抗原特異性細胞毒性t細胞的擴大培養方法

2023-07-08 09:36:01 2

專利名稱：：抗原特異性細胞毒性t細胞的擴大培養方法
技術領域：
：本發明涉及誘導、維持及擴大培養(expanding)醫療領域中有用的具有抗原特異性細胞殺傷活性的細胞毒性T細胞的方法。
背景技術：
：活的生命體主要通過免疫應答排除異物，而免疫系統由各式各樣的細胞及其產生的可溶性因子構成。其中起關鍵作用的為白細胞，尤其是淋巴細胞。淋巴細胞主要分為B淋巴細胞(以後稱作B細胞)和T淋巴細胞(以後稱作T細胞)兩種，二者均能特異性識別抗原，與之作用，從而保護生命體。T細胞分為具有CD(ClusterDesignation)4標誌，主要與輔助抗體的產生和誘導各種免疫應答有關的輔助性T細胞(TH)，以及具有CD8標誌，主要顯示細胞殺傷活性的細胞毒性T細胞(Tc，細胞毒性T淋巴細胞，亦叫做殺傷性T細胞，以後記作CTL)兩個亞類。CTL對識別、破壞、消除腫瘤細胞和病毒感染的細胞等起著最重要的作用，它不像B細胞那樣對抗原產生特異性反應，產生抗體，而是直接識別並作用於與靶細胞膜表面上的主要組織相容性複合物(majorhistocompatibilitycomplex,MHC;在人類中也稱作人白糹田胞抗原(HLA))I類分子結合的靶細胞來源的抗原(抗原肽)。該情況下，CTL膜表面的T細胞受體(以後稱作TCR)特異性識別前面所述的抗原肽，MHCI類分子^,、判斷」坑原肽是自身來源的還是非自身來源的。近年來，人們開始重新看待如藥物療法和》文射療法這樣對患者造成沉重的身體負擔的治療方法，提高了對減輕患者身體負擔的免疫治療方法的關注。尤其是使來源於免疫功能正常的人的CTL或T細胞體外(invitro)誘導產生對抗原產生特異性反應的CTL後，將其移4入患者的免疫過繼療法(adoptiveimrmmotherapy)的有效性備受矚目。例如，應用動物模型顯示免疫過繼療法對病毒感染及腫瘤是有效的治療方法[Greenberg,P.D.著，免疫學進展(AdvancesinImmunology),1992年出版]。再者，基於給免疫缺陷患者施用CTL能導致快速且持續地消除巨細胞病毒而不顯現毒性的特異性CTL應答的重構，將CTL應用於先天性、後天性及醫原性T細胞免疫功能不全患者也受到關注[ReusserP.等，Blood,第78巻，第5期，第1373-1380頁(1991)]。這種治療方法，要在維持或增強CTL的抗原特異性細胞殺傷活性的狀態下進行，所以維持或增加其細胞數目非常重要。對於維持或增加CTL的細胞數而言，根據動物模型的研究可推算在人類的免疫過繼療法中所需的有效細胞數，109-10"個抗原特異性T糹田胞是必須的(Greenberg,P.D.著,AdvancesinImmunology,1992年出版)。也就是說，免疫過繼療法中最大的問題是短時間內在體外獲得這些數目的細胞。對於維持或增強CTL的抗原特異性細胞殺傷活性而言，誘導CTL的抗原特異性應答時，一般的方法是用目的抗原反覆刺激。但是，該方法有時暫時地增加細胞數目，而最終細胞數減少，得不到必要的細胞數目。目前，相應的對策只有在反覆進行抗原刺激的初期階段凍存細胞，或克隆到抗原特異性CTL克隆，凍存一部分後，當長期培養過程中出現細胞數或抗原特異性殺傷活性降低時，融解凍存的細胞，再度進行抗原刺激。應用小鼠T細胞進行長期培養來建立T細胞的方法已有報導[PaulW.E.等，自然(Nature),第294巻，第5843期，第697-699頁(1981)]，該方法是分離T細胞建林的方法，它不能使T細胞增殖到109-101Q個細胞。美國專利第5057423號中公開了大量使用高濃度的白細胞介素2(IL-2)誘導淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)，3-4天使細胞增加IOO倍的方法。考慮到通常1個細胞分裂生成2個細胞大約需24小時，細胞數發生了飛躍式變化。另外，嘗試了應用同樣高濃度的IL-2謙導腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的過繼性免疫療法[RosenbergS.A.等，N.Engl.J.Med.,第313巻，第23期，第1485-1492(1985);RosenbergS.A.等，N.Engl.J.Med.，第319巻，第25期，第1676-1680，第8期，第2093-2101頁(1993)]。但是，前者是抗原非特異性T細胞的獲得方法，後者由於應用了活化的多克隆的淋巴細胞群，所以即便有特異性也是有限的。況且，上迷方法中均為了促進細胞增殖而應用了高濃度的IL-2。有報導說用高濃度的IL-2處理過的T細胞在IL-2不存在的情況下接受特異性抗原刺激時，有時會引起細胞凋亡(細胞死亡)[LenardoM.J.等，Nature,第353巻，第6347期，第858-861頁(1991);BoehmeS.A.等，Eur.j.Immunol.,第23巻，第7期，第1552-1560頁(1993)]。所以，上述方法中所得LAK細胞或TIL的有效性是有問題的。用T細胞生長因子和IL-2以低密度(5x103-1x14個/ml)培養T細胞，經過7天，細胞可快速增殖，最終增殖到細胞數達3-5x105個/1111的飽和密度。但是，有報導說，細胞一旦達到飽和密度，通常會死亡[GillisS.等，Immunol.Rev.,第54巻，第81-109頁(l兆l)]。因此，LAK細胞、TIL及低密度的T細胞培養方法，無論是實用性還是有用性均存在問題。關於抗原特異性CTL的報導有，體外培養同種異體的巨細胞病毒(CMV)特異性的CTL5-12周，使CTL增殖後，靜脈內施用給免疫功能不全的患者的過繼性免疫療法[RiddellS,A.等，Science,第257巻，第5067期，第238-240頁(1992)];用自身CMV感染成纖維細胞和IL-2[Riddel1S.A.等，J.Immunol"第146巻,第8期'第2795-2804頁(1991)]及用抗CD3單克隆抗體(抗CD3mAb)和IL-2[Riddel1S.A.等,J.Immunol.Methods,第128巻，第2期，第189-201頁(1990)]分離及大量培養CMV特異的CTL克隆的方法。但是，這些方法存在大的問題。即，獲得1x109個/1111的抗原特異性CTL大約需要3個月，其間患者的症狀仍在發展，很難按照患者狀況進4於處理。作為解決這些問題的方法，WO96/06929公開了REM法(Rapidexpansionmethod)。REM法是短期內增殖(expand)包含抗原特異性C丁L和Th的T細胞初期群的方法。該方法的特徵在於使各T細胞克隆增殖，提供大量的T細胞，但存在如下的問題。在REM方法中，應用抗CD3抗體、IL-2及經放射線照射而不增殖的PBMC(外周血單核細胞)和非洲淋巴細胞瘤病毒(Epstein-Barrvirus,以後略作EBV)感染的細胞使抗原特異性CTL數目增殖，然而存在如下問題不能排除T細胞內混入EBV轉染的B細胞(EBV-B細胞)(安全性問題)；有必要使用大量的PBMC(必要時至少約為抗原特異性CTL數的40倍)作為飼養細胞(feedercell);所增殖的CTL的抗原特異性細胞殺傷活性不能充分滿足要求；應用T細胞克隆以外的T細胞群進行增殖時，T細胞具有的抗原特異性殺傷活性與細胞的增殖一起降低等。也就是說，目前存在的抗原特異性CTL的製備方法，其現狀是，短期內製備足量有效的用於治療的具有抗原特異性細胞殺傷活性的CTL這樣的過繼性免疫療法中，必要的不可欠缺的問題尚未解決。發明公開本發明的目的是提供誘導、維持及擴大培養適用於過繼性免疫療法的保持高水平抗原特異性細胞殺傷活性的CTL的方法，即本發明涉及(1)—種誘導具有抗原特異性細胞殺傷活性的細胞毒性T細胞的方法，其特徵在於，該方法包括在選自下面(A)-(E)的至少一種物質存在下，將具有細胞毒性T細胞分化能力的前體細胞與抗原呈遞細胞一起培養的步驟(A)具有CD44結合活性的物質；(B)能調控由CD44配體與CD44結合而激發的信號的物質；(C)能抑制生長因子與生長因子受體結合的物質；(D)能調控由生長因子與生長因子受體結合而激發的信號的物質；(E)纖粘連蛋白、其片斷或它們的混合物；(2)上面(1)的方法，其中具有CD"結合活性的物質為CD"配體和/或抗CD44抗體；(3)上面(2)的方法，其中CD"配體為透明質酸；(4)上面(1)的方法，其中能抑制生長因子與生長因子受體結合的物質為具有生長因子結合活性的物質；(5)上面(4)的方法，其中具有生長因子結合活性的物質為抗生長因子抗體；7(6)上面(l)、(4)和(5)任一項的方法，其中生長因子為選自肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1和胰鳥素樣生長因子-2的至少一種生長因子；(7)上面(1)的方法，其中纖粘連蛋白的片斷為具有至少一種選自下列結構域的片斷(a)VLA-4結合結構域，(b)VLA-5結合結構域，及(c)肝素結合結構域；(8)—種維持具有抗原特異性細胞殺傷活性的細胞毒性T細胞的方法，其特徵在於，該方法包括在選自上面(1)中(A)-(E)的至少一種物質存在下，連續培養細胞毒性T細胞的步驟；(9)上面(8)的方法，其中具有CD44結合活性的物質為CD44配體和/或抗CD44抗體；(10)上面(9)的方法，其中CD44配體為造明質酸；(11)上面(8)的方法，其中能抑制生長因子與生長因子受體結合的物質為具有生長因於結合活性的物質；(12)上面(11)的方法，其中具有生長因子結合活性的物質為抗生長因子抗體；(13)上面(8)、(11)和(12)任一項的方法，其中生長因子為選自肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1和胰島素樣生長因子-2的至少一種生長因子；(14)上面(8)的方法，其中纖粘連蛋白的片斷為具有至少一種選自下列結構域的片斷(a)VLA-4結合結構域，(b)VLA-5結合結構域，及(c)肝素結合結構域；(15)—種擴大培養具有抗原特異性細胞殺傷活性的細胞毒性T細胞的方法，其特徵在於，該方法包括在選自上面U)中(A)-(E)的至少一種物質存在下培養細胞毒性T細胞的步驟；(16)上面(l5)的方法，其步驟中還包括在抗CD3抗體的存在下培養細胞毒性T細胞；(17)上面(l5)或U6)的方法，其步驟中細胞毒性T細胞與飼養細胞一起培養；(18)上面(17)的方法，其中伺養細胞為非病毒感染細胞；(19)上面(15)-(18)任一項的方法，其中具有CD44結合活性的物質為CD44配體和/或抗CD44抗體；(20)上面(19)的方法，其中CD44配體為透明質酸；(21)上面(15)-(18)任一項的方法，其中能抑制生長因子與生長因子受體結合的物質為具有生長因子結合活性的物質；(22)上面(21)的方法，其中具有生長因子結合活性的物質為抗生長固子抗體；(23)上面(15)、(18)、(21)和(22)任一項的方法，其中生長因子為選自肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1和胰島素樣生長因子-2的至少一種生長因子；(24)上面(15)的方法，其中纖粘連蛋白的片斷為具有至少一種選自下列結構域的片斷(a)VLA-4結合結構域，(b)VLA-5結合結構域，及(c)肝素結合結構域；(25)—種細胞毒性T細胞的回收方法，它包括從用上述(l)-(24)任一項中的方法所得的含細胞毒性T細胞的培養物中，選擇富含具有抗原特異性細胞殺傷活性的細胞毒性T細胞的細胞團的步驟；(26)用上述U)-(")任一項中的方法製備的具有抗原特異性細胞殺傷活性的細胞毒性T細胞，及(27)—種治療劑，其特徵在於，它含有上迷(26)的細胞毒性T細胞作為有效成分。附圖簡述圖1表示透明質酸對可溶性CD44與可溶性CD44識別抗體結合的抑制活性。圖2表示FL標記的透明質酸與CTL細胞表面上CD44的結合活性。圖3表示可溶性CD44識別抗體與培養基中的可溶性CD44的結合活性。圖4表示HA非阻斷(Non-Blocking)抗CD"抗體與培養基中的可溶性CD44的結合活性。圖5表示HA非阻斷抗CD"抗體與CTL細胞表面上CD"的結合活性。圖6表示培養基中添加了HA非阻斷抗CD44抗體的CTL擴大培養後，CTL細胞表面上該抗體的結合。本發明的最佳實施方式本發明發現至少一種選自下面(A)-(E)的物質(本發明中把該物質作為有效成分使用)能意外地發揮維持或增強CTL的抗原特異性細胞殺傷活性的能力，由此完成了本發明(A)具有CD44結合活性的物質；(B)能調控由CD44配體與CD44結合而激發的信號的物質；(C)能抑制生長固子與生長因子受體結合的物質；(D)能調控由生長因子與生長因子受體結合而激發的信號的物質；(E)纖粘連蛋白、其片斷或它們的混合物。因此，本發明提供誘導、維持及擴大培養適用於過繼性免疫療法的保持高水平抗原特異性細胞殺傷活性的CTL的方法。以下，具體說明本發明。(1)本發明的細胞毒性T細胞的誘導方法已知，通常由抗原呈遞細胞誘導的CTL在維持、增殖期間，其抗原特異性細胞殺傷活性降低。本發明提供即便長時間維持誘導後的細胞或使之增殖，不出現以往觀察到的抗原特異性細胞殺傷活性顯著降低的抗原特異性CTL的誘導方法。本發明的CTL的誘導方法把在上述有效成分的存在下誘導CTL作為其一個顯著特徵。在上述有效成分的存在下，為了使所得CTL對所希望的抗原產生識別能力，將優選的抗原呈遞細胞與具有CTL分化潛能的前體細胞一起培養，由此實施CTL的誘導。對前體細胞無特殊限制，只要是成為CTL的前階段且其命運是分化成CTL的細胞即可，例如外周血單核細胞(PBMC)、大4-:f細胞、記憶細胞等。抗原呈遞細胞無特殊限制，只要是能呈遞T細胞所識別的所有抗原即可。例如，呈遞所希望的抗原的單核細胞、B細胞、T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、成纖維細胞等，可用於本發明。抗原呈遞細胞是通過給具有抗原呈遞能力的細胞加載抗原肽，佳—抗原肽呈遞到細胞表面進行製備的[例如，參照BednarekM.A.等，J.10Immunol.,第147巻'第12期'第4047-4053頁(1991)]。另夕卜，當具有抗原呈遞能力的細胞具有加工(process)抗原的能力時，通過給該細胞加載抗原，抗原被攝取到細胞內，接受加工、處理，細胞將片斷化的抗原肽呈遞到細胞表面。給具有抗原呈遞能力的細胞加載抗的HLA限制性相匹配'。''、"—'、本發明中所使用的抗原無特殊限制，例如包括細菌、病毒等外源性抗原及腫瘤相關抗原(癌抗原)等內源性抗原等。本發明中優選抗原呈遞細胞為非增殖性細胞。為了使細胞成為非增殖性，可進行入X線等放射線照射或絲裂黴素(mitomycin)等藥物處理。本發明的CTL誘導方法中所使用的培養基無特殊限制，可使用眾所周知的混合了CTL、其前體細胞及抗原呈遞細胞的維持、生長發育所必需的成分的培養基，例如市場上銷售的培養基。除其自身的成分以外，這些培養基中可包含適當的蛋白質、細胞因子類、其它成分。合適地，含有白細胞介素2(IL-2)的培養基可用於本發明。另外，這些蛋白質、細胞因子類、其它成分可固定化到本發明的方法中所使用的培養器材和微粒等基體中。可通過後述的眾所周知的固定化方法，將這些成分按獲得所希望效果的量固定化到培養器材等中。CD44是廣泛存在於造血細胞、成纖維細胞、巨噬細胞等的細胞表面受體，已有報導透明質酸、硫酸肝素、硫酸軟骨素、骨橋蛋白(osteopontin)、I型膠原、4型膠原、纖粘連蛋白、serglyein等為其配體。已知，其功能是通過藉助細胞-細胞間、細胞-細胞外基質間的粘附向細胞內傳遞信號，活化其它粘附分子，產生細胞因子等。CTL中也存在CD44,CD44—旦與透明質酸和抗CD44抗體結合，CD44的胞內區存在的酪氨酸激酶結構域活化，使細胞內基質蛋白質的酪氨酸磷酸化，從而進行細胞內的信號傳遞。也就是i兌，CD44通過與其配體和抗CD44抗體結合而啟動信號，從而涉及各種功能。本發明中具有CD44結合活性的物質，無特殊限制，只要是顯示能維持或增強CTL的特異性細胞殺傷活性即可，例如CD44配體和/或抗CD44抗體。作為CD44配體無特殊限制，只要是顯示能維持或增強CTL的特異性細胞殺傷活性即可，例如包括透明質酸、硫酸肝素、硫酸軟骨素、骨橋蛋白、I型膠原、4型膠原、纖粘連蛋白、serglydn等，透明質酸特別優選。作為抗CDM抗體無特殊限制，只要是顯示能維持或增強CTL的特異性細胞殺傷活性即可，例如可使用市售的抗CD44抗體。對衍生物，如螢光標記的衍生物等無特珠限制，只要是顯示能維持或增強CTL的特異性細胞殺傷活性即可。本發明中，不管CD44與具有CD44結合活性的物質間有無結合，通過調控CD44配體與CD44結合而啟動的信號，可獲得期待的效果。