細胞凋亡誘導劑的製作方法

2023-07-09 04:29:16

細胞凋亡誘導劑的製作方法
【專利摘要】本發明涉及GST-π及其抑制劑的新用途、以及含有抑制GST-π的藥物和抑制自噬的藥物作為活性成分的用於誘導細胞凋亡的藥劑、含有該藥劑的醫藥組合物、使用了該組合物的伴隨著細胞凋亡異常的疾病的處置方法等。
【專利說明】細胞凋亡誘導劑
【技術領域】
[0001]本發明涉及GST-π及其抑制劑的新用途、新型的細胞凋亡誘導劑、含有該細胞凋亡誘導劑的醫藥組合物及伴隨著細胞凋亡異常的疾病的新治療方法。
【背景技術】
[0002]癌是人類所面對的最重要且最難對付的疾病之一，為了對其進行治療進行了大量的研究努力。癌是由於基因的突變或表基因的異常等而使細胞失去控制地進行增殖的疾病。關於癌的基因異常已有很多報告(例如Futreal et al.,Nat Rev Cancer.2004 ；4(3):177-83等)，其中很多被認為與細胞的增殖、分化、生存相關的信號傳遞有某些關聯。另外，由於相關的基因異常，由正常分子構成的細胞內的信號傳遞發生異常，由此導致特定的信號級聯的活化或滅活，最終有時會成為引起細胞異常增殖的一個因素。初期的癌治療主要著眼於對細胞增殖本身的抑制，但由於該治療也生理性地抑制正常增殖的細胞的增殖，因此會伴隨著脫髮、消化系統疾病、骨髄抑制等副作用。因此，為了抑制所述副作用，基於以癌特有的基因異常或信號傳遞異常為靶的分子靶向藥等的新想法的癌治療藥的開發不斷進展。
[0003]作為癌特有的基因異常，熟知的有KRAS(V-K1-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物，V-K1-ras2Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)的異常。KRAS 為位於EGFRJDGFR等酪氨酸激酶型受體的下遊的低分子量GTP結合蛋白(也稱為低分子量G蛋白)，其擔負著將來自這些受體的增殖或分化相關的信號向下遊的MAPK級聯傳遞的任務。正常的KRAS在通過配體結合而活化的受體的酪氨酸激酶活性的作用下介由Grb2及SOS而被活化，將Raf等MAPK磷酸化，從而驅動MAPK級聯，但變異型KRAS即使沒有受到來自受體的刺激也穩定地活化而持續地傳遞增殖信號。認為因此而發生異常的細胞增殖。
[0004]另一方面，作為催化穀胱甘肽結合的酶之一的穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)、特別是GST- n (glutathione S-transferase pi,也稱為GSTPl)的表達在各種癌細胞中增加,表明其可能是對部分抗癌劑產生抗性的一個原因。實際上已知，當使針對GST-π的反義DNA或GST-Ji抑制劑作用於過量表達GST-π並顯示藥物抗性的癌細胞系時，藥劑抗性得到抑制(Takahashi and Niitsu,Gan To Kagaku Ryoh0.1994 ;21 (7):945-51 ；Ban et al.,CancerRes.1996 ；56 (15):3577-82 ；Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther.2003 ；306 (3):861-9)。此外，最近的報告中報告了，當使針對GST-的siRNA作用於過量表達GST-的雄激素非依賴性前列腺癌細胞系時，其增殖得到抑制，細胞凋亡增加(Hokaiwado et al.，Carcinogenesis.2008 ；29 (6):1134_8)。另外還啟示，人結腸癌中，KRAS的變異通過AP-1的活化來誘導 GST-π 的過量表達(Miyanishi et al.,Gastroenterology.2001 ；121 (4):865-74)。
[0005]但是，關於GST-Ji與細胞增殖或細胞凋亡之間的關係、GST-Ji的分子機理、GST-π在各種細胞內信號傳遞中的作用等還幾乎未弄清楚。細胞內的信號傳遞極其複雜，不僅常有I種分子影響多種分子的作用、或相反I種分子受到多種分子的影響的情況，而且常有即使抑制了某種分子的作用，其它的信號級聯也活化，從而無法獲得期望效果的情況。因此，為了開發更為優異的分子靶向藥，需要弄清楚複雜地交織在一起的細胞的信號傳遞機理，儘管經過了多年研究也不過弄清楚了其中的極小一部分，因此還需要進一步的研究努力。

【發明內容】

[0006]發明要解決的課題
[0007]本發明的目的在於提供GST- π或其抑制劑的新用途、以及用於在細胞內有效誘導細胞凋亡的組合物及使用該組合物的方法。
[0008]用於解決課題的手段
[0009]本
【發明者】們為了弄清楚GST-π的分子機理不斷地進行刻苦研究，結果不僅發現了當抑制GST- 31的表達時，Raf-1、MEK及ERK的活化得到顯著抑制、和同樣地在通過G蛋白共軛型受體或酪氨酸激酶型受體的活化而活化的ΡΙ3Κ (Phosphoinositide3-kinase)信號級聯中也引起信號傳遞抑制，而且弄清楚了由於GST- π的表達抑制而發生細胞凋亡，由此也快速誘導自噬。並且，進一步繼續研究的結果還發現，通過在抑制GST-π的同時抑制自噬，能夠高效率地誘 導細胞發生細胞凋亡，從而完成了本發明。
[0010]即本發明涉及以下內容。
[0011](I) 一種用於誘導細胞凋亡的藥劑，其含有抑制GST-JI的藥物和抑制自噬的藥物作為活性成分。
[0012](2)—種用於誘導GST-Ji得到抑制的細胞發生細胞凋亡的藥劑，其含有抑制自噬的藥物作為活性成分。
[0013](3)根據上述(I)或(2)所述的藥劑，其用於誘導具有變異型KRAS的細胞發生細胞凋亡。
[0014](4)根據上述(I)~(3)中任一項所述的藥劑，其中，活性成分選自由RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸及表達它們的載體組成的組。
[0015](5) 一種醫藥組合物，其含有上述(I)~(4)中任一項所述的藥劑。
[0016](6)根據上述(5)所述的醫藥組合物，其用於治療細胞的異常增殖所引起的疾病。
[0017](7)根據上述(5)所述的醫藥組合物，其用於治療KRAS的變異所引起的疾病。
[0018](8)根據上述(5)所述的醫藥組合物，其用於治療癌。
[0019](9) 一種用於促進PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的藥劑，其含有GST- 和/或其功能性突變體作為活性成分。
[0020](10) 一種用於抑制PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的藥劑，其含有抑制GST- 的藥物作為活性成分。
[0021](11)一種用於抑制泛素化的藥劑，其含有GST-π和/或其功能性突變體作為活性成分。
[0022](12) 一種用於促進泛素化的藥劑，其含有抑制GST- π的藥物作為活性成分。
[0023](13)—種用於抑制自噬的藥劑，其含有GST- π和/或其功能性突變體作為活性成分。
[0024](14) 一種用於促進自噬的藥劑，其含有抑制GST- π的藥物作為活性成分。[0025]發明效果
[0026]由於本發明的細胞凋亡誘導劑與以往的藥劑相比能夠更有效地誘導細胞凋亡，因此製成醫藥組合物後的效果也高。特別是在癌的治療中，由於能夠利用細胞凋亡殺死癌細胞，因此不僅阻止癌的進展，而且還能夠期待使癌退縮的效果。另外，由於能夠以比以往的製劑低的用量發揮與以往同等的效果，因此還能夠減輕副作用。
[0027]另外，通過本發明還弄清楚了 GST-π的分子機理，發現了 GST-π或其抑制劑的新用途。其為疾病的處置、實驗方法等提供了新的選擇，不僅在醫療、獸醫療方面，而且在生物學、生化學、分子生物學等方面也可期待有較大貢獻。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1的a)為表示在GST- Ji siRNA作用下GST- Ji的表達被特異性抑制的情況的蛋白免疫印跡(Western blotting)的結果。圖1的b)為表示在GST-π siRNA轉染後第I~4天時的細胞數及GST-π的表達量的變化的圖。
[0029]圖2為表示GST- Ji SiRNA轉染後第2天時的RAS/Raf/MAPK信號級聯相關蛋白的表達的情況的蛋白免疫印跡的結果。可知伴隨著GST-π的表達抑制，Raf蛋白的表達量減少，進而MEK、ERK等MAPK的磷酸化得到抑制。
[0030]圖3表示Raf蛋白的免疫沈降實驗的結果。可知在GST-Ji siRNA處理組中，Raf蛋白及Ser621磷酸化Raf蛋白(p-Raf-1 (S621))的表達有些許減少，相反經泛素化的Raf蛋白增加。
[0031]圖4為對將GST-siRNA轉染子及Scramble siRNA轉染子用蛋白酶體抑制劑MG132及作為陰性對照的DMSO處理時的Raf蛋白的存在量進行比較的圖。GST-Ji siRNA轉染子通過用蛋白酶體抑制劑進行處理，觀察到磷酸化Raf蛋白(p-Raf-1 (S338))的存在量增加，但在Scramble siRNA中未見變化。`即，該情況啟示通過抑制GST-π的表達，磷酸化Raf蛋白在蛋白酶體作用下發生分解，其也與圖3中的泛素化Raf蛋白的增加相吻合。
[0032]圖5表示Raf蛋白與GST- 的共免疫沈降實驗的結果。在用抗ρ-Raf-l抗體沈降了的蛋白中顯示與抗GST-抗體反應，因此啟示ρ-Raf-l與GST-形成了複合物。
[0033]圖6表示GST- 敲除細胞的免疫螢光染色圖像。上一行為利用抗LC3抗體時的染色圖像，下一行為DAPI染色圖像。上一行從左起分別為轉染後第I天、第2天、第3天的染色圖像，下一行從左起分別為轉染後第4天、第5天的染色圖像。在圖中用箭頭表示的細胞中觀察到考慮是自噬體的點狀信號，推測自噬得到誘導。
[0034]圖7表示GST- 31 siRNA轉染後經過2天時的GST- 敲除細胞的電子顯微鏡圖像。左圖中，N表示核、用四邊形圍住的A部分的放大圖像在右圖。右圖中，M表示線粒體、L表示溶酶體。在用箭頭表示的部分中觀察到以包圍線粒體的方式形成了自噬體。
[0035]圖8表示使用了抗LC3抗體的GST-Ji敲除(KD)細胞提取液的蛋白免疫印跡(Western blot)的結果。GST-π KD 細胞(GST-π siRNA)中觀察到與對照(Scramble siRNA)相比，LC3的表達顯著增加。特別是II型的LC3 (LC3-1I)大量增加，由此推測誘導產生了自噬體。
[0036]圖9表示TUNEL染色的結果。上一行為對照組的圖像，下一行為GST- KD細胞組的圖像。從左起分別表示轉染後第3天、第4天、第5天的染色圖像。GST-JiKD細胞組中觀察到TUNEL陽性細胞。
