反應表面的樣品裂解和塗層的製作方法

2023-07-09 02:51:11

專利名稱：反應表面的樣品裂解和塗層的製作方法
技術領域：
本發明涉及便於核酸分析的共聚物。
背景技術：
固定在固體表面的核酸分子便於核酸製備和分析，尤其在高產量形式的製備和分 析中。示例的核酸製備和分析系統是Ddrect Plate Pr印系統，該系統中血液裂解(lysis) 發生在塗有結合DNA的聚合物的PCR板上。從血液中提取的DNA與該板上的聚合物結合。然 後，清洗該板，通過加入反應所必需的組分可以引發PCR。類似的產品可從Trinity Biotech PLC獲得。所謂"Xtra-Amp板"塗有二氧化矽，生物樣品的裂解以及從所述樣品提取的核酸 結合到該塗敷板上可以通過使用離液序列高的鹽進行。 如上所述，目前可得到的核酸製備和分析系統要求對進行核酸提取和/或分析的 容器預塗敷結合DNA的聚合物。因此，需要研製更簡單和/或更有效的系統。
發明概述 本發明提供便於進行核酸分析的共聚物，包含該共聚物的組合物，以及該共聚物 的製備方法和使用方法。 —方面，本發明提供一種共聚物，該共聚物包含可從第一組分獲得的部分、可從 第二組分獲得的部分以及可從含氨基組分獲得的部分，其中，第一組分包含疏水性單體或 其衍生物，第二組分包含能向與其直接或間接連接的含氨基的組分提供至少一個官能度的 單體或其衍生物，且含氨基組分與第二組分直接或間接地共價連接。 當含氨基組分與第二組分間接相連時，優選第二組分與間隔基的一端共價連接， 而該間隔基的另一端與含氨基組分相連。 還可以使用兩種或更多種不同單體的混合物作為第一組分以及兩種或更多種單 體的混合物作為第二組分。 在另一個實施方式中，可從第一組分獲得的部分包含第一疏水性聚合物或其衍生 物，可從第二組分獲得的部分包含第二聚合物或其衍生物，可從含氨基組分獲得的部分與 第二組分共價連接。這種實施方式的形成可以是第一組分的單體形成一種聚合物，第二組 分的單體形成一種聚合物，且所形成的聚合物相互連接的情況。這種情況可以是例如嵌段 共聚物或接枝聚合物的情況。 由疏水性單體產生的部分或者所得的疏水性聚合物部分分別可以使共聚物在疏 水性表面上形成膜，而由第二單體產生的部分或者第二聚合物部分分別提供官能度，這樣 使含氨基的組分可以直接或者間接與該共聚物連接。而該氨基再提供正電荷，使共聚物結 合核酸分子。換句話說，本發明的共聚物通過分別由疏水性單體或疏水性聚合物組分產生的部分與疏水性表面之間的疏水性相互作用以及通過其帶正電荷的氨基與帶負電荷的核 酸分子之間的靜電相互作用，能夠將核酸分子固定在疏水性表面上。 本發明中示例的共聚物包括但不限於氨基改性的苯乙烯_馬來酸酐共聚物、氨 基改性的異戊二烯_馬來酸酐接枝共聚物、氨基改性的甲基乙烯基醚_馬來酸酐交替共聚 物、氨基改性的丙烯酸硬脂酯_甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚物以及氨基改性的苯乙烯-甲 基丙烯酸縮水甘油酯共聚物。 另一方面，本發明提供包含本文所述共聚物的組合物，例如含共聚物的裂解緩衝 劑。 另一方面，本發明提供通過本文所述的共聚物與核酸分子之間的相互作用形成的 複合體(complex)。 另一方面，本發明提供進行生物測試的試劑盒，該試劑盒包含本文所述的共聚物。 示例的試劑盒包括但不限於用於包括本文所述共聚物和裂解緩衝劑的樣品製備的試劑 盒，用於包括本發明共聚物、裂解緩衝劑、任選清洗緩衝劑、DNA聚合酶和dNTP的核酸擴增 的試劑盒。 另一方面，本發明提供進行核酸測試的容器，該容器塗有本文所述的共聚物。 另一方面，本發明提供從生物樣品中提取核酸的方法，該方法包括將包含核酸的
生物樣品與裂解緩衝劑進行混合，所述裂解緩衝劑包含本文所述的共聚物。 另一方面，本發明提供將核酸固定在疏水性表面的方法，該方法包括同時或者順
序在疏水性表面上施用本文所述的共聚物和核酸。
另一方面，本發明提供核酸擴增的方法，該方法包括(i)混合含核酸的生物樣品 與含共聚物的裂解緩衝劑，(ii)將步驟(i)中形成的混合物施用在疏水性表面上，這樣用 裂解緩衝劑中的共聚物使生物樣品中的核酸固定在疏水性表面上，和(iii)使用固定在該 疏水性表面上的核酸作為模板進行核酸擴增。
附圖簡述

圖1是顯示定量實時PCR擴增e-肌動蛋白的結果的條形圖。y-軸示出檢測到的 DNA量(納克)。x-軸顯示使用不同裂解緩衝劑的不同製備組合(setup)。