也就是說，取代具有CD44結合活性的物質，以能調控CD44配體與CD44結合而啟動的信號的物質作有效成分，也可實施本發明。這裡作為CD44配體與CD44結合而啟動的信號也包含接受該信號後生物體所表達的信號。也就是說，該信號包括CD44的胞內區存在的酪氨酸激酶結構域活化，活化的酪氨酸激酶使細胞內基質蛋白質的酪氨酸磷酸化等。作為調控這些信號的物質包括如各種磷酸化酶等。本說明書中的調控是指能信號傳導通路中活化的信號向下遊傳遞，或抑制活化的信號向下遊傳遞。生長因子是各種促進細胞分裂和表達的多肽的總稱，通過細胞膜上特異性受體作用於靶細胞，受體中多數能將胞內區存在的酪氨酸激酶結構域活化，將信號傳遞給靶細胞。本發明中，作為生長因子無特殊限制，只要是通過抑制生長因子與生長因子受體的結合，或通過調控生長因子與生長因子受體結合而啟動的信號顯示能維持或增強CTL的特異性細胞殺傷活性即可。例如包括肝細胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和胰島素樣生長因子-2(IGF-2)、神經生長因子(NGF)、神經營養性因子、上皮生長因子、奶來源的生長因於、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、腦來源的成纖維細胞生長因子、酸性纖維細胞生長因子、角化細胞生長因子、血小板來源的生長因子(PDGF)、血小板鹼性蛋白質、血小板第4因子、結合組織活化肽、集落刺激因子、紅細胞生成素、血小板生成素、T細胞生長因子、B細胞生長因子、軟骨來源的因子、軟骨來源的生長因子、骨來源的因子、骨來源的生長因子、內皮細胞生長因子、內皮細胞來源的生長因子、眼來源的生長因子、精嚢來源的生長因子、塞兒託利(支持)細胞來源的生長因子、乳腺刺激因子、骨髓來源的生長因子、巨噬細胞來源的生長因子、循環間葉的生長因子、轉化生長因子-Ot、轉化生長因子-P、肝素結合性EGF樣生長因子、amphyllegrin、平滑肌細胞來源的的生長因子(SDGF)、batacellulin、表皮調節素(epiregulin)、neuregulin-1，-2,-3、血管內皮生長因子、神經營養素(neurotr(3phin,NT)-3,4,5,6,7,膠質細胞林來源的神經營養性因子、幹細胞因子、中期因子(midkine)、pleiotrophin、ephrin、血管生成素、活化素(activin)、月中瘤壞死因子等。根據本發明，優選的生長因子為肝細胞生長因子、胰烏素樣生長因子-1和胰島素樣生長因子-2。HGF是具有肝細胞增殖作用、蛋白質合成促進作用、膽汁淤滯改善作用、及預防藥物引起的腎功能損害作用等的生長因子。已知HGF的受體是c-Met,HGF的多種生理作用均通過c-Met進行。c-Met的胞內區具有酪氨酸激酶結構域。胰島素樣生長因子(IGF)是用胰島素樣生長因子抗體不能中和的胰島素樣活性物質。已知IGF存在IGF-1和IGF-2兩種。IGF結合的受體有胰島素受體、IGF-1受體、IGF-2受體，尤其是胰島素受體、IGF-]受體的胞內區具有酪氨酸激酶結構域。本發明中能夠抑制生長因子和生長因子受體結合的物質無特殊限制，只要能維持或增強CTL的特異性細胞殺傷活性即可，包括具有長因子受體結合的物質，'i者具有生長因;受體結合活性而抑制i長因子與生長因子受體結合的物質。前者包括，如抗生長因子抗體，優選的抗體有抗HGF抗體、抗1GF-l抗體、抗IGF-2抗體。後者包括，如抗生長因子受體抗體，優選的有抗c-Met抗體、抗胰島素受體抗體、抗IGF-l受體抗體、抗IGF-2受體抗體。另外，本發明與生長因子與生長因子受體有無結合無關'而是通過調控因生長因子與生長因子受體結合而啟動的信號獲得所期望的結果。即，本發明取代抑制生長因子與生長因子受體結合的物質，以調控生長因子與生長因子受體結合而啟動的信號的物質為有效成分進行實施。這裡因生長因子與生長因子受體結合而啟動的信號也包括接受13該信號後生物體發出的信號。該信號包括，如生長因子的胞內區存在的酪氨酸激酶結構域活化，從而使細胞內基質蛋白質的酪氨酸磷酸化等，調控這些信號的物質包括，如激酶抑制物等。常用的基因組重組技術等人為合成。纖粘連蛋白及其片斷可以[RuoslahtiE.等J.Biol.Chem.,第256巻,第14期，第7277-7281頁(1981)]的公開為基礎，從天然起源的物質以基本上純的狀態進行製備。本說明書中的基本上純的纖粘連蛋白或纖粘連蛋白片斷，它們與天然的纖粘連蛋白一起存在基本上不含有供給源來源的其它蛋白質等。本發明中上述纖粘連蛋白及其片斷可各自單獨或多種混合使用。可用於本發明的與纖粘連蛋白片斷及該片斷的製備相關的有用信息可從[KimizukaF.,等，J.Biochem.,第110巻，第2期，第284-291頁(1991)]，[KornblihttA.R.等，EMBOJ.第4巻，第7期，第1755—1759頁(1985)]，[SekiguchiK.等，Biochemistry,第25巻，第17期，第4936-4941頁(1986)]等獲得。纖粘連蛋白物是一種大的糖蛋白，分子量為220至250kD,能與許多生物大分子、細胞和微生物結合，所述生物大分子例如膠原、肝素、纖維蛋白、整合素家族VLA-4和VLA-5。另外，纖粘連蛋白分子的結構域分為幾個結構域結構(代謝>Vol.23,No.11(1986))。結構域1的分子量約30000，與肝素、纖維蛋白、金黃色葡萄球菌等結合。結構域2分子量約40000,與膠原結合。結構域3分子量約20000,與纖維蛋白弱結合。結構域4分子量約75000,為細胞結合結構域。結構域5(肝素結合結構域)分子量約35000,與肝素強結合。結構域6分於量約30000，與纖維蛋白結合。結構域7羧基末端的分子量約3000。結構域4中包含VLA-5結合結構域，結構域5和6之間含有VLA-4結合結構域。已知纖粘連蛋白有ED-A、ED-B、IIICS3種模型，進行選擇性剪接。nics有具有細胞粘附活性的cs-i和CS—5(FIBRONECTIN,DeaneF.Mosher,ACADEMICPRESS,(1989))。本發明中對纖粘連蛋白片斷無特殊限制，但優選具有選自其結構亦可是應用域1-7、VLA-4結合結構域、VLA-5結合結構域、ED-A、ED-b、mcs、cs-1和cs-5區域的片斷。另外，對本發明中使用的纖粘連蛋白片斷的分子量無特殊限制，但優選使用1-200kD，較優選5-190kD,更銀選10-180kD的片斷。本發明中特別優選的纖粘連蛋白片斷，優選使用具有選自(a)作為纖粘連蛋白來源的細胞結合結構域的整合素oc5p1(VLA-5)結合結構域；(b)整合素oc4pi(VLA-4)結合結構域，及(c)肝素結合結構域的至少一種結構域的片斷。包含VLA-5結合結構域的片斷具有SEQIDNO:1中所示的胺基酸序列；包含VLA-4結合結構域的片斷具有SEQIDNO:2中所示的胺基酸序列；包含肝素結合結構域的片斷具有SEQIDNO:3中所示的胺基酸序列。作為本發明中優選使用的纖粘連蛋白，在具有上述結合活性的範圍內纖粘連蛋白來源的胺基酸序列中可有1個或更多的胺基酸發生置換、缺失、插入、添加。例如，2個不同的結構域間插入1個或更多的胺基酸作為連接的片斷也可用於本發明。本說明書中基本上純的纖粘連蛋白片斷，可用如美國專利第5198423號中記載的基因重組體進行製備。特別是，實施例中H-2"(SEQIDNO:3)、H-296(SEQIDNO:4)、CH-271(SEQIDNO:5)及CH-296(SEQIDNO:6)重組片斷及其荻得方法詳細記載於該專利中。另外，實施例中所使用的C-24片斷(SEQIDNO:1)是根據美國第5102988號專利中記載的方法獲得的。C-CSl片斷(SEQIDNO:7)是根據日本第M04H8號專利中記載的方法荻得的。上述CH-271、CH-296、C-274、C-CS1的各片斷是具有VLA-5結合活性的細胞結合結構域的多肽。另外，C-CSl、H-296、CH-296是具有VLA-4結合活性的細胞結合結構域的多肽。H-2"、H-296,CH-271及CH-296是具有肝素結合結構域的多肽。'上述各結構域修飾了的片斷也可用於本發明。纖粘連蛋白的肝素結合部位是由3個III型類似序列(III-12、111-13、III-M)構成的。含有缺失上述in型類似序列中i個或2個的肝素結合部位的片斷也可用於本發明。如，片段可以是纖粘連蛋白的細胞結合部位(VLA-5結合結構域，Prol239-Ser1515)與1個III型類似序列結合的片斷CHV-89(SEQIDNO:8)、CHV-90(SEQIDNO:9)、CHV-92(SEQIDNO:10);或與2個III型類似序列結合的片斷CHV-179(SEQIDNO:11)、CHV-181(SEQIDNO:12)。CHV-89、CHV-90、CHV—92分別含有III—13、111-14、111—12。CHV—179含有III-13和III-14,CHV-181含有III-12和III-13。CHV-89、CHV-90、CHV-179是根據日本第2729712號專利中記載的方法獲得的。CHV-181是根據W097/18318中記載的方法獲得的。CHV-92是以上述文獻中的質粒為基礎定向構建質粒，應用該質粒通過基因工程學方法獲得的。另外，下述實施例中使用的H-275-Cys(SEQIDNO:13)是具有纖粘連蛋白的肝素結合結構域，且C末端具有半胱氨酸殘基的片斷。該片斷也可用於本發明。這些片斷或從這些片斷定向誘導的片斷可用亍305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6獨立行政法人產業技術綜合研究所特許微生物保藏中心(舊通商產業省工業技術院微生物工業技術研究所)以下述保藏號保藏的微生物製備的，或根據公知的方法(例如，定點誘變等)改變各微生物攜帶的質粒而製備的。FERMBP-2799(攜帶編碼H-271的質粒的大腸桿菌，^c/zehc/^co//HB101/pCH101),國際j呆藏日1989年5月12日FERMBP-2800(攜帶編碼CH-296的質粒的大腸桿菌，^c/^Wc/n,aco//HB101/pCH102),國際保藏日1989年5月12日FERMBP-5723(攜帶編碼C-CS1的質粒的大腸桿菌，Zsc/zm'c/n'aco//HB101/pCS25),原保藏.日1990年3月5日，移交國際保藏的請求日1996年10月23日FERMP-10721(攜帶編碼H-296的質粒的大腸桿菌)，日本國內保藏曰1989年5月12曰FERMP-12182(攜帶編碼CHV-89的質粒的大腸桿菌)，日本國內保藏日1991年4月8日FERMP-12183(攜帶編碼CHV-179的質粒的大腸桿菌)，日本國內保藏日1991年4月8曰規的方法進行測定。例如，這些方法中包含WilliamsD.A.的方法[WilliamsD.A.等，Nature,第352巻，第6334期，第438-441頁(1991)]。該方法是針對固定化到培養皿上的片斷進行細胞結合的測定方法。上述方法中，可替換細胞，使用肝素，如用標記的肝素，用同樣的方法評價片斷的肝素結合結構域。如前所述，纖粘連蛋白是一巨大的分子，有其便利點，本發明中優選使用纖粘連蛋白片斷。另外，本發明中所使用的纖粘連蛋白或其片斷，使用動物來源的血漿和臟器來源的產物時，有必要注意動物來源的病毒(HCV、HIV等)的汙染、純度、均一性等，所以特別優選用上述基因工程學方法獲得的纖粘連蛋白或其片斷。本發明中所使用的有效成分可單獨使用或2種或2種以上混合使用。本發明中具有CTL分化潛能的前體細胞與抗原呈遞細胞一起培養(共培養)誘導CTL時，可按照常規的眾所周知的條件[例如，參照BednarekM.A.，J.Immunol.,第147巻，第12期，第4047-4054頁(1991)]。對共培養條件無特殊限制，可使用常規細胞培養時所使用的條件，例如，在37°C、5%(302等條件下進行培養。該共培養通常進行約2-15天，其間用新製備的抗原呈遞細胞替換舊的'進行再刺激。另外，在適當的時間間隔內換成新鮮的培養基。進行共培養的培養基中本發明的有效成分的有效量無特殊限制，只要能獲得所期望的效果即可，例如優選0.001-1000"g/ml，更優選0.(M-100pg/ml。本說明書中，培養基中含有有效成分等成分包含這樣的實施方案將該成分固定化到細胞培養時加入培養基所使用的培養器材和加入到培養基中使用的微粒等基體上，使基體與培養基接觸(與培養基接觸後，不管是否固定化到基體上)，該成分包含到培養基中。也就是說，希望有效成分溶解到培養基中或固定化到培養器材和微粒等基體上存在。作為上迷有效成分，至少一種選自透明質酸、抗CD44抗體、抗HGF抗體、抗IGF-1抗體、抗IGF-2抗體及纖粘連蛋白片斷的成分較優選。如此誘導的CTL具有特異性識別目的抗原的能力，例如通過細胞殺傷活性特異性破壞具有該抗原的細胞。用細胞眾所周知的方法評價CTL的細胞殺傷活性。例如，對抗原呈遞細胞呈遞的肽和用放射性物質、螢光物質等標記的靶細胞的殺傷性，可通過;f聶取放射性物質的能力來測定CTL增殖的抗原特異性增加，或通過測定從CTL和把細胞抗原特異性釋放的GM-CSF、IFN-Y等細胞因子的量來進行評價(參照後面的實施例1-1-(3)。此外，也可通過炎光素等標記的抗原肽和複合物的使用進行直接確認。例如，將CTL與與CTL特異性抗體偶聯的第一螢光標記物接觸，然後與與第二螢光標記物偶聯的抗原肽-MHC複合物接觸，然後用FACS(fluorescence-activatedcellsorting)分析雙重標記細胞的存在，通過該方法進行評價。用本發明的方法誘導的CTL具有這樣的優點，即，即便長時間維持誘導後的細胞或使之快速增加，也不會象以往觀察到的那樣其抗原特異性的細胞殺傷活性降低。因此，通過將誘導的CTL克隆化，可作為具有穩定細胞殺傷活性的淋巴細胞維持。例如，用抗原、各種細胞因子、抗CD3抗體刺激所誘導的CTL，可使之增殖，進行擴大培養。對該CTL的維持、擴大培養無特殊限制，可用眾知的方法，例如後面所述本發明的細胞毒性T細胞的維持方法、擴大培養方法的使用較優選。(2)本發明的細胞毒性T細胞的維持方法
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：本發明的細胞毒性T細胞的維持方法是始終保持CTL的抗原特異性殺傷活性的維持方法。該方法的一顯著特徵是在含有本發明的有效成分的培養基中連續培養CTL，能連續維持該細胞的抗原特異性細胞殺傷活性。對適於該方法的CTL無限定，用本發明的方法可維持用眾知的方法所得的CTL,使之始終維持其抗原特異性細胞殺傷活性。另外，也適用於用上面U)中本發明的細胞毒性T細胞的誘導方法所得的CTL的維持。本發明中CTL連續培養的常規條件可按眾所周知的條件[例如，18參照CarterJ.等，Immunology,第57巻，第1期，第123-129頁(1QS6)]。對本發明的細胞毒性T細胞的維持方法中所使用的培養基無特殊限制，例如可使用上迷CTL誘導方法中所使用的培養基。本發明的方法通過含有前述有效成分的培養基進行實施。進行培養的培養基中，本發明的有效成分的含有量無特殊限制，只要能獲得預期結構即可。但，優選0.001-1000pg/ral,更優選0.01-100yg/ml。希望有效成分溶解到培養基中或固定化到培養器材和微粒等基體上存在。作為上迷有效成分，至少一種選自透明質酸、抗CD44抗體、抗HGF抗體、抗IGF-1抗體、抗IGF-2抗體及纖粘連蛋白片斷的成分較優選。再者，培養基中可添加細胞因子和其它眾知的成分。本發明優選應用含IL-2的培養基。與前面同樣，這些細胞因子和其它眾知的成分固定化到培養器材和微粒等基體上使用。對培養條件無特殊限制，可使用常規細胞培養時所使用的條件，例如，在37'C、5%C02等條件下進行培養。可在適當的時間間隔內換成新鮮的培養基。如上所迷，通過在含有本發明的有效成分的培養基中連續培養CTL，能抑制其特異性細胞殺傷活性的降低，維持CTL。本發明的效果可通過實施例1-1-(3)中的方法測定、確認用本發明的方法維持的CTL的細胞殺傷活性。另外，用眾所周知的擴大培養方法可使用該方法維持的CTL增殖，增殖的CTL也保持特異性細胞殺傷活性。作為CTL的擴大培養方法優選應用後述的本發明的CTL的擴大培養方法。(3)本發明的細胞毒性T細胞的擴大培養方法在適當的條件下培養細胞毒性T細胞可增加細胞數目(擴大培養)。以往，已開發出幾種CTL的擴大培養方法，但作為短期內可使CTL高效增殖的方法，已知有Riddell等開發出的前面所迷的REM法。該方法是使用經X線照射的非增殖性PBMC(作為飼養細胞使用)和用EBV轉化的B細胞(EBV-B細胞)，在IL-2、抗CD3抗體的存在下培養CTL的方法。但該方法不能否定EBV-B細胞混入T細胞的危險性，這一點是問題所在。本發明的細胞毒性T細胞的擴大培養方法是可始終保持抗原特異性細胞殺傷活性而使細胞數增加的方法。