幹細胞因子抑制劑的製作方法

2023-07-09 18:59:01 4

幹細胞因子抑制劑的製作方法
【專利摘要】本文提供的是涉及幹細胞因子抑制劑的方法、組合物和用途。例如，本文提供的是靶向幹細胞因子的抗體和用於治療纖維化和組織重塑疾病的方法。
【專利說明】幹細胞因子抑制劑
[0001]本申請要求於2011年I月10日提交的美國專利申請序列號61/431，246的優先權，該申請為了所有目的通過引用整體併入本文。 [0002]關於聯邦資助的研究或研發的聲明
[0003]本發明是在由美國國家衛生研究院頒發的HL059178撥款下藉助政府資助進行的。政府對本發明具有一定的權利。
發明領域
[0004]本文提供的是涉及幹細胞因子抑制劑的方法、組合物和用途。例如，本文提供的是靶向幹細胞因子的抗體和用於治療纖維化和組織重塑疾病的方法。
[0005]背景
[0006]牽涉組織重塑和纖維化的疾病是全世界死亡的主要原因。在西方世界中差不多45%的所有正常死亡可歸因於某些類型的慢性纖維增生性疾病並且相關的衛生保健費用為數十億美元。組織重塑是現有組織的再生或修復，其可以變化組織的特性(例如，血管重塑)或參與建立組織的動態平衡(例如骨重塑)。纖維化是作為修整或反應過程在器官或組織中形成或產生過量纖維結締組織，而不是形成纖維組織作為器官或組織的正常組分。纖維化影響幾乎所有組織和器官系統，並且纖維化組織可影響癌症轉移並且加速移植受者中的慢性移植物排斥。其中纖維化是發病率和死亡率的主要原因的疾病包括間質性肺疾病、肝硬化、腎病、心臟病和系統性硬化症等。
[0007]幹細胞因子(SCF)及其受體c-Kit已牽涉纖維化和組織重塑疾病(El-Koraie等人，Kidney Int.60:167 (2001) ;Powell 等人，Am.J.Physiol.289:G2 (2005) ；EI Kossi 等A, Am.J.Kidney Dis.41:785(2003) ;Powell 等 A, Am.J.Physiol.277:C 183(1999))。c-Kit是III型受體酪氨酸激酶,其存在於許多細胞類型(Orr-Urtreger等人,Development109:911(1990))。其也在分化的早期階段表達(Andre等人，Oncogene 4:1047(1989))且某些腫瘤表現出升高的c-kit的表達。SCF是c-Kit受體激酶特異性的配體。結合導致c-Kit的二聚化及其激酶活性的活化。首先從鼠成纖維細胞的上清液分離出SCF。此時，SCF被稱為肥大細胞生長因子(MGF) (Williams等人，Cell 63:167(1990))或造血生長因子KL(Kit配體)(Huang等人，Cell 63:225(1990))。隨後從大鼠肝細胞分離出同源物，稱為幹細胞因子(SCF) (Zsebo等人，Cell 63:195(1990))。相應的人蛋白質被不同地命名為不同的SCF、MGF、青灰因子(SF) (Cell 63:203(1990))。
[0008]先前的研究已表明C-Kit受體酪氨酸激酶的抑制劑能顯著抑制異常組織纖維化(參見，例如 Aono, Am.J.Respir.Crit.Care Med.171: 1279 (2005) ；Vuorinen 等人，Exp.Lung Res.33:357 (2007) ;Vittal 等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.321:35 (2007) ;Distler 等人，Arthritis Rheum 56:311 (2007))。然而，這種抑制劑具有若干個缺點。它需要通過口服施用來全身給藥，它具有一些與其應用相關的毒性，並且該化合物必須在細胞內遞送以發揮效力。因此，需要替代療法。
[0009]發明概述[0010]本文提供的是涉及幹細胞因子抑制劑的方法、組合物和用途。例如，本文提供的是靶向幹細胞因子的抗體和用於治療纖維化和組織重塑性疾病以及用於研究和診斷性用途的方法。
[0011]在一些實施方案中，本文的組合物、方法和用途提供涉及抑制幹細胞因子(SCF)的療法。一些實施方案提供靶向SCF的分離的抗體。在一些實施方案中，抑制SCF會影響C-Kit的活性。本發明提供的組合物、方法和用途可用於治療與組織重塑相關的纖維化疾病和病症。不像某些其它療法由於幹擾一般胞內信號傳導途徑而產生不希望的副作用，本文提供的實施方案通過調節SCF的活性而消除或減少此類副作用。因此，使毒性降至最小。而且，靶向胞外配體不需要將組合物遞送到細胞中以與胞內目標相互作用。在一些實施方案中，將組合物遞送到氣道中，從而提供了相比於需要口服施用的先前技術的優勢，且因此導致全身性生物利用度。 [0012]在一些實施方案中，本文提供的是包括提供幹細胞因子抑制劑和向受試者施用治療有效量的抑制劑的方法。在一些實施方案中，抑制劑是分離的抗體或其抗原結合片段(例如、Fab、Fab1、F(ab' )2和？￥片段等)。在一些實施方案中，抑制劑是小幹擾RNA。在更具體的實施方案中，抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。一些實施方案提供了特異性結合幹細胞因子的抗體或其抗原結合片段。一些實施方案提供了特異性結合包含胺基酸序列SEQ ID No:1或SEQ ID No:8的肽的抗體或其抗原結合片段。
[0013]在本文提供的方法的一些實施方案中，受試者患有疾病。因此，一些實施方案提供了施用抑制劑可預防疾病的至少一種體徵或症狀或減輕其嚴重度。在一些實施方案中，受試者具有幹細胞因子的異常活性或受試者具有異常的膠原蛋白生成。在一些實施方案中，受試者患有疾病，所述疾病包括但不限於纖維化或重塑疾病。在另外的實施方案中，疾病是肺部疾病。一些實施方案提供了受試者患有肺部疾病，所述肺部疾病包括但不限於特發性肺纖維化、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫症候群、囊性纖維化、支氣管周圍纖維化、過敏性肺炎或哮喘。此外，一些實施方案提供了受試者患有疾病，所述疾病包括但不限於硬皮症(scleiOdoma)、炎症、肝硬化、腎纖維化、實質纖維化、心內膜心肌纖維化、縱膈纖維化、結節性表皮下纖維變性、纖維組織細胞瘤、纖維胸、肝纖維化、纖維肌痛、齒齦纖維化或輻射誘導的纖維化。
[0014]儘管不限於施用方式，但是在方法的一些實施方案中，將抗體遞送到受試者的氣道中，例如通過鼻內施用。
[0015]在一些實施方案中，施用抑制劑會降低受體的活性。一些實施方案提供了施用抑制劑會降低幹細胞因子與受體的相互作用。在更具體的實施方案中，受體是受體酪氨酸激酶，而在另一更具體的實施方案中，受體是c-Kit。重要的是，本方法不限於靶向受體的位置或幹細胞因子的來源。例如，在一些實施方案中，受體在造血祖細胞、黑素細胞、生殖細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、成纖維細胞、肌成纖維細胞或肥大細胞中發現。另外，在一些實施方案中，幹細胞因子源於骨髓細胞、肝細胞、上皮細胞、平滑肌細胞或成纖維細胞。在一些實施方案中，向受試者施用抑制劑會導致直接抑制成纖維細胞活化。
[0016]一些實施方案提供了包含特異性結合幹細胞因子的分離的抗體或其抗原結合片段(例如蛋白或其肽片段(例如表位))的組合物。例如，一些實施方案提供了特異性結合包含胺基酸序列SEQ ID No:1的肽的分離的抗體或其抗原結合片段的組合物。另外的實施方案提供了結合SCF同工型b前體(例如，以GenBank登錄號NP_000890可用的序列(SEQ ID NO:4)的蛋白或肽片段)、或其變體或修飾形式、或SCF同工型a前體(例如，以GenBank登錄號NP_003985可用的序列(SEQ ID NO:6)的蛋白或肽片段)、或其變體或修飾形式的抗體或抗原結合片段。一些實施方案提供了結合蛋白或肽、或其變體或修飾形式的抗體或抗原結合片段，所述蛋白或肽為SCF的NCBI Reference Gene Sequence (例如,登錄號NG_012098(SEQ ID NO:7))的翻譯產物或變體或其片段。一些實施方案提供了結合包含SCF成熟形式的前11個胺基酸(例如，EGICRNRVTNN(SEQ ID NO:8))的肽的抗體或抗原結合片段。
[0017]一些實施方案提供了抗體或抗原結合片段，其結合編碼SCF的核酸或其變體或修飾形式的翻譯產物(例如，蛋白或肽)、或其變體或修飾形式。例如，實施方案提供了抗體或抗原結合片段，其結合具有如下序列的核酸的翻譯產物(例如，蛋白或肽)、或其變體或修飾形式，所述序列包含由 GenBank 登錄號 NM_000899 (SEQ ID NO:3)、NM_003994 (SEQ IDNO:5)和NG_012098(SEQ ID NO:7)、或其片段或變體(例如，可操作地連接到調控元件(例如，啟動子、增強子、聚合酶結合位點等)的突變體、cDNA、表達優化的變體等)定義的序列。在一些實施方案中，抗體或抗原結合片段結合蛋白或肽、或其變體或修飾形式，所述蛋白或肽為編碼肽序列EGICRNRVTNN(SEQ ID NO:8)的核苷酸序列的翻譯產物。肽和蛋白(及其片段和變體)以及編碼肽和蛋白(及其片段和變體)的核酸(及其片段和變體)在一些實施方案中用於產生抗體。還期望的是，用於生產本文提供的抗體的載體、質粒、表達構建體、細胞、細胞系、雜交瘤和有機體。
[0018]一些實施方案提供單克隆抗體而一些實施方案提供人源化抗體。在一些實施方案中，組合物用於藥物或用於製備藥物。在一些實施方案中，所述藥物用於治療疾病。組合物作為藥物的用途不限於可得以治療的疾病。例如，在一些實施方案中，疾病為特發性肺纖維化、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫綜合症，囊性纖維化、支氣管周圍纖維化、過敏性肺炎、哮喘、硬皮病、炎症、肝硬化、腎纖維化、實質纖維化、心內膜心肌纖維化、縱膈纖維化、結節性表皮下纖維變性、纖維組織細胞瘤、纖維胸、肝纖維化、纖維肌痛、齒齦纖維化或輻射誘導的纖維化。在一些實施方案中，組合物用於研究體外或模型系統(例如體內)的疾病。