圖2是顯示使用各種含共聚物KS19的裂解緩衝劑的結合特異性的條形圖。最右 面的柱顯示只使用EL但沒有KS19作為裂解緩衝劑的結果，該柱用作對照。y-軸顯示實時 PCR的平均Ct值。x-軸顯示各種裂解緩衝劑。 圖3是顯示使用各種含共聚物KS19的裂解緩衝劑與兩種清洗緩衝劑(MiIIiQ清 洗TE清洗)的組合的實時PCR條形圖。最右面的柱顯示只使用EL但沒有KS19作為裂解 緩衝劑的結果，該柱用作對照。y-軸顯示實時PCR的平均Ct值。x-軸顯示各種裂解緩衝 劑。 圖4是顯示使用各種含共聚物KS19的裂解緩衝劑與兩種清洗緩衝劑(TEWash和 TE+0. 05% NP40Wash)的組合的實時PCR條形圖。最右面的柱顯示只使用EL但沒有KS19 作為裂解緩衝劑的結果，該柱用作對照。y-軸顯示實時PCR的平均Ct值。x-軸顯示各種 裂解緩衝劑。
發明詳述 本發明提供便於進行核酸分析的共聚物，包含該共聚物的組合物，該共聚物的製備方法和使用方法。 —方面，本發明提供一種能與疏水性表面和核酸分子結合的共聚物。更具體地，本 發明的共聚物包含可從第一組分獲得的部分、可從第二組分獲得的部分以及可從含氨基 組分獲得的部分。第一組分包含疏水性單體或其能產生聚合物部分的任何衍生物，該組分 可以使共聚物通過疏水性相互作用與疏水性表面結合。第二組分包含第二單體或衍生物， 並能產生第二聚合物部分，該組分提供活性基團，該基團能使含氨基的化合物直接或間接 與該共聚物連接。 第一組分的單體可包括任何疏水性單體或其衍生物。這類疏水性單體的例子有 不飽和的芳香族化合物，如苯乙烯，烯烴，如乙烯或丙烯或者鏈多烯(alk即olyene)(多烯) 如丁二烯。 在第一組分的單體產生聚合物的情況，共聚物包含第一組分。該組分可包含任何 疏水性聚合物或其衍生物。示例的疏水性聚合物包括但不限於聚苯乙烯，聚烯烴，如聚乙 烯或聚丙烯，以及聚鏈多烯(polyalk即olyene)如聚丁二烯。 第二組分可包含任何單體或者可產生含活性基團的任何聚合物或其衍生物，所述 活性基團能夠直接連接含氨基化合物(即，通過與含氨基化合物的直接反應)或者間接連 接含氨基的化合物(即，通過首先與一種或多種不含氨基的化合物的一個或多個反應，其 中這些化合物的至少一部分結合到最終的共聚物產物中，而所述部分提供與含氨基化合物 的進一步連接)。在一些實施方式中，第二組分包含胺活性基團。在其它一些實施方式中， 第二組分包含羥基活性基團。示例的活性基團包括但不限於羧酸酯，酐，醛和環氧基團。第 二組分的單體的例子有馬來酸酐、丙烯酸、4_羥基苯乙烯、4_乙烯基-苯甲醛及其衍生物。 在第二組分單體形成第二組分的聚合物情況，示例的第二組分包括但不限於聚(馬來酸 酐)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(4-羥基-苯乙烯)、聚(4-乙烯基-苯甲醛)以 及這些聚合物的衍生物。 在一些實施方式中，本發明的共聚物可以通過以下方法合成，用帶氨基的化合物 (如，伯胺、仲胺或叔胺)，對由疏水性單體和向與其連接的含氨基的化合物提供至少一個 官能度的單體聚合獲得的共聚物進行改性，或者對包含疏水性聚合物和另一聚合物的共聚 物進行改性。帶氨基的化合物還可以包含第二官能團，如另一個氨基或羥基，以與共聚物上 的活性基團相互作用。示例的帶氨基化合物包括但不限於2-(二異丙基氨基)-乙胺、N， N-二乙基二亞乙基三胺、l-(2-氨基乙基)吡咯烷、1-氨基_4-甲基哌嗪、&&2，2，-四甲 基-1， 3-丙二胺、3-( 二丁基胺)丙胺、Girard試劑1\氯化膽鹼、2-(2_ 二乙基氨基乙基氨 基)-乙醇、2-{[2-(二甲基氨基)乙基]甲基氨基}乙醇、l，3-二-(二乙基氨基)-2-丙 醇、a-(二異丙基氨基)乙醇、2-[2-(二甲基氨基)乙氧基]乙醇、4-二異丁基氨基-l-丁 醇、6_ 二丙基氨基-1-己醇或者二乙醇胺。 在一些實施方式中，第二組分還可以包含間隔基部分，該部分將第二組分或第二 聚合物的單體與含氨基組分連接。該間隔基部分可以使氨基和疏水性聚合物主鏈之間達到 最佳的間距，能使核酸最佳固定在疏水性表面上。 所述間隔基部分可來自形成間隔基的分子，該分子可以在共聚物與含氨基化合物 反應之前或者同時與包含第一組分和第二組分的共聚物進行反應。形成間隔基的分子可以 是能夠與分別由第二單體獲得的部分或第二組分的聚合物部分的活性基團以及含氨基化