該方法的特徵是在本發明的有效成分的存在下進行培養。本發明的方法中對適用的CTL沒有限定，從生物體所得的具有細胞損傷活性的CTL、用眾所周知的方法誘導的CTL、用上述(1)中本發明的CTL的誘導方法誘導的CTL、用上述(2)中本發明的CTL的維持方法所維持的CTL均適用於本發明的CTL的擴大培養。本發明中CTL的擴大培養的常規條件可依照眾所周知的條件[例如，參照UbertiJ.P.等，Clin.I譲畫l.I畫unopathol.,第70巻，第3期，第234-240頁(1994)]。本發明的細胞毒性T細胞的擴大培養方法中，希望用加入上述有效成分，還含有抗CD3抗體、優選抗CD3單抗的培養基共培養CTL。更優選的是，CTL與適當的銅養細胞共培養。對上述方法中使用的培養基無特殊限制，可使用混合了CTL培養、發育所必需的成分的眾所周知的培養基，如市售的培養基。當與飼養細胞一起共培養CTL時'希望使用適於CTL、祠養細胞二者的維持、發育的培養基。這些培養基除包含其原來的構成成分以外，可包含適當的蛋白質、細胞因子類、其它眾知的成分，例如含有IL-2的培養基適於在本發明中應用。添加抗CD3抗體、尤其是抗CD3單抗的目的是活化CTL上的T細胞受體。按眾知的條件決定培養基中抗CD3抗體的含有量的話，0.01-400jig/ml合適。這些蛋白質、細胞因子類、其它眾知的成分可溶解到培養基中或固定化到培養器材和微粒等基體上。本發明的CTL的擴大培養方法，以培養基中含有上述有效成分進行實施。作為上述有效成分，至少一種選自透明質酸、抗CD"抗體、抗HGF抗體、抗IGF-l抗體、抗IGF-2抗體及纖粘連蛋白片斷的成分合適。另外，進行培養的培養基中對本發明的有效成分的含有量無特殊限制，只要能荻得預期結果即可，但優選0.001-1000Mg/ml，更優選0.01-100ng/ml。優選有效成分以溶解到培養基中或固定化到培養器材和微粒等基體上的形式存在。本發明的方法中使用的飼養細胞無特殊限制，只要是與抗CD3抗體，尤其是與抗CD3單抗協同刺激CTL,使T細胞受體或共刺激信號受體(costimulatorysignalreceptor)活化即可。本發明中可使用，如PBMV和EBV-B細胞。通常，飼養細胞在用放射線照射等手段奪去其增殖能力後使用。按照眾所周知的方法決定培養基中飼養細胞的含有量，例如1x105-1x107細胞/ml較合適。本發明的特殊優選實施方案中飼養細胞是非病毒感染的細胞，例如是EBV-B細胞以外的細胞，具體而言，可使用自身或非自身來源的PBMC等。這樣的話，可排除擴大培養的CTL中混在EBV-B細胞的可能性，象過繼性免疫療法那樣利用CTL時可提高其醫療的安全性。本發明的CTL的擴大培養方法中，對其培養條件無特殊限制，可使用常規細胞培養所使用的條件，例如，在37°C、5%(302等條件下進行培養。可在適當的時間間隔內換成新鮮的培養基。對本發明的CTL的擴大培養方法無特殊限制，只要是所使用的培養基中含有上述有放成分即可，上述方法之外的以往的CTL擴大培養方法中，培養基中包含本發明的有效成分的實施方案也包含在本發明內。根據本發明的擴大培養方法，例如通過14天的擴大培養，可得到細胞數增加102-103倍的CTL。與以往的CTL擴大培養方法相比，例如與用REM法得到的細胞相比，這樣得到的CTL保持更高的抗原特異性細胞殺傷活性。本發明的效果的判定可通過實施例I-I-(3)中的方法測定、確認用本發明的方法擴大培養的CTL具有的細胞殺傷活性。本發明中使用的有效成分具有維持或增強CTL的抗原特異性細胞殺傷活性的，可作為CTL誘導劑、CTL維持劑或CTL擴大培養劑(以後叫做CTL培養劑)使用。該CTL誘導劑由有效成分物質、或其它任意成分，如CTL的誘導方法中使用的培養基、CTL的維持方法中使用的培養基或CTL的擴大培養方法中使用的培養基中包含的，CTL和銅養細胞等的培養、發育所必需的成分及適當的蛋白質、細胞因子類(優選地IL-2)、所需的其它成分構成。含有這些CTL培養劑的培養劑可作為CTL誘導用、維持用或擴大培養用培養基(CTL培養基)使用。這些CTL培養劑可混合(包括溶解)到培養基中或固定化到培養器材和微珠等基體上。這些培養基可任意包含用於細胞培養的基本成分。可根椐眾知的方法將所需的成分適當混合，製備上述CTL培養劑及CTL用培養基。本發明還提供將有效成分固定化到如培養板、培養亞、培養瓶、培養袋等任意的培養器材(容器)或珠粒、膜等支持載體等基體(具體地說，細胞培養時培養基接觸的基體部分)上的CTL誘導用、維持用或擴大培養用的基體。對有效成分固定化到基體上的固定化量無特殊限制，只要能達到預期效果即可，怛使用基體誘導CTL時，基體中使用的任意培養基中有效成分的含有量要在本發明的CTL誘導方法、維持方法或擴大培養方法的說明中闡述的有效成分的優選培養基含有量範圍內。另外，有效成分中也可任意固定化蛋白質、細胞因子類、其它成分。作為固定化方法無特殊限制，例如可使用蛋白質吸附、生物素與親和素或抗生蛋白鏈菌素結合、化學固定法等眾所周知的固定化方法。所述器材適用於本發明的C丁L誘導方法、維持方法或擴大培養方法。用上迷CTL誘導方法、維持方法或擴大培養方法而得的CTL含有培養物中通常混有輔助性T細胞等CTL以外的細胞。本發明中，可通過離心從該培養物中回收培養物中的細胞，直接作為用本發明的方法荻得的CTL使用。另外，可用眾所周知的方法從該培養物中分離出富含具有抗原特異性細胞殺傷活性的CTL的細胞團(或培養物)，作為用本發明的方法獲得的CTL使用。也就是說，本發明中可通過實施將CTL含有培養物中CTL以外的細胞(例如，輔助性T細胞等)與CTL分離通ii如此分離細胞團，使抗原特異性細胞殺傷活、性濃縮'，這在REM法中是未涉及的。由此，作為本發明的一實施方案'本發明提供細胞毒性細胞的回收方法，它包括從用本發明的CTL誘導方法、維持方法或擴大培養方法中的任一方法製備的CTL含有培養物中選擇富含具有抗原特異性細胞殺傷活性的細胞毒性T細胞的細胞團工程。本發明的CTL回收方法，可以說是一個選擇性荻得具有高度抗原特異性細胞殺傷活性的CTL細胞團的方法，廣義地說，是生產或獲得所述CTL細胞團的方法。對細胞團的選擇方法無特殊限制，例如，用與針對CTL細胞表面上表達的細胞表面抗原的抗體，如抗CD8抗體結合的磁珠或柱子，從用上述CTL誘導方法、維持方法或擴大培養方法製備的CTL含有培養物中，只選擇性回收CTL，得到富含CTL的細胞團。另外，可用流式細胞儀選擇性分離CTL。另外，可通過從用本發明的CTL誘導方法、維持方法或擴大培養方法製備的CTL含有培養物中去除CTL以外的細胞而獲得富含CTL的細胞團。例如，為了除去輔助性T細胞，用與針對輔助性T細胞表面上表達的細胞表面抗原的抗體，如抗CD4抗體結合的；茲珠或柱於，從培養物中選擇性除去輔助性T細胞，而荻得富含CTL的細胞團。如此所得富含CTL的細胞團，與從CTL含有培養物中非選擇性回收的細胞團相比，具有更高效細胞殺傷活性，更適於作為用本發明的方法獲得的CTL使用。另外，本發明中富含CTL的細胞團包含只有CTL的細胞團。應用用本發明的CTL維持方法或擴大培養方法製備的CTL,再通過進行本發明的CTL維持方法或擴大培養方法來進行CTL的維持或擴大培養。例如，應用上述方法，從用本發明的擴大培養方法獲得的CTL中荻得富含CTL的級分，用該級分再度進行本發明的擴大培養方法，獲得細胞殺傷活性高的CTL。另外，用本發明的維持方法可維持用本發明的擴大培養方法得到的CTL的細胞殺傷活性。本發明還提供用本發明的CTL誘導方法、維持方法或擴大培養方法而得的CTL(包括用上迷回收方法從用這些方法所得的CTL含有培養物中回收)。所得CTL均具有抗原特異性的細胞殺傷活性，具有即便進行長時間的連續培養和擴大培養其細胞殺傷活性也不降低的特性。另外，本發明提供以含有該CTL,以之作有效成分的治療劑。該治療劑特別適於過繼性免疫療法使用。在過繼性免疫療法中，將適於患者治療的具有抗原特異性細胞殺傷活性的CTL通過如靜脈施用給患者。該治療劑的製備可按照製藥領域內眾知的方法'例如以用本發明的方法製備的CTL為有效成分，與例如適於非經口途徑施用的眾知的有機或無機載體、賦形劑、穩定劑等混合進行。作為CTL，用本發明的CTL擴大培養方方法不使用EBV感染細胞而製備的CTL特別適用於該目的。治療劑中CTL的含有量，治療劑的施用量，與23該治療劑相關的諸多條件均可按照眾所周知的過繼性免疫療法適當確定。以下列舉實施例對本發明進行更具體的說明，但本發明並不限於此。實施例1應用透明質酸擴大培養具有特異性細胞殺傷活性的CTL的方法實施例1-1(1)PBMC的分離及保存從具有HLA-All的健康供者實施成分採血後，用PBS(-)2倍稀釋所採血液，Ficoll-paque[Pharmacia]上分層後，500g離心20分鐘。離心後，用吸管回收中間層的外周血單核細胞(PBMC),洗滌。將採集的PBMC懸浮於由卯％FBS[BioWhittaker]/10%DMSO[Sigma]構成的保存液中，液氮中保存。誘導CTL時，37。C水浴中迅速融解保存的PBMC，用含10pg/mlDNase[Calbiochem]的RPMI1640培養基(BioWhittaker)洗滌後，用苔盼藍染色法算出細胞數供給各實驗。(2)抗流感病毒記憶性CTL的誘導部分改變Bednarek等的方法[BednarekM.A.等，J.Immunology.,第M7巻，第4047-4053頁(1991)]進行抗流感病毒記憶性CTL的誘導。即，將在實施例1-1-(1)中製備的PBMC懸浮到含有5%人AB型血清、O.lmM非必須胺基酸、lmM丙酮酸鈉、2mML-穀氨醯胺(均為BioWhittaker公司產品)、10mMHEPES(大力，>ff7夕)、1%鏈黴素-青黴素(Gibcol)的RPMI1640培養基(BioWhittaker)(以下略作5HRPMI)中，使之達到1-4x105細胞/ml，然後接種到24孔培養板中，lml/孔，在5%C02溼式培養箱中37°C培養1.5個小時，分離出塑料吸附性的單核細胞。然後，用RPMI1640培養基回收非粘附性細胞，作為應答細胞水上保存。向分離出的單核細胞中加入含5pg/ml的流感病毒蛋白質來源的表位肽(序列表中SEQIDNO:18中記載的基質蛋白來源的HLA-A2.1結合性肽)和l|ag/ml的(32微球蛋白[Scrips]抗原肽的5HRPMI,每孔0.5ml，室溫培養2小時，然後經X線照射(5500R),作為抗原呈遞細胞。從各孔吸去肽，用RPMIIMO培養基洗滌備孔，將冰上保存的應答細胞懸浮到5HRPMI中，使之達到0.5-2x106細胞/ml,然後添加抗原呈遞細胞，]ml/孔。此時，添加終濃度為lO^ig/ml的透明質酸(Calbiochem)。設定不添加樣品的組作為對照。在5%€02、37。C條件下培養培養板。培養開始後第2天，向各孔添加lml含60U/mlIL-2(鹽野義製藥公司)和lO^g/ml透明質酸的5HRPMI(對照組只含有IL-2)，第5天半量去除培養上清，然後添加lml含同樣IL-2和透明質酸的培養基(對照組只含有IL-2)。第7日，與說明同樣製備抗原呈遞細胞，將培養了周的應答細胞懸浮到5HRPMI中，使其濃度達0.5-2x106細胞/ml，以lml/孔添加到製備的抗原呈遞細胞上進行再刺激。此時，添加終濃度為lOpg/ml的透明質酸(對照組不添加)。再刺激後第2天向各孔添加lml含60U/mlIL-2和10(ag/ml透明質酸的5HRPMI(對照組只含有IL-2),第5天半量去除培養上清，然後添加lml與去除前同樣內容的培養基，再繼續培養2天，誘導CTL。(3)CTL細胞殺傷活性的測定通過應用Calcein-AM的細胞殺傷活性測定方法[LichtenfelsR.等，J.Immunol.Methods,第172巻，第2期，第227-239頁(1994)]來評價實施例1-1-(2)中製備的誘導開始後第14天的CTL的細胞殺傷活性。與表位肽共培養1晚，或將表位肽不存在下培養的保持HLA-A2.1的EBV轉化的B細胞(細胞名221A2.1)懸浮到含5。/。FBS(胎牛血清，BioWhittaker)的RPMI1640培養基中，使之達1x106細胞/mI,然後添加終濃度為25^iM的Calcein陽AM[Dotite],37。C培養1小時。用不含Calcein-AM的培養基洗滌細胞後，與2Q倍量的K562細胞(ATCCCCL-243)混合，作為Calcein標記的靶細胞。應用K562細胞是為了排除混入應答細胞中的NK細胞的非特異性殺傷活性。將在實施例1-1-(2)中製備的記憶性CTL作為效應細胞，用5HRPMI梯度稀釋成1x105-9x106細胞/ml後，以100ja1/孔加到96孔細胞培養板的各孔中，向其中添加1x10Vml的Calcdn標記的耙細胞，100)al/孔。將加入上迷細胞懸液的培養板在400g離心1分鐘後，在37。C的溼式培養箱中培養4小時。4小時後，從各孔吸25上清IOOjli，用螢光板讀數儀(485nm/538nm)測定培養上清中釋放出的Calcein量。按下式1計算出"特異性細胞殺傷活性(％)"。式1:特異性細胞殺傷活性(％)==((各孔的測定量-最小釋放量)/(最大釋放量-最小釋放量)}x100上式中，最小釋放量是指只含靶細胞和K562細胞的孔的Calcein釋放量，表示靶細胞的Calcein自然釋放量。最大釋放量是指向扭細胞中加入0.1%TritonX-100(大力54f義夕)使細胞完全破裂時釋放的Calcem量。其結果是，誘導後可誘導出特異性細胞殺傷活性，但誘導時有無添加透明質酸其細胞殺傷活性幾乎無差異。(4)CTL的擴大培養用5HRPMI洗滌在實施例1-1-(2)中製備的C丁L後，製備成3x104細胞/ml。X線照射(3300R)用工與實施例1-1-(1)同樣的方法採集的HLA-A2.1非保持allogenicPBMC,用培養基洗滌後，製備成2-5x106細胞/ml。將該3x104細胞/ml的CTL及4—10x106細胞/ml的allogenicPBMC懸浮到10ml5HRPMI中，再加入終濃度為50ng/ml的抗CD3抗體(JanssenKyowa)，加到12.5cm2的培養瓶(Falcon)中，37。C溼式(302培養箱中培養14天。此時，設定添加實施例1-1-(2)中誘導CTL時添加的透明質酸的組(終濃度10jag/ml)和不添加的組。此間，用肽進行刺激或完全不進行，培養開始第1天添加終濃度120U/ml的IL-2，再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清'向各培養瓶添加5ml含MU/mlIL-2的5HRPMI。此時，透明質酸添加組的培養基中添加同濃度的樣品。擴大培養開始後，第14天用與實施例1-1-(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性。測定結果如表1所示。表中E/T是效應細胞數(E)與靶細胞數(T)的比，肽添加表示對靶細胞有無添加肽。擴大增殖率是以擴大培養結束時的細胞數對擴大培養開始時的細胞數的比值作為增殖率求出的。表1tableseeoriginaldocumentpage27*:+:添加樣品；-:未添加樣品，+:附加肽；-:未附加肽結果是，CTL誘導時及擴大培養時添加透明質酸的組中，在擴大培養後的第M天，CTL保持有高特異性的細胞殺傷活性。另一方面，無論CTL誘導時還是擴大培養時，未添加樣品的組中其活性明顯降低。總而言之，結果表明在CTL誘導時及擴大培養時添加透明質酸，可在長期保持高特異性的細胞殺傷活性狀態下進行CTL的擴大培養。實施例1-2(1)抗流感病毒記憶性CTL的誘導應用用實施例1-1-U)中的方法分離、保存的PBMC，用與實施例l-1-(2)同樣的方法，誘導抗流感病毒記憶性CTL。此時，添加終濃度達lOpg/inl的透明質酸。並設定不添加樣品的組。用與實施例1-1-(3)同樣的方法評價如此製備的誘導開始後第14天的CTL的特異性細胞殺傷活性。結果是，誘導後可誘導出特異性細胞殺傷活性，但誘導時有無添加抗體其細胞殺傷活性幾乎無差異。(2)CTL的擴大培養應用實施例1-2-(l)中製備的CTL,用與實施例1-1—(4)同樣的方法，進行CTL的擴大培養。此時'不添加實施例1-2-(1)中誘導CTL時添加的透明質酸的組。此間，不用肽進行刺激，培養開始第1天添加終濃度U0U/ml的IL-2,再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清，向各培養瓶添加5ml含60U/mlIL-2的5HRPMI。擴大培養開始後，第14天用與實施例1-1-(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性。測定結果如表2所示。