[0019]本文實施方案提供了製備靶向幹細胞因子的抗體(例如，單克隆抗體)的方法，其包括以下步驟:提供包含SCF的免疫原性部分(例如，由SEQ ID NO:1或8提供)或由其組成的肽，用肽對宿主進行免疫，從宿主分離免疫細胞，使用免疫細胞製備雜交瘤，以及分離抗體或其抗原結合片段。一些實施方案提供了製備靶向幹細胞因子的抗體(例如，單克隆抗體)的方法，其中抗體或其抗原結合片段特異性結合幹細胞因子(例如，蛋白或其肽片段(例如，表位))。例如，一些實施方案提供了製備特異性結合包含胺基酸序列SEQ ID NO:I的肽的分離的抗體或其抗原結合片段的方法。另外的實施方案提供了製備抗體或抗原結合片段的方法，所述抗體或抗原結合片段結合SCF同工型b前體(例如，以GenBank登錄號NP_000890可用的序列(SEQ ID NO:4)的蛋白或肽片段)、或其變體或修飾形式、或SCF同工型a前體(例如，以GenBank登錄號NP_003985可用的序列(SEQ ID NO:6)的蛋白或肽片段)、或其變體或修飾形式。一些實施方案提供了製備結合蛋白或肽、或其變體或修飾形式的抗體或抗原結合片段的方法，所述蛋白或肽為SCF的NCBI Reference Gene Sequence (例如，登錄號NG_012098 (SEQ ID NO:7))或變體或其片段的翻譯產物。一些實施方案提供了製備抗體或抗原結合片段的方法，所述抗體或抗原結合片段結合包含SCF成熟形式的前11個胺基酸(例如，EGICRNRVTNN(SEQ ID NO:8))的肽。
[0020]一些實施方案提供了製備抗體或抗原結合片段的方法，抗體或抗原結合片段結合編碼SCF的核酸或其變體或修飾形式的翻譯產物(例如，蛋白或肽)、或其變體或修飾形式。例如，實施方案提供了製備抗體或抗原結合片段的方法，所述抗體或抗原結合具有如下序列的核酸的翻譯產物(例如，蛋白或肽)、或其變體或修飾形式，所述序列包含由GenBank登錄號 NM_000899 (SEQ ID NO:3)、NM_003994 (SEQ ID NO:5)和 NG_012098 (SEQ ID NO:7)、或其片段或變體(例如，可操作地連接到調控元件(例如，啟動子、增強子、聚合酶結合位點等)的突變體、cDNA、表達優化的變體等)定義的序列。在一些實施方案中，抗體或抗原結合片段結合蛋白或肽、或其變體或修飾形式，所述蛋白或肽為編碼肽序列EGICRNRVTNN (SEQID N0:8)的核苷酸序列的翻譯產物。肽和蛋白(及其片段和變體)以及編碼肽、蛋白及其片段和變體的核酸(及其片段和變體)在一些實施方案中用於製備由提供的技術所提供的抗體的方法。還期望的是，生產可用於生產本文提供的抗體的載體、質粒、表達構建體、細胞、細胞系、雜交瘤和有機體的方法。
[0021]一些實施方案提供包括以下步驟的方法:提供幹細胞因子抑制劑，以及將所述抑制劑施用至細胞或組織。
[0022]此外，一些實施方案提供了試劑盒，其包括包含特異性結合幹細胞因子的分離的抗體或其抗原結合片段的組合 物，用於將所述組合物施用至受試者的裝置，和/或使用說明。
[0023]基於本文所包含的教導，其他實施方案對相關領域的技術人員而言將是顯而易見的。
[0024]附圖簡述
[0025]結合下列附圖，本技術的這些和其它特徵、方面和優點將變得更好理解。
[0026]圖1不出的一系列圖表表明用抗體抑制SCF降低組織重塑介體的表達。圖1A不出的圖表表明抗SCF抗體降低用博來黴素處理的肺中羥脯氨酸的量；圖1B示出的圖表表明抗SCF抗體降低了 IL-25mRNA的量；圖1C示出的圖表表明抗SCF抗體降低IL_13mRNA的量；圖1D示出的圖表表明抗SCF抗體降低存在於血漿中的可溶性SCF的量。圖1E示出的圖表表明抗SCF抗體降低IL-25受體的量。
[0027]圖2示出的圖表表明IL-4刺激人成纖維細胞中的c-kit表達。
[0028]圖3示出了用於產生SCF特異性的抗體的免疫原性肽的胺基酸序列和對應的核苷酸序列。
[0029]圖4示出的曲線表明SCF特異性的單克隆抗體抑制用於MCP-1生成的HMC-1細胞的活化。
[0030]圖5示出的圖表表明在博來黴素損傷後SCF生成缺陷的小鼠中檢測到較少量的羥
脯氨酸。
[0031]發明詳述
[0032]本文提供的是涉及幹細胞因子抑制劑的方法、組合物和用途。例如，本文提供的是靶向幹細胞因子的抗體、產生靶向幹細胞因子的抗體的方法和用於治療纖維化和組織重塑疾病以及用於研究和診斷用途的方法。在一些實施方案中，本文的組合物、方法和用途提供涉及抑制幹細胞因子(SCF)的療法。一些實施方案提供靶向SCF的分離的抗體。在一些實施方案中，抑制SCF會影響c-Kit的活性。本發明提供的組合物、方法和用途可用於治療與組織重塑相關的纖維化疾病和痼疾。
[0033]定義
[0034]為了便於理解本技術的實施方案，下面定義多個術語和短語。其它定義在整個詳述中提出。
[0035]在整個說明書和權利要求中，下列術語採用本文明確相關的含義，除非上下文另外明確規定。本文中所用的短語「在一個實施方案中」不一定指相同的實施方案，儘管有此可能。而且，本文中所用的短語「在另一個實施方案中」不一定指不同的實施方案，儘管有此可能。因此，如下所述，本發明的各個實施方案可以容易地組合，而不脫離本發明的範圍或精神。
[0036]此外，本文中所用的術語「或」是包含性的「或」操作符，相當於術語「和/或」，除非上下文另外明確規定。術語「基於」不是唯一的，並且可以基於未被描述的其他因素，除非上下文另外明確規定。此外，在整個說明書中，「一(a)」、「一(an)」和「該(the)」的含義包括複數指示物。「in」的含義包括「在…中」和「在…上」。
[0037]術語「蛋白」和「多肽」指包含通過肽鍵連接的胺基酸的化合物，且可互換使用。由基因編碼的「蛋白」或「多肽」不限於由基因編碼的胺基酸序列，但包括蛋白的翻譯後修飾。
[0038]當本文所述的術語「胺基酸序列」是指蛋白分子的胺基酸序列時，「胺基酸序列」等類似術語如「多肽」或「蛋白」不意味將胺基酸序列限於與所述蛋白分子相關的完全、天然胺基酸序列。此外，「胺基酸序列」可由編碼蛋白的核酸序列演繹。
[0039]術語「新生的」當用於形容蛋白時是指新合成的蛋白，它沒有經歷翻譯後修飾，包括但不限於糖基化和多肽縮短。術語「成熟」當用於形容蛋白時是指這樣的蛋白，其已經受翻譯後加工和/或其處於可執行特定功能的細胞位置(例如在膜或多分子複合物內)，如果其未處於該位置則不能執行特定功能。
[0040]術語「部分」當用於形容蛋白時(如在「給定蛋白質的一部分」中)是指該蛋白的片段。該片段的大小範圍可以從4個胺基酸殘基到整個胺基酸序列減去一個胺基酸(例如，大小範圍包括4、5、6、7、8、9、10或11個…胺基酸至整個胺基酸序列減去一個胺基酸)。
[0041]術語「同源物」或「同源的」當用於形容多肽時是指兩個多肽之間的高度序列同一性或者三維結構之間的高度相似性或活性位點與作用機理之間的高度相似性。在優選的實施方案中，同源物與參考序列具有大於60%的序列同一'丨生,更優選大於75%的序列同一性，進一步更優選大於90%的序列同一性。
[0042]術語「變體」和「突變體」當用於形容多肽時是指與另一個通常相關的多肽相差一個或多個胺基酸的胺基酸序列。變體可以具有「保守性」改變，其中取代的胺基酸具有相似的結構或化學性質。一類保守性胺基酸取代是指具有類似側鏈的殘基的可互換性。例如，具有脂族側鏈的胺基酸組是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂族-羥基側鏈的胺基酸組是絲氨酸和蘇氨酸；具有含醯胺側鏈的胺基酸組是天冬醯胺和穀氨醯胺；具有芳族側鏈的胺基酸組是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有鹼性側鏈的胺基酸組是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；和具有含硫側鏈的胺基酸組是半胱氨酸和甲硫氨酸。優選的保守性胺基酸取代基團是:纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸以及天冬醯胺-穀氨醯胺。更罕見地，變體可以具有「非保守性」改變(例如用色氨酸替換甘氨酸)。類似的次要變化還可以包括胺基酸缺失或插入(即加成)，或兩者。可使用本領域熟知的電腦程式，例如DNAStar軟體來找出確定哪個和多少胺基酸殘基可以被取代、插入或缺失而不破壞生物活性的指導。可以在功能測定中測試變體。優選的變體具有小於10%，優選小於5%，進一步更優選小於2%改變(不管是置換還是缺失等)。
[0043]術語「結構域」當用於形容多肽時是指具有獨特的結構和/或功能特性的多肽的子部分；通常，這種特性在不同多肽中是類似的。子部分通常包含連續胺基酸，儘管它也包括協力作用的或由於摺疊或其他構型而非常鄰近的胺基酸。蛋白結構域的實例包括跨膜結構域，和糖基化位點。
[0044]術語「基因」是指包含對於產生RNA所需的編碼序列的核酸(例如DNA或RNA)序列，或多肽或其前體(例如胰島素原)。功能多肽可由全長編碼序列或由編碼序列的任何部分編碼，只要保留多肽的所需活性或功能性質(例如酶活性、配體結合、信號轉導等)。術語「部分」當用於形容基因時是指該基因的片段。該片段的大小範圍可以從幾個核苷酸到整個基因序列減去一個核苷酸。因此，「包含基因的至少一部分的核苷酸」可包含基因的片段或整個基因。
[0045]術語「基因」也涵蓋結構基因的編碼區且包括與編碼區5'和3'兩個末端相鄰、距離任一端大約Ikb的序列，使得所述基因對應於全長mRNA的長度。位於編碼區的5'端並存在於mRNA上的序列被稱作5'非 翻譯序列。位於編碼區的3'端或下遊並存在於mRNA上的序列稱作3'非翻譯序列。術語「基因」包括cDNA和基因的基因組形式。基因的基因組形式或克隆包含被稱作「內含子」或「間插區」或「間插序列」的非編碼序列中斷的編碼區。內含子是轉錄成核RNA(hnRNA)的基因的片段；內含子可含有調控元件如增強子。內含子從核或初級轉錄物中被除去或「剪接去除」；因此內含子在信使RNA(mRNA)轉錄物中不存在。在翻譯過程中mRNA起到的作用是確定新生多肽中的胺基酸的序列或順序。
[0046]除了含有內含子，基因的基因組形式還可以包括位於存在於RNA轉錄體的序列的 和3'端的序列。這些序列稱為「側翼」序列或區域(這些側翼序列位於存在於mRNA轉
錄物的非翻譯序列的5』或3』端)。5』側翼區可含有控制或影響基因轉錄的調控序列，例如啟動子和增強子。3』側翼區可含有指導轉錄終止、轉錄後切割和多腺苷酸化的序列。
[0047]術語「寡核苷酸」或「多核苷酸」或「核苷酸」或「核酸」是指包含兩個或更多個、優選超過三個，通常超過十個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。確切大小將取決於許多因素，而這又取決於寡核苷酸的最終功能或用途。寡核苷酸可以以任何方式產生，包括化學合成、DNA複製、逆轉錄或其組合。