6合物的另一活性基團反應的任何分子。示例的形成間隔基的分子包括但不限於乳糖酸內
酯(lactonolactone)，未改性的和化學改性的聚(乙二醇)(具有通式H0-(C2H40)n-H，其中，
n為1-20， 000)，未改性的和化學改性的聚(丙二醇)(H0-(C3H60)m-H，其中m為1-20， 000)，
甘油二縮水甘油醚，甘油-丙氧基化物三甘油醚和聚(甲基)丙烯酸。 本發明的共聚物可以是嵌段共聚物、接枝聚合物、統計聚合物或交替聚合物。它們
可以是線型的或支化的。 本發明的示例共聚物包括但不限於氨基改性的苯乙烯_馬來酸酐共聚物，氨基 改性的異戊二烯_馬來酸酐接枝共聚物，氨基改性的甲基乙烯基醚_馬來酸酐交替共聚物， 氨基改性的丙烯酸硬脂酯_甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚物和氨基改性的苯乙烯_甲基丙烯 酸縮水甘油酯共聚物。 本發明的共聚物可包含約5-60% (重量百分數，包括在此範圍之內的任何值)的 第二組分單體。例如，氨基改性的苯乙烯_馬來酸酐共聚物，氨基改性的異戊二烯_馬來酸 酐接枝共聚物和氨基改性的甲基醚_馬來酸酐交替共聚物各自可含有約7-50% (重量百分 數，包括在該範圍之內的任何值)的馬來酸酐。 本申請的共聚物可以通過以下方法合成，首先由第一疏水性單體和具有上面特定 的官能度的第二單體合成或者獲得共聚物，或者首先合成包含疏水性聚合物和第二聚合物 的共聚物，然後，直接或者間接用含氨基的化合物對形成的共聚物進行改性。例如，苯乙 烯_馬來酸酐共聚物可以商購，並可以通過氨解與2- 二異丙基氨基_乙胺(DIPAEA)共價 連接。下面實施例1提供了這種示例性合成的反應圖解。 如上所述，本發明共聚物便於進行核酸固定和分析。例如，本發明的共聚物可包含 在裂解緩衝劑或者另一核酸提取或製備的緩衝劑中。製成的緩衝劑可以和生物樣品混合， 然後加入到有疏水性表面的反應容器內。緩衝劑中的共聚物通過其單一的疏水性部分或其 疏水性聚合物部分在反應容器的疏水性表面上形成膜，而共聚物的氨基與核酸分子結合。 然後，固定到疏水性表面上的核酸分子可以被擴增和/或進行分析。因此，包含本發明的共 聚物可以將樣品裂解和反應容器的塗敷組合在一起，因而簡化核酸分析。
或者，上述的含共聚物的緩衝劑可以首先加到反應容器，這樣塗敷反應容器。然 後，將生物樣品加入到在塗敷的反應容器的緩衝劑中。 可以採用本發明方法進行分析的生物樣品包括有可能含有核酸分子的任何樣品。 這些樣品可以是從有機體直接分離的，或者可以隨後進行處理。示例的生物樣品包括但不 限於，血液、體液和培養的細胞。 本發明的共聚物優選不幹擾在和共聚物結合的核酸分子上進行的測試。這類測試 包括核酸雜交和核酸擴增，如各種類型的PCR。 因此，在一方面，本發明提供包含本文所述的共聚物的組合物，如含共聚物的裂解 緩衝劑。在另一方面，本發明提供通過本文所述共聚物與核酸分子之間的相互作用形成的 複合體。 在另一相關方面，本發明提供進行生物測試的試劑盒，該試劑盒包含本文所述的 共聚物。試劑盒的例子包括但不限於，用於包括本文所述共聚物和裂解緩衝劑的樣品製備 的試劑盒，用於包括本發明共聚物、裂解緩衝劑、任選清洗緩衝劑、DNA聚合酶和dNTP的核 酸擴增的試劑盒。
在另一方面，本發明提供進行核酸測試的容器，該容器塗有本文所述共聚物。經過 塗敷的容器的例子包括但不限於用於進行PCR的多孔板或帶以及PCR試管。在相關方面， 本發明提供用來結合和分析核酸的實心基板。這種基板包括但不限於，用於結合核酸並進 行雜交測試或其它核酸分析的載玻片和晶片。 在另一方面，本發明提供了從生物樣品提取核酸的方法，該方法包括將包含核酸 的生物樣品與裂解緩衝劑進行混合，該裂解緩衝劑包含本文所述的共聚物。該方法還包括 在有疏水性表面的反應容器中加入製成的混合物。 在另一方面，本發明提供將核酸固定到疏水性表面的方法，該方法包括同時或順 序在疏水性表面上施用本文所述的共聚物和核酸。在疏水性表面上同時施用核酸和共聚物 的實施方式中，所述核酸可以在施用之前與共聚物混合，或者可以將核酸和共聚物分開施 用於該表面。 在另一方面，本發明提供用於核酸擴增的方法，該方法包括(i)混合含核酸的生 物樣品與含共聚物的裂解緩衝劑，(ii)將步驟(i)中形成的混合物施用在疏水性表面上， 這樣用裂解緩衝劑中的共聚物使生物樣品中的核酸固定在疏水性表面上，和(iii)使用固 定在該疏水性表面的核酸作為模板進行核酸擴增。這些方法還包括在步驟(iii)之前用清 洗緩衝劑清洗疏水性表面。 本發明的示例的方法包括(i)混合血液樣品和與含DIPAEA共價連接的苯乙 烯-馬來酸酐共聚物的紅細胞裂解緩衝劑，形成混合物；(ii)將步驟(i)的混合物加入具 有疏水性表面的反應容器(如，PCR板或帶)；(iii)除去反應容器內的溶液；(iv)任選用 清洗緩衝劑清洗該反應容器；(v)在該反應容器內進行PCR;和(vi)任選檢測擴增的核酸 分子。 在第一和第二聚合物形成共聚物的情況，另一組實施方式總結如下