表2樣品添加一羊品*擴大增附加細胞殺傷活性(%)CTL誘擴大培殖率肽HE/T比導時養時(倍)1310對照--480-000.46.8--480+411.229.359.7透明++423-001.914.3質酸++423+7.223.359.685.1+-393-3.01.44.79.3+-393+9.922.147.778.0*:+:添加樣品；-:未添加樣品，+:附加肽；-:未附加肽其結果是，僅在CTL誘導時添加透明質酸的組中，即便在擴大培養時未添加樣品，U天的擴大培養後保持有高特異性的細胞殺傷活性。另一方面，無論CTL誘導時還是擴大培養時，未添加樣品的組中其活性明顯降低。總而言之，結果表明儘管只在CTL誘導時添加透明質酸，可在長期保持高特異性的細胞殺傷活性狀態下進行CTL的擴大培養。實施例1一3(1)抗流感病毒記憶性CTL的誘導應用用實施例1-1-(1)中的方法分離、保存的PBMC，用與實施例1-1-(2)同樣的方法，誘導抗流感病毒記憶性CTL。此時設定添加透明質酸(表3中稱作HA)(10|ug/ml)的組和完全不添加樣品的組。涉及透明質酸添加組的，設定同時共添加終濃度0.2ng/ml28的抗CD"抗體(透明質酸結合阻斷(Blocking)抗體；表中稱作HA阻斷抗CD44抗體)或抗CD44抗體(透明質酸結合非阻斷(Non-Blocking)抗體；表中稱作HA非阻斷抗CD44抗體)(均為Ancell公司，單抗)的組，研究抗體的阻斷效果。用與實施例1-1-(3)同樣的方法評價如此製備的誘導開始後第l4天的CTL的特異性細胞殺傷活性。結果是，誘導後可誘導出特異性細胞殺傷活性，但誘導時有無添加抗體其細胞殺傷活性幾乎無差異。(2)CTL的擴大培養應用實施例1-3-(1)中製備的C丁L,用與實施例1-1-(4)同樣的方法，進行CTL的擴大培養。此時，設定添加實施例1-3-(1)中誘導CTL時添加的終濃度10)ag/ml透明質酸的組和誘導時完全不添加透明質酸的組。另外，涉及到誘導時共添加透明質酸和抗CD44抗體的組，擴大培養時添加同樣的樣品和抗體。此間，不用肽進行刺激，培養開始第1天添加終濃度120U/ml的IL-2,再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清，向各培養瓶添加5ml含60U/mlIL-2的5HRPMI。擴大培養開始後，第14天用與實施例(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性。測定結果如表3所示。表3樣品添加樣品*擴大增附加細胞殺傷活性(%)CTL擴大培殖率肽HE/T比誘導時養時(倍)131030對照--330-2.46.27.49.6--330+3.95.87.210.9HA++350-001.95.3++350十4.815.335.370.2HA+HA阻++357一5.94.715.014.9斷抗CD44+357+10.911.819.517.5抗體HA+HA非++413-64.757.6阻斷抗++413+12.217.534.969.9CD44抗體__*:+:添力p才羊品；-:未添力p才竽品，+:附加肽；-:未附加肽其結果是，在CTL誘導時和擴大培養時添加透明質酸的組中，即便在14天的擴大培養後CTL保持有高特異性的細胞殺傷活性。另一方面，無論CTL誘導時還是擴大培養時，未添加樣品的組中其活性明顯降低。另外，在共添加透明質酸和抗CD44抗體(透明質酸結合阻斷抗體)的組中，完全阻斷了透明質酸的CTL活性維持效果。另一方面，共添加透明質酸和抗CD44抗體(透明質酸結合非阻斷抗體)的組中，未阻斷透明質酸的CTL活性維持效果。總而言之，透CD44抗原結合而發揮作用的。實施例2應用抗人CD44抗體擴大培養具有特異性細胞殺傷活性的CTL的方法(1)抗流感病毒記憶性CTL的誘導應用用實施例1-1-U)中的方法分離、保存的PBMC，用與實施例1-1-(2)同樣的方法，-秀導抗流感病毒記憶性CTL。此時，添加終濃度為0.2pg/ml的純化小鼠IgGl[Genzyme/Techne/>司]或實施例1-3-(1)中使用的2種抗人CD44抗體。並設定未添加抗體的組。用與實施例1-1-(3)同樣的方法評價如此製備的誘導開始後第14天的CTL的特異性細胞殺傷活性。結果是，誘導後可誘導出特異性細胞殺傷活性，但誘導時有無添加抗體其細胞殺傷活性幾乎無差異。(2)CTL的擴大培養應用實施例2-(1)中製備的CTL,用與實施例1-1-(4)同樣的方法，進行CTL的擴大培養。此時，設定添加實施例2-(1)30中誘導CTL時添加的終濃度O.^g/ml小鼠IgGl或2種抗人CD44抗體的組和i秀導時完全不添加抗體的組。此間，不用肽進^於刺激，培養開始第1天添加終濃度120U/ml的IL-2,再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清，向各培養瓶添加5ml含60U/mlIL-2及0.2)ng/ml小鼠IgGl或2種抗人CD44抗體的5HRPMI。但，不添加抗體的組中在換培養基時不添加抗體。擴大培養開始後，第14天用與實施例1-1-(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性。測定結果如表4所示。表4樣品添加樣品*擴大增附加細胞殺傷活性(%)CTL擴大培殖率肽lE/T比誘導時養時(倍)31030對照--413-5.910.512.8-一413+4.014.848.9小鼠IgGl+357-5.602++357+6.26.813.3HA非阻斷++357-10.314,221.2抗CD44抗++357+32.460.1104.8體HA阻斷抗十+420-1.61.3"CD44抗體++420+9.59.817.7*:+:添加樣品；-:未添加樣品，十附加肽；-:未附加肽其結果是，在CTL誘導時和擴大培養時添加抗人CD44抗體(透明質酸結合非阻斷抗體)的組中，即便在l4天的擴大培養後CTL保持有高特異性的細胞殺傷活性。另一方面，無論CTL誘導時還是擴大培養時，未添加這些抗體及添加抗人CD44抗體(透明質酸結合阻斷抗體)的組中其活性明顯降低。總之，CTL誘導時及擴大培養時添加抗人CD44抗體中不抑制透明質酸結合的抗體，可在長期保持高31實施例3透明質酸及抗人CD44抗體與可溶性或細胞表面上CD44抗原的結合性CD"有2種存在方式，即在培養上清中以可溶性方式存在(以後稱作可溶性CD")和細胞膜表面上的存在方式(以後稱作細胞表面上CD44)。CD44是透明質酸的受體，CTL擴大培養時通過添加透明質酸可起到維持細胞殺傷活性的效果，所以想檢測這種活性維持效果依賴於哪一種CD44抗原。實施例3-1(1)可溶性CD44與透明質酸的結合性評價用以下的方法評價透明質酸與可溶性CD44的結合性。即，將含5pg/ml抗人CD44抗體(可溶性CD44識別抗體，Ancell)的PBS(二、7隻4)力口入到Nunc-Immuno板(Nunc)中，100pl/孑L,室溫過夜，用0.025%Tween20(SIGMA)/PBS洗滌3次後，添加封閉液(大日本製藥公司)，300nl/孔，室溫培養1小時以上。另一方面，在含有可溶性CD44(15ng/ml)的RPMI培養基中添加透明質酸，使之終濃度分別達0,0.25,0.5,1)ig/ml，37。C培養1小時。再次用0.025%Tween20/PBS將封閉後培養板的各孔洗滌3次後，添加預培養的含有透明質酸或不含有透明質酸的含可溶性CD44(15ng/ml)的RPMI培養基，100pil/孔。再向各孔添加HRP標記的Conjugate[BenderMed,可溶性CD44測定用ELISA系統中附屬的試劑],室溫培養3小時。培養後，用0.025%Tween20/PBS將各孔洗滌3次，添力aTMB(3,3，,5,5，-tetramethylbenzidine)溶液(SIGMA),100|4/孔，室溫培養15分鐘後，添加2N硫酸，50pl/孔，終止反應。用酶標儀測定各孔的吸光度(450nm)。測定結果如圖1所示。結果是，即便在含可溶性CD44的培養基中添加透明質酸一點也不抑制可溶性CD44識別抗體的識別效杲。這說明，透明質酸與培養基中存在的可溶性CD44不結合。由此表明，透明質酸對CTL的特異性細胞殺傷活性的維持效果與培養基中的可溶性CDM完全不相關。(2)抗流感病毒記憶性CTL的誘導應用按實施例1-1-(1)中描迷的方法分離、保存的PBMC，用與實施例1-1-(2)同樣的方法進行抗流感病毒記憶性CTL的誘導。用實施例1-1-(3)同樣的方法評價如此製備的誘導開始後第14天的CTL的細胞殺傷活性。結果是，誘導開始後，可誘導出特異性細胞殺傷活性。(3)CTL的擴大培養用實施例3-1-(2)中製備的CTL,用與實施例1-1-(4)同樣的方法，進行CTL的擴大培養。此間，不用肽進行刺激，培養開始第1天添加終濃度120U/ml的IL-2,再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清，向各培養瓶添加5ml含60U/mlIL-2的51IRPMI。擴大培養開始後，第14天用與實施例1-1-(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性，可以確認這些CTL具有特異性細胞殺傷活性。(4)透明質酸與細胞表面上CD44的結合性評價用含1%多聚甲醛(大力，4)的PBS(-7,一)固定實施例3-1-(3)中製備的2x105細胞的CTL後，用PBS洗滌。將固定的細胞懸浮到含10pg/mlFL標記的透明質酸[MolecularProbes]的PBS中，37。C培養30分鐘。以在不含FL標記的透明質酸(FL-HA)的PBS中進行培養的組作為陰性對照。培養後，用PBS洗滌，再次懸浮到含1%多聚甲醛的PBS中。將製備的CTL上FACSVantage[Becton,Dickinson],測定細胞表面上的螢光強度。結果示於圖2中。結果顯示，FL標記的透明質酸結合到CTL的細胞表面上。這表明透明質酸通過與存在於CTL細胞表面上的CD"結合而發揮其CTL特異性細胞殺傷活性的維持效果。實施例3-2(1)抗人CD44抗體(HA非阻斷抗CD44抗體)與可溶性CD44的結合性評價用以下方法評價HA非阻斷抗CD44抗體與可溶性CD44的結合性。即，將含5pg/mlHA非阻斷抗CD44抗體或抗人CD44抗體(可溶性CD44識別抗體，Ancell)的PBS(-少X4)作為1抗加入到Nunc-Immuno板(Nunc)中，lOOpl/孑L，室溫過夜，用0.025%Tween20(SIGMA)/PBS洗滌3次後，添加封閉液(大日本製藥公司)，300)al/孔，室溫培養1小時以上。再次用0.025%Tween20/PBS將封閉後培養板的各孔洗滌3次後，添加含可溶性CD44(15ng/ml)的RPMI培養基，100jil/孑L。再向各孑L添力口HRP標記的Conjugate[BenderMed，可溶性CD44測定用ELISA系統中附屬的試劑],50|^1/孔，室溫培養3小時。培養後，用0.025%Tween20/PBS將各孔洗滌3次，添加TMB溶液(SIGMA)，100iul/孑L,室溫培養15分鐘後，添加2N硫酸，50^1/孔，終止反應。用酶標儀測定各孔的吸光度(450nm)。實驗進行2次，取其平均值，結果如固3、圖4所示。作為初級抗體應用的可溶性CD44識別抗體以抗體濃度依賴性方式識別培養基中的可溶性CD44。另一方面，HA非阻斷抗CD44抗體完全不識別培養基中的可溶性CD44。總之，HA非阻斷抗CD44抗體不結合培養基中存在的可溶性CD44。這表明HA非阻斷抗CD"抗體對CTL特異性細胞殺傷活性的維持效果與培養基中的可溶性CD44完全不相干。(2)抗流感病毒記憶性CTL的誘導應用按實施例1-1-(1)中描述的方法分離、保存的PBMC，用與實施例1-1-(2)同樣的方法進"f亍抗流感病毒記憶性CTL的誘導。用實施例1-1-(3)同樣的方法評價如此製備的誘導開始後第14天的CTL的細胞殺傷活性。結果是，誘導開始後，可誘導出特異性細胞殺傷活性。(3)CTL的擴大培養用實施例3-2-(2)中製備的CTL，用與實施例1-1-(4)同樣的方法，進行CTL的擴大培養。此間'不用肽進行刺激，培養開始第1天添加終濃度120U/ml的IL-2，再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清，向各培養瓶添加5ml含60U/mlIL-2的5HRPMI。擴大培養開始後，第14天用與實施例1-1-(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性，可以確認這些CTL具有特異性細胞殺傷活性。(4)抗人CD"抗體(HA非阻斷抗CD44抗體)與可溶性CD44的結合性評價用含1%多聚甲醛(*力，4)的PBS(-'7義)固定實施例3-2-(3)中製備的2x105細胞的CTL後，用PBS洗滌。將固定的細胞懸浮到含l!ig/ml抗CD44/FITC(FITC標記的HA非阻斷抗CD44抗體(CD44—FITC),Ancell)的1%BSA(SIGMA)PBS中，冰上放置30分鐘。以在含lng/ml小鼠IgGl/FITC(FITC標記的小鼠IgGl抗體(IgGl-FITC)'DAKO)的PBS中進行培養的組作為陰性對照。培養後，用PBS洗滌，再次懸浮到含1%多聚甲搭的PBS中。將製備的CTL上FACSVantage,測定細胞表面上的螢光強度。結果示於圖5中。結果顯示，FL標記的非阻斷抗CD44抗體結合到CTL的細胞表面上。這表明透明質酸通過與存在於CTL細胞表面上的CD44結合而發揮抗人非阻斷抗CD"抗體對CTL特異性細胞殺傷活性的維持效果。實》fe例3-3(1)抗流感病毒記憶性CTL的誘導應用按實施例1-1-(1)中描述的方法分離、保存的PBMC，用與實施例1.-1-(2)同樣的方法進行抗流感病毒記憶性CTL的誘導。此時，添加終濃度為0.2卩g/ml的HA非阻斷抗CD44抗體。還設定未添加抗體組。用實施例1-1-(3)同樣的方法評價如此製備的誘導開始後第14天的CTL的細胞殺傷活性。結果是，誘導開始後，可誘導出特異性細胞殺傷活性，但誘導時有無添加抗體，其細胞殺傷活性幾乎無差異o(2)CTL的擴大培養用實施例3-3-(1)中製備的CTL,用與實施例(4)同樣的方法，進行CTL的擴大培養。此時，添加實施例3-3-(1)中誘導CTL時添加的HA非阻斷抗CD44抗體，使其終濃度為0.2)ig/ml。另外，誘導時不添加抗體的組中此時也不添加抗體。此間，不用肽進行刺激，培養開始第1天添加終濃度120U/ml的IL-2，再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清，向各培養瓶添加5ml含60U/mlIL-2及0.2pg/mlHA非阻斷抗CD44抗體的5HRPMI。但，未添加抗體的組中，換培養基時不添加抗體。擴大培養開始後，第14天用與實施例1-1-(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性。結果確認，CTL誘導時和擴大培養時添加HA非阻斷抗CD44抗體的組中，即便在14天的擴大培養後，CTL維持高特異性的細胞殺傷活性，另一方面，無論CTL誘導時還是擴大培養時，未添加抗體的組中，其活性明顯降低。(3)HA非阻斷抗CD44抗體添加擴大培養後CTL細胞表面上抗體結合性評價用含1%多聚曱醛(大力，<)的PBS(-'7X4)固定實施例3-3-(1)中製備的2x105細胞的CTL(在添加HA非阻斷抗CD44抗體的條件下進行培養的CTL)後，用PBS洗滌。將固定的細胞懸浮到含l|ig/mlFITC標記的小鼠IgG或FITC標記的小鼠IgG抗體的1%BSA(SIGMA)PBS中，水上放置30分鐘。培養後，用PBS洗滌，再次懸浮到含1%多聚甲醛的PBS中。將製備的CTL上FACSVantage,測定細胞表面上的螢光強度。結果示於圖6中。結果顯示，在非阻斷抗CD44抗體添加的條件下擴大培養的CTL的細胞表面上結合有該抗體。這表明HA非阻斷抗CD"抗體對CTL特異性細胞殺傷活性的維持效果是通過該抗體與CTL細胞表面上存在的CD44結合而發揮的。實施例4應用抗人HGF抗體擴大培養保持特異性細胞殺傷活性的CTL實施例4-1(1)抗流感病毒記憶性CTL的誘導應用按實施例1-1-(1)中描迷的方法分離、保存的PBMC,用與實施例1-1-(2)同樣的方法進4亍抗流感病毒記憶性CTL的36誘導。此時，添加終濃度為0.2fig/ml的純化小鼠IgG(Genzyme/Techne)或抗人HGF抗體(小鼠單克隆抗體，Genzyme/Techne)。還設定未添力口抗體組。用實施例1-1-(3)同樣的方法評價如此製備的誘導開始後第14天的CTL的細胞殺傷活性。結果是，誘導開始後，可誘導出特異性細胞殺傷活性，但誘導時有無添加抗體，其細胞殺傷活性幾乎無差異。