括啟動子，翻譯前導序列，轉錄終止序列和聚腺苷酸化序列。
「編碼」是指這樣的過程，利用這一過程基因通過轉錄和翻譯機制為細胞提供信息，從中一系列胺基酸可以裝配成特異的胺基酸序列，以產生一種活性酶。應了解編碼特異胺基酸序列的過程包括DNA序列，其可包含不引起編碼的胺基酸變化的鹼基改變，或者包含可以改變一或多個胺基酸，但不影響由此DNA序列編碼的蛋白質的性質的鹼基改變。因此應了解本發明涵蓋了比具體舉例序列更多的序列。本發明還涵蓋了對所述序列的修飾，如序列中的缺失，插入或取代產生沉默改變，基本不影響所得蛋白質分子的功能性質。例如，本發明包括基因序列中的變化，其反映遺傳密碼的簡併，或引起化學等價胺基酸在給定位點產生。因此，丙氨酸，一種疏水性胺基酸，其密碼子可以由編碼疏水性較弱的另一個殘基如甘氨酸，或疏水性更強的殘基如纈氨酸，亮氨酸或異亮氨酸的密碼子取代。相似地，導致一個負電荷殘基由另一個殘基的取代，如天冬氨酸由穀氨酸取代，或者一個正電荷殘基由另一個殘基取代，如賴氨酸由精氨酸取代，也可以期望產生一種生物學等價產物。引起蛋白質分子N末端和C末端部分變化的核苷酸變化，預期也不改變蛋白質活性。在一些情況中，事實上需要產生序列的突變體以研究蛋白質生物學活性保留作用。這些提議的修飾均是本領域技術人員熟知的，在編碼產物中確定生物學活性的保留也是本領域技術人員熟知的。另外，本領域技術人員意識到本發明涵蓋的序列也通過其在嚴格條件下與本文舉例的序列的雜交能力而闡明。
「表達」是指基因編碼的蛋白質產物的產生。「過表達」是指轉基因生物中基因產物的產生水平超過正常或未轉化生物的水平。＂酶的「功能部分」或「功能片段」是指含有結合一或多個反應物的活性位點的或能改善或調節反應速度的部分，片段或等價節段。所述活性位點可以由存在於一或多個多肽鏈上的各獨立部分組成，並一般呈現高底物特異性。
「由一種核苷酸序列編碼的酶」包括由包括部分分離的DNA序列的核苷酸序列編碼的酶。
「轉化」是指將一個外源基因轉移至宿主生物基因組中，而且其通常穩定遺傳。
「相同性百分比」是指通過一種程序鑑別的一個多核苷酸/多肽的核苷酸/胺基酸與另一個多核苷酸/多肽序列的核苷酸/胺基酸的相同性百分率，所述程序例如是GAP程序，得自Wisconsin遺傳學計算機研究組(GCG)程序包(版本9.0)(Madison，WI)。GAP使用Needleman和Wunsch算式(分子生物學雜誌48443-453，1970)，進行兩個完整序列的對比，使匹配數目最大化，使缺口數目最小化。當需要運行上述算式的參數是非特異性時，使用程序提供的默認值。
「基本同源」或「基本相似」是指70％或更高的相似性或70％的同源性，其中兩個多肽序列之間的「相似性％」或「同源性％」是兩個序列呈現的相似位置數目的函數，其基於所用比數矩陣除以對比的位置數目再乘以100。當對比兩個序列(如果需要，導入缺口)以確定最大同源性時，進行這種對比。由國家生物技術信息中心提供的PowerBlast程序，可以用於計算最佳的有缺口的序列對比。也可以使用得自Wisconsin遺傳學計算機研究組程序包的GAP程序(版本9.0)(Madison，WI)。
「木質素單體組成」是指在木質化植物組織中發現的愈創木基單體和丁香基單體的相對比率。
「植物」包括整個植物或植物的一部分，包括植物器官(例如根部，莖，葉等)。
「被子植物」是指產生的種子包入子房中的植物。被子植物的一個特異性實例是Liquidambar styraciflua(L.)[sweetgum]。
「裸子植物」是指產生裸露種子的植物，即種子未包入子房中。裸子植物的一個特異性實例是Pinus taeda(L.)[火炬松]。
如本文所用，針對核酸分子或多肽的術語「分離的和/或純化的」是指核酸或多肽分子從其天然細胞環境中的體外分離，及與細胞的其它成分如核酸或多肽分離，以便能測序，複製和/或表達。
「載體」是一種重組核酸構建體，如可以附著本發明多核苷酸的質粒，噬菌體基因組，病毒基因組，粘粒，或人工染色體。在一個具體實施方案中，所述載體可以使附著的節段複製，例如在克隆載體的情況中。
「芥子醇脫氫酶」或稱「SAD」是指植物苯丙素苷(phenylpropanoid)生物合成途徑中的酶。其催化芥子醛轉化為芥子醇並使丁香基木質素產生。在本發明一個實施方案中，所述SADDNA序列(圖2A)從顫楊Populus tremuloides中鑑別。應了解這個序列可用作探針，通過本領域熟知的技術(EST，PCR，RT-PCR，抗SAD抗體，抗SAD多肽抗體等)從任何植物物種中克隆其等同物。SAD DNA序列在本文中定義為根據本發明所述酶分析方法，編碼能特異性催化芥子醛轉化為芥子醇的酶的任何DNA序列。苯丙素苷生物合成途徑參考圖1，其示出從4-香豆酸(1)至愈創木基(松柏醇(6))和丁香基(芥子醇(9))單木質醇，以形成愈創木基-丁香基木質素的生物合成途徑中不同步驟，及用於催化每個步驟的酶。每個反應步驟的酶是4-香豆酸3-羥化酶(C3H)，其將4-香豆酸(1)轉變為咖啡酸(2)；4-香豆酸-CoA連接酶(4CL)，其將咖啡酸(2)轉變為咖啡醯CoA(3)，咖啡醯CoA接著由咖啡醯-CoA O-甲基轉移酶(CCoAOMT)轉變為阿魏醯CoA(4)；肉桂醯-CoA還原酶(CCR)，其將阿魏醯CoA(4)轉變為松柏醛(5)；松柏醇脫氫酶(CAD)將松柏醛(5)轉變為愈創木基單木質醇松柏醇(6)；在松柏醛(5)處，所述途徑分為兩部分，其中松柏醛(5)也可以通過松柏醛5-羥化酶(CAld5H)轉變為5-羥基松柏醛(7)；5-羥基松柏醛O-甲基轉移酶(AldOMT)將5-羥基松柏醛(7)轉變為芥子醛(8)，芥子醛(8)隨後由芥子醇脫氫酶(SAD)轉變為丁香基單木質醇，芥子醇(9)。
先前已經報導最後芥子醇形成的步驟由CAD催化。本發明首次揭示從芥子醛中形成芥子醇的一種分離的酶。CAD和SAD一起調節愈創木基-丁香基木質素的數量和成分。本發明提供了一種分離的SAD蛋白和SAD cDNA克隆，其現在可以用於改變木質化。SEQ IDNO1提供了來自Populus tremuloides的SAD cDNA序列，而SEQ IDNO2提供了推導的SAD多肽的序列。
下表1中提供了所有報導的類CAD酶的胺基酸序列與本發明新SAD酶的對比。CAD已經在一些不同物種中得到鑑定。表1中所列數值表示胺基酸相同性百分率。表1示出SAD與所有其它已知CAD只呈現大約50％胺基酸序列相同性，表明SAD是具有與其它CAD不同生物化學功能的一種不同的新揭示的酶。因此，所述SAD蛋白質序列與所有目前已知的單木質醇CAD的序列可以從系統發育加以區別。
表1從資料庫中獲得的所有類CAD蛋白質序列對比，數值代表胺基酸序列相同性百分率