1. —種包含第一組分、第二組分和氨基的共聚物，其中，
(i)第一組分包含第一疏水性聚合物或其衍生物，
(ii)第二組分包含第二聚合物或其衍生物，
(iii)所述氨基與第二組分共價連接。 2.第1項的所述的共聚物，其中，第一疏水性聚合物是聚苯乙烯。 3.第1項的所述的共聚物，其中，第一疏水性聚合物是聚乙烯、聚丙烯、聚丁二烯、
聚烯烴或者聚鏈多烯。 4.第l項的所述的共聚物，其中，第二聚合物是聚(馬來酸酐)、聚(丙烯酸)或 聚(甲基丙烯酸)。 5.第l項的所述的共聚物，其中，第二聚合物是聚(4-羥基-苯乙烯)、聚(4_乙 烯基-苯甲醛)，或其衍生物。 6.第1項的所述的共聚物，其中，第二組分還包含胺活性基團。 7.第6項的所述的共聚物，其中，胺活性基團是羧酸酯、醛或環氧基團。 8.第1項的所述的共聚物，其中，第二組分還包含羥基活性基團。 9.第1項的所述的共聚物，其中，通過用帶氨基的化合物對包含第一疏水性聚合
物和第二聚合物的共聚物進行改性，使所述氨基與第二組分共價連接。 10.第9項的所述的共聚物，其中，帶氨基的化合物是伯胺、仲胺或叔胺。
11.第9項的所述的共聚物，其中，帶氨基的化合物還包含第二氨基。 12.第9項的所述的共聚物，其中，帶氨基的化合物還包含羥基。 13.第9項的所述的共聚物，其中，帶氨基的化合物是2_( 二異丙基氨基)_乙胺，
N， N- 二乙基二亞乙基三胺，1- (2-氨基乙基)吡咯烷，1-氨基-4-甲基哌嗪，N， N， 2， 2-四甲
基-l，3-丙二胺，3-(二丁基胺)丙胺，Girard試劑T，氯化膽鹼，2-(2-二乙基氨基乙基氨
基)-乙醇，2-{[2-(二甲基氨基)乙基]甲基氨基}乙醇，l，3-二-(二乙基氨基)-2-丙
醇，a-(二異丙基氨基)乙醇，2-[2-(二甲基氨基)乙氧基]乙醇，4-二異丁基氨基-l-丁
醇，e-二丙基氨基-i-己醇或二乙醇胺。 14.第1項的所述的共聚物，其中，第二組分還包含間隔基部分，該間隔基部分將 第二聚合物的單體與氨基連接。 15.第l項的所述的共聚物，其中，間隔基部分源自形成間隔基的分子，所述分子 選自乳糖酸內酯，未改性的和化學改性的聚(乙二醇)(具有通式H0-(C2H40)n-H，其中，n為 1-20， 000)，未改性的和化學改性的聚(丙二醇)(H0-(C3H60)m-H，其中m為1-20， 000)，甘油 二縮水甘油醚，甘油-丙氧基化物三甘油醚和聚(甲基)丙烯酸 16.氨基改性的苯乙烯_馬來酸酐共聚物，含有約7-50% (重量百分數)馬來酸 酐。 17.氨基改性的異戊二烯_馬來酸酐接枝共聚物，含有約7_50%馬來酸酐。
18.氨基改性的甲基乙烯基醚_馬來酸酐交替共聚物，有約50%馬來酸酐。
19.氨基改性的丙烯酸硬脂酯_甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚物。
20.氨基改性的苯乙烯_甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚物 21. —種用胺改性的共聚物，其中，該共聚物是苯乙烯-馬來酸酐共聚物，異戊二 烯_馬來酸酐接枝共聚物，甲基乙烯基醚_馬來酸酐交替共聚物，丙烯酸硬脂酯_甲基丙烯 酸縮水甘油酯共聚物，或苯乙烯_甲基丙烯酸縮水甘油基酯共聚物，所述胺是伯胺、仲胺或 叔胺。 22. —種裂解緩衝劑，包含上述1-21項中任一項所述的共聚物。 23. —種複合體，包含上述1-21項中任一項所述的共聚物和核酸分子。 24. —種用於進行生物測試的試劑盒，該試劑盒包含上述1-21項中任一項所述的