[0037]圖10為表示GST-JI KD細胞組和對照細胞組在siRNA轉染後經過I~4天時、自噬陽性細胞及細胞凋亡陽性細胞的比例的經時變化的圖(上)、和表示GST- KD細胞的GST-Ji的表達量的圖(下)。顯示對照組中幾乎未觀察到自噬或細胞凋亡，而GST-JiKD組中首先自噬陽性細胞在第2天達到峰值地急增、然後誘導了細胞凋亡。
[0038]圖ll表示GST-JIKD細胞的EGFR/PI3K/Akt/mT0R信號相關的蛋白的蛋白免疫印跡的結果。可知在GST- Ji KD細胞組中EGFR、PI3K及Akt的磷酸化被顯著抑制。
[0039]圖12為表示用蛋白酶體抑制劑MG132處理GST- π KD細胞時的磷酸化EGFR(P-EGFR)的表達量的變化的蛋白免疫印跡的結果。GST- Ji KD細胞中的ρ-EGFR的表達量降低通過蛋白酶體抑制劑處理而恢復，由此推測P-EGFR的表達量降低是由於蛋白酶體作用下的分解所引起的。
[0040]圖13為使用抗p-EGFR對共免疫沈降了的蛋白進行蛋白免疫印跡的結果。在抗GST- Ji抗體中觀察到了信號，由此推測p-EGFR與GST- Ji發生相互作用。
[0041]圖14為對使用了 GST- Ji抑制劑C16C2時的Raf蛋白及EGFR的表達水平的變化抑制劑濃度依賴性地進行觀察的結果。使用了 GST-π抑制劑時，與GST-π敲除的情況相同地觀察到EGFR、Raf蛋白的磷酸化得到抑制。
[0042]圖15為表示添加了 GST-Ji抑制劑C16C2時的細胞數的變化的曲線圖。可知添加了 GST-Ji抑制劑時，細胞數幾乎沒有增加。
[0043]圖16為表示Scramble siRNA處理組、GST- π KD組及GST- π KD+3MA組的自噬陽性細胞的比例的曲線圖。可知通過GST-敲除而增加的自噬被3-ΜΑ抑制。
[0044]圖17表示向GST- 31 KD細胞添加3-ΜΑ時的TUNEL染色圖像。上一行為添加了 ImM的3-ΜΑ的情況，下一行為添加了 5mM的3-MA的情況。從左起分別表示轉染後第2天、第3天、第4天的染色圖像。3-MA的添加量多者，更多地觀察到細胞凋亡細胞。
[0045]圖18為表示經時觀察對照細胞組(Scramble siRNA)、GST- π KD細胞組(GST- 3i siRNA)、GST- π KD 細胞 +lmM3_MA 組(GST- π siRNA+lmM3-MA)及 GST- π KD 細胞+5禮3-獻組(651'-315^1?應+511113-獻)的細胞凋亡的比例的結果的曲線圖。可知，3-ΜΑ的用量依賴性地進一步誘導了細胞凋亡。
【具體實施方式】
[0046]本發明涉及一種用於誘導細胞凋亡的藥劑或組合物(以下也稱為「細胞凋亡誘導劑」或「細胞凋亡誘導組合物」)，其含有抑制GST- 的藥物和抑制自噬的藥物作為活性成分。
[0047]在本說明書中使用的情況下，GST-π是指由GSTPl基因編碼的對穀胱甘肽結合(glutathione conjugation)進行催化的酶。GST-π存在於包括人在內的各種動物，其序列信息也是公知的(例如人:ΝΡ_000843 (ΝΜ_000852)、大鼠:ΝΡ_036709 (ΝΜ_012577)、小鼠:NP_038569 (NM_013541)等。編號表示NCBI資料庫的登錄號，括號外為胺基酸序列的編號、括號內為鹼基序列的編號)。
[0048]由於生物個體間有可能發生不影響蛋白的生理學功能的基因序列或胺基酸序列的變異，因此本發明中的GST-π或GSTPl基因不限於與上述的公知序列具有相同序列的蛋白或核酸，可具有相對於該序列有I個或2個以上、典型地有I個或多個、例如I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個不同胺基酸或鹼基的序列，另外可以包含與上述公知的GST-π具有同等功能的序列。關於GST-π的具體功能，如後所述。
[0049]需要說明的是，本說明書中，「在本說明書中使用的情況下」、「本說明書中使用的」、「本說明書中」、「本說明書中記載的」等表述只要沒有特別說明，表示其後的記載適用於本說明書中記載的全部發明。另外，只要沒有另外地定義，本說明書中使用的全部技術用語及科學用語具有與本領域技術人員通常理解的相同的含義。本說明書中參照的全部專利、公報及其它出版物它們全部引用到本說明書中。
[0050]對本說明書中使用的「抑制GST- Ji的藥物」沒有限定，例如包括抑制GST- Ji的產生和/或活性的藥物、促進GST- 的分解和/或滅活的藥物等。作為抑制GST- 的產生的藥物，對其沒有限定，可列舉出例如針對編碼GST-Ji的DNA的RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸及表達它們的載體等。
[0051]作為抑制GST-Ji的活性的藥物，對其沒有限定，可列舉出例如與GST-Ji結合的物質、例如穀胱甘肽、穀胱甘肽類似物(例如W095/08563、W096/40205、W099/54346、上述Nakajima et al., 2003 等中記載的物質)、酮洛芬(上述 Takahashi and Niitsu, 1994)、吲哚美辛(Hall et al.，Cancer Res.1989 ；49 (22):6265_8)、依他尼酸、伊洛前列素(iloprost) (Tew et al.,Cancer Res.1988 ；48 (13):3622_5)、抗 GST-π 抗體、GST-π 的顯性失活突變體等。這些藥物可從市售獲得，也可基於公知的技術適當製造。
[0052]作為抑制GST-π的產生或活性的藥物，從特異性高、副作用的可能性低出發，優選針對編碼GST- 的DNA的RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸及表達它們的載體。
[0053]GST- 31的抑制與不使GST- 抑制劑發揮作用的情況相比，可通過細胞中GST-的表達、活性受到抑制來確定。GST-π的表達可通過已知的任意方法來進行評價，沒有限定，例如利用了抗GST-Ji抗體的免疫沈降法』從』1^54、1狀、1_、蛋白免疫印跡法、免疫組化法、免疫細胞化學法、流式細胞法、利用了與編碼GST-π的核酸或其獨特的片段或該核酸的轉錄產物(例如mRNA)或剪接(splicing)產物特異性地雜交的核酸的、各種雜交反應法、Northern blot 法、Southern blot 法、各種 PCR 法等。
[0054]另外，GST-的活性可以通過採用已知的任意方法、例如免疫沈降法、蛋白免疫印跡法、質量分析法、拉下法(pull-down method)、表面等離體激元共振(SPR)法等對GST- η的已知活性、沒有限定、例如與Raf-1 (特別是磷酸化Raf-1)、EGFR (特別是磷酸化EGFR)等蛋白的結合性等進行分析來評價。
[0055]在本說明書中使用的情況下，RNAi分子是指引起RNA幹擾的任意分子，沒有限定，包括 siRNA (small interfering RNA)、miRNA (micro RNA)、shRNA (short hairpin RNA)>ddRNA(DNA-directed RNA)、piRNA(Piwi_interacting RNA)>rasiRNA(repeat associatedsiRNA)等雙鏈RNA及它們的改性體等。這些RNAi分子可從市售獲得，或基於公知的序列信息等進行設計、製作。
[0056]另外，在本說明書中使用的情況下，反義核酸包括RNA、DNA、PNA或它們的複合物。
[0057]在本說明書中使用的情況下，DNA/RNA嵌合多核苷酸，沒有限定，包括例如日本特開2003-219893中記載的由抑制靶基因的表達的DNA和RNA構成的雙鏈多核苷酸。[0058]在本說明書中使用的情況下，自噬可包括巨自噬、微自噬、分子伴侶介導的自噬等，典型地是指巨自噬。因此，本發明中的「自噬」這一用語只要沒有特別說明，是指「巨自噬」。
[0059]自噬是也被稱為「自食」的細胞內蛋白分解機理之一，負責細胞內的蛋白分解、循環。自噬在包括酵母、哺乳動物在內的廣泛的生物種中可見，大致伴隨有包括(a)PAS (吞噬泡組裝位置，phagophore assembly site)的形成、(b)將要分解的蛋白包圍的吞曬泡(隔離膜)的伸長及增大、和由此的將要分解的蛋白內包的自噬體的形成、(C)通過自噬體與溶酶體的融合的自溶酶體的形成、(d )自溶酶體內的蛋白的分解的一連串過程。
[0060]上述(a)~(C)的過程特別與自噬相關因子相關。自噬相關因子最初在酵母中進行研究，到目前為止被鑑定為以Atgl~27為代表的多種物質(Klionsky et al., DevCell.2003 ；5 (4):539_45)，但在哺乳動物中的研究也在進展，也鑑定了多種同源物，自噬的核分子機理也在逐漸變得清楚(Yang and Klionsky, CurrOpin Cell Biol.2010 ；22 (2):124-31)。
[0061]作為哺乳動物中的與自噬的核分子機理相關的自噬相關因子，可列舉出例如與PAS 的形成相關的 VMP1、TP53INP2、mAtg9、ULK 複合物(由 ULK1、ULK2、mAtgl3、FIP200 構成)、PI3K 複合物(由 BeclinK hVps34、pl50、AmbraK Atgl4L 構成的 Atgl4L 複合物、及由Beclinl、hVps34、pl50、Bif-U UVRAG構成的UVRAG複合物)、與吞噬泡的伸長相關的LC3-11、Atgl2_Atg5_Atgl6L 複合物等。
[0062]因此，作為抑制自噬的藥物，沒有限定，可列舉出例如抑制包括上述因子在內的自噬相關因子的產生和/或活性的藥物、促進自噬相關因子的分解和/或滅活的藥物等。作為抑制自噬相關因子的產生的藥物，可列舉出針對編碼自噬相關因子的DNA的RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸及表達它們的載體等。
[0063]作為抑制自噬相關因子的活性的藥物，對其沒有限定，可列舉出例如PI3K的抑制劑 (例如渥曼青黴素等)、特別是Class III PI3K的抑制劑(例如3-MA(3-甲基腺嘌呤)等)、抑制自噬體與溶酶體的融合的物質(例如巴佛洛黴素Al等)、抑制自溶酶體中的蛋白分解的物質(例如氣喧、売妝素等)、與自曬相關因子結合的物質(例如抗自曬相關因子的抗體等)、自噬相關因子的顯性失活突變體等。這些藥物可以從市售獲得，也可以基於公知的技術適當製造。本發明的一個方式中，抑制自噬的藥物不包括GST- π和/或其功能性突變體。
[0064]作為抑制自噬的藥物，從特異性高、副作用低的角度出發，優選針對編碼自噬相關因子的DNA的RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸及表達它們的載體。