[0048]術語「具有編碼基因的核苷酸序列的寡核苷酸」或編碼指定多肽的「核酸序列」是指包含基因的編碼區的核酸序列，或者換言之，編碼基因產物的核酸序列。編碼區可以以cDNA、基因組DNA或RNA形式存在。當以DNA形式存在時，寡核苷酸可以是單鏈(即有義鏈)或雙鏈的。合適的調控元件例如增強子/啟動子、剪接點、多腺苷酸化信號等可以放置在靠近基因的編碼區(如果需要)以允許適當的轉錄起始和/或初級RNA轉錄物的正確加工。可選地，本發明的表達載體中使用的編碼區可含有內源性增強子/啟動子、剪接點、間插序列、多腺苷酸化信號等或者內源性和外源性控制元件的組合。
[0049]術語「重組體」當形容核酸分子時是指包含藉助於分子生物技術連在一起的核酸的區段的核酸分子。術語「重組體」當形容蛋白質或多肽時是指使用重組體核酸分子進行表達的蛋白分子。
[0050]術語「互補」和「互補性」是指通過鹼基配對規則關聯的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列「5' -A-G-T-3' 」和序列「3' -T-C-A-5' 」互補。互補性可以是「部分的」，其中僅一些核酸的鹼基依據鹼基配對規則匹配。或者，核酸之間可以存在「完全」或「全部」互補性。核酸鏈之間的互補程度對於核酸鏈之間的雜交的效率和強度具有重大影響。這在擴增反應，以及依賴於核酸之間的結合的檢測方法中特別重要。
[0051]術語「野生型」當形容基因時是指具有分離自天然存在的來源的基因的特徵的基因。術語「野生型」當形容基因產物時是指具有分離自天然存在的來源的基因產物的特徵的基因產物。術語「天然存在的」當應用於某個對象時是指對象可在自然界中發現的事實。例如，可以從天然來源中分離並沒有通過人在實驗室中進行有意的修飾的生物體(包括病毒)中存在的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。野生型基因通常是這樣的基因，即該基因是在群體中最經常觀察到的，並且因此任意指定為「正常」或「野生型」形式的基因。相反，術語「修飾的」或「突變體」當形容基因或基因產物時分別是指與野生型基因或基因產物相比顯示序列中的修飾和/或功能特性(即改變的特性)的基因或基因產物。應當指出，天然存在的突變體能夠分離；它們通過與野生型基因或基因產物相比具有改變的特性的事實得以鑑定。
[0052]術語「等位基因」是指基因中不同的變化；該變化包括但不限於變體和突變體，多態性基因座和單核苷酸多態性基因座、移碼和剪接突變。等位基因可以在群體中天然存在，或者它可能在群體的任何特定個體的壽命期間出現。
[0053]因此，術語「變體」和「突變體」當用於形容核苷酸序列時是指與另一個通常相關的核酸序列相差一個或多個核苷酸的核酸序列。「變化」是兩個不同的核苷酸序列之間的差異；通常，一個序列是參考序列。
[0054]術語「反義」是指脫氧核糖核苷酸序列，其脫氧核糖核苷酸殘基的順序是與DNA雙鏈體的有義鏈中脫氧核糖核苷酸殘基的順序逆向的5'到3'方向。DNA雙鏈體的「有義鏈」是指DNA雙鏈體中的一條鏈，它由細胞在其自然狀態下轉錄成「有義mRNA」。因此，「反義」序列是具有與DNA雙鏈體中非編碼鏈相同的序列的序列。術語「反義RNA」是指與目標初級轉錄物或mRNA的全部或部分互補並通過幹擾其初級轉錄物或mRNA的處理、運輸和/或翻譯來阻斷目標基因的表達的RNA轉錄物。反義RNA的互補性可以是與特定基因轉錄物的任何部分，即在5'非編碼序列、3'非編碼序列、內含子或編碼序列處。此外，本文中所用的反義RNA可包含增加反義RNA阻斷基因表達的功效的核酶序列的區域。「核酶」是指催化RNA，且包括序列特異性核糖核酸內切酶。「反義抑制」是指能夠阻止目標蛋白的表達的反義RNA轉錄物的生產。
[0055]本文中使用的術語「引物」是指一種寡核苷酸，無論是在純化的限制酶切消化中天然產生的還是合成生產的，所述寡核苷酸在被置於誘導合成與核酸鏈互補的引物延伸產物的條件下(即，在核苷酸和誘導劑如DNA聚合酶存在下以及在合適的溫度和pH下)時能夠充當合成的起始點。該引物優選為單鏈以實現最大擴增效率，但是可替代地為雙鏈。如果為雙鏈，則在用於製備延伸產物之前，先處理該引物以分離它的鏈。優選地，該引物是寡脫氧核糖核苷酸。該引物必須足夠長，以在誘導劑的存在下引發延伸產物的合成。該引物的確切長度將取決於許多因素，包括溫度、引物來源和使用方法。
[0056]術語「探針」是指一種寡核苷酸(即核苷酸序列)，無論是在純化的限制酶切消化中天然產生的還是通過合成、重組或通過PCR擴增生產的，所述寡核苷酸能夠與另一種所關注的寡核苷酸雜交。探針可以為單鏈或雙鏈的。探針可用於特定基因序列的檢測、鑑定和分離。預期本發明中使用的任何探針可以用任何「報告分子」標記，以便在任何檢測系統中都可檢測到該探針，所述檢測系統包括但不限於酶(例如ELISA，以及基於酶的組織化學測定)系統、螢光系統、放射性系統和發光系統。本發明不意圖限於任何特定檢測系統或標記 。
[0057]術語「分離的」當用於形容核酸時，如在「分離的寡核苷酸」中，是指這樣的核酸序列，其被鑑定並且從至少一種在其天然來源中通常與其相關的汙染核酸中分離出。分離的核酸以不同於其在自然界中被發現的形式或背景存在。相反地，未分離的核酸，例如DNA和RNA，以其在自然界中存在的狀態被發現。未分離的核酸的實例包括:被發現在宿主細胞染色體上與相鄰基因接近的給定DNA序列(例如基因)；以具有許多其他編碼大量蛋白的mRNA的混合物形式存在於細胞中的RNA序列，例如編碼特定蛋白的特定mRNA序列。然而，編碼給定蛋白的分離的核酸包括，例如，在細胞中通常表達蛋白質的此類核酸，其中所述核酸處於與天然細胞的染色體位置不同的染色體位置，或者所述核酸的側翼存在不同於在自然界被發現的核酸序列的核酸序列。所述分離的核酸或寡核苷酸可以單鏈或雙鏈形式存在。當要利用分離的核酸或寡核苷酸表達蛋白質時，所述寡核苷酸將至少含有有義鏈或編碼鏈(例如，所述寡核苷酸可以是單鏈的)，但是可以含有有義鏈和反義鏈(即，所述寡核苷酸可以是雙鏈的)。
[0058]術語「純化的」是指核酸或胺基酸序列的分子，它們從其天然環境取出、分離或分開。因此「分離的核酸序列」可以是純化的核酸序列。「基本上純化的」分子至少60%、優選至少75%、更優選至少90%不含有其他與其天然相關的組分。本文中所用的術語「純化的」或「以純化」還指從樣品中移除汙染物。移除汙染蛋白質導致所關注的多肽在樣品中的百分比增加。在另一個實例中，在植物、細菌、酵母或哺乳動物宿主細胞中表達重組多肽，並且通過除去宿主細胞蛋白來純化所述多肽；由此提高樣品中重組多肽的百分比。
[0059]術語包含給定的多核苷酸序列或多肽的「組合物」泛指任何組合物，其包含給定多核苷酸序列或多肽。該組合物可以包括水溶液。包含多核苷酸序列或其片段的組合物可用作雜交探針。在一些實施方案中，多核苷酸序列以水溶液形式使用，所述水溶液含有鹽(例如NaCl)、洗滌劑(例如SDS)和其他組分(例如Denhardt溶液、奶粉、鮭魚精子DNA等)。
[0060]術語「測試化合物」是指任何化學實體、藥品、藥物等，它們可以用於治療或預防人體功能的疾病、病患、疾患或病症，或者改變樣品的生理或細胞狀態。測試化合物包括已知的和潛在的治療化合物。可以通過使用本發明的篩選方法進行篩選將測試化合物確定為具有治療性。「已知的治療性化合物」是指已顯示(例如通過動物試驗或之前關於施用於人的經歷)在此類治療或預防中有效的治療化合物。
[0061]如本文中使用，在廣泛意義上使用的術語「抗體」是指整個抗體、單克隆抗體(包括人、人源化或嵌合抗體)、多克隆抗體及其抗體片段，它們可以結合抗體(例如Fab'、F' (ab)2、Fv、單鏈抗體)，包含前述的互補決定區(⑶R)，只要它們表現出所需的生物活性。
[0062]本文中使用的「抗體片段」包含完整抗體的一部分，優選為完整抗體的抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙鏈抗體；線性抗體(Zapata等人，Protein Eng.,8(10):1057-1062(1995));單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
[0063]「特異性結合」特定多肽或特定多肽上的表位或對特定多肽或特定多肽上的表位有「特異性」的抗體是結合該特定多肽或特定多肽上的表位，而基本上不結合任何其它多肽或多肽表位的抗體。
[0064]本文中使用的「有效」或「活性」是指天然或天然存在的生物學和/或免疫學活性。
[0065]本文中使用的術語「體外」是指人工環境和在人工環境內發生的過程和反應。體外環境包括但不限於試管和細胞培養。術語「體內」是指天然環境(例如動物或細胞)和在天然環境內發生的過程或反應。
[0066]本文中使用的「抑制劑」是指一種分子，其可以消除、最小化或降低目標的活性，例如生物學、酶、化學或免疫學活性。
[0067]本文中使用的術語「疾病」是指偏離對於物種成員視為正常的或平均的條件，並且其在對該物種的大多數個體沒有不利的條件下對受影響的個體有害(例如腹瀉、噁心、發熱、疼痛、炎症等)。
[0068]本文中所用的術語「施用」是指向生理系統(例如受試者受試者或體內、體外或離體細胞、組織和器官)給予藥物、前藥、抗體或其他試劑，或治療性處理的行為。對於人體的示例性施用途徑可以通過眼睛(眼部)、口腔(經口、皮膚(經皮)、鼻子(經鼻)、肺(吸入)、口腔黏膜(經頰)、耳、通過注射(例如靜脈內、皮下、腫瘤內、腹膜內等)等。「共施用」是指向生理系統施用多於一種的化學試劑或治療性處理(例如放射療法)，所述生理系統例如受試者或體內、體外或離體細胞、組織和器官。本文中使用的與一種或多種額外的治療劑「聯合施用」包括同時(並行)施用和以任何順序連續施用。治療性處理的「共施用」可以同時，或以任何時間順序或物理結合。
[0069]本文中所用的術語「治療」包括通過以任何方式將本技術的治療組合物引入受試者的體內或身體上來減輕或緩解疾病或病症的至少一種副作用或症狀。「治療」指治療性處理和預防或預防性措施，其中目的是預防或減緩(減輕)靶向的病理疾患或病症。需要治療的受試者包括已患該病症的受試者以及易患該病症的受試者或要預防該病症的受試者。
[0070]本文中使用的「治療有效量」是指足以產生有益或所需的臨床效果的治療劑的量。所述劑量可以一次或多次施用進行施用。然而，精確地確定被認為是有效劑量的量可以取決於每位患者的個體因素，包括但不限於，患者的年齡、大小、疾病的類型或程度、疾病的階段、施用途徑、所用的輔助治療的類型或程度、正在進行的疾病過程，以及所需的治療類型(例如積極性治療與常規治療)。
[0071]本文中使用的術語「有效量」是指足以實現有益或所需的結果的組合物的量。有效量可以以一或多次施用、應用或劑量進行施用，且不意欲限於特定的製劑或施用途徑。