共聚物和裂解緩衝劑。 25. —種用於進行核酸擴增的試劑盒，該試劑盒包含上述1-21項中任一項所述的 共聚物、裂解緩衝劑、清洗緩衝劑、DNA聚合酶和dNTP。 26. —種用來進行核酸測試的容器，該容器塗有上述1-21項中任一項所述的共聚 物。 27. —種從生物樣品中提取核酸的方法，該方法包括將含核酸的生物樣品與第22 項所述的裂解緩衝劑混合。 28. —種將核酸固定在疏水性表面的方法，該方法包括同時或者順序在疏水性表 面上施用上述1-21項中任一項所述的共聚物和核酸。
29. —種用來擴增核酸的方法，該方法包括 (i)混合含核酸的生物樣品與第22項所述的裂解緩衝劑，形成混合物， (ii)將步驟(i)中形成的混合物施用在疏水性表面上，通過裂解緩衝劑中的共聚
9物將生物樣品中的核酸固定在疏水性表面上，和 (iii)使用固定在該疏水性表面上的核酸作為模板進行核酸擴增。 30.第29項所述的方法，該方法還包括在步驟(iii)之前清洗疏水性表面。 提供下面的實施例進行說明，這些實施例不構成限制。
實施例 實施例1 通過氨解作用，合成與DIPAEA共價連接的苯乙烯_馬來酸酐共聚物 按照以下步驟合成與DIPAEA共價連接的苯乙烯_馬來酸酐共聚物 步驟I.合成乳糖酸內酯 試劑 使用以下試劑氫氧化鉀；甲醇；Millipore水；一水合乳糖(360. 3g/mol) (Fluka 61340);碘(126. 9g/mol) (Fluka 57655) ;二乙醚；amberlite 1R-120 (Fluka06428) 反應式
將32克氫氧化鉀溶於400ml甲醇。另外，將24克(67mmol) —水合乳糖溶解在由 20ml微孔過濾水(Millipore water)和50ml甲醇組成的混合物中。在配備KPG攪拌器、滴 液漏鬥和回流冷凝器的三頸燒瓶中，將34. 2克(270mmol)碘溶於240ml甲醇，加熱該反應 混合物至最高4(TC。 一水合乳糖溶液通過滴液漏鬥緩慢加入。在下一步驟中，用新的滴液 漏鬥替代上述滴液漏鬥，1小時內緩慢加入氫氧化鉀溶液，同時反應溫度仍保持在40°C 。碘 顏色消失後，40°C的溫度再保持1小時。在30分鐘以上的時間冷卻該反應混合物至0°C ，懸 浮液通過玻璃吸濾器(多孔性4(Schott AG， Mainz， Germany)進行吸濾。殘餘物用冷卻至 4(TC的50ml甲醇和50ml 二乙醚進行洗滌，並吸濾至幹態。 然後，將該物質溶解在少量水中，將該溶液轉移到陽離子交換柱。交換柱 用Millipore水洗滌，收集洗脫液，直到洗脫液的pH成為中性，此後，交換柱用500ml Mi 11 ipore水洗滌，收集洗脫液。在下一步驟中，該溶液用250ml 二乙醚萃取兩次，除去殘餘 的碘。然後，在旋轉蒸發器上真空蒸餾至體積為50ml，除去水。殘餘的水通過冷凍乾燥除 去。 歩驟II 通過氨解作用，合成與DIPAEA共價連接的苯乙烯_馬來酸酐共聚物
翻 使用以下試劑苯乙烯-馬來酸酐共聚物(a-枯基端基，麗1600， Aldrich， Cat. No. 44,238-0) ;l，6-二氨基己烷(116. 2g/mol，Fluka 33000);乳糖酸內酯(按照上面所述 合成)；高碘酸鈉；2-(二異丙基氨基)-乙胺(DIPAEA) (Fluka， Cat. No. 38320);氰基硼氫化
10鈉和無水乙醇。
反應圖解
formula see original document page 11
述 將2. 5克苯乙烯-馬來酸酐共聚物加到50ml單頸燒瓶中，還加入預先已熔化的1，6-二氨基己烷。該燒瓶與旋轉蒸發器相連，加熱懸浮液至IO(TC保持1小時，再加熱至120°C保持2小時以上。然後在lmbar減壓下，於50°C除去揮發性化合物。 將21. 95克上面獲得的氨基官能化的共聚物和2. 55克乳糖酸內酯加入研缽中，通過研磨進行混合。然後，將該混合物加入在100ml單頸燒瓶的50mlMillipore水中，加熱至75t:保持6小時。然後，在旋轉蒸發器上，於減壓下濃縮該反應混合物至幹態。
將1000毫克這種共聚物_乳糖酸內酯_加成化合物加入到50ml單頸燒瓶中，再加入20ml Millipore水，室溫攪拌該混合物30分鐘。此時，加入1. 2克高碘酸鈉，使混合物反應2小時，同時使混合物避光。然後，加入lml乙二醇，再攪拌反應混合物30分鐘。在下一步驟中，加入2ml 2-(二異丙基氨基)-乙胺，攪拌混合物4小時。完成偶聯後，再加入400mg氰基硼氫化鈉，攪拌下持續反應過夜。然後，將該反應混合物蒸發至幹，乾燥後的產物