[0065]自噬的抑制可通過與不使本發明的自噬抑制劑發揮作用的情況相比，細胞中自噬得到抑制來確定。自噬的抑制可基於已知的任意方法，沒有限定，例如利用電子顯微鏡法的自噬體的檢測、自噬標記物(例如Atg5、Atgl2、LC3、特別是LC3-II等)的檢測等來進行評價。LC3-II，沒有限定，可以例如用抗LC3-II特異性抗體檢測，也可以在用電泳將試樣分離後，使用與LC3-II或者與LC3-I和LC3-II這兩者反應的抗體通過蛋白免疫印跡法等對分為與LC3-I不同的條帶的LC3-II進行檢測。另外，由於LC3-I散在於細胞質內，而LC3-II局部分布在隔離膜、自噬體、自溶酶體等自噬特有的結構中，因此也可以通過利用與LC3-II反應的抗體(包括與LC 3-I和LC3-II這兩者反應的抗體)的免疫染色等使其顯現出來，將顯示這些結構的點狀信號的存在、數量作為自噬的指標。[0066]抑制GST-JI的藥物與抑制自噬的藥物可以包含在單一製劑中，也可以分別包含在2個以上的製劑中。後者的情況下，各製劑可同時給予，也可以隔開時間間隔地給予。在隔開時間間隔地給予的情況下，可以將含有抑制GST-Ji的藥物的製劑在含有抑制自噬的藥物的製劑之前給予，也可以在之後給予。
[0067]本發明還涉及一種用於誘導GST-π得到抑制的細胞發生細胞凋亡的藥劑或組合物(以下也稱為「細胞凋亡誘導劑」或「細胞凋亡誘導組合物」)，其含有抑制自噬的藥物作為活性成分。
[0068]在本說明書中使用的情況下，「GST-得到抑制」包括例如在有GST-表達的細胞中，GST-Ji得到抑制的狀態。作為所述狀態，可列舉出例如將抑制GST-的藥物(例如上述的藥物等)向有GST-π表達的細胞給予後的狀態等。
[0069]某細胞中是否有GST-Ji表達可以是文獻學上已知的，或可以通過實際地對細胞的GST-π的表達進行檢測來確定。GST-π的表達可以使用包括已在上文描述過的方法在內的已知的任意方法來進行檢測。
[0070]本發明的藥劑或組合物可以是用於誘導具有變異型KRAS的細胞發生細胞凋亡的藥劑或組合物。
[0071]在本說明書中使用的情況下，作為變異型KRAS，沒有限定，可列舉出例如具有導致KRAS穩定地活化的變異的變異型KRAS，例如抑制內因性GTPase的變異、具有使鳥嘌呤核苷酸交換速度增加的變異等的變異型KRAS。作為所述變異的具體例子，沒有限定，可列舉出例如人KRAS的第12、13和/或61位胺基酸處的變異(抑制內因性GTPase)、人KRAS的第116和/或119位胺基酸處的變異(增加鳥嘌呤核苷酸交換速度)等(Bos，Cancer Res.1989 ；49
(17):4682-9 ；Levi et al.，Cancer Res.1991 ；51 (13):3497_502)。因此，本發明的一個方式中，關於變異型KRAS， 可列舉出人KRAS的第12、13、61、116、119位胺基酸中的至少一處具有變異的KRAS。本發明的一個方式中，變異型KRAS在人KRAS的第12位胺基酸處具有變異。另外，本發明的一個方式中，變異型KRAS還可以是誘導GST-π的過量表達的變異型KRAS0因此，具有變異型KRAS的細胞可以顯示GST-Ji的過量表達。
[0072]變異型KRAS的檢測可以使用已知的任意方法來進行。作為所述方法，沒有限定，可列舉出例如利用針對已知的變異序列的特異性核酸探針的選擇性雜交反應、酶錯配切割法、測序(上述 Bos，1989)、PCR-RFLP 法(上述 Miyanishi et al.，2001)等。
[0073]另外，GST-π表達的檢測還可以使用包括上述方法在內的已知的任意方法來進行。GST-Ji是否過量表達可通過例如將具有變異型KRAS的細胞中的GST-Ji的表達程度與具有正常的KRAS的同種細胞中的GST-Ji的表達程度進行比較等來評價。此時，當具有變異型KRAS的細胞中的GST- Ji的表達程度超過具有正常的KRAS的同種細胞中的GST- Ji的表達程度時，可以判斷GST-過量表達。
[0074]關於本發明的藥劑或組合物中的活性成分的配合量，可以是當給予藥劑或組合物時細胞凋亡得到誘導的量。另外，優選為不產生超過給予所帶來的好處的不良影響的量。所述量可以是公知的，或者可以通過使用了培養細胞等的體外試驗、或通過在小鼠、大鼠、狗或豬等動物模型中進行的試驗來適當確定，這樣的試驗方法是本領域技術人員熟知的。細胞凋亡的誘導可通過各種已知的方法、例如檢測DNA片段化、膜聯蛋白V在細胞膜上的結合、線粒體膜電位的變化、胱天蛋白酶的活化等細胞凋亡特有的現象、或TUNEL染色等來進行評價。活性成分的配合量可以根據藥劑或組合物的給藥方式的不同而變化。例如，當I次給予中使用幾個單位的組合物時，組合物I單位中配合的有效成分的量可以為I次給予所需要的有效成分的量的幾分之一。所述配合量的調整是本領域技術人員能夠適當進行的。
[0075]本發明還涉及製造用於誘導細胞凋亡的藥劑或組合物的方法，其包含將抑制GST- 的藥物和抑制自噬的藥物作為活性成分進行配合；本發明還涉及抑制GST- 的藥物及抑制自噬的藥物在製造用於誘導細胞凋亡的藥劑或組合物中的用途；本發明還涉及細胞凋亡誘導中使用的抑制GST-π的藥物和抑制自噬的藥物的組合；以及，本發明還涉及誘導細胞凋亡的方法，其包含給予有效量的抑制GST- 的藥物及抑制自噬的藥物。
[0076]本發明還涉及製造用於誘導GST-π得到抑制的細胞發生細胞凋亡的藥劑或組合物的方法，其包含將抑制自噬的藥物作為活性成分進行配合；本發明還涉及抑制自噬的藥物在製造用於誘導GST-π得到抑制的細胞發生細胞凋亡的藥劑或組合物中的用途；本發明還涉及誘導GST-π得到抑制的細胞發生細胞凋亡時使用的抑制自噬的藥物；以及，本發明還涉及誘導GST-π得到抑制的細胞發生細胞凋亡的方法，其包含給予有效量的抑制自噬的藥物。
[0077]關於上述製造方法或用途中的藥物和/或其配合量如已在上文所述的。各藥物的配合可以按照已知的任意方法來進行。
[0078]上述細胞凋亡誘導方法均可以是體外的方法，也可以是體內的方法。另外，關於該方法中的藥物如已在上文所述的，藥物的有效量可以是能夠誘導給予的細胞發生細胞凋亡的量。另外，優選不產生超過給予所帶來的好處的不良影響的量。該量可以是公知的，或可以通過使用了培養細胞等的體外試驗等來適當確定，這樣的試驗方法是本領域技術人員熟知的。細胞凋亡的誘導可以通過包含上述方法在內的各種已知方法來進行評價。關於上述有效量，當將藥物給予某細胞集團時，可以不必是誘導該細胞集團的全部細胞發生細胞凋亡的量。例如，上述有效量可以是誘導細胞集團中的細胞的1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、8%以上、10%以上、12%以上、15%以上、20%以上、進而25%以上等發生細胞凋亡的量。
[0079]本發明的細胞凋亡誘導劑能夠誘導細胞增殖存在異常的細胞等有效地發生細胞凋亡，作為醫藥組合 物的成分是有效的。因此，本發明的一個方面包括含有本發明的細胞凋亡誘導劑的醫藥組合物。
[0080]本發明的醫藥組合物在處置細胞凋亡存在異常的疾病方面特別有效。因此，本發明的一個方式涉及用於處置細胞凋亡存在異常的疾病的醫藥組合物，其含有上述細胞凋亡誘導劑。在本說明書中使用的情況下，細胞凋亡存在異常的疾病，對其沒有限定，包括例如細胞的異常增殖所引起的疾病、KRAS的變異所引起的疾病、GST-π的過量表達所引起的疾病等。作為細胞的異常增殖所引起的疾病，沒有限定，包括例如良性或惡性腫瘤、增生、瘢痕疙瘩、Cushing’s症候群、原發性醛固酮增多症、紅斑症、真性紅細胞增多症、白斑症、增生性瘢痕、扁平苔癬及著色斑病等。作為KRAS的變異所引起的疾病，沒有限定，包括例如良性或惡性腫瘤(也稱為癌、惡性新生物)等。作為GST-π的過量表達所引起的疾病，沒有限定，包括例如良性或惡性腫瘤、特別是藥物抗性(例如對美法侖、環磷醯胺等烷化劑、阿黴素等蒽環類抗腫瘤性抗生素、順鉬等鉬絡合物、依託泊甙等產生抗性)的惡性腫瘤等。本發明的一個方式中，細胞凋亡存在異常的疾病為癌。[0081]作為本發明中的癌，沒有限定，可列舉出例如纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、月旨肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、kaposi肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤等肉瘤、腦腫瘤、頭頸部癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、闌尾癌、結腸癌、直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽嚢癌、膽管癌、肛門癌、腎癌、輸尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、陰莖癌、睪丸癌、子宮癌、卵巢癌、外陰癌、陰道癌、皮膚癌等腫瘤、以及白血病、惡性淋巴瘤等。需要說明的是，本發明中，「癌」包括上皮性惡性腫瘤及非上皮性惡性腫瘤。本發明中的癌可存在於身體的任意部位，例如腦、頭頸部、胸部、四肢、肺、心臟、胸腺、食道、胃、小腸(十二指腸、空腸、迴腸)、大腸(結腸、盲腸、闌尾、直腸)、肝臟、胰臟、膽嚢、肛門、腎、輸尿管、膀胱、前列腺、陰莖、睪丸、子宮、卵巢、外陰、陰道、皮膚、橫紋肌、平滑肌、滑膜、軟骨、骨、甲狀腺、腎上腺、腹膜、腸繫膜、骨髄、血液、血管系統、淋巴結等淋巴系統、淋巴液等。
[0082]本發明的一個方式中，癌包含具有上述定義的變異型KRAS的癌細胞。本發明的一個方式中，癌包含顯示激素或生長因子非依賴性的增殖的癌細胞。本發明的一個方式中，癌包含顯示GST-的過量表達的癌細胞。本發明的一個方式中，癌為藥物抗性的。本發明的一個方式中，癌具有對選自由美法侖、環磷醯胺等烷化劑、阿黴素等蒽環類抗腫瘤性抗生素、順鉬等鉬絡合物、依託泊甙組成的組中的藥物具有抗性。本發明的一個方式中，癌對選自由美法侖、環磷醯胺、阿黴素、順鉬、依託泊甙組成的組中的藥物具有抗性。
[0083]本發明還涉及用於處置細胞凋亡存在異常的疾病的醫藥組合物，其含有抑制GST-π的藥物及抑制自噬的藥物作為活性成分；本發明還涉及用於處置細胞凋亡存在異常的疾病的醫藥組合物的製造方法，其包含將抑制GST-Ji的藥物及抑制自噬的藥物作為活性成分進行配合；本發明還涉及抑制GST-π的藥物及抑制自噬的藥物在製造用於處置細胞凋亡存在異常的疾病的醫藥組合物中的用途；本發明還涉及在處置細胞凋亡存在異常的疾病中使用的抑制GST-Ji的藥物與抑制自噬的藥物的組合；以及，以及本發明還涉及用於處置細胞凋亡存在異常的疾病的方法，其包含將所述醫藥組合物的有效量給予需要的對象。
[0084]上述製造方法或用途中的藥物和/或配合量、細胞凋亡存在異常的疾病如已在上文所述的。另外，各藥物的配合可以按照已知的任意方法來進行。
[0085]本