(2)CTL的擴大培養用實施例4-1-(1)中製備的CTL，用與實施例1-1-(4)同樣的方法，進行CTL的擴大培養。此時，設定添加實施例4-l-(1)中誘導CTL時添加的終濃度為2ng/ml的小鼠IgGl或抗人HGF抗體的組別，和誘導時不添加抗體的組別。此間，不用肽進4於刺激，培養開始第1天添加終濃度120U/ml的IL-2,再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清，向各培養瓶添加5ml含60U/mlIL-2及2|ig/ml小鼠IgGl或抗人HGF抗體的5HRPMI。但，未添加抗體的組中，換培養基時不添加抗體。擴大培養開始後，第M天用與實施例1-]-(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性。測定結果如表5所示。表5衝羊品添加樣品*擴大增附加細胞殺傷活性(%)CTL誘擴大培殖率肽1E/T比導時養時(倍)131030對照--340-0.60.61.519.4--340+03.26.821.3小鼠++207-000.13.9++207+04.19.330.3抗++435一1.23.104.0HGF++435+7.219.539.674.5抗體*:+:添加才羊品；-:未添加才羊品Tl:+:附加肽；-:未附加肽結果，CTL誘導時和擴大培養時添加抗人HGF抗體的組中，即便在14天的擴大培養後，CTL維持高特異性的細胞殺傷活性。另一方面，無論CTL誘導時還是擴大培養時，未添加抗體的組中，其活性明顯降低。總之，通過CTL誘導時及擴大培養時添加抗人HGF抗體，可在長期保持特異的高效細胞殺傷活性的狀態下進行CTL的擴大培養。實》包例4一2(1)抗流感病毒記憶性CTL的誘導應用按實施例1-1-(1)中描述的方法分離、保存的PBMC,用與實施例1-1-(2)同樣的方法進行抗流感病毒記憶性CTL的誘導。此時，添加終濃度為2叫/ml的抗人HGF抗體(小鼠單克隆抗體，Genzyme/Techne)。還設定未添力口抗體組。用實施例1-1-(3)同樣的方法評價如此製備的誘導開始後第14天的CTL的細胞殺傷活性。結果是，誘導開始後，可誘導出特異性細胞殺傷活性，但誘導時有無添加抗體，其細胞殺傷活性幾乎無差異。(2)CTL的擴大培養用實施例4-2-(1)中製備的CTL,用與實施例1-1-(4)同樣的方法，進行CTL的擴大培養。此時，不添加實施例4-2-(1)中誘導CTL時添加的抗人HGF抗體。此間，不用肽進行刺激，培養開始第1天添加終濃度l加U/ml的IL-2，再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清，向各培養瓶添加5ml含60U/mlIL-2的5HRPMI。擴大培養開始後，第14天用與實施例1-1-(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性。測定結果如表6所示。表6tableseeoriginaldocumentpage39:+:添力口才羊品；-:未添力口衝羊品，+:附加肽；-:未附加肽結果，僅在CTL誘導時添加抗人HGF抗體的組中，即便在擴大培養時不添加該抗體，14天的擴大培養後，CTL維持高特異性的細胞殺傷活性。另一方面，無論CTL誘導時還是擴大培養時，未添加抗體的組中，其活性明顯降低。結果表明，即便僅在CTL誘導時添加抗人HGF抗體，也可在長期保持特異的高效細胞殺傷活性的狀態下進行CTL的擴大培養。實施例5應用抗人IGF-1抗體擴大培養保持特異性細胞殺傷活性的CTL實施例5-1(1)抗流感病毒記憶性CTL的誘導應用按實施例1-1-(1)中描述的方法分離、保存的PBMC，用與實施例1-1-(2)同樣的方法進行抗流感病毒記憶性CTL的誘導。此時，添加終濃度為2pg/ml的純化羊IgG(CHEMICONInternational)或抗人IGF-1抗體(羊多克隆抗體，Genzyme/Techne)。還設定未添加抗體組。用實施例1-1-(3)同樣的方法評價如此製備的誘導開始後第14天的CTL的細胞殺傷活性。結果是，誘導開始後，可誘導出特異性細胞殺傷活性，但誘導時有無添加抗體，其細胞殺傷活性幾乎無差異。(2)CTL的擴大培養用實施例5-1-(1)中製備的CTL,用與實施例1-1-(4)同樣的方法，進行CTL的擴大培養。此時，設定添加實施例5-l-(])中誘導CTL時添加的終濃度為2|iig/ml的羊IgG或抗人IGF-1抗體的組別，和誘導時不添加抗體的組別。此間，不用肽進^f亍刺激，培養開始第1天添加終濃度l:20U/ml的IL-2,再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清，向各培養瓶添加5m含60U/mlIL-2及2pg/ml羊IgG或抗人IGF-1抗體的5HRPMI。但，未添加抗體的組中，換培養基時不添加抗體。擴大培養開始後，第14天用與實施例1-1-(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性。測定結果如表7所示。表7樣品添加樣品*擴大增附加細胞殺傷活性(%)CTL誘擴大培殖率肽，1E/T比導時養時(倍)131030對照-340-0.80.61.519.4--340+03.26.821.3羊IgG+463-001.65.6+463+0.72.16.618.9抗++368-000.43.4IGF-1++368十13.040.280.490.9抗體*:+:添力口才羊品；-:未添力口才羊品，十附加肽；-:未附加肽結果，CTL誘導時和擴大培養時添加抗人IGF-1抗體的組中，即便在14天的擴大培養後，CTL維持高特異性的細胞殺傷活性。另一方面，無論CTL誘導時還是擴大培養時，未添加抗體的組中，其40活性明顯降低。總之，通過CTL誘導時及擴大培養時添加抗人IGF-l抗體，可在長期保持特異的高效細胞殺傷活性的狀態下進行CTL的擴大培養。實施例5—2(1)抗流感病毒記憶性CTL的誘導應用按實施例-1-中描述的方法分離、保存的PBMC,用與實施例1-1-(2)同樣的方法進行抗流感病毒記憶性CTL的誘導。此時，添加終濃度為2ng/ml的抗人IGF-1抗體(羊多克隆抗體，Genzyme/Techne)。還i殳定未添力口抗體組。用實施例1-1-(3)同樣的方法評價如此製備的誘導開始後第14天的CTL的細胞殺傷活性。結果是，誘導開始後，可誘導出特異性細胞殺傷活性，但誘導時有無添加抗體，其細胞殺傷活性幾乎無差異。(2)CTL的擴大培養用實施例5-2-(1)中製備的CTL,用與實施例1-1-(4)同樣的方法，進行CTL的擴大培養。此時，不添加實施例5-2-(1)中誘導CTL時添加的抗人IGF-1抗體。此間，不用肽進行刺激，培養開始第1天添加終濃度UOU/ml的IL-2，再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清，向各培養瓶添加5ml含60U/mlIL-2的5HRPMI。擴大培養開始後，第14天用與實施例1-1-(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性。測定結果如表8所示。41表S樣品添力口樣'口*擴大增附加細胞殺傷活性(o/o)CTL誘擴大培殖率肽1E/T比導時養時(倍)1310對照-一547一7.38.49.1-一5478.111.221.5抗++637-3.83.27.5IGF-1十十637+20.847.469.0抗體十一553-9.411.615.0+-553+49.682.6111.0:+:'添力口才羊口口口；-:未i^力口才羊口；Tf:十附加肽；-:未附加肽結果，在CTL誘導時添加抗人IGF-1抗體的組中，即便在擴大培養時不添加該抗體，14天的擴大培養後，CTL維持高特異性的細胞殺傷活性。另一方面，無論CTL誘導時還是擴大培養時，未添加抗體的組中，其活性明顯降低。結果表明，即便僅在CTL誘導時添加抗人IGF-1抗體，也可在長期保持特異的高效細胞殺傷活性的狀態下進行CTL的擴大培養。實施例6應用抗人IGF-2抗體擴大培養保持特異性細胞殺傷活性的CTL(1)抗流感病毒記憶性CTL的誘導應用按實施例1-1-(1)中描迷的方法分離、保存的PBMC'用與實施例1-1-(2)同樣的方法進行抗流感病毒記憶性CTL的誘導。此時，添加終濃度為2|ag/ml的純化小鼠IgGl(Genzyme/Techne)或抗人IGF-2抗體(小鼠單克隆抗體，Genzyme/Techne)。還設定未添力口抗體組。用實施例1-1-(3)同樣的方法評價如此製備的誘導開始後第14天的CTL的細胞殺傷活性。結果是，誘導開始後，可誘導出特異42性細胞殺傷活性，但誘導時有無添加抗體，其細胞殺傷活性幾乎無差異。(2)CTL的擴大培養用實施例6-(1)中製備的CTL,用與實施例1-1-(4)同樣的方法，進行CTL的擴大培養。此時，設定添加實施例6-(1)中誘導CTL時添加的終濃度為2|ug/ml的小鼠IgGl或抗人IGF-2抗體的組別，和從誘導時開始不添加抗體的組別。此間，不用肽進行刺激，培養開始第1天添加終濃度120U/ml的IL-2，再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清，向各培養瓶添加5ml含60U/mlIL-2及2pg/ml小鼠IgGl或抗人IGF-2抗體的5HRPMI。但，未添加抗體的組中，換培養基時不添加抗體。擴大培養開始後，第14天用與實施例1-1-(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性。測定結果如表9所示。表9樣品添加樣品*擴大增附力口細胞殺傷活性(%)CTL誘擴大培殖率肽1E/T比導時養時(倍)131030對照--237-2.13.95.69.7--237+04.16.912.4小鼠十十370-0000IgGl+十370+0003.1抗++225-3.95.05.810.2IGF-2++225+7.116.537.771.5抗體*:+:添力口才羊品；-:未添力p才羊品，+:附加肽；-:未附加肽結果，CTL誘導時和擴大培養時添加抗人IGF-2抗體的組中，即便在14天的擴大培養後，CTL維持高特異性的細胞殺傷活性。另一方面，無論CTL誘導時還是擴大培養時，未添加抗體的組中，其活性明顯降低。這表明即便僅在CTL誘導時添加抗人IGF-2抗體，也可在長期保持特異的高效細胞殺傷活性的狀態下進行CTL的擴大培養。實施例7維持腫瘤相關抗原特異性細胞殺傷活性的CTL的擴大培養實施例7-1(1)腫瘤相關抗原(MAG3)特異的CTL的誘導應用用實施例l-l-(l)中的方法分離、保存的PBMC進行腫瘤相關抗原(melanoma-associatedantigen3,MAG3)片爭異的CTL的i秀導。部分改變PlebanskiM.等的方法[PlebanskiM.等，Eur.J.Immunol.,第25巻，第6期，第1783-1787頁(1995)]進行腫瘤相關抗原(MAG3)特異的CTL的誘導。即，將實施例l-l-(l)中製備的PBMC懸浮到5HRPMI中，濃度達2-4x107細胞/ml，等量分為兩份。一半作為應答細胞冰上保存，一半作為抗原呈遞細胞，等量添加含80jLig/ml黑色素瘤抗原MAG3來源的表位肽(序列表的SEQIDNO:19中的黑色素瘤抗原MAG3來源的HLA-A2.1結合性肽)及6pg/ml卩2微球蛋白(Scrips)抗原肽的5HRPMI,5%C02溼式培養箱中37'C培養2小時。其後，用5HRPMI洗滌，與冰上保存的應答細胞混合，製備成2x106細胞/ml。分別添加終濃度為25ng/ml、5|Lig/ml的IL-7和KLH，24孔培養板(Falcon)中，2ml/孔。此時，添加終濃度10j^g/ml的透明質酸(Calbiochem)。另外，設定不添加樣品的組別作對照。5%C02、37。C培養培養板。培養開始後第4天半量換液，各孔添加lml含60U/mlIL-2和10嗎/ml透明質酸的5HRPMI(對照只含有IL-2)。第7日，同樣製備抗原呈遞細胞後，X線照射(5500R)，調配成4xl06細胞/ml。將培養了1周的應答細胞懸浮到5HRPMI中，濃度達2xlos細胞/m1,與製備的抗原呈遞細胞等量混合，添加到24孔培養板中，lml/孔，再添加終濃度25ng/ml的IL-7,進行再刺激。此時，添加終濃度10)ag/ml的透明質酸(對照不添加)。再刺激後第1天向各孔添加lml含60U/mlIL-2和10pg/ml透明質酸的5HRPMI(對照只含有IL-2),第3天半量換液後'添加lml與換液前相同內容的培養基。1周間再實施同樣的再刺激1次，共4次，誘導CTL。(2)CTL細胞殺傷活性的測定用與實施例l-l-(3)同樣的方法評價實施例7-l-(l)中製備的誘導開始後第35天的CTL的細胞殺傷活性。但此時，用與表位肽共培養一晚或在表位肽不存在的條件下培養的HLA-A2.1EBV轉染的B細胞(細胞名221A2.1)作為靶細胞。結果，誘導之後可誘導出特異性細胞殺傷活性，但誘導時有無添加透明質酸其細胞殺傷活性幾乎無差異。(3)CTL的擴大培養用實施例7-1-(1)中製備的CTL，用與實施例l-l-(4)同樣的方法，進行CTL的擴大培養。此時，設定添力口實施例7-1-(])中誘導CTL時添加的10^ig/ml透明質酸的組別，和從誘導時開始不添加樣品的組別。此間，不用肽進行刺激，培養開始第1天添加終濃度120U/ml的IL-2，再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清，向各培養瓶添加5ml含60U/mlIL-2及10)ag/ml透明質酸的5HRPMI。但，未添加抗體的組中，換培養基時不添加樣品。擴大培養開始後，第14天用與實施例1-1-(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性。測定結果如表10所示。tableseeoriginaldocumentpage45*:+:添加樣品；-:未添加樣品TI:+:附加肽；-:未附加肽結果，CTL誘導時和擴大培養時添加透明質酸的組中，即便在l4天的擴大培養後，CTL維持高特異性的細胞殺傷活性。另一方面，無論CTL誘導時還是擴大培養時，未添加樣品的組中，其活性明顯降低。這表明抗腫瘤相關抗原(MAGE3)CTL的擴大培養時，通過在誘導時及擴大培養時添加透明質酸，可在長期保持特異的高效細胞殺傷活性的狀態下進行CTL的擴大培養。實施例7—2(1)腫瘤相關抗原(MART1)特異性CTL的誘導應用用實施例l-l-(l)中的方法分離、保存的PBMC,用與實施例7-l-(l)同樣的方法進行月中瘤相關抗原(melanomaantigenrecognizedbyTcell,MARTI)特異的CTL的誘導。用黑色素瘤抗原MARTI來源的表位肽(序列表的SEQIDNO:20中的MARTI來源的HLA-A2.1結合性肽)作抗原肽。此時，添加終濃度10pg/ml的透明質酸(Calbiochem)。另外，設定不添加樣品的組別作對照。用與實施例1-1.-(3)同樣的方法評價如此製備的誘導開始後第35天的CTL的細胞殺傷活性。但此時，用與表位肽共培養一晚或在表位肽不存在的條件下培養的HLA-AllEBV轉染的B細胞(細胞名221A2.1)、100U/mlIFN-Y存在下培養兩晚的HLA-A2.1癌細胞抹(細胞名624md,保持HLA-A2.1的MARTI表達細胞)或HLA-A2.1非保持細胞林(細胞名888mel，不保持HLA-A2.1的MARTI表達細胞)作為靶細胞。結果，誘導之後可誘導出特異性細胞殺傷活性，但誘導時有無添加樣品其細胞殺傷活性幾乎無差異。(2)CTL的擴大i咅養用實施例7-2-(1)中製備的CTL，用與實施例1-1-(4)同樣的方法，進行CTL的擴大培養。此時'設定添加實施例7-2-(1)中誘導CTL時添加的lO^g/ml透明質酸的組別，和AU秀導時開始不添加樣品的組別。此間，不用肽進^"刺激，培養開始第l天添加終濃度120U/ml的IL-2,再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清，向各培養瓶添加5ml含60U/miIL-2及lOpg/ml透明質酸的5HRPMI。但，未添加抗體的組中，換培養基時不添加樣品。46擴大培養開始後，第14天用與實施例1-1-(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性。測定結果如表ll所示。