用於本文中所述的各種應用。
實施例2
在塗敷共聚物的板中進行的實時PCRP口口口燃H化錄)
1. 在未塗敷帶的每個孔中分配100 iU裂解緩衝劑。
2. 在每個孔中加入10 iU的血液樣品，通過移液管吸上和放下15次進行混合。
3. 將所述帶在室溫培養15分鐘。
4. 用連接到真空的移液管尖端吸取儘可能多的液體。
5. 將120 iU清洗溶液分配在適當的孔中。
6. 吸取儘可能多的液體。
7. 加入25 ii 1 PCR Mastermix，進行定量的PCR(qPCR)。
KS19-EL :與DIPAEA共價連接的苯乙烯-馬來酸酐共聚物(共聚物"KS19"[10mg/ml])和QIAGEN緩衝劑EL(紅細胞裂解液，含155mM NH4C1和10mM KHC03)的混合物。KS19與緩衝劑EL的體積比為1 : l至l : 2.5。KS19-RBCL :聚合物"KS19" (10mg/ml)與Gentra的紅血細胞裂解緩衝劑RBCL(Gentra， Minne即olis， MN)的1 : 1 (體積體積)的混合物。
清洗溶液 TE(10mM Tris/CI pH 8.0;lmM EDTA) ， TE有0. 05% Nonidet P40 (NP40)，或去離子水。 試驗結果
第一試驗 在本試驗中，如上所述進行血液樣品的裂解以及將樣品中的核酸分子結合到PCR板。圖1示出了定量實時PCR的結果，該定量實時PCR擴增了對P-肌動蛋白編碼的染色體基因。其y軸顯示檢測到的擴增的DNA( "ng"(納克))，X軸顯示使用不同裂解緩衝劑的不同製備組合。最左面的柱代表按照上述方案使用KS19-EL作為裂解緩衝劑和未塗敷的板時核酸的擴增，不同之處是使用蒸餾水清洗；而其餘所有的柱代表使用預塗敷KS19的板和各種沒有共聚物的裂解緩衝劑時核酸的擴增。 總之，使用KS19-EL作為裂解緩衝劑和使用沒有進行預塗敷的板時核酸擴增的產率類似於或者甚至略優於使用預塗敷共聚物的板和沒有共聚物的各種裂解緩衝劑的產率。
為了確證而重複試驗 在本試驗中，前面的結果得到確證。此外，對裂解緩衝劑進行改變，並補充了顯示核酸特異性的對照試驗。為進行對照，裂解緩衝劑EL用蒸餾水進行稀釋，稀釋比為1 : 2，因此，圖2中第一柱和最後一柱之間的差別恰好是存在KS19聚合物的結果。圖2中Y軸顯示實時PCR的平均"Ct"值，而X值顯示用緩衝劑EL或緩衝劑RBCL對KS19聚合物進行稀釋後的裂解緩衝劑-共聚物的不同組合。KS19-EL， KS19-EL2， KS19-EL3和KS19-EL4分別指KS19與緩衝劑EL的稀釋比為1 : 2，1 : 2. 5，1 : 3和1 : 3. 5 ;而KS19-RBCL和KS19-RBCL2分別指KS19與緩衝劑RBCL的稀釋比為1 : 2和1 : 3。第一柱和最後一柱的Ct值之間的差大於3. 3。這表明在裂解緩衝劑中存在KS19使基因組DNA在qPCR中的檢測提高10倍(PCR導致擴增的碎片數量呈指數增加；233 = 10)。 這一結果還顯示傳統的紅細胞裂解緩衝劑(EL)與KS19混合，能夠進行最靈敏的核酸檢測。因此，可以推出大多數KS19聚合物分子結合由紅細胞裂解緩衝劑釋放的含核酸的細胞器(即，核和線粒體)，並且這些細胞器可以和該聚合物一起固定在容器壁上。
達到最優化的試驗 通過將用MilliQ水製備的清洗緩衝劑改變為TE緩衝劑，可以進一步提高該方案的操作性能。這導致使用KS19-EL的PCR和使用EL的PCR之間的Ct差大於4. 5 (圖3)。本試驗顯示使用KS19-EL能夠通過qPCR檢測到2. 1納克的基因組DNA，表明操作性能提高到五倍以上。 上面示出的所有結果都是使用MJ Opticon 2 Real Time Cycler和適當的PCR消耗品(8-孔帶)獲得的。還使用Applied Biosystems TaqMan System 7700和ABI OpticalTubes進行類似的試驗，所獲結果與使用MJ Opticon 2 Real TimeCycler的結果類似(圖4)。此外，通過使用有0. 05% NP40的TE作為清洗緩衝劑，進一步提高操作性能，可以檢測到1.6納克的基因組DNA。 上面本說明書中參考和/或在申請資料頁中列出的所有美國專利，美國專利申請公報，美國專利申請，外國專利，外國專利申請和非專利出版物都全文通過參考結合於本文。 由上面所述可以理解，雖然為了說明在此描述了本發明的特定實施方式，但是，在不偏離本發明的精神和範圍的情況下可以進行各種修改。因此，本發明只受所附權利要求書的限制。