1M.sativa，AF083332；2PtCAD，AF217957；3P.deltoides，z19568；4A.corada，D13991；5N.tabacum，x62343；6N.tabacum，x62344；7E.globulus，AF038561；8E.gunnii，x65631；9Z.mays，aj005702；10Z.mays，y13733；11S.offininarum，AJ231135；12P.radiada，u62394；13P.taeda，z37992；14P.taeda，z37991；15P.abies，x27675；16PtXAD(重新命名為PtSAD)。DNA構建體根據本發明提供了一種DNA構建體，其是具有啟動子序列，編碼區和終止子序列的植物DNA。所述編碼區編碼木質素生物合成必需的SAD酶。所述編碼區適當的最小大小為50個鹼基。基因啟動子位於轉基因的5』末端(所述轉基因可以是單獨的SAD或SAD與來自植物單木質醇的另一種酶組合，如下文所述)，以控制轉基因表達，基因終止子序列位於轉基因的3』末端以發出轉基因轉錄結束的信號。
根據本發明的DNA構建體可以通過轉化摻入植物基因組中，以改變木質素生物合成，例如提供富集丁香基的木質素。所述DNA構建體可以包括本文提供的克隆，稱為PtXAD(後來重新命名為PtSAD)，及其變體如通過遺傳密碼簡併形成的變體，及其功能等價物。
本發明的DNA構建體可以插入植物中，以調節SAD酶的產生。根據所述構建體的性質，在植物生命的全部階段或特殊時期，所述蛋白質的產生可以提高或降低。例如，DNA編碼序列，啟動子和終止序列的方向可以用於抑制木質素形成或增強木質素形成。為了木質素生物合成的負調節，所述DNA是反義方向。為了增強木質素生物合成，所述DNA是有義方向，由此在植物基因組中提供一或多個額外的DNA拷貝。在這種情況中，所述DNA合適地是全長cDNA拷貝。也可以將所述基因表達定向於植物的特殊細胞類型，如上皮，木質部，根部等。本發明的構建體可以通過本領域已知的各種方式用於轉化單子葉和雙子葉植物細胞。在許多情況中，可以培養這種植物細胞再生為整個植物，其隨後繁殖提供經遺傳修飾的植物的連續子代。根據本發明適當遺傳修飾的植物例如包括但非限於樹如白楊，楊樹，松樹和桉樹。啟動子和終止序列本領域熟知各種基因啟動子序列，並可用於本發明的DNA構建體中。本發明構建體中啟動子適當提供連接的DNA節段表達。所述啟動子也可以是可誘導的，以便基因表達可以用外源添加的因子啟動或關閉。也可以優選組合所需的DNA節段和啟動子，以在植物中提供組織特異性表達或發育調節的基因表達。
所述啟動子可選自已知在植物中起作用的啟動子，例如CaMV35S，GPAL2，GPAL3和控制相應酶表達的外源植物啟動子。組成型啟動子如CaMV35S啟動子(Odell等，1985)或CaMV 19S(Lawton等，1987)可以用於驅動轉基因在靶植物所有組織類型中表達。其它啟動子是nos(Ebert等，1987)，Adh(Walker等，1987)，蔗糖合酶(Yang等，1990)，α-微管蛋白，遍在蛋白，肌動蛋白(Wang等，1992)，cab(Sullivan等，1989)，PEPCase(Hudspeth等，1989)或與R基因複合物結合的那些啟動子(Chandler等，1989)。另一方面，組織特異性啟動子的應用可以更加選擇性控制功能。組織特異性啟動子的應用具有這樣的優點，即所需的蛋白質只在需要其功能的組織中產生。適當地，組織特異性啟動子如限制轉基因在發生木質化的發育木質部中表達的那些啟動子，可以用於本發明的DNA構建體中。
通過如Sambrook等，第二版(1982)所述標準方法，可以將DNA節段與所述啟動子組合。簡而言之，可以如Jefferson(1987)所述構建含有啟動子如CaMV 35S啟動子的質粒，或者得自Clontech實驗室，Palo Alto，加利福尼亞(例如pBI121或pBI221)。典型地，構建這些質粒以在所述啟動子下遊提供特異於不同限制酶的多克隆位點。DNA節段可以使用限制酶亞克隆在啟動子下遊，以保證所述DNA以針對相關啟動子的正確方向插入，以便所述DNA可以表達。
基因終止序列位於待轉錄的DNA序列的3』。本領域已知的各種基因終止序列可以用於本發明的構建體中。這些包括胭脂氨酸合酶(NOS)基因終止序列(見例如2000年10月6日提請的PCT申請PCT/US/0027704所述，題目為「在植物中導入多個基因的方法」，在此併入參考)。標記基因在本發明構建體中還可摻入標記基因，以助於選擇具有轉基因陽性整合的植物組織。「標記基因」是為表達所述標記基因的細胞賦予一種獨特表型，並因此使這種轉化的細胞可與不具有標記的細胞相區分的基因。本領域已知許多適當標記基因的實例，並可以用於本發明實踐中，如新黴素磷酸轉移酶II(NPT II)基因，其賦予卡那黴素或潮黴素抗性，所述抗生素殺死不含有NPT II基因的未轉化的植物組織(Bevan等，1983)。用於本發明方法中的多種其它標記基因實例示於引入本文作入參考的2000年10月6日提請的PCT/US/0027704，題目為「在植物中導入多個基因的方法」中。轉化用本發明的DNA構建體轉化來自植物例如樹木中的組織或細胞，並隨後產生轉基因植物，可以通過本領域已知的各種方法實現。例如，將DNA構建體移至宿主植物組織中的農桿菌和微粒介導的方法特別適用於樹木物種(Tsai等，1994；Ellis等，1993；及2000年10月6日提請的發明名稱為「在植物中導入多個基因的方法」的PCT申請PCT/US00/27704所述)。在轉化後，使用本領域熟知的方法(見於Tsai等，1994；Ellis等，1993；及2000年10月6日提請的PCT申請PCT/US00/27704所述)可以選擇對例如抗生素如卡那黴素有抗性的轉基因植物組織，並培養再生為整個植物。
轉化和再生方法易於適應許多植物物種。針對植物物種已經公布了許多轉化和再生方法(見於PCT申請PCT/US00/27704，如前)。DNA克隆編碼來自Populus tremuloides的松柏醇脫氫酶(CAD，圖1)的愈創木基途徑基因(GenBank#AF217957)首先被克隆。這個cDNA稱為PtCAD(GenBank#AF217957)。鑑定大腸桿菌表達的重組PtCAD蛋白對松柏醛和芥子醛的催化活性。因為單木質醇生物合成途徑中間體一起存在於木質化組織中(Osakabe等，1999；Li等，2000)，因此用松柏醛和芥子醛的混合物分析PtCAD酶活性。如圖5(a)和(c)所示，所述反應混合物在酶反應後通過HPLC分離。通過基於質譜分析法的化學結構分析確證從松柏醛中只形成松柏醇，而且PtCAD與芥子醛不反應。因此，PtCAD具有特異性催化松柏醛生物合成愈創木基單木質醇松柏醇反應的功能(圖1)。CAD底物對松柏醛的特異性也證實在丁香基單木質醇芥子醇的生物合成中，需要另一種酶—本發明的SAD，如圖1所示。
設計一不同的克隆策略以基於與CAD的可辨別序列分離候選的SAD基因，如上所述。使用PtCAD cDNA作為探針對Populustremuloides木質部cDNA文庫的1.8×104pfu的低嚴格性和高嚴格性的示差篩選(見實施例2所述)，基於序列分析分離出兩組陽性克隆，即I組和II組序列。I組12個克隆的序列與PtCAD相同，II組cDNA的序列彼此相同但不同於PtCAD。II組中8個克隆中有2個是全長cDNA，並稱為PtSAD。PtSAD cDNA(SEQ ID NO1)長度為1446bp，編碼362個胺基酸的一個ORF(SEQ ID NO2)，計算MW為38991，pI為6.69。在PtSAD cDNA中發現了在常見醇脫氫酶(ADH)中鑑別的輔因子和鋅結合序列(Jomvall等，1987；O』Malley等，1992；Galliano等，1993)。Zn1結合基序和結構性Zn2共有序列分別位於第71-85位胺基酸殘基和第91-117位胺基酸殘基。一個NADP結合位點經鑑別位於第191-196位殘基。