表11樣品添加一羊品*擴大增附加革巴細胞細胞傷害活性(％)CTL誘擴大培殖率肽11E/T比導時養時(倍)2720對照--287-221A2.103.84.1--287+221A2.18.127.543.5--287—888mel32.544.843.7--287-624mel27.455.881.6E/T比2617透明++217-221A2.1000質酸+217+221A2.19.152.874.4++217-888mel000++217一624mel29.673.890.6*:+:、添力口才羊品；-:未'添力口沐豐v口，+:附加肽；-:未附加肽結果，CTL誘導時和擴大培養時添加透明質酸的組中，即便在14天的擴大培養後，CTL維持高特異性的細胞殺傷活性。另一方面，無論CTL誘導時還是擴大培養時，未添加樣品的組中，其活性明顯降低。另外，對於對於腫瘤細胞抹特異的細胞殺傷活性而言，CTL誘導時和擴大培養時添加透明質酸的組中，即便在14天的擴大培養後，CTL維持高特異性的細胞殺傷活性。這表明抗腫瘤相關抗原(MART1)CTL的擴大培養時，通過在誘導時及擴大培養時添加透明質酸，可在長期保持特異的高效細胞殺傷活性的狀態下進行CTL的擴大培養。實施例8與REM法的比較及與REM法的組合47(1)抗流感病毒記憶性CTL的誘導應用用實施例l-l-(l)中的方法分離、保存的PBMC，用與實施例1-1-(2)同樣的方法進行抗流感病毒記憶性CTL的誘導。此時，添加終濃度1(Vg/ml的透明質酸作樣品。另外，設定不添加樣品的組別作對照。用與實施例l-l-(3)同樣的方法評價如此製備的誘導開始後第4天的CTL的細胞殺傷活性。應用5|ag/ml的實施例l-(2)中描迷的流感病毒蛋白質來源的表位肽作抗原肽。(2)通過抗CD3抗體進行的保持特異性活性的CTL的擴大培養用5HRPMI洗滌實施例8-(1)中製備的CTL後，製備成5x104細胞/ml。另一方面，X線照射(3300R)與實施例l-l-(l)同樣採集的HLA-A24及A2.1非保持allogenicPBMC,用培養基洗滌後，製備成5xio6細胞/ml。將3x104細胞的CTL及4-10x106細胞的allogenicPBMC懸浮到10ml5HRPMI中，再加入終濃度50ng/ml的抗CD3抗體(^乂七^協和)，力口到12.5cm2的培養瓶(Falcon)中，37。C的溼式C02培養箱中培養l4天。此時，設定添加透明質酸樣品(終濃度lOpg/ml)的組，及不添加的組。此間，不用肽進行刺激，培養開始第1天添加終濃度120U/ml的IL-2,再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清，向各培養瓶添加5ml含60U/mlIL-2的5HRPMI。此時，樣品添加組6々培養基中添加終濃度10pg/ml的透明質酸。擴大培養開始後，第14天用與實施例1-1-(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性。測定結果如表12所示。另一方面，如下實施用REM法進行的擴大培養。X線照射(3300R)HLA-A24及A2.1非保持allogenicPBMC,用培養基洗滌後，製備成5x16細胞/ml。另夕卜，X線照射(8000R)EBV-B細胞，用培養基洗滌後，製備成1x106細胞/ml。將實施例8-l-(l)中製備的3x104細胞的CTL及4—10x106細胞的allogenicPBMC即2.5x106細胞的EBV-B細胞懸浮到10ml5HRPMI中，再加入終濃度50ng/ml的抗CD3抗體(\7七>協和)，加到l2.5cm2的培養齊fl(Falcon)中，37。C的溼式C02培養箱中培養M天。此時，設定添加透明質酸樣品(終濃度10|ag/ml)的組，及不添加的組。此間，不用肽進4亍刺激，培養開始第1天添加終濃度120U/ml的IL-2，再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清，向各培養瓶添加5ml含60U/mlIL-2的5HRPMI。此時，樣品添加組的培養基中添加終濃度10)Lig/ml的透明質酸。擴大培養開始後，第14天用與實施例1-1-(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性。測定結果如表12所示。表12tableseeoriginaldocumentpage49結果，未添加透明質酸誘導的CTL(未添加CTL活性維持物)用REM法擴大培養時維持高效細胞殺傷活性。但用不使用EBV-B細胞的方法進行擴大培養時，細胞殺傷活性顯著降低。另一方面，CTL誘導時和擴大培養時兩發明添加透明質酸，即便不添加EBV-B細胞，在14天的擴大培養後可維持相當高的CTL細胞殺傷活性。況且，根據本發明進行擴大培養後，其抗原特異性細胞殺傷活性也比REM法高。另外，用REM法進行擴大培養時，在擴大培養前，從誘導時開始，若添加本發明方法的具有CTL活性維持效果的物質之一-透明質酸，與單獨用REM法擴大培養用以往的技術誘導的CTL相比，可高度維持細胞殺傷活性。總而言之，本發明的CTL的擴大培養方法中，不必要使用REM法中所必需的EBV-B細胞，可避免應用EBV-B細胞的危險性。還可維持比REM法高的CTL活性。由此表明，本發明的CTL的擴大培養方法是比REM法安全的方法。此外，將透明質酸引入REM法可維持高活性，所以透明質酸可能適於所有的CTL細胞的擴大培養方法。也就是說，通過在各種CTL擴大培養方法中利用本發明中使用的物質，可在長期保持特異的高效細胞殺傷活性的狀態下，進行CTL的擴大培養。實施例9纖粘連蛋白片段的製備U)纖粘連蛋白片段的製備按照美國專利第5198423號公報，從大腸桿菌另外，分別用大腸桿菌HB101/pHD102(FERM;P-10721)、大腸桿菌HB101/pCH101(FERMBP-2799)、大腸桿菌HB101/pCH102(FERMBP-2800)，用上述公報中的方法培養，從培養物中製備出纖粘連蛋白來源的片段H-296、CH-271、CH-296。應用大腸桿菌JM109/pTF7221(FERMBP-1915),按照美國專利第5102988號公報中的方法培養，從培養物中製備出纖粘連蛋白來源的片段C-274。應用大腸桿菌HB101/pCS25(FERMBP-5723),按日本專利第310417S號公報中的方法培養，從培養物中製備出纖粘連蛋白來源的片段C-CSl。分另'J應用大腸桿菌HB101/pCHV89(FERMP-12182)、HB101/pCHV179(FERMP-12183)，按曰本專利第2729712號公報中的方法培養，從培養物中製備出纖粘連蛋白來源的片段CHV-89/CHV-179。另外，用上述公報中的方法製備纖粘連蛋白來源的片段CHV-90。50即，按照該公報中的操作構建質粒pCHV90，培養攜帶該質粒的轉化體，從培養物中製備CHV-卯。按WO97/18318的方法構建含有編碼CHV-181的DNA的質粒(pCHV181)後，培養插入了該質粒的大腸桿菌(E.coliHB101/pCHV181)，用與上面CHV-179同樣的方法，從培養物中製備纖粘連蛋白來源的片段CHV-181。(2)CHV-92的製備質粒pCHV181是用於表達上迷多肽CHV-181的，用它構建缺失了編碼CHV-181的區域中編碼111-13的區域的質粒CHV92。缺失體的操作按日本專利第2729712號公報中記載的從質粒pCHV179製備III-14編碼區域的缺失操作進行。培養用上述質粒pCHV92轉化的大腸桿菌HB101(E.coliHB101/pCHV92),按日本專利第2729712號公報中記載的CHV-89多肽的純化方法進行純化，得到純化的CHV-92標本。(3)H-275-Cys的製備按如下操作構建表達多肽H-275-Cys的質粒。即，從大腸桿菌HB101/pCH102(FERMBP-2800)製備質粒pCH102。以該質粒為模板，用序列表的SEQIDNO:4中所示引物鹼基序列US和序列表的SEQIDNO:15中所示引物鹼基序列14A進行PCR，得到約0.8kb的編碼纖粘連蛋白肝素結合多肽的DNA片段。用Ncol、BamHI(均為寶酒造製備)消化所得DNA片段，然後與用Ncol、BamHI消化的pTVU8N(寶酒造)連接，構建質粒pRHl。用BamHI和HincII(寶酒造)消化質粒載體pINm-ompAl[GhrayebJ.等，EMBOJ.,第3巻，第10期，第2437-2442頁(1984)],回收含脂蛋白終止子區域的約0.9kb的DNA片段。將之與用BamHI和HincII消化的上述質粒pRHl混合，進行連接，得到依次含lac啟動子、編碼肝素結合多肽的DNA片段及脂蛋白終止子的質粒pRHl-T。以質粒pRHl-T為模板，用引物Cys-A(序列表的SEQIDNO:16中所示鹼基序列)和引物Cys-S(序列表的SEQIDNO:17中所示鹼基序列)進行PCR後，用NotI(寶酒造)消化回收的擴增片段，再將該片段進行自身連接。用Spel和Scal(寶酒造)消化所得環狀DNA,得到2.3kb的DNA片段，然後將該片段與用Spd和Scal(寶酒造)消化質粒pRHl-T而得的2.5kb的DNA片段混合，進行連接，得到質粒pRH-Cys。該質粒中，H-271的N末端附加了Met-Ala-Ala-Ser4個胺基酸，並且可編碼C末端附加了Cys的多肽(H-275-Cys)。根椐以下方法製備多肽H-2"-Cys。在120mlLB培養基中培養用質粒pRH-Cys轉化的大腸桿菌HB101(E.coliHB101/pRH-Cys)，"。C培養一晚。將從培養液中回收的菌體懸浮到40ml破碎用緩衝液(50mMTris-HCl,ImMEDTA,150mMNaCl,ImMDTT，ImMPMSF，pH7.5)中，進行超聲波處理，破壞菌體。將離心所得上清過用純化用緩衝液(50mMTris-HCl，pH7.5)平衡過的HiTrap-肝素柱(Pharmacia)。用同一緩衝液洗滌柱內的非吸附級分後，用具有0-1MNaCl濃度梯度的純化緩衝液進行洗脫。通過SDS-PAGE分析洗脫液，收集與H-275-Cys分子量相對應的級分，得到純化的H-275-Cys樣品。實施例10應用纖粘連蛋白片段(FNfr)擴大培養具有特異性細胞殺傷活性的CTL(1)抗流感病毒記憶性CTL的誘導應用按實施例1-1-(1)中描述的方法分離、保存的PBMC，用與實施例1-1-(2)同樣的方法進行抗流感病毒記憶性CTL的誘導。此時，添加終濃度為lO^g/ml的實施例9中的各纖粘連蛋白片段(以後記作FNfr)。設定未添加Fnfr的組作對照。用實施例1-1-(3)同樣的方法評價如此製備的誘導開始後第14天的CTL的細胞殺傷活性。結果是，誘導開始後，可誘導出特異性細胞殺傷活性，但誘導時有無添加FNfr，其細胞殺傷活性幾乎無差異。(2)CTL的擴大培養用實施例10-(1)中製備的CTL,用與實施例1-1-(4)同樣的方法，進行CTL的擴大培養。此時，添加誘導CTL時所添加的FNfr,使其終濃度為10pg/ml。另外，不添加FNfr進行誘導的對照組中不添加FNfr。此間，'不用肽進行刺激，培養開始第1天添加終濃度UOU/ml的IL-2，再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清，向各培養瓶添加5ml含60U/mlIL-25HRPMI或含10%HycloneFBS、O.lmM非必須胺基酸、lmM丙酮酸鈉、2mML-穀氨醯胺(均為BioWhittaker)、10mMHEPES(六力"4f只夕)、1%鏈黴素-青黴素(GibcolBRL)的RPMI1640培養基(BioWhittaker)(以下略作10HycloneRPMI)。此時，FNfr添加組的培養基中添加同濃度的FNfr。擴大培養開始後，第14天用與實施例1-1-(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性。以"特異性細胞殺傷活性維持(％)"算出能將擴大培養前的特異性細胞殺傷活性維持到何等程度。按下式2計算特異性細胞殺傷活性維持(％)。測定結果如表13所示。式2:特異性細胞殺傷活性維持(％)={擴大培養後的特異性細胞殺傷活性(％)/擴大培養前的特異性細胞殺傷活性(％)}表13培養基纖粘連蛋白片段擴大增殖率(倍)細胞殺傷活性維持(％)E/T比=35服PMI對照(未添加41717.3FNfr)CH-27139753.5H-29641349.3C-CS139349.3CHV-9237066.210HycloneRPMI對照(未添加13048.1FNfr)CH-271132250.8H-29675162.3H-2715272.2C-CS1130跳2CHV-9235157.853tableseeoriginaldocumentpage54如表13所示，與不添加纖粘連蛋白片段的對照組相比，誘導時及擴大培養時添加各種纖粘連蛋白片段的組中的CTL，在14天的擴大培養後保持有特異的高效細胞殺傷活性。總之，在纖粘連蛋白片段片段的共存下進行誘導、擴大培養，可在長期保持高效細胞殺傷活性的狀態下進行CTL的擴大培養。實施例U纖粘連蛋白存在下進行CTL誘導、擴大培養(1)抗流感病毒記憶性CTL的誘導應用按實施例1-1-(1)中描述的方法分離、保存的PBMC，用與實施例1-1-(2)同樣的方法進行抗流感病毒記憶性CTL的誘導。此時，添加FNfr時添加終濃度為10)tig/ml的纖粘連蛋白(Galbiochem)(對照組未添加)。用實施例1-1-(3)同樣的方法評價如此製備的誘導開始後第14天的CTL的細胞殺傷活性。誘導時有無添加FNfr，其細胞殺傷活性幾乎無差異。(2)CTL的擴大培養用與實施例10-(2)同樣的方法，對實施例11-U)中製備的CTL進行C擴大培養。此時，誘導時添加纖粘連蛋白的添加終濃度為10/ig/ml的纖粘連蛋白(Galbiochem)(對照組未添加)。用與實施例1-1-(3)同樣的方法測定所得CTL的特異性細胞殺傷活性，以"特異性細胞殺傷活性維持(°/。)"算出能將擴大培養前的特異性細胞殺傷活性維持到何等程度。測定結果如表l4所示。表14擴大增殖率(倍)細胞殺傷活性維持(％)E/T比=3對照(未添加FNfr)13048.1纖粘連蛋白157148.9如表14所示，纖粘連蛋白存在下進行CTL誘導及擴大培養的組中，保持高效的細胞殺傷活性。另一方面，CTL誘導時及擴大培養時無論哪種未添加纖粘連蛋白的對照的細胞殺傷活性明顯降低。總之，CTL誘導時及擴大培養時添加纖粘連蛋白，可在長期保持特異的高效細胞殺傷活性的狀態下進行CTL的擴大培養。實施例12固定化的纖粘連蛋白(FN)片段存在下進行的CTL的擴大培養(1)固定化FN片段將纖粘連蛋白片段固定化到以後的實驗中使用的培養器材(容器)上。即，將含各種纖粘連蛋白片段(終濃度lOpg/ml)的PBS添加到24孔培養板、12.5cm2培養瓶中，各1-2ml，室溫孵育2小時後，4。C保存，直到使用。使用前，用PBS將上述培養板、培養瓶洗塗2次。(2)抗流感病毒記憶性CTL的誘導用與實施例l-l-(2)同樣的方法，用按實施例l-l-(l)的方法分離、保存的PBMC,進行抗流感病毒記憶性CTL的誘導。此時，使用固定化了FNfr的培養板作培養器材(對照組中使用未進行固定化處理的培養板)。用實施例l-l-(3)的方法評價誘導後的CTL的細胞殺傷活性，誘導時有無使用固定化了FNfr的培養板對細胞殺傷活性的差異幾乎無影響。(3)CTL的擴大培養用與實施例10-(2)同樣的方法擴大培養實施例12-(2)中製備的CTL。此時，使用固定化了各種FNfr的培養瓶作培養器材(對照組中使用未進行固定化處理的培養瓶)。另外，培養基中應用5510Hyclone/RPMI。以"特異性細胞殺傷活性維持(％)"評價如此擴大培養的CTL的細胞殺傷活性與擴大培養前相比能維持到何等程度。按上式2計算"特異性細胞殺傷活性維持(％)"。測定結果如表15所示。表15纖粘連蛋白片段擴大增殖率(倍)細胞殺傷活性維持(％)E/T比=3對照(FNfr非固定)13048.1CH-27112895.4H-2962795.0H-27140133.9C-CS113073.8H-275-Cys87137.7CHV-9212292.7如表l5所示，CTL誘導時及擴大培養時使用固定化了纖粘連蛋白片段的培養器材(培養板、培養瓶)的組CTL,擴大培養後保持特異的高效細胞殺傷活性。另一方面，CTL誘導時及擴大培養時無論哪個使用未固定化纖粘連蛋白片段的培養器材的對照中，細胞殺傷活性明顯降低。總之，通過使用固定化的纖粘連蛋白片段，可與溶解到培養基中的片段同樣用於長期保持高效細胞殺傷活性的CTL的擴大培養。實施例13維持腫瘤相關抗原特異的細胞殺傷活性的CTL的擴大培養(1)肺瘤相關抗原(MART1)特異的CTL的誘導應用按實施例l-l-(l)中的方法分離、保存的PBMC，用與實施例7-l-(l)同樣的方法進4亍腫瘤相關抗原(melanomaantigenrecognizedbyTcell,MARTI)特異的CTL的誘導。