權利要求
一種裂解緩衝劑，其包含如下所述的共聚物所述共聚物包含可從第一組分獲得的部分、可從第二組分獲得的部分和可從含氨基的組分獲得的部分，其中，(i)所述第一組分包含疏水性單體或其衍生物，(ii)所述第二組分包含提供至少一個可與含氨基的組分直接或間接連接的官能團的單體或其衍生物，(iii)含氨基的組分與第二組分直接或間接地共價連接。
2. —種從生物樣品中提取核酸的方法，該方法包括將含核酸的生物樣品與權利要求1 中所限定的裂解緩衝劑混合。
3. —種擴增核酸的方法，該方法包括(i) 將含核酸的生物樣品與權利要求1的裂解緩衝劑混合，形成混合物；(ii) 將步驟(i)中形成的混合物施用在疏水性表面上，從而通過所述裂解緩衝劑中的 共聚物將所述生物樣品中的核酸固定在疏水性表面上，禾口(iii) 使用固定在該疏水性表面上的核酸作為模板進行核酸擴增。
4. 如權利要求3所述的方法，該方法還包括在步驟(iii)之前清洗所述疏水性表面。
5. —種能與疏水性表面結合的複合體，其包含權利要求l中所限定的共聚物和核酸分子。
6. —種用於進行生物測試的試劑盒，該試劑盒包含權利要求l中所限定的共聚物和裂 解緩衝劑。
7. —種用於進行核酸擴增的試劑盒，該試劑盒包含權利要求l中所限定的共聚物、裂 解緩衝劑、清洗緩衝劑、DNA聚合酶和dNTP。
8. —種用來進行核酸測試的容器，該容器塗有權利要求l中所限定的共聚物。
9. 一種將核酸固定在疏水性表面的方法，該方法包括同時或者順序在所述疏水性表面 上施用權利要求1中所限定的共聚物和核酸。
10. 如權利要求1-9中任一項所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵 在於，所述共聚物的疏水性單體是苯乙烯。
11. 如權利要求1-9中任一項所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵 在於，所述共聚物的疏水性單體是具有2-8個碳原子的烯烴或鏈多烯，優選乙烯、丙烯或丁 二烯。
12. 如權利要求1-9中任一項所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵 在於，所述共聚物的第二組分的單體是馬來酸酐、丙烯酸或甲基丙烯酸，或它們的衍生物。
13. 如權利要求1-9中任一項所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵 在於，所述共聚物的第二單體是4-羥基-苯乙烯、4-乙烯基_苯甲醛或它們的衍生物。
14. 如權利要求1-9中任一項所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵 在於，所述共聚物中與含氨基組分連接的官能團包括羧酸酯、醛、酐、醯胺或環氧基團。
15. 如權利要求1-9中任一項所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵 在於，所述共聚物的第二組分還包含羥基活性基團。
16. 如權利要求1-9中任一項所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵 在於，通過用帶氨基的化合物對由疏水性單體和第二單體獲得的共聚物進行改性，使所述共聚物的含氨基的組分與第二組分共價連接。
17. 如權利要求16所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵在於，所述 共聚物的帶氨基的化合物是伯胺、仲胺或叔胺。
18. 如權利要求16或17所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵在於， 所述共聚物的帶氨基的化合物還包含第二氨基。
19. 如權利要求16或17所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵在於， 所述共聚物的帶氨基的化合物還包含羥基。