【發明者】們這次弄清楚了 GST- Ji通過分別與位於PI3K/Akt/mT0R信號級聯上遊的酪氨酸激酶型受體、特別是其磷酸化形態、以及作為RAS/Raf/MAPK信號級聯的構成分子的Raf、特別是其磷酸化形態結合，阻止這些分子的泛素化，從而促進這些信號級聯。因此，本發明還涉及用於促進PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的藥劑或組合物(也稱為「信號級聯促進劑」或「信號級聯促進組合物」)，其含有GST- π和/或其功能性突變體作為活性成分。本發明的藥劑或組合物特別是能夠同時促進PI3K/Akt/mT0R信號級聯及RAS/Raf/MAPK信號級聯這兩者。
[0086]作為本說明書中使用的「GST- π的功能性突變體」，沒有限定，可列舉出例如(i )GST- 的胺基酸序列上雖然具有I個或2個以上、典型地I個或多個變異、但與GST- 具有同等功能的突變體、(ii)由具有編碼GST-π的基因的鹼基序列的核酸、或者與該核酸編碼同一多肽的核酸在鹼基序列上具有I個或2個以上、典型地I個或多個變異的核酸編碼、且與GST-Ji具有同等功能的突變體、(iii)由具有編碼GST-π的基因的鹼基序列的核酸、與該核酸編碼同一多肽的核酸或者與編碼(ii)的突變體的核酸的互補鏈、或其片段在嚴格條件下雜交的核酸編碼、且與GST-π具有同等功能的突變體、(iv)具有與GST-π的胺基酸序列具有60%以上、優選70%以上、更優選80%以上、進一步優選90%以上、特別優選95%以上的同源性的胺基酸序列、且與GST-π具有同等功能的突變體、(V)由具有與編碼GST-Ji的基因的鹼基序列具有60%以上、優選70%以上、更優選80%以上、進一步優選90%以上、特別優選95%以上的同源性的核酸編碼、且與GST-π具有同等功能的突變體等。
[0087]GST-Ji的胺基酸序列及編碼GST-的基因的鹼基序列如上所述在各種動物中已知，本領域技術人員可以以這些序列信息為基礎，通過已知的任意方法、例如化學合成、利用限制酶的核酸的剪切或插入、部位特異性變異導入、放射線或紫外線照射等來適當製作上述功能性突變體。
[0088]關於某突變體是否與GST-具有同等功能，可通過採用已知的任意方法，例如免疫沈降法、蛋白免疫印跡法、質量分析法、拉下法、表面等離體激元共振(SPR)法等來分析GST-Ji的已知功能，沒有限定，例如與Raf-1 (特別是磷酸化Raf-1 )、EGFR (特別是磷酸化EGFR)等蛋白的結合性等，並與合適的陰性對照、作為陽性對照的GST-π比較來進行評價。例如，某突變體中，在上述功能比陰性對照優異的情況下，例如當優異10%以上、25%以上、50%以上、75%以上、進而100%以上時，和/或當在該功能為GST-Ji的1/100以上、1/50以上、1/25以上、1/10以上、1/5以上、進而1/2以上時，該突變體包括在GST-Ji的功能性突變體中。
[0089]本說明書中使用的「嚴格條件」的用語是本【技術領域】公知的參數，記載在標準的協議集，例如 Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3d ed.，Cold Spring Harbor Press (2001)、Ausubel et al., Current Protocols in MolecularBiology, Greene Publishing Associates (1992)等中。
[0090]本發明的嚴格條件是指，例如使用65°C的、由3.5 X SSC (0.15M氯化鈉/0.15M檸檬酸鈉、pH為7)、Fico ll0.02%、聚乙烯吡咯烷酮0.02%、牛血清白蛋白0.02%、NaH2P0425mM(pH為7)、SDS0.05%、EDTA2mM組成的雜交反應緩衝液的雜交反應。雜交反應後，DNA移動了的膜用2 X SSC在室溫中，接著用0.1~0.5XSSC/0.1XSDS在直至68 °C的溫度下洗滌。或者，嚴格雜交反應也可以使用ExpressHyb (κ)雜交液(Clontech公司)等市售的雜交反應緩衝液，按照製造者所記載的雜交反應及洗滌條件進行。
[0091]雖然也存在達到產生同程度的嚴格性的結果的能夠使用的其它條件、試劑等，但是由於本領域技術人員了解該條件，因此對此本說明書中沒有特別記載。但是，也可以操作條件從而能夠明確地確定編碼GST- 的突變體的核酸。
[0092]本發明中的GST-π和/或其功能性突變體除了作為蛋白的GST-π、其功能性突變體以外，還包括編碼GST- 的核酸、編碼GST- 的功能性突變體的核酸。
[0093]在本說明書中使用的情況下、「信號級聯」是指多個信號傳遞分子依次傳遞信號的信號傳遞。例如在「PI3K/Akt/mT0R信號級聯」的情況下，按照首先PI3K被活化、由此接著Akt被活化、進而由此mTOR被活化的情形，信號被傳遞。這在其它的信號級聯的表述中也同樣。信號的上遊與下遊的關係中，活化的聯繫可以直接發生，也可以間接發生。例如PI3K所引起的Akt的活化中，已知中間存在稱為PIP3 (磷脂醯肌醇(3，4，5)三磷酸酯)或TOKl (磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1，也稱為I3DPKl)的分子。
[0094]PI3K/Akt/mT0R信號級聯是由PI3K的活化所驅動的信號級聯，其作為與細胞的生存等相關的信號是已知的。關於PI3K的活化，對其沒有限定，例如通過配體與G蛋白共軛型受體或酪氨酸激酶型受體結合而發生活化，經活化的PI3K通過將肌醇磷脂磷酸化，產生例如PIP3等磷脂醯肌醇。其通過在PH區域與TOKl或Akt結合，從而促進這些蛋白局部分布於膜。I3DKl通過與PIP3結合而在膜活化，經活化的I3DKl將Akt的第308位的T磷酸化。Akt的第473位的絲氨酸被mTOR的複合物之一 mT0RC2磷酸化，通過這2處的胺基酸的磷酸化，Akt完全活化。[0095]關於Akt活化mTOR的路徑雖然尚未完全弄清楚，但考慮與PRAS40(proline-richAkt/PKB substrate40kDa)相關。PRAS40如其名稱所示為Akt的底物，認為其是與mTOR複合物結合後抑制其活化的分子，認為當Akt被活化時，PRAS40被磷酸化，由此PRAS40與mTOR複合物脫離，mTOR活化。並且，當mTOR活化時，將ULK1、ULK2 (unc-51樣激酶)以及mAtgl3 (mammalian autophagy_relatedl3)磷酸化,通過抑制自卩遼信號的啟動從而抑制自曬。
[0096]另一方面，RAS/Raf/MAPK信號級聯是與細胞增殖等相關的信號級聯。當例如生長因子等配體與G蛋白共軛型受體、酪氨酸激酶型受體結合時，屬於低分子G蛋白的KRAS被活化、經活化的KRAS將Raf (—種MAPKKK)磷酸化並活化。經活化的Raf將MEK (MAPK/ERK激酶，一種MAP2K)活化，經活化的MEK將ERK (細胞外信號調節激酶，一種MAPK)活化。經活化的ERK向核內移動，促進各種mRNA的轉錄，從而引起細胞增殖。
[0097]本發明中，促進信號級聯不僅是指提高信號級聯的活化，也指抑制信號級聯的滅活。信號級聯是否得到促進可以通過與未使本發明的藥劑或組合物發揮作用時相比、信號級聯得到活化來確定。對於信號級聯的活化，沒有限定，例如可通過檢測信號級聯構成分子的活化(例如磷酸化等)、或者由信號級聯的活化所引起的細胞現象、例如在PI3K/Akt/mT0R信號級聯的情況下為自噬的抑制等、在RAS/Raf/MAPK信號級聯的情況下為細胞的增殖等來進行評價。
[0098]本發明還涉及用於促進PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的藥劑或組合物的製造方法，其包含將GST- π和/或其功能性突變體進行配合的工序；本發明還涉及GST- π和/或其功能性突變體在製造用於促進PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的藥劑或組合物中的用途；本發明還涉及P13K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的促進中使用的GST- π和/或其功能性突變體；以及，本發明還涉及促進PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的方法，其包含給予有效量的GST- π和/或其功能性突變體。
[0099]本發明的用於促進信號級聯的藥劑或組合物對於處置PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的異常、特別是伴隨著這些信號級聯的抑制的疾病是有用的。作為所述疾病，沒有限定，可列舉出例如伴隨著這些信號級聯的構成分子的表達、活性抑制和/或分解、滅活增加的疾病(例如由這些分子的基因異常、GST- π的表達/活性抑制等導致的疾病)等。
[0100]因此，本發明還涉及用於處置伴隨著PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的抑制的疾病的醫藥組合物，其含有GST- π和/或其功能性突變體作為活性成分；本發明還涉及用於處置伴隨著PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的抑制的疾病的醫藥組合物的製造方法，其包含將GST- π和/或其功能性突變體進行配合的工序；本發明還涉及GST- π和/或其功能性突變體在製造用於處置伴隨著PI3K/Akt/mTOR信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的抑制的疾病的醫藥組合物中的用途；本發明還涉及伴隨著PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的抑制的疾病的處置中使用的GST-π和/或其功能性突變體；以及，本發明還涉及處置伴隨著PI3K/Akt/mTOR信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的抑制的疾病的方法，其包含給予有效量的GST- π和/或其功能性突變體。
[0101]本發明還涉及用於抑制PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的藥劑或組合物(也稱為「信號級聯抑制劑」或「信號級聯抑制組合物」)，其含有抑制GST- π的藥物作為活性成分。
[0102]本發明中，抑制信號級聯不僅是指誘導信號級聯的滅活，還指抑制信號級聯的活化。信號級聯是否得到抑制可通過與未使本發明的藥劑或組合物發揮作用時相比、信號級聯得到抑制來確定。關於信號級聯的抑制，沒有限定，例如可通過檢測信號級聯構成分子的活化(例如磷酸化等)的降低、或者由信號級聯的抑制所引起的細胞現象，例如在PI3K/Akt/mTOR信號級聯的情況下為自噬的增加等、在RAS/Raf/MAPK信號級聯的情況下為細胞增殖的抑制等來進行評價。