另外，PtSAD與所有其它已知全長單木質醇CAD只呈現大約50％胺基酸序列相同性(見上表1)。然而，其與那些據信與防禦病原體功能相關的ADH示出無意義的低胺基酸序列相同性(10-40％)(Jornvall等，1987；Brill等，1999)。這些序列特性證實PtSAD屬於一類新ADH，與通常已知的單木質醇CAD可區分。這一點由通過對PtSAD及已知全長單木質醇CAD蛋白質序列進行系統發育分析的結果充分支持，所述分析示出這些單木質醇CAD(圖3)形成與PtSAD明顯分離的一簇。鑑於這些基因與愈創木基特異性PtCAD和來自火炬松和雲杉CAD的胺基酸序列的廣泛相同性(80-98％)，這一簇單木質醇CAD是愈創木基特異性的，所述單拷貝基因參與裸子植物中愈創木基單木質醇的生物合成(O』Malley等，1992；Galliano等，1993；MacKay等，1995)。因此，系統發育分析可以反映出愈創木基CAD系統發育組在遠古即分支成PtSAD所屬的一更加丁香基特異性的系統發育組。用PtCAD或PtSAD cDNA探針重複篩選Populus tremuloides木質部cDNA文庫的獨立系列pfu，總是可以分離出與PtCAD或PtSAD相同的克隆，表明木質化木質部中兩種主要的單木質醇ADH，CAD和SAD。
為證實PtSAD基因的生物化學功能，將PtSAD cDNA在大腸桿菌中表達，以產生其重組蛋白。當將PtSAD重組蛋白與松柏醛單獨溫育時，對酶反應產物的HPLC-MS分析表明PtSAD對松柏醛具有786nmol/分鐘/mg蛋白質的比活性。然而，PtSAD對芥子醛具有6964nmol/分鐘/mg蛋白質的比活性，表明PtSAD對芥子醛的催化活性是對松柏醛的活性的9倍。因此，PtSAD特異於芥子醛而且SAD芥子醇脫氫酶催化芥子醛轉化為芥子醇。
PtSAD的芥子醛特異性證據來自PtSAD重組蛋白與松柏醛和芥子醛混合物的反應。PtSAD與松柏醛和芥子醛混合物反應的HPLC-MS分析(圖5)結論性地表明芥子醇是芥子醛的唯一產物，而且在一種體內情況中PtSAD與松柏醛不反應。
因此，總而言之，CAD對愈創木基單木質醇—松柏醇—的形成是愈創木基特異性的，SAD只催化丁香基單木質醇—芥子醇—的生物合成。另外，這些結果提示CAD和SAD蛋白在協調植物中愈創木基和丁香基木質素的細胞特異性生物合成中的各自作用。
現在首次克隆了編碼這種SAD酶的cDNA。SAD酶的存在是植物中丁香基木質素生物合成所必需的，而且在轉基因植物中摻入SAD基因是在植物中成功工程化丁香基木質素的可行機制。
本發明通過以下非限制性實施例進行進一步闡述。實施例1從白楊Populus tremuloides中分離SAD cDNA根據廠商指導(GIBCO BRL)在λgt22A載體中構建白楊發育的木質部cDNA文庫。白楊CAD cDNA(GenBank#AF217957)用作探針以在高和低嚴格雜交條件下示差篩選所述cDNA文庫。將來自所述cDNA文庫的大約6000pfu印在4個單獨的尼龍膜上。將兩個這樣印跡的膜與32P標記的CAD cDNA探針在低嚴格雜交條件(50℃)下雜交，其它兩個在高嚴格條件(65℃)下雜交。以此方式共篩查18000個pfu。在用高或低嚴格條件下探查的膜上檢測到高密度雜交信號。然而，低密度信號只在低嚴格雜交條件下探查的膜上檢測到。高嚴格膜上高密度信號與低嚴格膜上高密度信號完美排列，可以示差分離具有低密度信號的陽性克隆。高密度克隆證實為白楊CAD cDNA。對具有低密度信號的陽性克隆進行進一步篩查直至分離單個克隆。然後將純化的λgt22A克隆通過NotI和EcoRI克隆位點亞克隆入pBluescriptS/K質粒載體中。測序結果表明所述分離的cDNA克隆長度為1425bp(SEQ ID NO1)，編碼一個362個胺基酸的蛋白質(SEQ ID NO2)，其示出與白楊CAD蛋白具有53％序列相同性。這個cDNA克隆最初命名為PtXAD，隨後在證實其生物化學功能之後重新命名為SAD。
只在低嚴格雜交條件下與所述探針雜交的克隆的序列彼此相同，但與PtCAD不同。發現這些低嚴格度與探針雜交的克隆中有兩個是全長cDNA；將它們命名為PtSAD並以兩個方向測序(ABI31O；Perkin-Elmer)(GenBank登記號AF273256)。實施例2從白楊中克隆新的醇脫氫酶基因PtSAD為測試被子植物中不同的CAD和SAD基因的假說，從白楊發育木質部克隆CAD cDNA，PtCAD，並用於在相同物種中篩選相關序列。低和高嚴格性示差篩查白楊木質部cDNA文庫的2.4×104個噬斑形成單位(pfu)(Wu等，2000)，可分離兩組陽性克隆。I組含有12個序列與PtCAD相同的cDNA。II組由8個cDNA組成，其序列彼此相同但不同於PtCAD。II組中8個克隆中有兩個是全長cDNA，將其暫時命名為PtSAD。
PtSAD的開放讀框長度為1086bp，編碼pI為6.69的一個39kD蛋白質。PtSAD推導的胺基酸序列與PtCAD呈53％相同性，與其它被子植物單木質醇CAD序列呈約50％的相同性，但其與病原體防禦相關的醇脫氫酶(ADH)的序列不明顯相同(10-40％)(Brill等，1999)。另一方面，PtCAD示出與來自以下植物的CAD具有廣泛的胺基酸序列相同性Populus trichocarpa X Populus deltaides(97％)(PtCADA；Van Doorsselaere等，1995)，Eucalyptus gunnii(81％) (pEuCAD2；Grima-Pettenati等，1993)，菸草(82％)(pTCAD14；Knight等，1992)，苜蓿(79％)(MsaCad2；Brill等，1999)，及其它報導的被子植物(～80％)(Brill等，1999)。因此，PtSAD屬於一類新的ADH。
PtSAD中存在在ADH中保守的輔助子和鋅結合序列(Jomvall等，1987)(圖1)。Zn1結合基序和結構性Zn2共有區域(Jomvall等，1987；MacKay等，1995)分別位於第71-85和第91-117位胺基酸殘基。NADP結合位點(Jomvall等，1987)經鑑別在第191-196位殘基。用PtCAD或PtSAD cDNA探針重複篩查白楊木質部cDNA文庫總可以分離與PtCAD或PtSAD相同的克隆，表明它們是木質化木質部中兩種主要的單木質醇相關ADH。