[0072]本文中使用的術語「藥物組合物」是指活性劑與(按需要)惰性或活性載體的組合，使組合物特別適合用於體內、體外或離體的診斷性或治療性用途。
[0073]本文中使用的術語「藥學上可接受的」或「藥理學上可接受的」是指當向受試者施用時基本不會產生不利反應例如毒性、過敏性或免疫反應的組合物。
[0074]本文中使用的「載體」包括藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑，它們對於暴露在所用的劑量和濃度的細胞或哺乳動物是無毒的。通常，生理學上可接受的載體是水性PH緩衝溶液。生理學上可接受的載體的實例包括緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA ;糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成鹽平衡離子，例如鈉；和/或非離子型表面活性劑。
[0075]本文中使用的術語「患者」或「受試者」是指通過本技術的組合物來治療或經受通過本技術提供的各種試驗的生物體。術語「受試者」包括動物，優選哺乳動物，包括人。在優選的實施方案中，受試者是靈長類動物。在更優選的實施方案中，受試者為人。
[0076]本文中使用的術語「樣品」以其最廣泛的意義使用。在一種意義上其可以指動物細胞或組織。在另一種意義上，它意在包括從任何來源獲得的樣本或培養物，例如生物和環境樣品。生物樣品可以從植物或動物(包括人)獲得並且涵蓋流體、固體、組織和氣體。環境樣品包括環境材料，例如表面物質、土壤、水和工業樣品。這些實例不應被解讀為限制適用於本技術的樣品類型。
[0077]本技術的實施方案 [0078]儘管本文的公開內容是指某些示例性實施方案，但是應當理解，這些實施方案是作為實例提出，而不是作為限制。
[0079]1.SCF 抑制劑
[0080]幹細胞因子(SCF)是C-Kit受體激酶特異性的配體。SCF與c_Kit的結合導致C-Kit的二聚化和其激酶活性的活化，這是對於血細胞生成、黑素原生成和能育性是重要的。通過c-Kit，SCF的作用是促進細胞存活、增殖、分化、粘附和功能活化。c-Kit的異常活化可導致疾病，包括纖維化和組織重塑缺陷。特別地，存在具有已知重塑缺陷的多種肺部疾病以及影響其它器官和組織的其它慢性組織重塑疾病。例如，涉及纖維化或組織重塑缺陷的疾病的具體實例為特發性肺纖維化、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫綜合症，囊性纖維化、支氣管周圍纖維化、過敏性肺炎、哮喘、硬皮病、炎症、肝硬化、腎纖維化、實質纖維化、心內膜心肌纖維化、縱膈纖維化、結節性表皮下纖維變性、纖維組織細胞瘤、纖維胸、肝纖維化、纖維肌痛、齒齦纖維化或輻射誘導的纖維化。
[0081]因此，幹擾SCF和C-Kit之間的相互作用可用於治療或研究涉及引起纖維化和組織重塑缺陷的C-Kit的異常活化的疾病。C-Kit受體在造血祖細胞、黑素細胞、生殖細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和肥大細胞上發現。因此，防止SCF與c-Kit的相互作用可以改變數種疾病相關細胞群體的活化，該細胞群體均已牽涉纖維化和組織重塑疾病表型。
[0082]此外，SCF誘導纖維化反應中的關鍵介體，IL-25和IL-13。數據表明IL-25可以驅動IL-13以T細胞和抗原非依賴性方式表達。因此，這些方法可在無抗原特異性應答下發展並且因此長期維持重塑和纖維化疾病。可以預期建立複雜的級聯，其中SCF誘導IL-25，其反過來誘導產生IL-13，肌成纖維細胞分化和膠原蛋白生成。IL-4已被鑑定為纖維化相關的細胞因子。
[0083]2.抗體
[0084]在一些實施方案中，抑制SCF與C-Kit相互作用的能力藉助於識別SCF的抗體來達成。抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，並且例如可以是人、人源化或嵌合抗體。針對目標抗原的單克隆抗體通過多種技術來製備，所述技術包括常規單克隆抗體方法學，例如KiMller和Milstein的體細胞雜交技術(Nature 256:495(1975))。儘管在一些實施方案中，體細胞雜交方法是優選的，但也涵蓋其它生產單克隆抗體的技術(例如B淋巴細胞的病毒或致癌轉化)。
[0085]可以預期，針對SCF的抗體可用於本文所述的實驗性、診斷性和治療性方法。在某些實施方案中，本文提供的抗體用於檢測生物樣品中SCF的表達。例如，可將包括組織活檢的樣品切片並且使用例如免疫螢光或免疫組織化學來檢測蛋白。可選地，可將來自樣品的單個細胞分離，並且通過FACS分析在固定細胞或活細胞上檢測蛋白質表達。此外，可在蛋白質陣列上使用抗體來檢測SCF的表達。在其它實施方案中，在體外基於細胞的測定或體內動物模型中使用本文提供的抗體以通過抑制SCF來降低表達c-Kit的細胞的活性。在一些實施方案中，通過施用治療有效量的針對SCF的抗體將抗體用於治療人類患者。
[0086]為了生產抗體，可通過用對應於所需表位(例如，SCF片段，例如，包含由SEQ IDNO:1或8或其免疫原性部分提供的序列的片段)的肽注射來對各種宿主動物進行免疫，所述宿主動物包括但不限於兔子、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。可通過用抗原進行免疫(例如，通過注射)產生SCF抗體，所述抗原包含SCF同工型b前體(例如，以GenBank登錄號NP_000890可用的序列(SEQ ID NO:4)的蛋白或肽片段)或其變體或修飾形式的肽、一部分或全蛋白、或SCF同工型a前體(例如，以GenBank登錄號NP_003985可用的序列(SEQID N0:6)的蛋白或肽片段)或其變體或修飾形式的肽、一部分或全蛋白。也可通過用SCF的 NCBI Reference Gene Sequence (例如，登錄號 NG_012098 (SEQ ID NO:7))或變體或其片段的翻譯產物進行免疫來產生抗體。
[0087]在一些實施方案中，所述肽與免疫原性載體(例如白喉類毒素、牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血藍蛋 白(KLH))綴合。使用各種佐劑來提高免疫應答，取決於宿主物種，包括但不限於弗氏佐劑(完全和不完全)、礦物凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質如溶血卵磷月旨、普郎尼克多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔血藍蛋白、二硝基酚和潛在有用的人佐劑如BCG (卡介苗)和短小棒狀桿菌。
[0088]多克隆抗體可通過任何已知方法來製備。可通過多次皮下或腹膜內注射在無菌鹽水中稀釋的任選地綴合至KLH、血清白蛋白等的相關抗原(純化的肽片段、全長重組蛋白、融合蛋白等)，通過對動物(例如兔子、大鼠、小鼠、驢等)進行免疫來產生多克隆抗體，並且將所述多克隆抗體與佐劑組合以形成穩定的乳劑。然後從經如此免疫的動物的血液、腹水等回收多克隆抗體。收集的血液凝結，並且傾析血清,通過離心來澄清,並測定抗體滴度。可以根據本領域的標準方法(包括但不限於親和色譜、離子交換色譜、凝膠電泳和透析等)從血清或腹水中純化多克隆抗體。
[0089]為了製備單克隆抗體，可使用提供通過培養中的連續細胞系生產抗體分子的任何技術(參見例如 Harlow 和 Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。這些技術包括但不限於最初由Kohler和Milstein開發的雜交瘤技術以及三瘤(trioma)技術、人B細胞雜交瘤技術(參見例如Kozbor等人，Immunol.Today,4:72(1983))、和生產人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(Cole 等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, Inc.,第 77-96頁(1985))。
[0090]在本文提供的一些實施方案中，由雜交瘤製備抗體。採用雜交瘤法，如上所述對小鼠、倉鼠或其它適當的宿主動物進行免疫以通過淋巴細胞引發將特異性結合免疫性抗原的抗體的生產。可選地，可在體外免疫淋巴細胞。免疫後，分離淋巴細胞，並使用例如聚乙二醇將其與適合的骨髓瘤細胞系融合以形成雜交瘤細胞，雜交瘤細胞隨後可以從未融合的淋巴細胞和骨髓瘤細胞中選出。通過免疫沉澱、免疫印跡或通過體外結合測定例如放射免疫測定(RIA)或酶聯免疫吸附測定(ELISA)來確定生產特別針對所選抗原的單克隆抗體的雜交瘤，然後可使用標準方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press, 1986)在體外(例如培養中)或作為動物中的腹水腫瘤在體內繁殖所述雜交瘤。然後，如對於上文多克隆抗所述，可從培養基或腹水液中純化單克隆抗體。
[0091]用於製備雜交瘤的優選動物系統是鼠系統。在小鼠中生產雜交瘤是一種眾所周知的方法。免疫方案和分離用於融合的經免疫的脾細胞的技術是本領域已知的。融合伴侶(例如鼠骨髓瘤細胞)和融合方法也是已知的。本技術的實施例方案提供由雜交瘤生產的抗體(例如單克隆抗體)，所述雜交瘤通過用為SCF蛋白的一部分或片段的肽對小鼠進行免疫而製備。例如，一些實施方案提供了抗體或抗原結合片段，其通過用例如以GenBank登錄號NP_000890可用的序列(SEQ ID NO:4)的蛋白、或肽片段或其變體或修飾形式、或通過用例如以GenBank登錄號NP_003985可用的序列(SEQ ID NO:6)蛋白或肽片段、或其變體或修飾形式進行免疫來結合SCF。一些實施方案提供了結合蛋白或肽、或其變體或修飾形式的抗體或抗原結合片段，所述蛋白或肽為SCF的NCBI Reference Gene Sequence (例如,登錄號NG_012098(SEQ ID NO:7))的翻譯產物或變體或其片段。
[0092]例如，本技術的實施例提供由雜交瘤生產的單克隆抗體，所述雜交瘤通過用胺基酸序列SEQ ID NO:1或8的肽對小鼠進行免疫而製備。還預期的是涉及使用包含一個或多個取代、缺失、插入或其他改變的SEQ ID NO:1或8的變體製備的抗體的方法和組合物，只要所述變體生產SCF特異性的抗體。生產SEQ ID NO:1或8和其類似序列的多肽可根據本領域熟知的各種技術來 達成。例如，SEQ ID NO:1或8的多肽或其變體可使用細胞表達系統和編碼SEQ ID NO:1或8的多肽或其變體的核酸來生產。舉例來說，根據SEQ ID NO:1的多肽可使用根據SEQ ID NO:2的核苷酸序列來生產。