[0103]本發明還涉及用於抑制PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的藥劑或組合物的製造方法，其包含將抑制GST-π的藥物進行配合的工序；本發明還涉及抑制GST- Ji的藥物在製造用於抑制PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的藥劑或組合物中的用途；本發明還涉及PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的抑制中使用的抑制GST- 的藥物；以及，本發明還涉及抑制PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的方法，其包含給予有效量的抑制GST- π的藥物。
[0104]本發明的用於抑制信號級聯的藥劑或組合物對於處置伴隨著PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的異常、特別是這些信號級聯的活化的疾病是有用的。作為所述疾病，沒有限 定，可列舉出例如伴隨著這些信號級聯的構成分子的表達、活性的增加和/或分解、滅活抑制的疾病(例如由這些分子的基因異常、GST- π的表達/活性的增加等導致的疾病)、伴隨著由除這些信號級聯的構成分子以外的因子(例如受體型酪氨酸激酶的活化等)引起的信號級聯的活化的疾病等。
[0105]因此，本發明還涉及用於處置伴隨著PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的活化的疾病的醫藥組合物，其含有抑制GST-π的藥物作為活性成分；本發明還涉及用於處置伴隨著PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的活化的疾病的醫藥組合物的製造方法，其包含將抑制GST-1i的藥物進行配合的工序；本發明還涉及抑制GST- Ji的藥物在製備用於處置伴隨著PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的活化的疾病的醫藥組合物中的用途；本發明還涉及伴隨著PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的活化的疾病的處置中使用的抑制GST- π的藥物；以及，本發明還涉及處置伴隨著PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的活化的疾病的方法，其包含給予有效量的抑制GST- 的藥物。
[0106]本發明還涉及用於抑制泛素化的藥劑或組合物(也稱為「泛素化抑制劑」或「泛素化抑制組合物」)，其含有GST- π和/或其功能性突變體作為活性成分。
[0107]泛素化是指泛素與蛋白結合，與對細胞內不需要的蛋白進行處理的過程相關。經泛素化的蛋白被蛋白酶體分解。
[0108]本發明的一個方式中，泛素化得到抑制的蛋白為GST-π可結合的蛋白。另外，本發明的一個方式中，泛素化得到抑制的蛋白選自由構成RAS/Raf/MAPK信號級聯的蛋白、構成PI3K/Akt/mT0R信號級聯的蛋白、及酪氨酸激酶型受體組成的組。本發明的優選方式中，泛素化得到抑制的蛋白選自由EGFR及Raf-1、特別是它們的磷酸化形態組成的組。
[0109]本發明中，泛素化的抑制可通過與不使本發明的藥劑或組合物發揮作用時相比、泛素化得到抑制來確定。泛素化的抑制可通過已知的任意方法，沒有限定，例如免疫沈降法、蛋白免疫印跡法、質量分析法、拉下法等來進行評價。
[0110]本發明還涉及用於抑制泛素化的藥劑或組合物的製造方法，其包含將GST-π和/或其功能性突變體進行配合的工序；本發明還涉及GST-π和/或其功能性突變體在製造用於抑制泛素化的藥劑或組合物中的用途；本發明還涉及泛素化抑制中使用的GST-π和/或其功能性突變體；以及，本發明還涉及抑制泛素化的方法，其包含給予有效量的GST-π和/或其功能性突變體。
[0111]本發明的用於抑制泛素化的藥劑或組合物對於處置伴隨著泛素化亢進的疾病是有用的。作為所述疾病，沒有限定，可列舉出例如伴隨著泛素連接酶的表達、活性增加和/或分解、滅活抑制的疾病(例如由泛素連接酶的基因異常、GST- π的表達/活性抑制等導致的疾病)等。
[0112]因此，本發明還涉及用於處置伴隨著泛素化亢進的疾病的醫藥組合物，其含有GST-π和/或其功能性突變體作為活性成分；本發明還涉及用於處置伴隨著泛素化亢進的疾病的醫藥組合物的製造方法，其包含將GST- π和/或其功能性突變體進行配合的工序；本發明還涉及GST- π和/或其功能性突變體在製備用於處置伴隨著泛素化亢進的疾病的醫藥組合物中的用途 ；本發明還涉及伴隨著泛素化亢進的疾病的處置中使用的GST-π和/或其功能性突變體；以及，本發明還涉及處置伴隨著泛素化亢進的疾病的方法，其包含給予有效量的GST- π和/或其功能性突變體。
[0113]本發明還涉及用於促進泛素化的藥劑或組合物(也稱為「泛素化促進劑」或「泛素化促進組合物」)，其含有抑制GST- Ji的藥物作為活性成分。
[0114]本發明的一個方式中，泛素化得到促進的蛋白為GST-π可結合的蛋白。另外，本發明的一個方式中，泛素化得到促進的蛋白選自由構成RAS/Raf/MAPK信號級聯的蛋白、構成PI3K/Akt/mT0R信號級聯的蛋白、及酪氨酸激酶型受體組成的組。本發明的優選方式中，泛素化得到促進的蛋白選自由EGFR及Raf-1、特別是它們的磷酸化形態組成的組。
[0115]本發明中，泛素化的促進可通過與不使本發明的藥劑或組合物發揮作用時相比、泛素化得到促進來確定。泛素化的促進可通過已知的任意方法，沒有限定，例如免疫沈降法、蛋白免疫印跡法、質量分析法、拉下法等來進行評價。
[0116]本發明還涉及用於促進泛素化的藥劑或組合物的製造方法，其包含將抑制GST-π的藥物進行配合的工序；本發明還涉及抑制GST-π的藥物在製造用於促進泛素化的藥劑或組合物中的用途；本發明還涉及泛素化促進中使用的抑制GST-π的藥物；以及，本發明還涉及促進泛素化的方法，其包含給予有效量的抑制GST- π的藥物。
[0117]本發明的用於促進泛素化的藥劑或組合物對於處置伴隨著泛素化抑制的疾病是有用的。作為所述疾病，沒有限定，可列舉出例如伴隨著泛素連接酶的表達、活性抑制和/或分解、滅活增加的疾病(例如由泛素連接酶的基因異常、GST- π的表達/活性增加等導致的疾病)等。
[0118]因此，本發明還涉及用於處置伴隨著泛素化抑制的疾病的醫藥組合物，其含有抑制GST-π的藥物作為活性成分；本發明還涉及用於處置伴隨著泛素化抑制的疾病的醫藥組合物的製造方法，其包含將抑制GST-π的藥物進行配合的工序；本發明還涉及抑制GST-π的藥物在製備用於處置伴隨著泛素化抑制的疾病的醫藥組合物中的用途；本發明還涉及伴隨著泛素化抑制的疾病的處置中使用的抑制GST-π的藥物；以及，本發明還涉及處置伴隨著泛素化抑制的疾病的方法，其包含有效量的抑制GST- π的藥物進行給予。
[0119]本發明還涉及用於抑制自噬的藥劑或組合物(也稱為「自噬抑制劑」或「自噬抑制組合物」)，其含有GST-π和/或其功能性突變體作為活性成分。本
【發明者】們這次弄清楚了GST- π與位於PI3K/Akt/mT0R信號級聯上遊的酪氨酸激酶型受體、特別是其磷酸化形態結合、阻止其泛素化，從而促進該信號級聯，而已知PI3K/Akt/mT0R信號級聯的活化會抑制自嗤(例如上述 Yang and Klionsky, 2010)。
[0120]本發明中，自噬的抑制可通過與不使本發明的藥劑或組合物發揮作用時相比、細胞中自噬得到抑制來確定。關於自噬的評價方法，如上所述。
[0121]本發明還涉及用於抑制自噬的藥劑或組合物的製造方法，其包含將GST- π和/或其功能性突變體進行配合的工序；本發明還涉及GST-π和/或其功能性突變體在製備用於抑制自噬的藥劑或組合物中的用途；本發明還涉及自噬抑制中使用的GST-π和/或其功能性突變體；以及，本發明還涉及抑制自噬的方法，其包含給予有效量的GST-Ji和/或其功能性突變體。
[0122]本發明的用於抑制自噬的藥劑或組合物對於處置伴隨著自噬亢進的疾病等是有用的。作為所述疾病，沒有限定，可列舉出例如伴隨著PI3K/Akt/mT0R信號級聯抑制的疾病(例如由PI3K/Akt/mT0R信號級聯構成分子和/或位於其上遊的分子的基因異常、GST- π的表達/活性抑制等導致的疾病)、肌病、肝臟疾病、再灌注損傷等。
[0123]因此，本發明還涉及用於處置伴隨著自噬亢進的疾病的醫藥組合物，其含有GST-π和/或其功能性突變體作為活性成分；本發明還涉及用於處置伴隨著自噬亢進的疾病的醫藥組合物的製造方法，其包含將GST- π和/或其功能性突變體進行配合的工序；本發明還涉及GST- π和/或其功能性突變體在製備用於處置伴隨著自噬亢進的疾病的醫藥組合物中的用途；本發明還涉及伴隨著自噬亢進的疾病的處置中使用的GST-π和/或其功能性突變體；以及，本發明還涉及處置伴隨著自噬亢進的疾病的方法，其包含將有效量的GST- π和/或其功能性突變體給予需要的對象。
[0124]本
【發明者】們這次還弄清楚了通過抑制GST-π使得自噬得到促進。因此，本發明還涉及用於促進自噬的藥劑或組合物(也稱為「自噬促進劑」或「自噬促進組合物」)，其含有抑制GST-π的藥物作為活性成分。本發明還涉及用於促進自噬的藥劑或組合物的製造方法，其包含將抑制GST- 的藥物進行配合的工序；本發明還涉及抑制GST- 的藥物在製備用於促進自噬的藥劑或組合物中的用途；本發明還涉及自噬促進中使用的抑制GST-π的藥物；以及，本發明還涉及促進自噬的方法，其包含給予有效量的抑制GST-π的藥物。
[0125]本發明的用於促進自噬的藥劑或組合物對於處置伴隨著自噬抑制的疾病等是有用的。作為所述疾病，沒有限定，可列舉出例如伴隨著PI3K/Akt/mT0R信號級聯活化的疾病(例如由PI3K/Akt/mT0R信號級聯構成分子和/或位於其上遊的分子的基因異常、GST-π的表達/活性增加等導致的疾病)、衰老(aging)、缺血性疾病等。
[0126]因此，本發明還涉及用於處置伴隨著自噬抑制的疾病的醫藥組合物，其含有抑制GST-π的藥物作為活性成分；本發明還涉及用於處置伴隨著自噬抑制的疾病的醫藥組合物的製造方法，其包含將抑制GST-Ji的藥物進行配合的工序；本發明還涉及抑制GST-Ji的藥物在製備用於處置伴隨著自噬抑制的疾病的醫藥組合物中的用途；本發明還涉及伴隨著自噬抑制的疾病的處置中使用的抑制GST- 的藥物；以及，本發明還涉及對伴隨著自噬抑制的疾病進行處置的方法，其包含將有效量的抑制GST-π的藥物給予需要的對象。
[0127]關於信號級聯、泛素化或自噬的抑制/促進所涉及的本發明的上述各種藥劑或組合物中的活性成分的配合量，當給予該藥劑或組合物時，可以是實現所期望的效果(即信號級聯、泛素化或自噬的抑制/促進)的量。另外，優選不產生超過給予所帶來的好處的不良影響的量。所述量可以是公知的，或者可以通過使用了培養細胞等的體外試驗、或通過在小鼠、大鼠、狗或豬等動物模型中的試驗來適當確定，這樣的試驗方法是本領域技術人員熟知的。信號級聯、泛素化或自噬的抑制/促進可通過包括上述方法在內的各種已知的方法來進行評價。活性成分的配合量可根據藥劑、組合物的給藥方式的不同而變化。例如，當I次給予中使用幾個單位的組合物時，組合物I單位中配合的有效成分的量可以為I次給予所需的有效成分的量的幾分之一。本領域技術人員可適當對所述配合量進行調整。