對PtSAD及獲得的全長單木質醇CAD蛋白質序列的系統發育分析示出裸子植物和被子植物CAD形成一不包括PtSAD的簇(圖2)。這個簇中的被子植物單木質醇CAD與裸子植物CAD呈現～70％胺基酸序列相同性，但與PtSAD呈現～50％胺基酸序列相同性，提示所有這些推定的被子植物單木質醇CAD均可能是愈創木基特異性的。這些結果還可能反映愈創木基CAD系統發育組分支成PtSAD所屬的更加丁香基特異性組。實施例3DNA和RNA凝膠印跡分析如述從各種白楊組織中分離白楊基因組DNA和總RNA(Li等，1997；Hu等，1998)。為確定在白楊中是否有其它的PtCAD和PtSAD相關序列，用白楊基因組DNA進行凝膠印跡分析，所述DNA用各種限制酶消化並與PtCAD(圖4A)或PtSAD(圖4B)全長cDNA探針雜交。在高嚴格條件下進行DNA和RNA凝膠印跡雜交(Hu等，1998)。探針是用DECA引發標記系統(Ambion，Austin，TX)經α-32p-dATP(Amersham)標記的PtCAD或PtSAD cDNA。
在每個泳道中均有一條強單條帶，但在每個泳道中也檢測到一弱的單條帶，也許是不太相關序列的跡象。綜合cDNA篩查結果，我們解釋這些數據表明PtCAD和PtSAD可能是白楊中一小基因家族的主要成員。
DNA印跡分析還清楚表明PtCAD和PtSAD彼此不交叉雜交。因此，使用相同雜交條件及PtCAD和PtSAD全長cDNA探針進行RNA凝膠印跡分析，以研究白楊中PtCAD和PtSAD的組織特異性表達。在含有大量木質化木質部的組織中發現最強的PtCAD表達，但其表達在富集韌皮部的組織中較低(1-3節間；圖4C)。在經歷迅速韌皮部(1-3節間；圖4D)和木質部(4-9節間；圖4D)發育的組織中檢測到PtSAD強表達。在除去維管中脈的葉中未觀測到PtCAD和PtSAD表達。
還進行了蛋白質凝膠印跡分析以核實PtCAD和PtSAD的組織特異性表達。獲得針對在大腸桿菌中產生的經親和純化的PtCAD和PtSAD重組蛋白的多克隆抗血清，並使用蛋白質凝膠印跡核實抗PtCAD和PtSAD重組蛋白的PtCAD和PtSAD抗體的特異性。針對所測試的各種重組蛋白的量(直至75ng)，PtCAD抗體與PtSAD蛋白不交叉反應(圖4F)。PtCAD蛋白呈現期望的～39kD分子量，而且在木質部的蛋白質提取物中比韌皮部組織中更豐富。相反，在韌皮部蛋白質提取物中檢測到使用PtSAD抗體的最強信號(圖4F)。RNA和蛋白質凝膠印跡分析一致表明PtCAD和PtSAD均與木質化相關。富含丁香基木質素的韌皮部中強PtSAD表達(Grand等，1982)提示PtSAD在丁香基單木質醇生物合成中的特殊作用。因此，本文鑑定的是PtCAD和PtSAD基因的生物化學功能。實施例4酶活性測定為測定具有SEQ ID NO2胺基酸序列的白楊SAD的酶活性，進行以下實驗(i)PtCAD和PtSAD重組蛋白的表達和純化及植物蛋白提取物的製備PtCAD和PtSAD的編碼序列通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增，使用指定引物在其起始和終止密碼子上遊導入NdeI和Not1位點，所用引物是有義引物SEQ ID NO3(5』GGCATATGTCCAAGTCACCAGAA3』)和反義引物SEQ ID NO4(5』TGCGGCCGCGGGCTTCGTAGCTGCCAA3』)。將所述PCR產物克隆入pET23b+載體(Novagen，Madison，WI)的NdeI和Not1位點，以在克隆的序列羧基末端融合一His標記。在證實序列後，將工程化的pET23b+構建體移至大腸桿菌宿主菌株BL21(DE3)(Novagen)中。如述進行重組PtCAD和PtSAD的誘導和純化(Li等，2000)。在生長季節從以下植物中收集分化的莖木質部，並用於如述分離蛋白質粗提物(Li等，2000)白楊，霍布葉鐵木(Ostrya virginiana)，紅樺(Betula alleghaniensis)，糖槭(Acer saccharum)，紅花槭(Acer rubrum)，膠皮糖香樹(Liquidambar styracifla)，和火炬松(Pinus taeda)。
(ii)抗PtCAD和抗PtSAD抗體的製備及蛋白質凝膠印跡分析將經親和純化的PtCAD和PtSAD重組蛋白質用於免疫接種兔(Alpha Diagnostic，San Antonio，TX)。1∶3000稀釋的抗體用於木質部蛋白質粗提物的蛋白質凝膠印跡分析中(Osakabe等，1999)。通過Bio-Rad蛋白質分析系統測定蛋白質濃度。
(iii)SAD酶活性分析在不同pH的總體積為300μl的溶液中進行SAD酶反應，所述溶液含有100mM磷酸鈉緩衝液，500μM底物丁香醛(或松柏醛)，1ug重組SAD蛋白，2.5mMβ-巰基乙醇和500μM NADPH，所述pH值為5.4，6.0，6.4，7.0，7.4，8.0或8.4。在30℃反應10分鐘後，終止反應並用0.5ml乙酸乙酯提取。重複4次提取並將合併的乙酸乙酯蒸發及溶解於HPLC流動相中，以對反應產物進行LC-MS鑑別和定量(Osakabe等，1999；Li等，2000)。發現SAD反應最佳pH值為7.0。因此，在上述條件下在最佳pH7.0用混合底物，芥子醛和松柏醛進行SAD反應。
(iv)酶功能及反應動力學的HPLC-UV/MS分析基本酶反應混合物含有50mM磷酸鈉緩衝液，5mMβ-巰基乙醇，500μM NADPH或NADP，純化的重組蛋白(煮沸的蛋白質用作對照)，和酚底物，總體積為500μl。針對底物特異性測試，使用500μM醛底物和1ug純化的重組PtCAD或PtSAD蛋白(～25pmol)。為確定酶的最佳pH值，將所述底物和重組PtCAD或PtSAD蛋白濃縮物用於pH5-8.5的磷酸鈉緩衝液中。所有反應均在30℃進行10分鐘。
就正常和抑制動力學分析而言，針對PtCAD的反應時間為4分鐘及pH為8.0(1.2μg純化重組蛋白)，針對PtSAD的反應時間為4分鐘、pH為7.0(0.1ug)。針對動力學，使用不同濃度的(0.5-200μM)的p-香豆醛，咖啡醛，松柏醛，5-羥基松柏醛或芥子醛，以測定Km，Vmax及酶轉換數Kcat。針對抑制動力學，PtCAD介導的芥子醛(1-200μM)還原在存在1-5μM松柏醛的情況下分析，PtSAD催化的松柏醛(1-200μM)還原在存在1-5μM芥子醛的情況下分析。所有反應均通過加入10μL的6N HCl(將pH調節為2)和500ng內標o-香豆酸終止，並通過HPLC-UV/MS分析。
將100μL反應混合物等份直接注射於具有自動樣品注射的Supelcosil LC-ABZ柱(15cm×4.6mm×5μm；Supelco，Bellefonte，PA)上，並用Hewlett-Packard(HP)1100液相層析系統在40℃，以流速0.25mL/分鐘等度分離。梯度程序是20％乙腈於10mM甲酸中，pH2.5，12分鐘，20％一100％乙腈，12-16分鐘，及在100％乙腈保持5-10分鐘；用HP1100二級管陣列檢測儀及具有氣壓離電離-電噴射源的HP1100液相層析MS檢測儀系統以陰性離子模式進行檢測。通過將在70V下MS掃描中所述產物的電離片段化模式與真標準相對比鑑別和證實反應產物。如述測定上述產物的量和Km，Vmax，Kcat及表觀抑制常數(Ki)值(平均值±SE)(Osakabe等，1999；Li等，2000)。使用各種底物測試的CAD酶(即表2)和SAD酶(即表3)的抑制動力學結果如下所示。