20. 如權利要求16所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵在於，所 述共聚物的帶氨基的化合物是2-( 二異丙基氨基)-乙胺，N， N- 二乙基二亞乙基三胺，1- (2-氨基乙基)吡咯烷，1-氨基-4-甲基哌嗪，N， N， 2， 2-四甲基-1 ， 3-丙二胺，3- ( 二丁 基胺)丙胺，Girard試劑T，氯化膽鹼，2- (2- 二乙基氨基乙基氨基)_乙醇，2- {[2- ( 二甲基 氨基)乙基]甲基氨基}乙醇，l，3-二-(二乙基氨基)-2-丙醇，a-(二異丙基氨基)乙醇，2- [2-(二甲基氨基)乙氧基]乙醇，4-二異丁基氨基-l-丁醇，6-二丙基氨基-l-己醇或 二乙醇胺。
21. 如權利要求1-9中任一項所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵 在於，所述共聚物的第二組分還包含間隔基部分，該間隔基部分將單體與含氨基的組分連 接。
22. 如權利要求21所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵在於，所述 間隔基部分源自形成間隔基的分子，所述分子選自乳糖酸內酯；具有通式HO- (C2H40) n_H的 未改性的和化學改性的聚(乙二醇)，該通式中的n為1-20， 000 ;具有通式H0-(C3H60)m-H 的未改性的和化學改性的聚(丙二醇)，該通式中的m為1-20， 000 ;甘油二縮水甘油醚；甘 油_丙氧基化物三甘油醚和聚(甲基)丙烯酸。
23. 如權利要求1-9中任一項所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵 在於，所述共聚物是氨基改性的苯乙烯_馬來酸酐共聚物，其含有約7-50重量％馬來酸酐。
24. 如權利要求1-9中任一項所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵 在於，所述共聚物是氨基改性的異戊二烯-馬來酸酐接枝共聚物，其含有約7-50%馬來酸 酐。
25. 如權利要求1-9中任一項所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵 在於，所述共聚物是氨基改性的甲基乙烯基醚_馬來酸酐交替共聚物，其含有約50%馬來 酸酐。
26. 如權利要求1-9中任一項所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵 在於，所述共聚物是氨基改性的丙烯酸硬脂酯_甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚物。
27. 如權利要求1-9中任一項所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵 在於，所述共聚物是氨基改性的苯乙烯_甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚物。
28. 如權利要求1-9中任一項所述的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器，其特徵 在於，所述共聚物是用胺改性的共聚物，其中，該共聚物是苯乙烯_馬來酸酐共聚物，異戊 二烯-馬來酸酐接枝共聚物，甲基乙烯基醚-馬來酸酐交替共聚物，丙烯酸硬脂酯-甲基丙 烯酸縮水甘油酯共聚物，或苯乙烯_甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚物，所述胺是伯胺、仲胺或 叔胺。
全文摘要
本發明涉及反應表面的樣品裂解和塗層。更具體而言，本發明涉及包含共聚物的裂解緩衝劑，所述共聚物包含可從第一組分獲得的部分、可從第二組分獲得的部分和可從含氨基的組分獲得的部分，其中，(i)所述第一組分包含疏水性單體或其衍生物，(ii)所述第二組分包含提供至少一個可與含氨基的組分直接或間接連接的官能團的單體或其衍生物，(iii)含氨基的組分與第二組分直接或間接地共價連接，本發明還涉及包含所述共聚物的裂解緩衝劑、方法、複合體、試劑盒或容器。本發明可用於從生物樣品中提取或擴增核酸、進行生物測試等廣泛用途。
文檔編號C12N15/11GK101748117SQ20091026158
公開日2010年6月23日 申請日期2006年2月6日 優先權日2005年2月10日
發明者B·斯賓格, C·埃爾巴赫, R·法比斯, R·西麥爾裡齊, S·溫納 申請人:恰根有限公司