[0128]關於信號級聯、泛素化或自噬的抑制/促進所涉及的上述各種藥劑或組合物的製造方法或用途中的藥物、其配合量，如已在上文所述的。各藥物的配合也可以按照已知的任意方法來進行。
[0129]信號級聯、泛素化或自噬的抑制/促進所涉及的上述各種方法均可以是體外方法，也可以是體內方法。另外，關於上述方法中的藥物的有效量，可以是在給予的細胞中實現所期望的效果(即信號級聯、泛素化或自噬的抑制/促進)的量。另外，優選是不產生超過給予所帶來的好處的不良影響的量。所述量可以是公知的，或者可以通過使用了培養細胞等的體外試驗等來適當確定，這樣的試驗方法是本領域技術人員熟知的。所期望的效果的實現可以通過包括上述方法在內的各種已知方法來進行評價。關於上述有效量，當將藥物給予某細胞集團時，可以不必是誘導該細胞集團的全部細胞產生所期望的效果的量。例如，上述有效量可以是誘導細胞集團中的細胞的1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、8%以上、10%以上、12%以上、15%以上、20%以上、進而25%以上等產生所期望的效果的量。
[0130]當本說明書中記載的本發明的各種藥劑、組合物、處置方法等中的活性成分為核酸、例如RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸等時，這些活性成分可以作為單獨的核酸直接利用，也可以載持到各種載體上後利用。作為載體，可以利用質粒載體、噬菌體載體、噬菌粒載體、粘粒載體、病毒載體等公知的任意載體。載體優選至少包含增加所載持的核酸的表達的啟動子，此時，所述核酸優選與所述啟動子可發揮功能的方式連接。核酸與啟動子以可發揮功能的方式連接是指，在啟動子的作用下，該核酸與啟動子按照合適地產生該核酸所編碼的蛋白的方式配置。載體可以是在宿主細胞內能夠複製的，基因的轉錄可以是在宿主細胞的細胞核外進行，也可以在細胞核內進行。在後者的情況下，核酸被整合到宿主細胞的基因組中。[0131]另外，有效成分也可以載持在各種非病毒性脂質或蛋白載體上。作為所述載體，沒有限定，可列舉出例如膽固醇、脂質體、抗體原體(antibody protomer)、環糊精納米粒子、融合肽、適體(aptamer )、生物降解性聚乳酸共聚物、聚合物等，能夠提高向細胞內攝入的效率(例如參照 Pirollo and Chang, Cancer Res.2008 ；68 (5):1247-50 等)。特別是陽離子脂質體、聚合物(例如聚乙烯亞胺等)是有用的。關於作為所述載體有用的聚合物的進一步的例子，可列舉出例如US2008/0207553、US2008/0312174等中記載的載體等。
[0132]本說明書中記載的本發明的各種醫藥組合物中，只要不影響活性成分的效果，還可以將活性成分與其它任意成分組合。作為這樣的任意成分，可列舉出例如其它的化學治療劑、藥理學上容許的載體、賦形劑、稀釋劑等。另外，根據給予途徑、藥物釋放方式等，還可以將上述組合物用合適的材料、例如腸溶性包衣劑、限時崩解性材料包覆，另外，還可以納入合適的藥物釋放體系。
[0133]本說明書中記載的本發明的各種藥劑及組合物(包括各種醫藥組合物)可以通過包括經口及非經口這兩者的各種路徑給予，例如沒有限定，經口、靜脈內、肌肉內、皮下、局部、腫瘤內、直腸、動脈內 、門靜脈內、心室內、經黏膜、經皮、鼻內、腹腔內、肺內及子宮內等路徑，也可以製成適合各給予途徑的劑型。所述劑型及製劑方法可以適當採用任意的公知的劑型及製劑方法(例如參照標準薬剤學、渡邊喜照^編、南江堂、2003年等)。
[0134]例如，作為適合經口給予的劑型，沒有限定，可列舉出散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、液體製劑、懸浮劑、乳劑、凝膠劑、糖漿劑等，另外作為適合非經口給予的劑型，可列舉出溶液性注射劑、懸浮性注射劑、乳濁性注射劑、用時製備型注射劑等注射劑。非經口給予用製劑可以為水性或非水性的等滲性無菌溶液或懸浮液的形態。
[0135]本說明書中記載的本發明的各種藥劑或組合物(包括各種醫藥組合物)可以靶向化為以特定的組織、細胞為靶。靶向化可以通過已知的任意方法實現。當期望向癌遞送時，沒有限定，可以使用例如通過將製劑製成適合EPR (增強性透過與滯留，enhancedpermeability and retention)效果的表達的直徑為50~200 μ m、特別是75~150 μ m等大小的被動靶向、和/或使用⑶19、HE R2、轉鐵蛋白受體、葉酸受體、VIP受體、EGFR(Torchi I in, AAPS J.2007 ；9 (2):E128_47)、RAAGlO (日本特表 2005-532050)、PIPA (日本特表2006-506071)、KID3 (日本特表2007-529197)等配體、或具有RGD基序、NGR基序的肽、F3、LyP-1 (Ruoslahti et al.，J Cell Biol.2010 ；188 (6):759-68)等作為靶向劑的主動靶向等方法。另外，類視黃醇由於已知作為針對癌細胞的靶向劑是有用的(W02008/120815),因此還可以利用含有類視黃醇作為靶向劑的載體。所述載體除了上述文獻外，在 W02009/036368、W02010/014117 等中有記載。
[0136]本說明書中記載的本發明的各種藥劑或組合物(包括各種醫藥組合物)可以以任意形態供給，從保存穩定性的觀點出發，也可以以可用時製備的形態提供，例如在醫療現場或其附近由醫師和/或藥劑師、護士、或其他輔助醫務人員等製備得到的形態。該形態當本發明的藥劑或組合物含有脂質和/或蛋白、核酸等難以穩定保存的成分時特別有用。此時，本發明的藥劑或組合物可以以包含這些必須構成要素中的至少一個的I個或2個以上的容器形式提供，在使用之前，例如使用前24小時以內、優選使用前3小時以內、並且更優選即將使用前製備。製備時，可以適當使用進行製備的場所中通常能夠獲得的試劑、溶劑、調劑器具等。[0137]因此，本發明還涉及組合物的製備試劑盒，其包含單獨或組合地包含本發明的各種藥劑或組合物中可含有的活性成分的I個或2個以上的容器；以及以這樣的試劑盒形式提供的各種藥劑或組合物的必要構成要素。本發明的試劑盒除了上述容器外，還可以包含記載有本發明的各種藥劑或組合物的製備方法、給予方法等的說明，例如說明書、CD、DVD等電子記錄介質等。另外，本發明的試劑盒可以包含用於完成本發明的各種藥劑或組合物的全部構成要素，但也可以不一定要含有全部構成要素。因此，本發明的試劑盒可以不含有在醫療現場、實驗室等中通常可獲得的試劑、溶劑，例如無菌水、生理鹽水、葡萄糖溶液等。
[0138]本說明書中記載的本發明的各種處置方法中的有效量是例如減輕疾病的症狀，或使疾病的進展延緩或停止的量，優選為抑制或使疾病治癒的量。另外，優選為不產生超過給予所帶來的好處的不良影響的量。所述量可以通過使用了培養細胞等的體外試驗、或通過在小鼠、大鼠、狗或豬等動物模型中的試驗來適當確定，這樣的試驗方法是本領域技術人員熟知的。另外，本發明的處置方法中使用的藥物的用量可以是本領域技術人員公知的，也可以通過上述試驗等來適當確定。
[0139]本說明書中記載的本發明的處置方法中給予的活性成分的具體用量可以考慮與需要處置的對象有關的各種條件，例如症狀的嚴重程度、對象的一般健康狀態、年齡、體重、對象的性別、飲食、給予的時期及頻率、並用的藥物、對治療的反應性、劑型及對治療的依從性等來確定。
[0140]作為給予途徑包括包含經口及非經口這兩者的各種路徑，例如經口、靜脈內、肌肉內、皮下、局部、腫瘤內、直腸、動脈內、門靜脈內、心室內、經黏膜、經皮、鼻內、腹腔內、肺內
及子宮內等路徑。
[0141]關於給予頻率，根據所用藥劑、組合物的性狀、包括上述條件在內的對象的條件的不同而不同，例如可以為I日多次(即I日2、3、4次或5次以上)、1日I次、數日(即2、3、4、
5、6、7日等)1次、I周I次 、數周I次(SP2、3、4周I次等)。
[0142]在本說明書中使用的情況下，用語「對象」表示任意的生物個體，優選為動物，進一步優選為哺乳動物，進一步優選為人的個體。本發明中，對象可以是健康的，也可以患有某種疾病，當期望處置特定的疾病時，典型地是指患有所述疾病，或者具有患病風險的對象。
[0143]另外，用語「處置」在本說明書中使用的情況下，是包含以疾病的治癒、暫時的緩解或預防等為目的的醫學上容許的全部種類的預防性和/或治療性介入。例如，「處置」這一用語包括疾病進展的延緩或停止、病變的退縮或消失、發病的預防或再發的防止等，包含各種目的的醫學上容許的介入。
[0144]實施例
[0145]以下基於實施例對本發明進一步進行說明，但所述實施例是本發明的示例，並不是對本發明進行限定。
[0146]實施例1:GST_n敲除對RAS/Raf/MAPK信號級聯的影響
[0147](I)細胞培養
[0148]將K-RAS變異陽性結腸癌細胞株M7609在含有10%胎牛血清(FBS)的RPM1-1640培養基中、在37°C、含有5%C02的大氣下進行培養。另外，在培養基中加入作為抗生素的100U/mL的青黴素、100 μ g/mL的鏈黴素。
[0149](2) GST-1i siRNA 的轉染[0150]在轉染的前一日，將M7609細胞用不含抗生素的加有10%FBS的RPM1-1640培養基播種到IOOmm組織培養用塑料培養皿中，使細胞達到I X IO6個/10mL。在ImL的Opt1-MEMI 減少血清培養基(Opt1-MEM I Reduced Serum Medium, GIBCO 公司)中加入 600pmol 的GST-Ji siRNA(序列編號 1:GGGAGGCAAGACC UUCAUUTT, siRNA ID#2385，Ambion 公司)，溫和混合。接著，將 35 μ L 的 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen 公司)稀釋到 ImL 的 Opt1-MEMI減少血清培養基中，溫和混合。將稀釋後的GST-Ji siRNA與稀釋後的LipofectamineRNAiMAX合併，溫和混合後，在室溫下孵育10分鐘。其間，將培養基換成IOmL的Opt1-MEMI減少血清培養基。孵育10分鐘後，向細胞中加入GST-1i siRNA與LipofectamineRNAiMAX的複合物，在37°C、含有5%C02的大氣下進行孵育。孵育5小時後，換成IOmL的不含抗生素的加有10%FBS的RPM1-1640培養基。另外，作為對照實驗，使用Scramble siRNA (序列編號 2:CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG，北海道 System science 公司)進行同樣的操作。在GST-Ji siRNA轉染後的第1、2、3、4天時，測量細胞數，同時觀察GST-Ji敲除。GST-Ji敲除如下所述地用蛋白免疫印跡法進行分析。