表2重組PtCAD蛋白的動力學性質底物 Km(μM) Vmax(nmol/分鐘/ug)Kcata(/分) Vmax/Km(％)p-香豆醛 6.2±1.1 0.17±0.04 6.8±0.230.1咖啡醛 37.0±5.40.15±0.03 6.0±0.24.4松柏醛 2.3±0.8 0.21±0.03 8.4±0.31005-羥基松柏醛 17.5±2.50.17±0.04 6.8±0.410.6芥子醛 9.1±1.2 0.10±0.01 4.0±12.0akcat，酶轉換數數值是三個獨立實驗結果的平均值±SE
表3重組PtSAD蛋白的動力學性質底物 Km(μM) Vmax(nmol/分鐘/μg) Kcata(/分)Vmax/Km(％)p-香豆醛 15.6±1.42.9±0.3 116±1127.4咖啡醛140.0±9.1 2.0±0.1 80±4 2.2松柏醛12.7±1.52.3±0.2 92±6 26.65-羥基松柏醛 36.1±2.33.8±0.4 152±1615.5芥子醛7.4±1.1 5.0±0.3 200±13100aKcat，酶轉換數數值是三個獨立實驗結果的平均值±SE實施例5白楊莖單木質醇成分的化學合成和硫酸解分析除了以下原料所有醛及其醇衍生物均得自Sigma/Aldrichp-香豆醛，p-香豆醇，咖啡醛，咖啡醇，5-羥基松柏醛及5-羥基松柏醇是如述從其相應苯醛衍生物中化學製備(Osakabe等，1999；Li等2000)。這些化合物的結構性質通過1H-NMR證實。p-香豆醛δ(丙酮-d6；使用標準碳數目)，6.48(1H，dd，J1＝15.9，J2＝7.8，C8H)，6.80(2H，m，Ar-H)，7.46(1H，d，J＝15.8，C7H)，7.48(2H，m，Ar-H)，9.50(1H，d，C9H)；ρ-香豆醇δ(丙酮-d6)，4.1 8(2H，dd，J1＝49，J2＝1，C9H)，6.19(1H，dt，J1＝15.9，J2＝5.5，C8H)，6.49(1H，d，J＝15.9，C7H)，6.78(2H，m，Ar-H)，7.26(2M，m，Ar-H)；咖啡醛δ(丙酮-d6)，6.53(1H，dd，J1＝15.7，J2＝7.6，C8H)，6.90(1H，dt，J＝7.9，C5H)，7.10(1H，dd，J1＝7.9，J2＝2.1，C6H)，7.20(1H，d，J＝2.1，C2H)，7.51(1H，d，J＝15.7，C7H)，9.61(1H，d，J＝7.6，C9H)；咖啡醇δ(丙酮-d6)，4.17(2H，d，J5.5，C9H)，6.14(1H，dt，J1＝15.9，J2＝5.5，C8H)，6.43(1H，dt，J1＝15.9，J2＝1.5，C7H)，6.75(2H，d，J＝1.5，C5H，C6H)，6.92(1H，d，J＝1.5，C2H)；5-羥基松柏醛δ(丙酮-d6)，3.88(3H，s，OCH3)，6.60(1H，dd，J1＝15.6，J2＝7.8，C8H)，6.88(1H，d，J＝1.7，C6H)，6.95(1H，d，J＝1.7，C2H)，7.50(1H，d，J＝15.6，C7H)，9.61(1H，d，J＝7.8，C9H)；5-羥基松柏醇δ(丙酮-d6)，3.87(3H，s，OCH3)，4.28(2H，t，J＝5.5，C9H)，6.20(1H，dt，J1＝15.9，J2＝5.5，C8H)，6.47(1H，d，J＝15.9，C7H)，6.51(1H，d，J＝1.8，C6H)，6.64(1H，d，J＝1.8，C2H)。為進行單木質醇組成分析，用苯/醇提取白楊莖節間並進行基於氣相層析-質譜(MS)的硫酸解分析(Rolando等人，1992；Tsai等人，1998)。實施例6木質素的組織化學分析，免疫定位及顯微鏡檢為進行木質素的組織化學定位，將從4月齡溫室生長的白楊植物(克隆271)莖節間的新鮮手工切片(厚度為～20μm)，立即在新製備的飽和氯水中在4℃溫育10分鐘。在用水衝洗3次後，將切片在室溫在4％亞硫酸鈉中溫育5分鐘，在50％甘油中封固，並用Nikon(日本東京)Eclipse 400螢光顯微鏡照相。將得自用於組織化學分析的相同節間的節段(厚度為～1mm)基於加以修改的Wittich等(1999)所述方法用於免疫定位。在4℃將所述節段在4％低聚甲醛於0.1M PBS(4mM磷酸鈉，pH7.4，和200mM NaCl)中固定12小時。在4℃在PBS中衝洗2小時後，將所述節段在乙醇系列中脫水，滲濾並包埋於丁基甲基甲基丙烯酸酯中。
在UVC2 CRYO室(PELCO，Redding，CA)中於-20℃在UV光下進行聚合40小時。用Leica(wetzlar，德國)RM2155切片機製備切片(厚度為3μm)，並在Superfrost/plus(Fisher)玻片上封固。將玻片用丙酮漂洗以除去丁基甲基甲基丙烯酸酯，將玻片再在乙醇系列中再水合併首先用0.1M氯化羥銨封閉5分鐘，然後與1％BSA在室溫溫育30分鐘。在與抗PtCAD，抗PtCAD5H(Osakabe等，1999)，抗PtAldOMT(Li等，2000)，或抗PtSAD抗體(1∶500稀釋)在37℃溫育2小時後，將玻片在含有0.1％BSA的PBS中衝洗，並與綴合鹼性磷酸酶的山羊抗兔抗體(1∶100；BoehringerMannheim)在37℃溫育1.5小時。在PBS中衝洗後，將與抗PtSAD，抗PtCAId5H或抗PtAIDOMT抗體溫育的玻片與二甲基甲醯胺和氮藍四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸的混合物在pH9.5反應，並將與抗PtCAD抗體溫育的那些玻片用Fast Red TR/Naphthol AS-MX(Sigma)處理；這兩種處理均在室溫進行20-30分鐘。免疫前血清用作對照。然後將玻片在50％甘油中封固，並用Nikon Eclipse 400顯微鏡觀測，使用Sony(日本東京)DKC-5000數位相機照相。實施例7白楊莖維管組織中愈創木基和丁香基木質素分布的組織化學和化學檢測PtCAD/PtSAD和愈創木基丁香基木質素生物合成之間的原位關係，通過分析愈創木基和丁香基木質素在白楊莖的維管組織中的分布而鑑別。丁香基木質素可以通過Cross/Bevan或Maule顏色反應(Nakano和Meshitsuka，1992)與愈創木基木質素原位顯色區分。這兩種方法中基於木質素的發色團形成機制是相似的。丁香基核心的氯化產生粉色(正在木質化的細胞)或紅色(已經木質化的細胞)，而愈創木基核心產生淡褐色(正在木質化細胞)至深褐色(已經木質化細胞)(Bland，1966；Wardrop，1981)。在這些實驗中使用Cross/Bevan方法，因為其反應條件適度，解決了在Maule生色反應中通常發生的薄組織切片破壞的問題。
在初生維管組織中，木質素只在木質部中觀測到，而且是愈創木基類型，通過在莖節間1-4之間原生木質部和後生木質部導管元件的褐色染色而證實(圖7A和7B)。這一點可以通過對莖木質素進行硫酸解分析而進一步證實，其表明只檢測到愈創木基單體(圖7D)。初生木質部是唯一含有純化的愈創木基木質素的莖組織(圖7E-7G)。在次生維管系統分化期間出現愈創木基-丁香基木質素，這通過對莖節間5及遠端進行化學分析表明(圖7H)。然而，丁香基木質素在愈創木基木質素之後在次生木質部中沉積，這通過分別在發育中，部分木質化，及廣泛木質化次生木質部元件中由淡褐色至粉色然後紅色的顏色變化而表明(圖7G)。這與報導的丁香基木質素在愈創木基之後在被子植物木質部細胞中相繼沉積相一致(Terashima等，1986；Saka和Goring，1988)。