[0093]而且，針對人蛋白的人單克隆抗體可以使用攜帶完整的人免疫系統而不是小鼠系統的轉基因小鼠來產生。將來自轉基因小鼠的脾細胞用所關注的抗原進行免疫，所述抗原用於生產分泌對人蛋白的表位具有特異性親和力的人單克隆抗體的雜交瘤。
[0094]單克隆抗體也可通過重組DNA【技術領域】技術人員已知的其它方法來產生。例如，組合抗體展示可用於產生單克隆抗體(參見例如，Sastry等人，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA,86:5728(1989) ；Huse 等人，Science, 246:1275(1989) ；Orlandi 等人，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 86:3833(1989))。如上所述用免疫原對動物進行免疫後，克隆所得到的B-細胞庫的抗體譜。通常，已知通過使用寡聚體引物和PCR的混合物而用於獲得不同免疫球蛋白分子群體的可變區的DNA序列的方法。例如，對應於5'前導(信號肽)序列和/或構架I (FRl)序列的混合型寡核苷酸引物，以及保守的3'區域的引物可用於擴增和分離來自多種鼠抗體的重鏈和輕鏈可變區(參見例如,Larrick等人,Biotechniques, 11:152(1991))。類似的策略也可用於擴增來自人抗體的人重鏈和輕鏈可變區(參見例如，Larrick等人，Methods !Companion to Methods in Enzymology, 2:106 (1991))。
[0095]可選地，單克隆抗體也可以通過使用重組DNA方法來製備，如描述於美國專利4，816，567中。編碼單克隆抗體的多克隆抗體(例如，從成熟B細胞或雜交瘤細胞)例如通過使用特異性擴增編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸引物的RT-PCR進行分離，並且其序列使用常規程序來確定。然後將所分離的編碼重鏈和輕鏈的多核苷酸克隆到適當的表達載體中，其當將該表達載體轉染到不另外生成免疫球蛋白的宿主細胞諸如大腸桿菌(E.coli)、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞中時，使單克隆抗體通過該宿主細胞產生。此外，所需物種的重組單克隆抗體或其片段可從所述的噬菌體展示文庫分離(McCafferty 等人，1990, Nature, 348:552-554 ；Clackson 等人，1991, Nature, 352:624-628 ;和 Marks 等人，1991，J.Mol.Biol.，222:581-597)。 [0096]編碼單克隆抗體的多核苷酸可以多種不同的方式使用重組DNA技術進一步修飾以產生替代抗體。在一些實施方案中，可以將例如小鼠單克隆抗體的輕鏈和重鏈的恆定結構域I)取代例如人抗體的那些區域以產生嵌合抗體，或2)取代非免疫球蛋白多肽以產生融合抗體。在其它實施方案中，截短或去除所述恆定區以產生單克隆抗體的所需抗體片段。此外，可以使用可變區的定點誘變或高密度誘變來優化單克隆抗體的特異性、親和力等。
[0097]例如，還預期的是嵌合小鼠-人單克隆抗體，這些抗體可以通過本領域已知的重組DNA技術來生產。例如，編碼鼠(或其它物種)單克隆抗體分子的恆定區的基因用限制酶消化以去除編碼鼠恆定區的區域，並且編碼人恆定區的基因的等同部分被取代(參見，例如Robinson等人、PCT/US86/02269 ;歐洲專利申請184，187 ;歐洲專利申請171，496 ；歐洲專利申請173,494 ；W0 86/01533 ；US 4,816, 567 ;歐洲專利申請125,023(各自通過引用整體併入本文)；Better 等人，Science, 240:1041-1043 (1988) ;Liu 等人，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 84:3439-3443(1987) ；Liu 等人，J.1mmunol.139:3521-3526(1987)；Sun 等人，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 84:214-218 (1987) ；Nishimura 等人，Proc.Res.，47:999-1005(1987) ；ffood 等人，Nature, 314:446-449(1985)和 Shaw 等人，J.Natl.CancerInst.,80:1553-1559(1988))o
[0098]嵌合抗體可以進一步通過用來自人可變區的等同序列替換不直接參與抗原結合的可變區的序列進行人源化。人源化嵌合抗體的一般綜述由S.L.Morrison, Science, 229:1202-1207(1985)和由 Oi 等人，Bio Techniques,4 =214(1986)提供。那些方法包括分離、操作和表達核酸序列，所述核酸序列編碼來自至少一條重鏈或輕鏈的免疫球蛋白可變區的全部或部分。這種核酸的來源是本領域技術人員熟知的。然後編碼嵌合抗體或其片段的重組DNA可以被克隆入適當的表達載體中。
[0099]合適的人源化抗體可通過⑶R取代來生產(參見，例如，US5, 225, 539 Jones等人，Nature, 321:552-525(1986) ;Verhoeyan 等人，Science, 239:1534(1988) JPBeidler等人，J.1mmunol., 141:4053 (1988))。特定人抗體的所有⑶R都可以用至少一部分非人⑶R替代或只有一些CDR可用非人CDR替代。僅需要替代對於人源化抗體與Fe受體結合而言重要的⑶R的數目。
[0100]抗體可通過任何方法人源化，所述方法能夠用衍生自非人抗體的CDR代替人抗體的CDR的至少一部分。人CDR可利用寡核苷酸定點誘變用非人CDR替代。
[0101]還預期了嵌合和人源化抗體，其中特定胺基酸已被取代、缺失或添加。特別地，優選的人源化抗體在框架區中具有胺基酸取代，例如以提高與抗原結合。例如，在具有小鼠CDR的人源化抗體中，位於人構架區的胺基酸可以被位於小鼠抗體中的相應位置的胺基酸替代。已知在某些情況下這種取代可提高人源化抗體與抗原的結合。
[0102]在本文提供的某些實施方案中，可取的是使用抗體片段。已知多種用於生產抗體片段的技術。傳統上，通過完整抗體的蛋白水解消化來衍生這些片段(例如Morimoto等人，1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 和 Brennan 等人，1985，Science，229:81)。例如，抗體的木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段(稱為Fab片段)，每個片段具有單個抗原結合位點和殘餘Fe片段。胃蛋白酶處理得到F(ab' )2片段，該片段具有兩個抗原聯合位點，並且仍能夠交聯抗原。
[0103]然而，這些片段現在通常由如上所述的重組宿主細胞直接生成。因此，Fab、Fv和scFv抗體片段均可在大腸桿菌或其它宿主細胞中表達和從其分泌，從而允許生成大量的這些片段。可選地，此類抗體片段可由上文討論的抗體噬菌體文庫分離。抗體片段還可以是線性抗體，例如如描述於美國專利5，641，870中，並且可以是單特異性或雙特異性的。用於生產抗體片段的其它技術對於熟練的專業人員將是顯而易見的。 [0104]Fv是最小抗體片段，其包含完整的抗原識別和抗原結合位點。該區域由緊密、非共價締合的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域的二聚體構成。在該構型中，每個可變結構域的三個CDR相互作用以限定Vh-Vl 二聚體的表面上的抗原結合位點。六個CDR共同賦予抗體以抗原結合特異性。然而，甚至單個可變域(或僅包含三個抗原特異性CDR的Fv的一半)具有識別並結合抗原的能力，但親和力比整個結合位點低。
[0105]Fab片段也包含輕鏈的恆定結構域和重鏈的第一恆定結構域(CHl)。Fab片段與Fabi片段的不同之處在於在包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸的重鏈CHl結構域的羧基末端添加數個殘基。F(ab' )2抗體片段最初生產為Fab'片段對，它們之間具有鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其它化學綴合也是本領域技術人員已知的。
[0106]本文提供的技術還涵蓋修飾抗體以增加其血清半衰期。這可以通過例如以下方法來實現:通過抗體片段中適當區域的突變而將補救受體結合表位引入到抗體片段中，或者將所述表位引入到肽標籤中，然後將肽標籤融合到抗體片段的任一端或抗體片段的中間(例如通過DNA或肽合成)。
[0107]本技術包括與本文提供的嵌合抗體、人源化抗體、和人抗體、或其抗體片段基本同源的變體和等效物。這些可以含有例如保守性取代突變，即一個或多個胺基酸被相似的胺基酸取代。例如，保守性取代是指一個胺基酸被屬於相同一般類別的另一個胺基酸取代，諸如，例如一個酸性胺基酸被另一個酸性胺基酸取代，一個鹼性胺基酸被另一個鹼性胺基酸取代，或一個中性胺基酸被另一個中性胺基酸取代。保守性胺基酸取代所指的意思在本領域中是熟知的。
[0108]另外的實施方案利用本領域已知的用於構建Fab表達文庫的技術(Huse等人，Science, 246:1275-1281(1989))以允許快速且容易鑑定具有所需特異性的單克隆Fab片段。
[0109]此外，該技術涵蓋特異性識別SCF的雙特異性抗體。雙特異性抗體是能夠特異性識別並結合至少兩種不同表位的抗體。雙特異性抗體可以是完整抗體或抗體片段。用於製備雙特異性抗體的技術是本領域常用的(Millstein等人，1983，Nature 305:537-539 ；Brennan 等人，1985, Science 229:81 ；Suresh 等人，1986, Methods in Enzymo1.121:120 ；Traunecker 等人，1991，EMBO J.10:3655-3659 ；Shalaby 等人，1992，J.Exp.Med.175:217-225 ；Kostelny 等人，1992，J.1mmunol.148:1547-1553 ；Gruber 等人，1994，J.1mmunol.152:5368 ;和美國專利 5，731，168)。