[0151](3) GST-31敲除的蛋白免疫印跡分析
[0152]在GST- Ji siRNA轉染後的上述各時間點使用採集的細胞進行GST- Ji敲除的蛋白免疫印跡分析。將採集的細胞在不含血清的培養基中培養16小時。將細胞用冷PBS洗滌後，加入冷 lysis buffer(l%NP-40、50mM Tris-HClU50mM NaClUmM EDTA,complete MiniEDTA-free (Roche 公司)、PhosSTOP (Roche 公司)、pH 為 7.5)，冰冷，孵育 30 分鐘，使其溶解。在4°C、15000rpm下進行離心分離15分鐘，得到細胞提取液。對得到的細胞提取液使用 Micro BCA 蛋白分析試劑盒(Micro BCA Protein Assay Kit, Thermo SCIENTFIC 公司)進行蛋白定量。GST-Ji siRNA 轉染子:4.35 μ g/μ L，Scramble siRNA 轉染子:4.56 μ g/μ U。接著，使20 μ g的細胞提取液在還原條件下變性，使用MultiGel II mini4/20( 13W)(CosmoBio公司)進行SDS-PAGE，將蛋白分離。SDS-PAGE結束後，使用箱式印跡裝置電轉錄到PVDF膜上。將轉錄膜用添加有5%脫脂乳/0.05%Tween20的PBS (簡寫為PBS-T)在4°C下孵育16小時，進行印跡(blotting)。然後，使其與用PBS-T稀釋的抗GST-Ji抗體(MBL公司)在4°C下反應16小時。二次抗體反應使用辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗體在室溫下進行I小時。然後，使其與化學發光底物在室溫下反應I分鐘，然後使用X射線膜檢測化學發光。各操作之間的洗滌使用PBS-T振蕩5分鐘、3次。另外，siRNA轉染後，按照達到1.0X105個/5mL的方式播種到60mm組織培養用塑料培養皿中，培養皿中的總細胞數用血細胞計測量直至第4天。
[0153](4) RAS/Raf/MAPK信號級聯相關蛋白的蛋白免疫印跡分析
[0154]使用在GST-1i siRNA轉染後第2天採集的細胞，對RAS/Raf/MAPK信號級聯相關的主要蛋白與上述(3)同樣地進行蛋白免疫印跡分析。作為抗體加入抗GST-π抗體，使用了抗 p-Raf-l(Ser338)抗體(MILLIP0RE 公司)、抗 Raf-1 抗體(Santa Cruz 公司)、抗 p-MEKl/2(Ser217/221)抗體(Cell Signaling 公司)、抗 MEK1/2 抗體(Cell Signaling 公司)、抗p-ERKl/2 (Thr202/Tyr204)抗體(Cell Signaling 公司)、抗 ERK 抗體(Cell Signaling 公司)、抗GAPDH抗體(Abeam公司)。
[0155]將結果示於圖1及2。圖1a)中觀察到，GST-π的表達被GST-π siRNA抑制，但Scramble siRNA中沒有被抑制。圖1b)中可知,轉染後即使經過4天時，GST-π的表達仍然被GST- Ji siRNA穩定地抑制，並且抑制GST- Ji的表達的情況下，與未抑制的情況相比，培養4天後的細胞數顯著減少。另外，從圖2可清楚，GST-Ji siRNA處理組中，RAS/Raf/MAPK信號級聯相關蛋白的磷酸化與Scramble siRNA處理組相比均降低。因此可知，由於GST-π的表達抑制，RAS/Raf/MAPK信號級聯及細胞增殖異常得到抑制。
[0156]實施例2:GST- Ji敲除對泛素化的影響
[0157](I) GST- 31敲除對Raf-1的泛素化的影響
[0158]按照實施例1 (I)~(2)的步驟進行M7609細胞的培養及GST- siRNA轉染。
[0159]與實施例1 (3)同樣地，從siRNA轉染後第2天開始在不含血清的培養基中培養16小時，回收細胞提取液。對得到的細胞提取液使用Micro BCA蛋白分析試劑盒進行蛋白定量(Scramble siRNA:8.88μ g/μ L、GST-π siRNA:7.18 μ g/mL)。將 0.5 μ g 的細胞提取液與結合在Dynabeads Protein G (Invitrogen公司)上的抗Raf-1抗體混合,在用振蕩機溫和混合的同時，在4°C下孵育2小時,將Raf-1蛋白分離後,使用抗泛素抗體(Santa Cruz公司)，與實施例1 (3)同樣地進行蛋白免疫印跡分析。關於Raf-1的蛋白酶體分解抑制相關的Ser621的磷酸化修飾，使用抗p-Raf-1 (Ser621)抗體(MILLIP0RE公司)同樣地進行研究。
[0160](2) GST- 31敲除下蛋白酶體抑制劑對Raf-1表達的影響
[0161]按照實施例1(1)~(2)的步驟進行M7609細胞的培養及GST-1i siRNA的轉染。從GST-1i siRNA轉染後第2天開始，將細胞在不含血清的培養基中培養16小時。用5 μ M MG132處理4小時後，回收細胞提取液。作為MG132處理的對照，同樣地進行0.05%DMS0處理。對得到的細胞提取液使用Mic ro BCA蛋白分析試劑盒進行蛋白定量(Scramble siRNA-DMSO處理組:3.36 μ g/ μ、Scramble siRNA_MG132 處理組:3.16 μ g/ μ L、GST- π siRNA-DMSO 處理組:3.12 μ g/ μ L、GST-1i siRNA-MG132 處理組:3.16 μ g/ μ L)。在將 20 μ g 的細胞提取液供給到SDS-PAGE後，使用抗p-Raf-1 (Ser338)抗體及抗Raf-1抗體，與實施例1 (3)同樣地進行蛋白免疫印跡分析。
[0162](3) ρ-Raf-l 與 GST-的共免疫沈降
[0163]按照實施例1 (I)的步驟進行M7609細胞的培養。接著，將按照實施例1 (2)的步驟得到的GST-Ji敲除細胞用冷PBS洗滌，然後加入冷共免疫沈降緩衝液(0.5%NP-40、50mM HEPESU50mM NaClUmM EGTAU.5mM MgCl2,complete Mini EDTA-free,PhosSTOP,pH為7.5)，冰冷、孵育30分鐘，使其溶解。在4°C、15000rpm下進行離心分離15分鐘，得到細胞提取液。對得到的細胞提取液使用Micro BCA蛋白分析試劑盒進行蛋白定量(12.1 μ g/yL)。將Img的細胞提取液與結合在Dynabeads Protein G上的抗p-Raf-1 (Ser338)抗體(US Biological公司)混合，在用振蕩機溫和混合的同時，在4°C下孵育16小時，進行共免疫沈降。接著，進行使用了抗GST-π抗體的蛋白免疫印跡分析。
[0164]將結果示於圖3~5。從圖3可清楚，GST-1i siRNA處理組中，與Raf-1共沈降的泛素量與Scramble siRNA處理組相比更多，Raf-1的泛素化增強。另外，圖4顯示，GST-Ji siRNA作用下的ρ-Raf-l的表達降低與蛋白酶體相關；圖5顯示，GST-π與p-Raf-1結合。以上結果啟示，GST-Ji與ρ-Raf-l結合，抑制其泛素化，由於GST-π抑制，p-Raf-1的泛素化得到促進，Ρ-Raf-l的存在量減少。
[0165]實施例3:利用GST-π敲除的自噬及細胞凋亡誘導的分析[0166](I)利用免疫螢光染色的自噬誘導的分析
[0167]利用作為自噬特異性標記蛋白的LC3的免疫螢光染色對利用GST- π敲除的自噬誘導進行分析。將實施例1 (2)的步驟中得到的GST-π敲除細胞按照達到I X IO5個/2mL的方式播種到放入到35mm組織培養用塑料培養皿的蓋玻片上。將培養基吸出(aspirate)後，加入添加有4%多聚甲醛的PBS，在室溫下孵育10分鐘，使細胞固定。細胞的浸透化使用添加有0.5%Triton X-100的PBS在冰上進行5分鐘。用冷PBS洗滌10分鐘後，與用添加有1%BSA的PBS稀釋了的抗LC3B抗體(Invitrogen公司)在溼式腔室內、37°C下使其反應I小時。二次抗體反應使用Alexa Fluor488標記的兔抗體(Invitrogen公司)在37°C進行I小時。使用 Prolong Gold antifade reagent with DAPI 載持(mount)到載玻片上,在 4°C下孵育16小時。抗體反應後的洗滌使用PBS、37°C下進行5分鐘、3次。螢光顯微鏡觀察時的自噬陽性細胞為具有存在於細胞質中的點狀LC3信號的細胞。
[0168]( 2 )利用蛋白免疫印跡的自噬誘導的分析
[0169]進而利用LC3的蛋白免疫印跡分析對GST-π敲除細胞的自噬誘導進行分析。將實施例1 (2)的步驟中得到的GST-π敲除細胞按照達到I X IO5個/2mL的方式播種到放入到35mm組織培養用塑料培養皿的蓋玻片上。孵育規定的時間後，回收細胞提取液，供於蛋白免疫印跡分析。作為一次抗體，使用抗LC3B抗體(SIGMA公司)，使其與轉錄膜在4°C反應16小時。LC3分子的檢測在與HRP標記二次抗體反應後，使用化學發光試劑來進行。是否誘導了自噬採用向LC3的I型(18kDa)和II型(16kDa)的轉移來評價。
[0170](3)利用電子顯微鏡觀察的自噬誘導的分析
[0171]在實施例1 (2)中的siRNA轉染後第I天，將細胞按照達到0.4X IO5個/0.5mL的方式播種到8孔組織培養用培養玻片上。用含有2.5%戊二醛的0.1M 二甲酸緩衝液(pH為
7.4)固定I小時，在用0.1M 二甲酸緩衝液衝洗後，用1%0s04和1.5%亞鐵氰化鉀進行2小時後固定。在採用乙醇、10分鐘脫水3次後,用環氧樹脂(TAAB Laboratories Equipment公司)包埋。用Diamond Knife製作超薄切片，用乙酸鈾醯和檸檬酸鉛進行電子染色，用電子顯微鏡(日立透射電子顯微鏡H-7500,日立High Technologies公司)觀察切片。
[0172](4)利用TUNEL染色的細胞凋亡誘導的分析
[0173]TUNEL 法使用 In Situ Cell Death Detection Kit, POD (Roche)如下進行。將實施例1 (2)的步驟中得到的GST-π敲除細胞按照達到I X IO5個/2mL的方式播種到放入到35_組織培養用塑料培養皿的蓋玻片中。將培養基吸出後，加入添加有4%多聚甲醛的PBS，在室溫下孵育60分鐘，將細胞固定。為了進行內因性過氧化物酶的印跡，用添加有3%H202的甲醇在室溫下孵育10分鐘。接著，用添加有0.l%Triton X-100的0.1%檸檬酸鈉在冰上處理2分鐘，進行細胞的浸透化。TUNEL反應在溼式腔室內、37°C下進行60分鐘。使過氧化物酶標記抗螢光素抗體在37°C下反應30分鐘後，利用使用了 DAB底物的發色反應進行TUNEL陽性細胞的檢測。用蘇木精進行復染，在光學顯微鏡下觀察染色細胞，將TUNEL陽性細胞評價為細胞凋亡細胞。各操作之間的洗滌採用利用PBS的衝洗來進行。