聚集的原生韌皮部實質細胞，初級韌皮部纖維的前體(Esau，1965)，存在於初級生長組織中(圖7A-7C)，但這些細胞不發生木質素染色，可能因為其缺少次生壁增厚過程。一旦木質化和次生增厚過程開始，它們也不能愈創木基木質素染色(圖7I)。取而代之，隨著它們分化為纖維，在這些細胞中發生丁香基陽性粉色(圖7I)至紅色(圖7E和7F)生色。事實上，已知韌皮部纖維富含丁香基木質素，但它們也積聚愈創木基-丁香基木質素(Grand等，1982)。總而言之，這些觀測表明與次生木質部元件中木質化順序不同，在初級韌皮部纖維中丁香基木質素的生物合成領先，愈創木基木質素生物合成被壓制。
免疫定位用於證實PtCAD是否與合成愈創木基木質素的初級木質部相關，及PtCAD和PtSAD的分布是否與韌皮部和木質部分子中愈創木基和丁香基木質素沉積模式一致。也分析了另一種丁香基途徑蛋白PtCAd5H的分布。實施例8白楊莖節間中PtCAD，PtCAd5H和PtSAD的免疫定位使用與在蛋白質凝膠印跡分析期間的那些相似條件進行細胞免疫定位，通過這些條件證實PtCAD和PtSAD抗體的特異性(圖4E和4F)。在與氮藍四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸底物進行抗兔IgG-鹼性磷酸酶反應後，在組織切片中顯色PtSAD和PtCAld5H。用Fast Red底物顯示PtCAD信號。分析系列切片。與抗PtCAD，抗PtSAD或抗PtCAId5H抗血清在相同蛋白質濃度使用的免疫前血清不產生免疫標記信號(數據未示出)。在第三個節間，幾乎僅在發育的後生木質部維管中檢測到PtCAD(圖8A)。在後生維管中未檢測到PtSAD，但其在原生韌皮部實質細胞和實質貯藏組織髓鞘中最顯著(圖8B)。
PtCAld5H的細胞分布(圖8C)與PtSAD的細胞分布一致。在第三個節間，木質化和次生壁增厚已經在後生木質部維管中開始，但在原生韌皮部實質細胞中未開始(圖7A-7C)。一致地，在原生韌皮部實質細胞中觀測不到木質素生色反應(圖7A)，儘管在這些細胞中檢測到PtSAD和PtCAld5H(圖8B和8C)。然而，在第6節間，丁香基木質素沉積(圖7I)和PtSAD信號(數據未示出)在這些分化為初級韌皮部纖維的細胞中均觀測到。在第8節間，在這些分化的纖維細胞中PtSAD信號消失(圖8E)，意味著在這些細胞中接近完全的丁香基單木質醇生物合成(圖7E)。
在這個階段，在這些成熟纖維中PtCAD比PtSAD更顯著(圖8D)，表示愈創木基單木質醇的活性生物合成。由於初級韌皮部持續其向心分化進程，新的韌皮部實質細胞在朝向莖中心的成熟纖維鄰近出現。這些新初級韌皮部纖維前體(Esau，1965)用PtSAD得以標記(圖8E)，但仍然不能用PtCAD標記(圖8D)。在第12節間，PtSAD信號在初級韌皮部纖維中消失(圖8I)，提示在這些細胞中丁香基單木質醇生物合成完成。然而，PtCAD信號在這些成熟纖維中明顯保持(圖8H)。在第15節間，PtCAD或PtSAD在完全木質化的這些纖維中均檢測不到(數據未示出)。這些結果與組織化學木質素定位結果一致，表明在初級韌皮部纖維中丁香基木質素的生物合成領先於愈創木基木質素的生物合成。
然而，這些原形成層衍生的初級韌皮部分子和次生木質部呈現相反的木質化順序。PtCAD比PtSAD在木質部紡錘狀原始細胞中出現的早(圖8H和8I)，與在次生木質部中丁香基木質素的生物合成落後於愈創木基木質素生物合成的化學和組織化學結果一致。另外，在分化的次生木質部中，PtCAD信號在成熟維管中最顯著(圖8F和8H)，但在發育的纖維和輻射狀細胞中也很明顯。PtSAD信號在富含丁香基木質素的徑向和軸向輻射細胞中最強(圖8G)(Wardrop和Dadswell，1952；Musha和Goring，1975)，而且在成熟纖維細胞中也較顯著，但在發育的維管中幾乎沒有(圖8G和8I)。次生木質部中這些蛋白質分布模式在較早的節間保持不變(數據未示出)。這些結果與組織化學觀測結果一致，表明PtCAD與在愈創木基木質素合成中特異的細胞相關，PtSAD和PtCAd5H與含有富含丁香基木質素的維管元件相關。實施例9在轉化植物中富含丁香基的木質素的產生以下遺傳轉化舉例示出了植物中富含丁香基的木質素的產生A.為在被子植物中產生富含丁香基的木質素，將被子植物用在任何適當啟動子驅動下的有義SAD基因通過任何適當遺傳轉化系統遺傳轉化。
B.為在裸子植物中產生富含丁香基的木質素，將裸子植物用在任何適當啟動子驅動下的有義SAD基因通過任適當遺傳轉化系統遺傳轉化。
現在對本發明已經加以描述及特異性舉例描述，本領域技術人員意識到可以在所述範圍內進行各種修改，包括變化，添加及省略。因此，本發明也涵蓋了這些修改，而且本發明的範圍僅限於所附權利要求書的最廣泛的法定解釋範圍內。
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序列表110密西根理工大學管理委員會120植物中富含丁香基的木質素的遺傳工程130066040-9686140Unknown1412001-09-0515060/230,0861512000-09-051604170PatentIn version 3.021012111446212DNA213aspen populus tremuloides4001tttttttttt tttcctagcc ttccttctcg acgatatttc tctatctgaa gcaagcacca60tgtccaagtc accagaagaa gaacaccctg tgaaggcctt cgggtgggct gctagggatc120aatctggtca tctttctccc ttcaacttct ccaggagggc aactggtgaa gaggatgtga180ggttcaaggt gctgtactgc gggatatgcc attctgacct tcacagtatc aagaatgact240ggggcttctc catgtaccct ttggttcctg ggcatgaaat tgtgggggaa gtgacagaag300ttgggagcaa ggtgaaaaag gttaatgtgg gagacaaagt gggcgtggga tgcttggttg360gtgcatgtca ctcctgtgag agttgtgcca atgatcttga aaattactgt ccaaaaatga420tcctgacata cgcctccatc taccatgacg gaaccatcac ttacggtggc tactcagatc480acatggtcgc taacgaacgc tacatcattc gattccccga taacatgccg cttgacggtg540gcgctcctct