[0110]所述的用於生產單鏈抗體的技術(U.S.4，946，778 ;通過引用併入本文)可適於生產所需的特異性單鏈抗體。單鏈Fv抗體片段包含抗體的Vh和\結構域，其中這些結構域存在於單一多肽鏈中。優選地，Fv多肽進一步包含V1^P'結構域之間的多肽接頭，該接頭使得單鏈Fv抗體片段能夠形成抗原結合所需的結構。關於單鏈Fv抗體片段的綜述，參見 Pluckthun 的 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg和Moore 編輯，Springer-Verlag, New York,第 269-315 頁(1994)。
[0111]3.其它SCF抑制劑
[0112]還預期抑制SCF可以通過多種其它類型的抑制劑來實現。例如，在一些實施方案中，小幹擾RNA(siRNA)可用來靶向和降解SCFmRNA。siRNA是長度為20-25個核苷酸的雙鏈RNA分子。儘管其特徵不受限制於，但是通常SiRNA為21個核苷酸長，並且在兩端上具有2-核苷酸3'突出端。每條鏈具有5'磷酸基團和3'羥基。在體內，該結構是通過dicer酶處理的結果，所述酶將長的dsRNA或小髮夾RNA轉化為siRNA。然而，也可以合成siRNA並且將其外源引入細胞 中以產生所感興趣的基因的特異性敲除。序列已知的基本上任何基因可以基於與適當定製的siRNA的序列互補性被祀向。例如，本領域普通技術人員可合成siRNA (參見，例如，Elbashir 等人，Nature 411:494(2001) ;Elbashir 等人 Genes Dev 15:188(2001) ；Tuschl T 等人，Genes Dev 13:3191(1999))。
[0113]在一些實施方案中，RNAi用於抑制SCF。RNAi表示一種進化上保守的細胞防禦來控制外源基因在大多數真核生物(包括人)中的表達。RNAi通常由雙鏈RNA(dsRNA)觸發，並引起單鏈目標RNA(例如mRNA)的序列特異性降解。mRNA降解的介體是小幹擾RNA(SiRNA)，其通常由長dsRNA通過細胞中的酶促切割而產生。siRNA —般為大約21個核苷酸的長度(例如21-23個核苷酸長度)並且具有鹼基配對結構，其特徵在於兩個核苷酸
突出端。在向細胞引入小RNA或RNAi後，據信將序列遞送至稱作RISC(RNA誘導的沉默複合體)的酶複合體。RISC識別目標並用內切核酸酶切割它。應當注意，如果更大的RNA序列被遞送到細胞，則RNA酶III酶(例如Dicer酶)將較長的dsRNA轉化成21-23個核苷酸的雙鏈siRNA片段。在一些實施方案中，RNAi寡核苷酸被設計成靶向融合蛋白的連接區。化學合成的siRNA變成對於在培養的體細胞中哺乳動物基因功能的全基因組分析有效的試劑。超過它們用於驗證基因功能的價值，siRNA也具有作為基因特異性治療劑的巨大潛力(參見例如，Tuschl 和 Borkhardt,Molecular Intervent.2002 ；2(3):158-67,通過引用併入本文)。
[0114]siRNA轉染到動物細胞中導致有效的、持久的特定基因的轉錄後沉默(Caplen等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.2001 ；98:9742-47 ;Elbashir 等人，Nature.2001 ；411:494-98 ;Elbashir 等人，Genes Dev.2001 ；15:188-200 ;和 Elbashir 等人，EMBO J.2001 ；20:6877-88，其均通過引用併入本文)。用siRNA進行RNAi的方法和組合物描述於例如美國專利6，506, 559，通過引用併入本文。
[0115]siRNA特別有效地降低靶向的RNA的量及其蛋白產物，通常至檢測不到的水平。沉默效應可持續數月，並且極其特異-目標RNA與siRNA的中心區域之間的一個核苷酸錯配常常足以防止沉默(Brummelkamp等人，Science 2002 ；296:550-53 ;和Holen等人，Nucleic AcidsRes.2002 ；30:1757—66，其均通過引用併入本文)。
[0116]設計siRNA中的重要因素是存在用於siRNA結合的可及位點。Bahoia等人，(J.Biol.Chem.，2003 ；278:15991_97，通過引用併入本文)描述了使用稱為掃描陣列的一種DNA陣列以尋找mRNA中用於設計有效的siRNA的可及位點。這些陣列包括寡核苷酸，該寡核苷酸的尺寸範圍從單體至某個最大值，通常共聚體(Co-mer)，其通過逐步加入序列中的每個鹼基使用物理屏障(掩模)合成。因此，陣列代表目標基因區域的完全寡核苷酸互補序列。目標mRNA與這些陣列的雜交提供了該目標mRNA區域的詳盡可及性特徵。這種數據可用於設計反義寡核苷酸(範圍為7聚體到25聚體)，其中重要的是達到寡核苷酸長度與結合親和力之間的折中，例如以保留效力和目標特異性(Sohail等人，NucleicAcids Res.,2001 ;29 (10):2041-45)。用於選擇siRNA的其它方法和關注描述於例如WO05054270,W005038054A1,W003070966A2, J Mol Biol.2005 年 5 月 13 日；348 (4):883-93,J Mol Biol.2005 年 5 月 13 日；348(4):871_81，和 Nucleic Acids Res.2003 年 8 月 I 日；31(15):4417-24，其各自通過引用整體併入本文。此外，軟體(例如MWG在線siMAX siRNA設計工具)是商業或公共可獲得的，用於選擇和設計的siRNA和RNAi試劑。
[0117]在一些實施方案中，本發明利用包括平端的siRNA (參見例如US20080200420，通過引用整體併入本文)，突出端(參見例如US20080269147A1，通過引用整體併入本文)、鎖核酸(參見例如W02008/006369、W02008/043753和W02008/051306，其各自通過引用整體併入本文)。在一些實施方案中，siRNA經由基因表達或使用細菌來遞送(參見例如Xiang等人，Nature 24:6(2006)和W006066048，其各自通過引用整體併入本文)。
[0118]在其它實施方案中，利用shRNA技術(參見例如20080025958，通過引用整體併入本文)。小髮夾RNA或短髮夾RNA(shRNA)是緊密髮夾環的RNA的序列，其可用於通過RNA幹擾來沉默基 因表達。shRNA使用引入細胞中的載體並且利用U6啟動子以確保總是表達shRNA。該載體通常被傳遞到子代細胞，使基因沉默能夠遺傳。shRNA髮夾結構通過細胞機器切割成siRNA，其隨後結合到RNA誘導的沉默複合物(RISC)。該複合物結合併切割匹配siRNA且與其結合的mRNA。shRNA通過RNA聚合酶III轉錄。
[0119]本發明還包括包含如下所述的本發明的RNAi化合物的藥物組合物和製劑。
[0120]SCF以跨膜形式和可溶形式兩者存在。從跨膜形式切割SCF可溶性結構域後，SCF從細胞表面釋放以作為c-Kit的配體起作用。因此，預期SCF活性可以通過抑制可溶性SCF從膜結合形式的釋放來改變，例如，通過抑制或降低從膜結合形式裂解可溶性結構域的蛋白酶的活性。
[0121]此外，預期SCF可以被化學品(例如小分子，例如藥物)或者其它結合或修飾SCF的生物試劑抑制。例如，本領域的普通技術人員可設計和產生RNA適體或其它核酸適體，它們例如通過使用SELEX或本領域已知的其它體外進化方法來特異性地識別並結合SCF。此外，可通過如下抑制SCF活性:特異性降低SCF或誘導SCF的改變構象，使其不能有效地與c-Kit相互作用。在一些實施方案中，SCF抑制劑是一種「設計的錨蛋白重複蛋白」(DARPin)(參見例如，Stumpp MT&Amstutz P,「DARPins:a true alternative to antibodies」, CurrOpin Drug Discov Devel 2007,10(2):153_59，為了所有目的通過引用併入本文)。在一些實施方案中，SCF被小分子抑制，例如結合SCF且阻斷其功能的小分子(例如抑制其結合和/或其它與c-Kit受體的相互作用(例如活化相互作用))。
[0122]可以預期，可通過抑制SCF的表達來影響SCF活性，例如通過抑制SCF的轉錄，通過抑制SCF的翻譯，通過抑制SCF mRNA的加工，通過抑制SCF多肽的加工。通過抑制SCF多肽的摺疊，通過抑制SCF在細胞內運輸，或通過抑制SCF插入到質膜中。SCF活性可以通過染色質結構或其它表觀遺傳調節SCF的裝置的變化(例如DNA甲基化的變化)來改變。此外，SCF活性可以通過在囊泡或其它阻礙其對c-Kit的作用的細胞隔室中特異性隔離SCF來改變。
[0123]4.使用SCF抑制劑的療法
[0124]抑制SCF可用於治療疾病的療法。因此，本文提供了包括抑制SCF以使患有疾病的個體獲益的療法。特別地，如本文所示，涉及纖維化和組織重塑的疾病狀態表現出異常的SCF活性。例如，分離自具有纖維化或組織重塑表型的患病個體的成纖維細胞直接響應SCF，其導致產生更嚴重的表型(包括增加的膠原生成)。因此，如本文所示，抑制SCF可顯著影響包括炎症和目標組織重塑的嚴重疾病後果的產生。還預期的是在產生與具有動態病程或更加可以預測的病程的急性和慢性病症相關的纖維化的期間靶向SCF的療法。可受益於抑制SCF的療法的適應症包括但不限於，特發性肺纖維化、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫綜合症，囊性纖維化、支氣管周圍纖維化、過敏性肺炎、哮喘、硬皮病、炎症、肝硬化、腎纖維化、實質纖維化、心內膜心肌纖維化、縱膈纖維化、結節性表皮下纖維變性、纖維組織細胞瘤、纖維胸、肝纖維化、纖維肌痛、齒齦纖維化或輻射誘導的纖維化。
[0125]重要的是，靶向SCF的療法降低或消除與其它類似療法(例如靶向C-Kit的那些療法)相關的毒性效應。這些不需要的毒性效應與靶向細胞內(而不是細胞外)目標以及產生的細胞信號傳導中的 更廣泛和一般的變化相關。儘管該療法並不局限於它們的施用途徑，但是本文提供的技術的實施方案通過鼻內施用經氣道SCF遞送抑制劑。這種施用能夠將治療劑直接遞送到牽涉纖維化和組織重建的肺病中的目標組織，而不是依賴於通過口服施用的組合物進行全身遞送。