[0174]將結果示於圖6~10。圖6為抗LC3抗體時的免疫螢光染色圖像，在用箭頭示出的細胞中，觀察到顯示LC3的點狀信號。推測該LC3的點狀信號為自噬體，其結果可知在GST-Ji敲除細胞中 誘導了自噬。
[0175]圖7為GST- Ji siRNA轉染後經過2天時的GST- Ji KD細胞的電子顯微鏡觀察圖像。左圖中用四邊形圍住的A的部分的放大圖像在右圖。右圖中，箭頭所示的部分中可確認到自噬體按照包圍線粒體的方式形成。
[0176]圖8表示LC3的蛋白免疫印跡的結果。被抗LC3抗體識別的LC3蛋白存在2種型。當發生自噬、LC3被攝入脂質雙層膜時，LC3從I型變化為II型。因此，通過LC3-1I型的檢測量的變化，能夠確認是否誘導了自噬。從圖8的結果可知，GST- Ji siRNA處理組中LC3的I型、II型均誘導了表達，特別是確認到II型顯著增加；而Scramble siRNA處理組中，I型、II型的表達均低，且I型比II型的表達量更低。
[0177]從這些結果可知，通過抑制GST-π的表達，自噬得到誘導。
[0178]圖9表示TUNEL染色的結果。上一行為Scramble siRNA處理組的圖像，下一行為GST-1i siRNA處理組的圖像，在敲除了 GST- π的細胞中，觀察到TUNEL陽性細胞、即細胞凋亡。
[0179]圖10為表示GST-1i siRNA處理組和Scramble siRNA處理組的自噬陽性細胞及細胞凋亡陽性細胞的比例的經時變化的曲線圖。需要說明的是，自噬陽性細胞的比例表示上述(I)的利用抗LC3抗體的免疫螢光染色實驗中的具有點狀LC3信號的細胞相對於500個細胞的比例；細胞凋亡陽性細胞的比例表示上述(4)的TUNEL染色實驗中的TUNEL陽性細胞相對於1000個細胞的比例。由此可知，自噬陽性細胞的比例在處理後急劇增加，在第2天達到峰值，其後下降，而細胞凋亡陽性細胞的比例雖然緩慢但持續地增加至第4天。
[0180]實施例4:GST~ π敲除對EGFR/PI3K/Akt/mT0R信號級聯的影響
[0181](l)EGFR/PI3K/Akt/mT0R信號的蛋白免疫印跡分析
[0182]除了使用抗p-EGFR (Tyrl068)抗體(Cell Signaling 公司)、抗 EGFR 抗體(SantaCruz 公司)、抗 p_PI3Kp85 (Tyr458)/p55 (Tyrl99)抗體(Cell Signaling 公司)、抗 PI3K、p85 抗體(MILLIPORE 公司)、抗 p_Akt (Ser473)抗體(Cell Signaling 公司)、抗 Akt 抗體(Cell Signaling 公司)、抗 p-p70S6K (Thr389)抗體(Cell Signaling 公司)、抗 p-p70S6K(Thr421/Ser424)抗體(Cell Signaling 公司)、抗 p70S6K 抗體(Cell Signaling 公司)作為一次抗體以外，與實施例1 (1)、(2)、(4)同樣地對構成EGFR/PI3K/Akt/mT0R信號級聯的各蛋白的表達進行分析。
[0183](2) GST-31敲除下蛋白酶體抑制劑對p-EGFR表達的影響
[0184]按照實施例1 (I)~(2)的步驟進行M7609細胞的培養及GST-π siRNA的轉染。GST-Ji siRNA轉染後第2天，用不含血清的培養基培養細胞16小時。用5μΜ MG132處理2小時後，回收細胞提取液。作為MG132處理的對照，同樣地進行0.05%DMS0處理。對得到的細胞提取液使用Micro BCA蛋白分析試劑盒進行蛋白定量(Scramble siRNA-DMSO處理組:11.98 μ g/μ L、Scramble siRNA_MG132 處理組:12.29 μ g/μ L、GST_ π siRNA-DMSO 處理組:8.91 μ g/ μ L、GST-1i siRNA-MG132 處理組:9.24 μ g/ μ L)。將 80 μ g 的細胞提取液供於SDS-PAGE後，用抗p-EGFR (Tyrl068)抗體及抗EGFR抗體進行蛋白免疫印跡分析。
[0185](3) p-EGFR與GST-的共免疫沈降
[0186]按照實施例1 (I)的步驟進行M7609細胞的培養。接著，將細胞用冷PBS洗滌後，加入冷共免疫沈降緩衝液(1.0%TritoN X-100、50mM Tris-HCl、150mM NaCl.complete MiniEDTA-free、PhosSTOP, pH為7.5)，冰冷、孵育30分鐘，使其溶解。在4°C、12000rpm下進行離心分離10分鐘，得到細胞提取液。對得到的細胞提取液使用Micro BCA蛋白分析試劑盒進行蛋白定量(9.08 μ g/μ L)。將Img細胞提取液與結合在Dynabeads Protein G上的抗p-EGFR (Tyrl068)抗體(Calbiochem公司)混合,在用振蕩機溫和混合的同時,在4°C孵育16小時，進行共免疫沈降。接著，使用抗GST-π抗體進行蛋白免疫印跡分析。
[0187] 將結果示於圖11~13。圖11顯示GST-Ji siRNA處理組中，構成EGFR/PI3K/Akt/mTOR信號級聯的各蛋白的磷酸化與Scramble siRNA處理組相比減少；圖12顯示利用GST-1i siRNA的p-EGFR的表達降低與蛋白酶體相關；並且，圖13顯示GST- π與p-EGFR結合。以上結果啟示，GST-1i與p-EGFR結合，有助於其穩定化，通過抑制GST- π，p-EGFR的泛素化得到促進，ρ-EGFR的存在量減少。
[0188]實施例5:GST- Ji抑制劑對細胞增殖等的影響
[0189](I) GST- 31抑制劑對EGFR及Raf-1的磷酸化的影響
[0190]按照實施例1(1)的步驟進行M7609細胞的培養。將細胞按照達到4.0 X IO5個/5mL的方式播種到60_組織培養用塑料培養皿中。加入GST-1i抑制劑C16C2 (委託帝人Pharma公司製作)使其達到10、50、100 μ M，24小時後回收細胞提取液。對得到的細胞提取液使用Micro BCA蛋白分析試劑盒進行蛋白定量(非處理:8.5 μ g/μ L、10 μ L:8.49 μ g/μ L、50yM:7.68 μ g/μ L、100 μ M:6.4 μ g/μ L)。在將 50 μ g 細胞提取液供於 SDS-PAGE 後，通過蛋白免疫印跡法對各蛋白的表達進行分析。
[0191](2) GST-31抑制劑對細胞增殖等的影響
[0192]按照實施例1(1)的步驟進行M7609細胞的培養。將細胞按照達到1.0X IO5個/5mL的方式播種到60_組織培養用塑料培養皿中。16小時後，加入GST- π抑制劑，使其達到50 μ Μ。培養皿中的總細胞數用血細胞計測量，直至第2天。作為GST-1i抑制劑的對照，進行0.05%DMS0處理。
[0193]將結果示於圖14及15。從這些結果可知，利用GST-Ji抑制劑也與GST-π敲除同樣地抑制EGFR及Raf-1的磷酸化(圖14)以及細胞增殖(圖15)。
[0194] 實施例6:自噬抑制劑對GST- Ji敲除細胞的影響
[0195](I)細胞培養
[0196]在按照實施例1 (2)的步驟進行GST-JisiRNA轉染後，替換成不含抗生素的培養基，孵育3小時。將細胞播種到放入到35mm組織培養用塑料培養皿的蓋玻片上，在培養基中加入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA，SIGMA公司)，使其達到I及5mM，然後培養規定的時間。
[0197](2)自噬陽性細胞的評價
[0198]與實施例3(1)同樣用抗LC3抗體對(I)中培養的細胞進行免疫螢光染色。
[0199](3) TUNEL 染色
[0200]與實施例3 (4)同樣地對(I)中培養的細胞進行TUNEL染色。
[0201]將結果示於圖16~18。圖16表示各組中自噬陽性細胞相對於1000個細胞的比例，可知在自噬抑制劑的作用下自噬陽性細胞的比例顯著減少。圖17的上一行表示GST-1i siRNA + lmM3-MA處理組、下一行表示GST- π siRNA + 5mM3-MA處理組。從圖9及圖17可知，通過並用自噬抑制劑，細胞凋亡陽性細胞顯著增加。圖18為表示自噬抑制劑用量依賴性地進一步誘導細胞凋亡的曲線圖。通過添加GST- π siRNA,細胞凋亡得到誘導，當進一步追加自噬抑制劑即3-MA時，3-MA的追加用量依賴性地進一步誘導細胞凋亡。因此可知，通過將抑制GST- Ji 的藥物與抑制自噬的藥物組合，能夠更有效地誘導細胞凋亡。
【權利要求】
1.一種用於誘導細胞凋亡的藥劑，其含有抑制GST-π的藥物和抑制自噬的藥物作為活性成分。
2.一種用於誘導GST-π得到抑制的細胞發生細胞凋亡的藥劑，其含有抑制自噬的藥物作為活性成分。
3.根據權利要求1或2所述的藥劑，其用於誘導具有變異型KRAS的細胞發生細胞凋亡。
4.根據權利要求1~3中任一項所述的藥劑，其中，活性成分選自由RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸及表達它們的載體組成的組。
5.一種醫藥組合物，其含有權利要I~4中任一項所述的藥劑。
6.根據權利要求5所述的醫藥組合物，其用於治療細胞的異常增殖所引起的疾病。
7.根據權利要求5所述的醫藥組合物，其用於治療KRAS的變異所引起的疾病。
8.根據權利要求5所述的醫藥組合物，其用於治療癌。
9.一種用於促進PI3K/Akt/mT0R信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的藥劑，其含有GST- π和/或其功能性突變體作為活性成分。
10.一種用於抑制PI3K/Akt/mTOR信號級聯和/或RAS/Raf/MAPK信號級聯的藥劑，其含有抑制GST- 的藥物作為活性成分。
11.一種用於抑制泛素化的藥劑，其含有GST-π和/或其功能性突變體作為活性成分。
12.一種用於促進泛素化的藥劑，其含有抑制GST-π的藥物作為活性成分。
13.一種用於抑制自噬的藥劑，其含有GST- π和/或其功能性突變體作為活性成分。
14.一種用於促進自噬的藥劑，其含有抑制GST- 的藥物作為活性成分。
【文檔編號】A61P35/00GK103619355SQ201180071784
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2011年6月21日 優先權日:2011年6月21日
【發明者】新津洋司郎, 西夛裕樹 申請人:日東電工株式會社