cctttgtgcc gggattacag tgtatagtcc cttgaaatat tttggactag600atgaacccgg taagcatatc ggtatcgttg gcttaggtgg acttggtcac gtggctgtca660aatttgccaa ggcctttgga tctaaagtga cagtaattag tacctcccct tccaagaagg720aggaggcttt gaagaacttc ggtgcagact catttttggt tagtcgtgac caagagcaaa780tgcaggctgc cgcaggaaca ttagatggca tcatcgatac agtttctgca gttcaccccc840ttttgccatt gtttggactg ttgaagtctc acgggaagct tatcttggtg ggtgcaccgg900aaaagcctct tgagctacct gccttttctt tgattgctgg aaggaagata gttgccggga960gtggtattgg aggcatgaag gagacacaag agatgattga ttttgcagca aaacacaaca1020tcacagcaga tatcgaagtt atttcaacgg actatcttaa tacggcgata gaacgtttgg1080ctaaaaacga tgtcagatac cgattcgtca ttgacgttgg caatactttg gcagctacga1140agccctaagg agaagatccc atgttctcga accctttata aaatctgata acatgtgttg1200atttcatgaa taaatagatt atctttggga tttttcttta ataaacgaag tgttctcgaa1260aacttaacat cggcaatacc ctggcagcta cgagaaacgc tttagaattg tttgtaagtt1320tgtttcatta gggtgatacc atgctctcga gtcctttgta agatccattt atagttgcgt1380gaatgctatg aacaaataat atgtttgcgg cttctcttca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1440aaaaaa14462102211362212PRT213aspen populus tremuloides4002Met Ser Lys Ser Pro Glu Glu Glu His Pro Val Lys Ala Phe Gly Trp1 5 10 15Ala Ala Arg Asp Gln Ser Gly His Leu Ser Pro Phe Asn Phe Ser Arg20 25 30Arg Ala Thr Gly Glu Glu Asp Val Arg phe Lys Val Leu Tyr Cys Gly35 40 45Ile Cys His Ser Asp Leu His Ser Ile Lys Asn Asp Trp Gly Phe Ser
50 55 60Met Tyr Pro Leu Val Pro Gly His Glu Ile Val Gly Glu Val Thr Glu65 70 75 80Val Gly Ser Lys Val Lys Lys Val Asn Val Gly Asp Lys Val Gly Val85 90 95Gly Cys Leu Val Gly Ala Cys His Ser Cys Glu Ser Cys Ala Asn Asp100 105 110Leu Glu Asn Tyr Cys Pro Lys Met Ile Leu Thr Tyr Ala Ser Ile Tyr115 120 125His Asp Gly Thr Ile Thr Tyr Gly Gly Tyr Ser Asp His Met Val Ala130135 140Asn Glu Arg Tyr Ile Ile Arg Phe Pro Asp Asn Met Pro Leu Asp Gly145150 155 160Gly Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr Ser Pro Leu Lys165 170 175Tyr Phe Gly Leu Asp Glu Pro Gly Lys His Ile Gly Ile Val Gly Leu180 185 190Gly Gly Leu Gly His Val Ala Val Lys Phe Ala Lys Ala Phe Gly Ser195 200 205Lys Val Thr Val Ile Ser Thr Ser Pro Ser Lys Lys Glu Glu Ala Leu210 215 220Lys Asn Phe Gly Ala Asp Ser Phe Leu Val Ser Arg Asp Gln Glu Gln225230 235 240Met Gln Ala Ala Ala Gly Thr Leu Asp Gly Ile Ile Asp Thr Val Ser245 250 255Ala Val His Pro Leu Leu Pro Leu Phe Gly Leu Leu Lys Ser His Gly260 265 270Lys Leu Ile Leu Val Gly Ala Pro Glu Lys Pro Leu Glu Leu Pro Ala275 280 285Phe Ser Leu Ile Ala Gly Arg Lys Ile Val Ala Gly Ser Gly Ile Gly290 295 300Gly Met Lys Glu Thr Gln Glu Met Ile Asp Phe Ala Ala Lys His Asn305310 315 320Ile Thr Ala Asp Ile Glu Val Ile Ser Thr Asp Tyr Leu Asn Thr Ala325 330 335Ile Glu Arg Leu Ala Lys Asn Asp Val Arg Tyr Arg Phe Val Ile Asp340 345 350Val Gly Asn Thr Leu Ala Ala Thr Lys Pro355 360210321l23212DNA213aspen populus tremuloides4003ggcatatgtc caagtcacca gaa 23210421127212DNA213aspen populus tremuloides4004tgcggccgcg ggcttcgtag ctgccaa2權利要求
1.一種分離的芥子醇脫氫酶(SAD)基因。
2.一種cDNA，其包含編碼SAD或其功能片段的核苷酸序列。
3.一種cDNA，其包含編碼具有與SAD基本相似胺基酸序列並呈SAD活性的多肽的核苷酸序列。
4.權利要求2的cDNA，其由SEQ ID NO1組成。