此時，添加終濃度2fxg/ml的抗HGF抗體。另外，設定不添加樣品的組別作對照。用與實施例l-l-(3)同樣的方法評價如此製備的誘導開始後第35天的CTL的細胞殺傷活性。但此時，用與表位肽共培養一晚或在表位肽不存在的條件下培養的HLA-A2.1EBV轉染的B細胞(細胞名221A2.1)、100U/mlIFN-Y存在下培養兩晚的HLA-A2.1癌細胞林(細胞名624mel，保持HLA-A2.1的MARTI表達細胞)或HLA-A2.1非保持細胞抹(細胞名938mel,不保持HLA-A2.1的MARTI表達細胞)作為靶細胞。結果，誘導之後可誘導出特異性細胞殺傷活性，但誘導時有無添加樣品其細胞殺傷活性幾乎無差異。(2)CTL的擴大培養用實施例13-(1)中製備的CTL,用與實施例1-1-(4)同樣的方法，進行CTL的擴大培養。此時，設定添加實施例13-(1)中誘導CTL時添加的2|ug/ml抗HGF抗體的組別，和從誘導時開始不添加樣品的組別。此間，不用肽進行刺激，培養開始第l天添加終濃度120U/ml的IL-2,再開始培養後第4天以後每2-3天半量去除培養上清，向各培養瓶添加5ml含60U/mlIL-2及2pg/ml抗HGF抗體的5HRPMI。但，未添加抗體的組中，換培養基時不添加樣品。擴大培養開始後，第14天用與實施例1-1-(3)同樣的方法測定CTL的特異性細胞殺傷活性。測定結果如表16所示。表16tableseeoriginaldocumentpage57tableseeoriginaldocumentpage58*:+:添加樣品；-:未添加樣品f+:附加肽；-:未附加肽結果，CTL誘導時和擴大培養時添加抗HGF抗體的組中，即便在14天的擴大培養後，CTL維持高特異性的細胞殺傷活性。另一方面，無論CTL誘導時還是擴大培養時，未添加樣品的組中，其活性明顯降低。另外，對於對於腫瘤細胞林特異的細胞殺傷活性而言，CTL誘導時和擴大培養時添加抗HGF抗體的組中，即便在14天的擴大培養後，CTL維持高特異性的細胞殺傷活性。這表明抗腫瘤相關抗原(MARTI)CTL的擴大培養時，通過在誘導時及擴大培養時添加抗HGF抗體，可在長期保持特異的高效細胞殺傷活性的狀態下進行CTL的擴大培養。序列表說明SEQIDNO:1是命名為C-274的人纖粘連蛋白來源的肽片斷的胺基酸序列。SEQIDNO:3是命名為H-271的人纖粘連蛋白來源的肽片斷的胺基酸序列。SEQIDNO:4是命名為H-296的人纖粘連蛋白來源的肽片斷的胺基酸序列。SEQIDNO:5是命名為CH-271的人纖粘連蛋白來源的肽片斷的胺基酸序列。SEQIDNO:6是命名為CH-296的人纖粘連蛋白來源的肽片斷的胺基酸序列。SEQIDNO:7是命名為C-CS1的人纖粘連蛋白來源的肽片斷的胺基酸序列。SEQIDNO:8是命名為CHV-89的人纖粘連蛋白來源的肽片斷抗HGF抗體的胺基酸序列。SEQIDNO:9是命名為CHV-%的人纖粘連蛋白來源的肽片斷的胺基酸序列。SEQIDNO:10是命名為CHV-92的人纖粘連蛋白來源的肽片斷的胺基酸序列。SEQIDNO:11是命名為CHV-179的人纖粘連蛋白來源的肽片斷的胺基酸序列。SEQIDNO:12是命名為CHV-181的人纖粘連蛋白來源的肽片斷的胺基酸序列。SEQIDNO:13是命名為H-275-Cys的人纖粘連蛋白來源的肽片斷的胺基酸序列。SEQIDNO:14是引物12S的鹼基序列。SEQIDNO:15是引物14A的鹼基序列。SEQIDNO:16是引物Cys-A的鹼基序列。SEQIDNO:17是引物Cys-S的鹼基序列。SEQIDNO:18是以流感病毒的基質(matrix)蛋白來源的HLA-A2.1結合性肽為基礎設計的肽的胺基酸序列。SEQIDNO:19是以黑色素瘤抗原MAGE3來源的HLA-A2.1結合性肽為基礎設計的肽的胺基酸序列。SEQIDNO:20是以黑色素瘤抗原MARTI來源的HLA-A2.1結合性肽為基礎設計的肽的胺基酸序列。產業上利用的可能性本發明提供CTL的誘導方法、維持方法和擴大培養方法，它能在維持和/或擴大培養時保持高活性的抗原特異性細胞殺傷活性。該方法在有必要使用大量CTL的過繼性免疫療法等細胞醫療領域內極其有用。另外，由於根據本發明的方法而製備的CTL是用安全的方法製備的，所以是安全性極高的細胞醫藥。序列表TAKARABIOINC.抗原特異性細胞毒性T細胞的擴大培養方法<130〉02-050-PCT<150〉JP200卜2467472001-08-15<150〉JP2001-3769662001-12-11〈150〉JP2002-0844282002-03-2520PatentlnVer.2.1<210〉1<211〉274PRT人工序列人工序列的描述命名為C-274的纖粘連蛋白片段<400〉1ProThrAspLeuArgPheThr15ThrTrpAlaProProProSer20TyrSerProValLysAsnGlu35ProSerAspAsnAlaValVal5055TyrValValSerValSerSer6570LeuArgGlyArgGinLysThr85PheSerAsplieThrAlaAsn100AsnlieGlyProAspThrMetArgVal1015lieAspLeuThrAsnPheLeuValArg2530GluAspValAlaGluLeuSerlieSer4045LeuThrAsnLeuLeuProGlyThrGlu60ValTyrGluGinHisGluSerThrPro7580GlyLeuAspSerProThrGlylieAsp9095SerPheThrValHisTrplieAlaPro105110ArgAlaThrlieThrGlyTyrArglieArgHisHisProGluHisPhe115120125SerGlyArgProArgGluAspArgValProHisSerArgAsnSerlie130135140ThrLeuThrAsnLeuThrProGlyThrGluTyrValValSerlieVal145150155160AlaLeuAsnGlyArgGluGluSerProLeuLeulieGlyGinGinSer165170175ThrValSerAspValProArgAspLeuGluValValAlaAlaThrPro180185190ThrSerLeuLeulieSerTrpAspAlaProAlaValThrValArgTyr195200205TyrArglieThrTyrGlyGluThrGlyGlyAsnSerProValGinGlu210215220PheThrValProGlySerLysSerThrAlaThrlieSerGlyLeuLys225230235.240ProGlyValAspTyrThrlieThrValTyrAlaValThrGlyArgGly245250255AspSerProAlaSerSerLysProlieSerlieAsnTyrArgThrGlu260265270lieAsp<210〉2〈211〉25<212〉PRT<213〉Homosapiens3271<212〉PRT人工序列<220〉人工序列的描述命名為H-271的纖粘連蛋白片段3AlalieProAlaProThrAspLeu15SerLeuSerAlaGinTrpThrPro20ArgValArgValThrProLysGlu3540AsnLeuAlaProAspSerSerSer5055AlaThrLysTyrGluValSerVal6570SerArgProAlaGinGlyValVal85ProArgArgAlaArgValThr100SerTrpArgThrLysThrGluThr115120ValProAlaAsnGlyGinThrPro130135ValArgSerTyrThrlieThrGly145150lieTyrLeuTyrThrLeuAsnAsp165lieAspAlaSerThrAlalieAspLysPheThrGinValThrProThr1015ProAsnValGinLeuThrGlyTyr2530LysThrGlyProMetLysGlulie45ValValValSerGlyLeuMetVal60TyrAlaLeuLysAspThrLeuThr7580ThrThrLeuGluAsnValSerPro9095GluThrThrlieThrlie110lieThrGlyPheGinValAspAla125lieGinArg'ThrlieLysProAsp140LeuGinProGlyThrAspTyrLys155160AsnAlaArgSerSerProValVal170175AlaProSerAsnLeuArgPheLeuAspAlaThr105180185190AlaThrThrProAsnSerLeuLeuValSerTrpGinProProArgAla195200205ArglieThrGlyTyrlielieLysTyrGluLysProGlySerProPro210215220ArgGluValValProArgProArgProGlyValThrGluAlaThrlie225230235240ThrGlyLeuGluProGlyThrGluTyrThrlieTyrVallieAlaLeu24525025562LysAsnAsnGinLysSerGluProLeulieGlyArgLysLysThr2602652704296PRT人工序列〈223〉人工序列的描述命名為H-296的纖粘連蛋白片段<400〉4AlalieProAlaProThrAspLeuLysPheThrGinValThrProThr151015SerLeuSerAlaGinTrpThrProProAsnValGinLeuThrGlyTyr202530ArgValArgValThrProLysGluLysThrGlyProMetLysGlulie354045AsnLeuAlaProAspSerSerSerValValValSerGlyLeuMetVal505560AlaThrLysTyrGluValSerValTyrAlaLeuLysAspThrLeuThr65707580SerArgProAlaGinGlyValVal85ProArgArgAlaArgValThrAsp100SerTrpArgThrLysThrGluThr115120ValProAlaAsnGlyGinThrPro130135ThrThrLeuGluAsnValSerPro9095AlaThrGluThrThrlieThrlie105110lieThrGlyPheGinValAspAla125lieGinArgThrlieLysProAsp140ValArgSerTyrThrlieThrGlyLeuGinProGlyThrAspTyrLys145150155160lieTyrLeuTyrThrLeuAsnAspAsnAlaArgSerSerProValVal165170175lieAspAlaSerThrAlalieAspAlaProSerAsnLeuArgPheLeu180185190AlaThrThrProAsnSerCeuLeuValSerTrpGinProProArgAla195200205ArglieThrGlyTyrlielieLysTyrGluLysProGlySerProPro210215220ArgGluValValProArgProArgProGlyValThrGluAlaThrlie225230235240ThrGlyLeuGluProGlyThrGluTyrThrlieTyrVallieAlaLeu245250255LysAsnAsnGinLysSerGluProLeulieGlyArgLysLysThrAsp260265270GluLeuProGinLeuValThrLeuProHisProAsnLeuHisGlyPro275280285GlulieLeuAspValProSerThr290295<213〉5549PRT人工序列人:]::::序列的描述命名為ch-271的纖粘連蛋白片段5ProThrAspLeuArgPheThrAsnlieGlyProAspThrMetArgVal151015ThrTrpAlaProProProSerlieAspLeuThrAsnPheLeuValArg202530TyrSerProValLysAsnGluGluAspValAlaGluLeuSerlieSer354045ProSerAspAsnAlaValValLeuThrAsnLeuLeuProGlyThrGlu505560TyrValValSerValSerSerValTyrGluGinHisGluSerThrPro65707580LeuArgGlyArgGinLysThrGlyLeuAspSerProThrGlylieAsp859095PheSerAsplieThrAlaAsnSerPheArgAlaThrlieThrGlyTyrArglieArgHisHisProGluHisPhe115120125SerGlyArgProArgGluAspArgValProHisSerArgAsnSerlie130135140ThrLeuThrAsnLeuThrProGlyThrGluTyrValValSerlieVal145150155160AlaLeuAsnGlyArgGluGluSerProLeuLeulieGlyGinGinSer165170175ThrValSerAspValProArgAspLeuGluValValAlaAlaThrPro180185190ThrSerLeuLeulieSerTrpAspAlaProAlaValThrValArgTyr195200205TyrArglieThrTyrGlyGluThrGlyGlyAsnSerProValGinGlu210215220PheThrValProGlySerLysSerThrAlaThrlieSerGlyLeuLys225230235240ProGlyValAspTyrThrlieThrValTyrAlaValThrGlyArgGly245250255AspSerProAlaSerSerLysProlieSerlieAsnTyrArgThrGlu260265270lieAspLysProSerMetAlalieProAlaProThrAspLeuLysPhe275280285ThrGinValThrProThrSerLeuSerAlaGinTrpThrProProAsn290295300ValGinLeuThrGlyTyrArgValArgValThrProLysGluLysThr305310315320GlyProMetLysGlulieAsnLeuAlaProAspSerSerSerValVal325330335ValSerGlyLeuMetValAlaThrLysTyrGluValSerValTyrAla340345350LeuLysAspThrLeuThrSerArgProAlaGinGlyValValThrThr355360365LeuGluAsnValSerProProArgArgAlaArgValThrAspAlaThr370375380GluThrThrlieThrlieSerTrpArgThrLysThrGluThrlieThr385390395400GlyPheGinValAspAlaValProAlaAsnGlyGinThrProlieGin405410415ArgThrlieLysProAspValArgSerTyrThrlieThrGlyLeuGin420425430ProGlyThrAspTyrLyslieTyrLeuTyrThrLeuAsnAspAsnAla435440445ArgSerSerProValVallieAspAlaSerThrAlalieAspAlaPro450455460SerAsnLeuArgPheLeuAlaThrThrProAsnSerLeuLeuValSer465470475480TrpGinProProArgAlaArglieThrGlyTyrlielieLysTyrGlu485490495LysProGlySerProProArgGluValValProArgProArgProGly500505510ValThrGluAlaThrlieThrGlyLeuGluProGlyThrGluTyrThr515520525lieTyrVallieAlaLeuLysAsnAsnGinLysSerGluProLeulie530535540GlyArgLysLysThr545<210〉6<211〉574PRT〈213〉人工序列〈223〉人工序列的描述命名為CH-296的纖粘連蛋白片段<400〉6ProThrAspLeuArgPheThrAsnlieGlyProAspThrMetArgVal151015ThrTrpAlaProProProSerlieAspLeuThrAsnPheLeuValArg202530TyrSerProValLysAsnGluGluAspValAlaGluLeuSerlieSer354045ProSerAspAsnAlaValValUuThrAsnUuLeuProGlyThrGlu505560TyrValValSerValSerSerValTyrGluGinHisGluSerThrPro65707580LeuArgGlyArgGinLysThrGlyLeuAspSerProThrGlylieAsp859095PheSerAsplieThrAlaAsnSerPheThrValHisTrplieAlaPro100105110ArgAlaThrlieThrGlyTyrArglieArgHisHisProGluHisPhe115120125SerGlyArgProArgGluAspArgValProHisSerArgAsnSerlie130135140ThrLeuThrAsnLeuThrProGlyThrGluTyrValValSerlieVal145150155160AlaLeuAsnGlyArgGluGluSerProLeuLeulieGlyGinGinSer165170175ThrValSerAspValProArgAspLeuGluValValAlaAlaThrPro180185190ThrSerLeuLeulieSerTrpAspAlaProAlaValThrValArgTyr195200205TyrArglieThrTyrGlyGluThrGlyGlyAsnSerProValGinGlu210215220PheThrValProGlySerLysSerThrAlaThrlieSerGlyLeuLys225230235240ProGlyValAspTyrThrlieThrValTyrAlaValThrGlyArgGly245250255AspSerProAlaSerSerLysProlieSerlieAsnTyrArgThrGlu260265270lieAspLysProSerMetAlalieProAlaProThrAspLeuLysPhe275280285ThrGinValThrProThrSerLeuSerAlaGinTrpThrProProAsn290295300ValGinLeuThrGlyTyrArgValArgValThrProLysGluLysThr305310315320GlyProMetLysGlulieAsnLeuAlaProAspSerSerSerValVal325330335ValSerGlyLeuMetValAlaThrLysTyrGluValSerValTyrAla340345350LeuLysAspThrLeuThrSerArgProAlaGinGlyValValThrThr355360365LeuGluAsnValSerProProArgArgAlaArgValThrAspAlaThr370375380GluThrThrlieThrlieSerTrpArgThrLysThrGluThrlieThr385390395400GlyPheGinValAspAlaValProAlaAsnGlyGinThrProlieGin405410415ArgThrlieLysProAspValArgSerTyrThrlieThrGlyLeuGin420425430ProGlyThrAspTyrLyslieTyrLeuTyrThrLeuAsnAspAsnAla435440445ArgSerSerProValVallieAspAlaSerThrAlalieAspAlaPro450455460SerAsnLeuArgPheLeuAlaThrThrProAsnSerLeuLeuValSer465470475480TrpGinProProArgAlaArglieThrGlyTyrlielieLysTyrGlu485490495LysProGlySerProProArgGluValValProArgProArgProGly500505510ValThrGluAlaThrlieThrGlyLeuGluProGlyThrGluTyrThr515520525lieTyrVallieAlaLeuLysAsnAsnGinLysSerGluProLeulie530535540GlyArgLysLysThrAspGluLeuProGinLeuValThrLeuProHis545550555560ProAsnLeuHisGlyProGlulieLeuAspValProSerThr565570<210〉768302PRT人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述命名為C-CS1的纖粘連蛋白片段7ProThrAspLeuArgPheThrAsn15ThrTrpAlaProProProSerlie20TyrSerProValLysAsnGluGlu3540ProSerAspAsnAlaValValLeu5055TyrValValSerValSerSerVal6570LeuArgGlyArg.GinLysThrGly85PheSerAsplieThrAlaAsnSer100ArgAlaThrlieThrGlyTyr115SerGlyArgProArgGluAsp130135ThrLeuThrAsnLeuThrPro145150AlaLeuAsnGlyArgGluGlu165ThrValSerAspValProArg180ThrSerLeuLeulieSerTrp195TyrArglieThrTyrGlyGluThr210215PheThrValProGlySerLysSerlieGlyProAspThrMetArgVal1015AspLeuThrAsnPheLeuValArg2530AspValAlaGluLeuSerlieSer45ThrAsnLeuLeuProGlyThrGlu60TyrGluGinHisGluSerThrPro7580LeuAspSerProThrGlylieAsp9095PheThrValHisTrplieAlaPro105110ArgHisHisProGluHisPhe125ProHisSerArgAsnSerlie140GluTyrValValSerlieVal155160LeuLeulieGlyGinGinSer170175GluValValAlaAlaThrPro190ProAlaValThrValArgTyr205GlyGlyAsnSerProValGinGlu220ThrAlaThrlieSerGlyLeuLysArglie120ArgValGlyThrSerProAspLeu185AspAla200225230235240ProGlyValAspTyrThrlieThrValTyrAlaValThrGlyArgGly245250255AspSerProAlaSerSerLysProlieSerlieAsnTyrArgThrGlu260265270lieAspLysProSerAspGluLeuProGinLeuValThrLeuProHis275280285ProAsnLeuHisGlyProGlulieLeuAspValProSerThr2902953008367PRT人工序列<223〉人工序列的描述命名為CHV-89的纖粘連蛋白片段<400〉8ProThrAspLeuArgPheThrAsnlieGlyProAspThrMetArgVal151015ThrTrpAlaProProProSerlieAspLeuThrAsnPheLeuValArg202530TyrSerProValLysAsnGluGluAspValAlaGluLeuSerlieSer354045ProSerAspAsnAlaValValLeuThrAsnLeuLeuProGlyThrGlu505560TyrValValSerValSerSerValTyrGluGinHisGluSerThrPro65707580LeuArgGlyArgGinLysThrGlyLeuAspSerProThrGlylieAsp859095PheSerAsplieThrAlaAsnSerPheThrValHisTrplieAlaPro100105110ArgAlaThrlieThrGlyTyrArglieArgHisHisProGluHisPhe115120125SerGlyArgProArgGluAspArgValProHisSerArgAsnSerlie130135140ThrLeuThrAsnLeuThrProGlyThrGluTyrValValSerlieVal145150155160AlaUuAsnGlyArgGluGluSerProLeuLeulieGlyGinGinSer165170175ThrValSerAspValProArgAspLeuGluValValAlaAlaThrPro180185190ThrSerLeuLeulieSerTrpAspAlaProAlaValThrValArg'Tyr195200205TyrArg'lieThrTyrGlyGluThrGlyGlyAsnSerProValGinGlu210215220PheThrValProGlySerLysSerThrAla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eThrlieSerTrpArgThrLysThrGluThrlieThr385390395400GlyPheGinValAspAlaValProAlaAsnGlyGinThrProlieGin405410415ArgThrlieLysProAspValArgSerTyrThrlieThrGlyUuGin420425430ProGlyThrAspTyrLyslieTyrLeuTyrThrLeuAsnAspAsnAla435440445ArgSerSerProValVallieAspAlaSerThrAlalieAspAlaPro450455460SerAsnLeuArgPheLeuAlaThr465470<210〉13<211〉276PRT人工序列〈223〉人工序列的描述命名為H-275-Cys的纖粘連蛋白片段13MetAlaAlaSerAlalieProAlaProThrAspLeuLysPheThrGin151015ValThrProThrSerLeuSerAlaGinTrpThrProProAsnValGin202530LeuThrGlyTyrArgValArgValThrProLysGluLysThrGlyPro354045MetLysGlulieAsnLeuAlaProAspSerSerSerValValValSer505560GlyLeuMetValAlaThrLysTyrGluValSerValTyrAlaLeuLys65707580AspThrLeuThrSerArgProAlaGinGlyValValThrThrLeuGlu859095AsnValSerProProArgArgAlaArgValThrAspAlaThrGluThr100105110ThrlieThrlieSerTrpArgThrLysThrGluThrlieThrGlyPhe115120125GinValAspAlaValProAlaAsnGlyGinThrProlieGinArgThr130135140lieLysProAspValArgSerTyrThrlieThrGlyLeuGinProGly145150155160ThrAspTyrLyslieTyrLeuTyrThrLeuAsnAspAsnAlaArgSer165170175SerProValVallieAspAlaSerThrAlalieAspAlaProSerAsn180185190LeuArgPheLeuAlaThrThrProAsnSerLeuLeuValSerTrpGin195200205ProProArgAlaArglieThrGlyTyrlielieLysTyrGluLysPro210215220GlySerProProArgGluValValProArgProArgProGlyValThr225230235240GluAlaThrlieThrGlyLeuGluProGlyThrGluTyrThrlieTyr245250255VallieAlaLeuLysAsnAsnGinLysSerGluProLeulieGlyArg260265270LysLysThrCys275〈210〉14〈211〉38DNA人工序列<220〉人工序列的描述引物12S14aaaccatggcagctagcgctattcctgcaccaactgac38<210〉1536<212〉DNA<213〉人工序列<220〉人工序列的描述引物14A<400〉15aaaggatccctaactagtctttttccttccaatcag3616<211〉40DNA人工序列人工序列的描述引物Cys-A16aaaagcggccgctagcgcaagccatggtctgtttcctgtg40〈210〉1741DNA人工序列<220〉<223〉人工序列的描述引物Cys-S17aaaagcggccgcactagtgcatagggatccggctgagcaac41189<212〉PRT人工序列的描述基於來源於流感病毒的基質蛋白而設計的肽18GlylieLeuGlyPheValPheThrLeu15<210〉199<212〉PRT人工序列<220〉人工序列的描述基於來源於黑色素瘤抗原MAGE3的HLA2.1結合性肽而設計的肽<400〉19PheLeuTrpGlyProArgAlaLeuVal1520〈211〉9PRT人工序列人工序列的描述基於來源於黑色素瘤抗原MART1的HLA2.1結合性肽而設計的肽20AlaAlaGlylieGlylieLeuThrVal158權利要求1.一種誘導具有抗原特異性細胞殺傷活性的細胞毒性T細胞的方法，其特徵在於，該方法包括在選自下面(A)和(B)的至少一種物質存在下，將具有細胞毒性T細胞分化能力的前體細胞與抗原呈遞細胞一起培養的步驟(A)抗CD44抗體或透明質酸；和(B)抗生長因子抗體。2.權利要求1的方法，其中生長因子為選自肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1和胰島素樣生長因子-2的至少一種生長因子。3.—種維持具有抗原特異性細胞殺傷活性的細胞毒性T細胞的方法，其特徵在於，該方法包括在選自權利要求1中(A)和(B)的至少一種物質存在下，連續培養細胞毒性T細胞的步驟。4.權利要求3的方法，其中生長因子為選自肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1和胰島素樣生長因子-2的至少一種生長因子。5.—種擴大培養具有抗原特異性細胞殺傷活性的細胞毒性T細胞的方法，其特徵在於，該方法包括在選自權利要求1中(A)和(B)的至少一種物質存在下培養細胞毒性T細胞的步驟。6.權利要求5的方法，其中在所述步驟中細胞毒性T細胞還在抗CD3抗體的存在下培養。7.權利要求5或6的方法，其中在所述步驟中細胞毒性T細胞與詞養細胞一起培養。8.權利要求7的方法，其中飼養細胞為非病毒感染細胞。9.權利要求5-8中任一項的方法，其中生長因子為選自肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1和胰島素樣生長因子-2的至少一種生長因子。10.—種細胞毒性T細胞的回收方法，它包括從用權利要求l-9中任一項的方法所得的含細胞毒性T細胞的培養物中，選擇富含具有抗原特異性細胞殺傷活性的細胞毒性T細胞的細胞群的步驟。11.用權利要求l-IO中任一項的方法製備的具有抗原特異性細胞殺傷活性的細胞毒性T細胞。12.—種治療劑，其特徵在於，它含有權利要求11的細胞毒性T細胞作為有效成分。全文摘要本發明提供誘導具有抗原特異性細胞殺傷活性的細胞毒性T細胞的方法，維持該細胞的方法，連續培養該細胞的方法，擴大培養該細胞的方法，所述方法包括在選自(A)-(E)的至少一種物質存在下培養細胞毒性T細胞的步驟(A)具有CD44結合活性的物質；(B)能調控由CD44配體與CD44結合而激發的信號的物質；(C)能抑制生長因子與生長因子受體結合的物質；(D)能調控由生長因子與生長因子受體結合而激發的信號的物質；(E)纖粘連蛋白、其片斷或它們的混合物。文檔編號C12N5/02GK101633907SQ200910203518公開日2010年1月27日申請日期2002年8月15日優先權日2001年8月15日發明者佐川裕章,出野美津子,加藤鬱之進申請人:寶生物工程株式會社