[0126]在某些實施方案中，含有有效濃度的SCF特異性抗體的生理上適宜的溶液可通過局部、眼內、胃腸外、口服、鼻內、靜脈內、肌內、皮下、或通過任何其它有效的裝置來施用。特別地，抗體可通過鼻內施用被遞送到受試者的氣道中。可選地，組織可以通過用針直接注射或通過插管或其它遞送管來接收生理上適宜的組合物(例如無菌的溶液，諸如鹽水或磷酸鹽緩衝溶液、懸浮液或乳液)，其包含有效濃度的SCF特異性抗體。任何有效的成像裝置諸如X射線、超聲波掃描圖或光纖顯像系統可以用於定位目標組織和引導施用。在另一個替代方案中，包含有效濃度的SCF特異性抗體的生理上適宜的溶液可被全身施用到血液循環中以治療不能直接到達或解剖學上分離的組織。這類操作的共同目標是將有效濃度的SCF特異性抗體與目標組織充分接觸以實現SCF特異性抗體接觸組織。
[0127]至於向受試者施用SCF抑制劑(例如SCF特異性抗體)，預期以藥學有效量施用SCF抑制劑。本領域普通技術人員認識到，藥學有效量根據所用的治療劑、受試者的年齡、狀況和性別、以及受試者的疾病的程度而變化。通常，該劑量不應大到引起不良副作用，例如高粘滯性症候群、肺水腫、充血性心力衰竭等。該劑量也可以由各個醫師或獸醫調節來獲得所需的治療目的。[0128]如本文中使用，術語「藥學有效量」所涵蓋的實際量將取決於施用途徑、待治療的受試者的類型和所考慮的特定受試者的物理特性。確定該量的這些因素及其關係是醫學、獸醫和其它相關領域的熟練從業者熟知的。該量和施用方法可以經過調整來獲得最佳效力，但將取決於以下因素，諸如體重、飲食、並行的藥物治療、和本領域技術人員將認識到的其它因素。
[0129]在一些實施方案中，SCF抑制劑(例如SCF特異性抗體)根據本文提供的技術以藥學有效量施用。在一些實施方案中，SCF抑制劑(例如SCF特異性抗體)以治療有效劑量施用。可以對給藥量和頻率進行選擇以產生有效水平且基本上沒有有害作用的SCF抑制劑。當施用時，SCF抑制劑(例如SCF特異性抗體)的劑量範圍通常為0.001至10，OOOmg/kg/天或劑(例如0.01至1000mg/kg/天或劑；0.1至100mg/kg/天或劑)。
[0130]藥物組合物優選包含一種或多種本文發明化合物以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。藥學上可接受的載體是本領域已知的，諸如描述於例如Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing C0.(A.R.Gennaro 編輯，1985)中的那些載體。
[0131]在一些實施方案中，向受試者施用單一劑量的根據本文提供的技術的SCF抑制劑(例如SCF特異性抗體)。在其它實施方案中，在兩個或更多個由小時、天、周等隔開的時間點施用多個劑量。在一些實施方案中，在長時間(例如長期)施用化合物，例如施用數月或數年的時間(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多的月或年；例如受試者的一生)。在這些實施方案中，化合物可以定期(例如每天、每周等)服用，且服用較長的持續時間。
[0132]在一些實施方案中，SCF抑制劑(例如SCF特異性抗體)與另一種化合物或一種以上其它化合物(例如2種或3種或更多種其它化合物)共施用。
[0133]5.試劑盒
[0134]本文的一些實施方案提供用於治療受試者的試劑盒。在一些實施方案中，試劑盒包括SCF抑制劑和合適的溶液和緩衝液。實施例包括所有對照和使用說明。
實施例
[0135]材料和方法
[0136]SCF核苷酸序列和蛋白
[0137]編碼幹細胞因子(SCF)的人基因也稱為試劑盒配體並且具有官方標誌KITLG和HGNC 號數量 HGNC:6343。SCF 還被稱為 SF ；MGF ；SCF ；FPH2 ;KL_1 ；Kitl ；SHEP7 ;和 kit-配體。已發現該基因的兩個編碼不同同工型的轉錄物變體。SCF(試劑盒配體)同工型b前體可以 GenBank 登錄號 NM_000899 (mRNA 轉錄物；SEQ ID NO:3)和 NP_000890 (蛋白序列；SEQID NO:4)可用。SCF (試劑盒配體)同工型a前體可以GenBank登錄號NM_003994(mRNA轉錄物；SEQ ID NO:5)和 NP_003985(蛋白序列；SEQ ID NO:6)可用。NCBI Reference GeneSequence具有登錄號NG_012098 (SEQ ID No:7)。對於這兩種同工型，第一 25胺基酸包括信號肽並且成熟形式包括始於胺基酸26。成熟形式的前11個胺基酸是EGICRNRVTNN(SEQID NO:8)。
[0138]博來黴素模型
[0139]通過1.t.注射溶解於60μ I磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中的0.003U博來黴素(Blenoxane,無菌硫酸博來黴素；Bristol_Meyers Pharmaceuticals, Evansville, IN ；
0.15U/Kg小鼠體重)在無特異性病原體(SPF)雌性CBA/J小鼠(6_8周齡；The JacksonLaboratory,Bar Harbor,ME)中誘導間質性肺纖維化。對照通過相同的途徑接受60 μ I的PBS0所有程序在無菌環境中進行並且由制度動物護理和使用委員會批准。
[0140]全肺組織學
[0141]麻醉劑施行安樂死後，來自博來黴素攻擊的小鼠的全肺用用10%福馬林完全膨脹，切開，並置於新鮮福馬林中24小時。常規組織學技術用於將整個肺包埋在石蠟中，並且5 μ m全肺切片用蘇木精和曙紅染色。
[0142]抗-SCF多克隆抗體的生產和施用
[0143]抗-SCF抗體通過用重組(全蛋白)SCF對兔子進行免疫並且產生多克隆SCF特異性抗體而產生。用蛋白G柱從血清中分離多克隆抗體。將分離的IgG部分進行定量並且以懸浮於鹽水中的指定濃度使用。以類似的方式分離來自免疫前血清的IgG，用作對照。簡言之，在用博來黴素治療後7天，通過鼻內施用向小鼠給予100、150或200 μ g對照或抗-SCF。每天重複這種處理直至施用博來黴素後12天。因此，治療方案被認為是治療性的。
[0144]小鼠抗人單克隆抗體的產生
[0145]在識別免疫原性人肽(例如，SEQ ID NO:1或8)後，用標準協議對小鼠進行免疫。確定指示免疫和融合雜交瘤的高滴度血清抗體。分析來自各個克隆的培養物上清液的SCF特異性抗體並且基於特異性對上清液進行選擇。將生產針對肽的特異性單克隆抗體的五個雜交瘤進行繁殖並且隨後在生物學相關的培養物中測試具有最高滴度的單克隆。在一些實施方案中，具有序列EGICRNRVTNN (SEQ ID NO:8)的肽用於產生抗體(例如單克隆抗體)。在一些實施方案中，SCF蛋白序列(例如，由SEQ ID N0:4和/或SEQ ID NO:6提供)的任何肽片段(例如，抗原片段)用於產生抗體。在一些實施方案中，SCF的突變體或變體形式(例如，包含關於由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6提供的序列的一個或多個胺基酸取代)用於提供用於產生抗體的肽。應當理解，這些實施方案包括所用的分子生物學領域中已知的蛋白和肽的添 加、缺失、取代、翻譯後修飾(例如糖基化、環化、N-和C-末端修飾等)和其它變化，以提供用於產生抗體的肽。
[0146]測試小鼠抗人單克隆抗體
[0147]為了證明單克隆抗體抑制SCF，對SCF敏感的肥大細胞系進行測試。第一次使用表達c-Kit且對SCF響應的HMC-1細胞系、肥大細胞瘤細胞系。簡言之，將HMC-1細胞在特定生長培養基中培養並且以I X IO6個細胞/ml的濃度接種於24孔組織培養板中。將重組人SCF(l-100ng/ml)與單克隆抗-SCF抗體(Uyg/ml)混合，然後於37°C孵育30分鐘。孵育後，將抗體/SCF或單獨SCF加入到HMC-1細胞。在I小時或24小時後，收穫培養的HMC-1細胞，作為單克隆抗體抑制SCF的指示測量mRNA和蛋白質水平。
[0148]通過定量PCR分析mRNA表送
[0149]將待測試的細胞或組織分散於Iml Trizol試劑(Invitrogen)中。如所述(Invitrogen)分離RNA，將5 μ g的mRNA逆轉錄，以評價基因表達。細胞因子mRNA的檢測使用先前可得的引物/探針組(PE Biosystems,Foster City,CA)進行確定,並且使用ABIPrism 7500Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA)進行分析。作為用於標準化mRNA表達的對照測定GAPDH mRNA。相對於未攻擊的小鼠中的基因表達計算基因表達的改變。
[0150]細胞因子生成的確定
[0151]使用購自Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA)的基於 Bio-Plex 珠的細胞因子測定對細胞因子的蛋白水平進行定量。使用標準方案，使用該方法可以快速且持續地評價細胞因子的水平。
[0152]統計學分析
[0153]使用Prism GraphPad軟體分析數據。除非另有說明，否則所示數據代表兩個或更多個實驗。通過單向AN0VA、隨後Newman-Keuls後檢驗確定所有實驗的統計學顯著性。顯著性差異被視為P < 0.05。
[0154]來自患者群體的肺成纖維細胞的分離和繁殖
[0155]密西根大學醫學院的機構審查委員會批准了該研究。所有患者進行了臨床評價，包括胸部射線照相術、肺功能測量、和光纖支氣管鏡之前的薄片計算機斷層攝影術。在這些患者中，間質性肺炎由。症狀的編譯、生理症狀和射線照相術發現確定。在2000年5月至2002年5月之間，通過密西根大學醫學院的臨床核心設施由疑似患有間質性肺炎的患者獲得外科肺活檢。在經受胸廓切除的患者中由切除的樣本獲得組織學正常肺。每個活檢使用無菌技術在層流操作臺中分別進行處理，然後經處理用於培養原代成纖維細胞系。兩名病理學家未察覺任何其他臨床發現，獨立地評論每個活檢並且組織學分類是基於先前出版的特發性間質性肺炎的標準。