5.一種分離並純化的DNA分子，其包含具有植物SAD基因轉錄調節區域的DNA節段。
6.一種分離的多核苷酸，其包含選自SEQ ID NO1核苷酸序列的互補序列、反向互補序列和反向序列的一個核苷酸序列。
7.一種分離的多核苷酸，其包含在嚴格雜交條件下與以下序列雜交的一個核苷酸序列(a)SEQ ID NO1；(b)(a)序列的互補序列；(c)(a)序列的反向互補序列；及(d)(a)序列的反向序列。
8.一種多核苷酸，其包含與以下序列只有一或多個保守缺失、插入或取代而不同的一個核苷酸序列(a)SEQ ID NO1；(b)(a)序列的互補序列；(c)(a)序列的反向互補序列；及(d)(a)序列的反向序列。
9.一種多核苷酸，其包含與以下序列有至少70％序列相似性的核苷酸序列(a)SEQ ID NO1；(b)(a)序列的互補序列；(c)(a)序列的反向互補序列；及(d)(a)序列的反向序列。
10.由權利要求2的cDNA編碼的多肽，其包含具有SAD序列的胺基酸序列，或其具有基本類似於SAD或其功能片段的胺基酸序列的序列保守變體。
11.權利要求10的多肽，其由SEQ ID NO2組成。
12.一種改變植物組織中木質素單體組成的方法，包括(a)導入一種DNA構建體，其包含編碼SAD或基本類似於SAD的多肽序列的核苷酸序列，其中所述序列可操縱地與在植物宿主中起作用的啟動子和基因終止序列連接；(b)再生所述植物細胞以提供轉基因植物；及(c)在轉基因植物細胞中以有效改變植物的木質素單體組成的量表達所述DNA構建體。
13.權利要求12的方法，其中所述植物組織是植物細胞，植物器官或完整植物。
14.權利要求12的方法，其中所述植物組織選自由被子植物和裸子植物組成的一組。
15.一種產生具有改變的木質素結構的植物細胞的方法，包括(a)用權利要求9的多核苷酸轉化植物細胞以產生轉基因植物細胞；及(b)在有利於再生和成熟植物生長的條件下培養所述轉基因細胞。
16.一種修飾植物中酶活性的方法，包括在植物基因組中穩定摻入權利要求9的多核苷酸。
17.一種改變植物中木質素含量或組成的方法，包括通過轉化將一個重組DNA穩定摻入植物基因組，所述重組DNA包含一個基因啟動子序列和一個基因終止子及一個間插區域，所述間插區域包含一個編碼與內源性植物芥子醇脫氫酶基因具有足夠序列相似性的DNA序列的核苷酸序列，以便當所述核苷酸序列表達時，所述內源性植物芥子醇脫氫酶基因的表達被抑制，而且其中所述核苷酸序列是植物芥子醇脫氫酶基因或其功能片段。
18.一種提高植物中芥子醇脫氫酶活性的方法，包括通過轉化將一個重組DNA穩定摻入植物細胞培養物的基因組中，所述重組DNA包含一個基因啟動子序列和一個基因終止子及一個間插區域，所述間插區域包含一個編碼與內源性植物芥子醇脫氫酶基因具有足夠序列相似性的DNA序列的核苷酸序列，以便當所述核苷酸序列表達時，所述內源性植物芥子醇脫氫酶基因表達提高；從含有插入的重組DNA的培養物中選擇細胞；從選擇的細胞中再生完整植物；並選擇再生自所選擇細胞的具有特徵在於芥子醇脫氫酶活性降低的表型的完整植物，其中所述核苷酸序列是植物芥子醇脫氫酶基因或其功能片段。
19.一種在基因組中摻入了重組DNA分子的植物，所述重組DNA分子包含編碼SAD的核苷酸序列。
20.權利要求19的植物，其是樹。
21.權利要求19的植物，其中所述編碼SAD的核苷酸序列是有義方向。
22.權利要求19的植物，其中所述植物是被子植物。
23.權利要求19的植物，其中所述植物是裸子植物。
24.一種具有實質性改變的木質素單體組成的轉基因植物，其包含一種重組DNA分子，該重組DNA分子包含可操縱地連接於一個啟動子的編碼植物SAD的核苷酸序列，所述重組DNA以有效改變植物的木質素單體組成的量表達。
25.一種轉基因植物細胞，其包含一種DNA構建體，所述DNA構建體具有一個啟動子序列，一個SAD編碼區域和一個終止子序列。
26.一種包含權利要求25的轉基因植物細胞的植物，及其果實，種子和後代。
27.一種用於摻入植物基因組以改變植物木質素單體組成的DNA構建體，其包含一個可操縱連接的基因啟動子序列，一個編碼SAD的核苷酸序列或與其基本相似的序列，及在植物細胞中起作用的基因終止子。
28.一種轉基因植物，其包含權利要求27的DNA構建體。
29.權利要求27的DNA構建體，其中所述植物是裸子植物。
30.權利要求27的DNA構建體，其中所述植物是被子植物。
31.權利要求27的DNA構建體，其中所述編碼SAD的核苷酸序列是有義方向。
32.權利要求27的DNA構建體，其中所述編碼SAD的核苷酸序列是反義方向。
33.權利要求27的DNA構建體，其中所述啟動子可以是組成型或組織特異性的。
34.權利要求27的DNA構建體，其中所述啟動子可以是同源或異源的。
35.一種DNA構建體，其從5』至3』方向包含(a)一個基因啟動子序列，(b)一個多核苷酸，其具有權利要求8或9任一項的序列，SEQID NO1或基本相似序列，包含編碼參與木質素生物合成途徑的酶的基因；及(c)一個基因終止序列。
36.權利要求27的DNA構建體，其中所述非編碼區是有義方向。
37.權利要求27的DNA構建體，其中所述非編碼區是反義方向。
38.權利要求27的DNA構建體，其中所述基因啟動子序列提供在木質部中轉錄。
39.一種DNA構建體，其包含一個基因啟動子序列，和一個基因終止子，及一個間插區域，所述間插區域包含編碼一種蛋白質的核苷酸序列，該核苷酸序列與內源性植物芥子醇脫氫酶基因具有足夠序列相似性，當所述核苷酸序列表達時，所述內源性植物基因的表達被抑制，所述內源性植物基因是編碼芥子醇脫氫酶的基因，其中所述核苷酸序列是植物芥子醇脫氫酶基因或其功能片段。
40.一種DNA構建體，其從5』至3』方向包含(a)一個基因啟動子序列，(b)權利要求8或9任一項的多核苷酸，其包含編碼參與木質素生物合成途徑的一種酶的至少一個功能部分的至少一個開放讀框；及(c)一個基因終止序列。
41.一種改變植物中木質素組成的方法，包括在所述植物基因組中摻入權利要求27的DNA構建體，所述摻入在使得至少一部分植物細胞有效將所述構建體摻入植物基因組的量和條件下進行。
42.權利要求41的方法，其中所述改變的木質素組成與相對於基因組中未摻入所述DNA構建體的相似對照植物而言丁香基單木質醇的增加相關。
43.一種獲得植物中芥子醇脫氫酶表達改變的方法，包括在所述植物基因組中摻入權利要求27的DNA構建體。
44.權利要求43的方法，其中所述改變的表達與與相對於基因組中未摻入所述DNA構建體的相似對照植物而言芥子醇脫氫酶表達的增加相關。
全文摘要
本發明涉及一種新的DNA序列，其編碼一種先前未鑑別的木質素生物合成途徑的酶，芥子醇脫氫酶(SAD)，該酶調節植物中丁香基木質素的生物合成。本發明還提供了將這一新SAD基因或其基本相似序列摻入植物基因組以在植物中進行富含丁香基的木質素的遺傳工程的方法。
文檔編號C12N15/29GK1473198SQ01818406
公開日2004年2月4日 申請日期2001年9月5日 優先權日2000年9月5日
發明者文森特·李·C·姜, 李來庚, 文森特 李 C 姜 申請人:密西根理工大學管理委員會