[0156]將間質性肺炎和正常活檢切碎並且分散的組織碎片置於150-cm2細胞培養燒瓶(Corninglnc.，Corning, NY)中，其含有補充有 15%胎牛血清(DMEM-15，BioWhittaker)、lmmol/L 穀氨酸胺(BioWhittaker)、100U/ml 青黴素(Bioffhittaker) > 100 μ g/ml 鏈黴素(Bioffhittaker )和 0.25 μ g 兩性黴素 B (Fungizone ；Bioffhittaker)的杜爾貝科氏改良伊格爾培養基(DMEM，Bioffhittakerffalkersville, MD)。在 37°C和 5% CO2 恆溫箱中將所有原代肺癌細胞系維持於DMEM-15中並且進行連續傳代(總共五次)以得到純的肺成纖維細胞群體。所有原代成纖維細胞系以第6代至第10代用於下述的實驗中並且所有實驗在可比較的條件下進行。
[0157]1.抗SCF抗體降低纖維化和炎症
[0158]在開發本技術實施方案的同時進行的實驗證實了抗-SCF抗體降低纖維化和炎症。如所述在小鼠中誘導肺纖維化。在博來黴素損傷後第7天，使小鼠經受利用抗-SCF抗體的治療，所述抗體通過鼻內施用用遞送到氣道中。繼續治療直到博來黴素暴露後第12天。第16天收穫肺，用顯微鏡檢查，並且拍攝一系列顯微照片。肺組織學證實了抗-SCF抗體減輕整體炎症。此外，減輕Masson』 s三色染色,它表示膠原蛋白沉積。
[0159]2.抗-SCF抗體降低SCF、羥脯氨酸、IL-25和IL-13的水平在開發本技術實施方案的同時對羥脯氨酸和特定細胞因子的水平進行監測。檢查來自上述實驗的肺組織切片中是否存在羥脯氨酸(一種膠原前體)。該數據顯示抗-SCF抗體以劑量依賴性方式降低羥脯氨酸的生成和SCF的血漿水平(圖1A和圖D)。另外，作為mRNA水平的函數測量的IL-25和IL-13表達減少，IL-25受體的表達也如此(圖1B、圖C和圖E)。
[0160]特別地，該實驗測試BLM模型中抗SCF抗體治療的效應(圖1)。在第O天用鹽水(圖1，「SAL」)或BLM(圖1，「BLM」)治療。在第8和12天，以指定的劑量用非免疫(圖1，「IgG」)抗體或抗-SCF抗體(圖l，「aSCF」)通過氣管內治療不同組。獲得並檢查各治療組的H&E染色的肺組織切片。纖維化通過生物化學方法被定量為肺羥脯氨酸含量(圖1A)。然後通過實時PCR分析肺的IL-13mRNA (圖1C)。從SAL-或BLM-治療的小鼠收集的血漿和肺組織隨後通過ELISA分析可溶性SCF(圖1D)或通過實時PCR分析IL_25mRNA(圖1B)。數值表示平均值土標準誤差(η = 7)。單個星號)表示與鹽水對照組相比的統計學顯著性(P < 0.05)，而雙星號1)表示相對於BLM+IgG對照組的顯著性。
[0161]3.1L-4刺激人成纖維細胞中的c-kit表達
[0162]在開發本技術實施方案的同時進行的實驗顯示IL-4刺激c-kit在人成纖維細胞中的表達。除了肺部炎症的小鼠模型之外，SCF受體還在被診斷為患有過敏性肺炎且因此具有促-纖維化環境的患者的成纖維細胞群體中表達。使來自患者(正常)和被診斷患有過敏性肺炎的患者的肺的正常區域的肺成纖維細胞生長。在用I或10ng/ml的IL-4刺激後測量c-kit的表達。使用實時PCR測定各個細胞系(133、131、173、177A、177B)。當用IL-4( 一種纖維化有關的細胞因子)刺激時，與生長的來自患有非纖維化疾病的患者的肺成纖維細胞相比，來自過敏性肺炎患者的成纖維細胞顯示c-kit的顯著上調。數據表明SCF活化來自炎性病變的成纖維細胞，而不是來自正常組織的那些，並且促進纖維化相關基因(包括膠原蛋白)的表達(圖2)。
[0163]4.小鼠抗人單克隆抗體阻斷SCF誘導的HMC肥大細胞活化
[0164]在開發本技術實施方案的同時進行的實驗顯示SCF特異性單克隆抗體抑制用於MCP-1生產的HMC-1細胞的活化。肥大細胞的活化是SCF誘導的典型反應，該反應可用於監測SCF介導的細胞因子反應的抗體中和。先前的研究已經表明在肥大細胞中SCF強烈上調單核細胞趨化蛋白(MCP)-l。產生針對SEQ ID NO:1的單克隆抗體(圖3)。使用用IOOng/ml SCF刺激的人肥大細胞系HMC-1測試這種抗體的功效試驗。用重組SCF預孵育單克隆抗體(6 μ g/ml) 5分鐘，然後將SCF或SCF加上抗-SCF放置在培養的HMC-1細胞(I X IO6個細胞/ml)上。隨後將細胞孵育12小時，然後收集無細胞上清液並且用Bio-Plex分析MCP-1。該數據說明SCF特異性單克隆抗體抑制用於MCP-1生成的HMC-1細胞的活化(圖4)。
[0165]5.經受BLM-誘導的損傷的SCF-缺乏的小鼠具有減輕的纖維化
[0166]在開發本文提供的技術的實施方案期間，檢查變體小鼠中的SCF缺陷(圖5)。這些小鼠具有一個等位基因(SI)中的SCF基因的完全缺失以及另一個等位基因(Sld)中的膜結合配體的缺失，這顯著降低可溶性SCF的表達。當使這些小鼠及其野生型對照(WT)經受BLM-誘導的肺損傷時，通過羥脯氨酸分析在形態(Masson三色染色)和生物化學上，與野生型小鼠相比突變小鼠中的纖維化顯著降低(圖5)。
[0167]在第O天野生型和SCF缺陷小鼠用鹽水(「SAL」)或BLM( 「BLM」)治療，21天之後收穫肺。纖維化通過生物化學方法被定量為肺羥脯氨酸含量。數值表示平均值土標準誤差(η = 3)。單個星號O表示與WT鹽水治療的對照平均值相比的統計學顯著性(P<0.05)，而雙星號)表示與WT BLM治療組相比的顯著性。
[0168]也在Sl/Sld小鼠注意到類似的對細胞因子表達和端粒酶誘導的抑制。這些數據合在一起表明了 SCF/c-Kit信號誘導的肺纖維化的關鍵性作用。
[0169]上述說明書中提及的所有出版物和專利均為了所有目的通過引用整體併入本文。在不脫離所述技術的範圍和精神的前提下，對本技術的所述組合物、方法和用途的各種修改和變更對於本領域技術人員而言將是顯而易見的。雖然本技術已結合具體示例性實施方案進行描述，但應當理解，受權利要求書保護的本發明不應過分地受這些具 體實施方案的限制。實際上，對於藥理學、生物化學、醫學科學或相關領域技術人員明顯的所述用於實施本發明的方式的各種修改意欲在下列權利要求的範圍之內。
【權利要求】
1.一種治療纖維化或組織重塑疾病的方法，包括向患有纖維化或組織重塑疾病或有患所述疾病的危險的受試者施用治療有效量的幹細胞因子抑制劑。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述抑制劑是分離的抗體或其抗原結合片段。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述施用預防所述疾病的至少一種症狀或減輕其嚴重度。
4.如權利要求2所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體或其抗原結合片段。
5.如權利要求2所述的方法，其中所述抗體或其抗原結合片段特異性結合幹細胞因子。
6.如權利要求2所述的方法，其中所述抗體或其抗原結合片段特異性結合包含胺基酸序列的肽，所述胺基酸序列選自由SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:8組成的組。
7.如權利要求2所述的方法，其中所述抗體是多克隆抗體。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述抑制劑是小幹擾RNA。
9.如權利要求1所述的方法，其中所述受試者具有幹細胞因子的異常活性。
10.如權利要求1所述的方法，其中所述受試者具有異常的膠原蛋白生成。
11.如權利要求1所述的方法，其中所述疾病是纖維化。
12.如權利要求1所 述的方法，其中所述疾病是重塑疾病。
13.如權利要求1所述的方法，其中所述疾病是肺部疾病。
14.如權利要求1所述的方法，其中所述疾病為特發性肺纖維化、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫症候群、囊性纖維化、支氣管周圍纖維化、過敏性肺炎或哮喘。
15.如權利要求1所述的方法，其中所述疾病為硬皮症、炎症、肝硬化、腎纖維化、實質纖維化、心內膜心肌纖維化、縱膈纖維化、結節性表皮下纖維變性、纖維組織細胞瘤、纖維胸、肝纖維化、纖維肌痛、齒齦纖維化或輻射誘導的纖維化。
16.如權利要求2所述的方法，其中通過鼻內施用將所述抗體或其抗原結合片段遞送到受試者的氣道中。
17.如權利要求1所述的方法，其中所述施用所述抑制劑降低受體的活性。
18.如權利要求17所述的方法，其中所述施用所述抑制劑降低幹細胞因子與受體的相互作用。
19.如權利要求17所述的方法，其中所述受體是受體酪氨酸激酶。
20.如權利要求17所述的方法，其中所述受體是c-Kit。
21.如權利要求17所述的方法，其中所述受體在造血祖細胞、黑素細胞、生殖細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、成纖維細胞、肌成纖維細胞或肥大細胞中發現。
22.如權利要求1所述的方法，其中所述幹細胞因子源於骨髓細胞、肝細胞、上皮細胞、平滑肌細胞或成纖維細胞。
23.如權利要求1所述的方法，其中向受試者施用所述抑制劑導致直接抑制成纖維細胞活化。
24.一種組合物，其包括特異性結合幹細胞因子的分離的抗體或其抗原結合片段。
25.一種組合物，其包括特異性結合包含胺基酸序列的肽的分離的抗體或其抗原結合片段，所述胺基酸序列選自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:8組成的組。
26.如權利要求24所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體或其抗原結合片段。
27.如權利要求24所述的方法，其中所述抗體是人源化抗體或其抗原結合片段。
28.一種製備靶向幹細胞因子的分離的單克隆抗體的方法，包括以下步驟:提供包含序列或序列一部分的肽，所述序列選自由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:4、SEQ ID N0:6和SEQID N0:8組成的組，用所述肽對宿主進行免疫，自所述宿主分離免疫細胞，使用免疫細胞製備雜交瘤，以及分離所述抗體或其抗原結合片段。
29.一種方法，包括以下步驟:提供幹細胞因子抑制劑，以及將所述抑制劑施用至細胞或組織。
30.一種試劑盒，其包括權利要求24所述的組合物，用於將所述組合物施用至受試者的裝置，和使用說明書。
【文檔編號】C07K16/00GK103547288SQ201280012594
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年1月10日 優先權日:2011年1月10日
【發明者】N.W.盧卡茨, V.A.多爾加徹夫, S.L.孔克爾, C.M.霍加博亞姆, S.H.範 申請人:密執安大學評議會