一種梯度膠及其製備方法
2023-07-08 18:38:56 2
一種梯度膠及其製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種梯度膠及其製備方法，該梯度膠為SDS-PAGE梯度膠，由輕液和重液組成，輕液和重液均由以下成分(以體積百分比計)組成：凝膠緩衝液(3.5×)：20-35％；A液：15-70％，雙蒸水：0-60％，甘油：0-15％，AP：0.15-0.40％，TEMED：0.015-0.04％，且輕液和重液組成成分及含量不同，通過膠液配製、灌膠、清洗、聚合、拆膠、修整和封裝製成。本發明製成的梯度膠外觀較好，解析度高，對樣品分子組成的分析更為細緻，獲得更清晰的樣品分子區帶且穩定性好，無論是在電場繼續作用下，還是存放一定時間後，各區帶之間相對位置基本不變。
【專利說明】一種梯度膠及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種凝膠及其製備方法，尤其涉及一種梯度膠及其製備方法。
[0002]本申請中下列定義是指:
[0003]輕液:梯度膠中濃度較低的膠液；
[0004]重液:梯度膠中濃度較高的膠液；
[0005]凝膠緩衝液(3.5X):是指將配製的凝膠緩衝液標準液稀釋3.5倍製得，本發明中其它類似表示意義均相同。
【背景技術】
[0006]隨著泳動距離的增加，單一濃度的凝膠在一些情況下難以發揮較好的作用，無法檢測、分離全部樣品分子。因此，目前梯度膠已廣泛取代了單一濃度的凝膠。樣品分子在這種梯度膠中泳動時，起初由於樣品分子在孔徑比它大的凝膠區域中泳動，各種大小不同的樣品分子以各自不同的泳動率在電場中運動；但後來，當樣品分子達到凝膠孔徑小於樣品分子大小的區域中時，樣品分子就被凝膠孔限所阻，不同大小的樣品分子之間形成穩定的區帶，因此，梯度膠對樣品分子組成的分析更為細緻，獲得更清晰的樣品分子區帶，即使電場在繼續作用時，各區帶之間也保持相對位置不變。因此，梯度膠不僅能進一步提高凝膠電泳的解析度，還能在同一凝膠板中同時分離，分析大小相差很大的樣品分子。同時，由於這種梯度膠系統中，凝膠的孔徑大小成相應的梯度，用這種方法樣品分子遷移後也不易再擴散，是一種較好的分析方法。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是針對現有技術中存在的上述問題，提出了一種外觀、解析度、重複性和穩定性好的梯度膠。
[0008]本發明的目的可通過下列技術方案來實現:一種梯度膠，所述梯度膠為SDS-PAGE梯度膠，所述SDS-PAGE梯度膠由輕液和重液組成，所述輕液和重液均由以下成分(以體積百分比計)組成:凝膠緩衝液(3.5X):20-35%汸液:15-70%，雙蒸水:0-60%，甘油:0-15%, AP:0.15-0.40%, TEMED:0.015-0.04%，且所述輕液和重液組成成分及含量不同。
[0009]在上述的一種梯度膠中，所述凝膠緩衝液是通過將262gBis_Tris溶於去礦物質水配製成IL的標準液，pH為6.2-6.6。
[0010]在上述的一種梯度膠中，所述A液為30%的Acr-BiS水溶液，其中Acr與Bis的質量比為19:1。
[0011]在上述的一種梯度膠中，所述梯度膠為4% -20% SDS-PAGE梯度膠。
[0012]在上述的一種梯度膠中，所述4% -20% SDS-PAGE梯度膠的輕液由以下成分組成:凝膠緩衝液(3.5X):23mL ;A 液:14mL，雙蒸水:43mL, AP:300 μ L，TEMED:30 μ L ;重液由以下成分組成:凝膠緩衝液(3.5Χ):20mL ；A 液:46mL,甘油:4mL, AP:200 μ L，TEMED:20 μ L。
[0013]在上述的一種梯度膠中，所述梯度膠為8% -16% SDS-PAGE梯度膠。
[0014]在上述的一種梯度膠中，所述8% -16% SDS-PAGE梯度膠的輕液由以下成分組成:凝膠緩衝液(3.5X):20mL ;A 液:15mL，雙蒸水:39mL, AP:135 μ L，TEMED:13 μ L ;重液由以下成分組成:凝膠緩衝液(3.5Χ):20mL ；A液:30mL，雙蒸水:7.5mL，甘油:7.5mL, AP:135 μ L，TEMED:13μ L。
[0015]本發明另一個目的在於提供上述梯度膠的製備方法，所述製備方法主要包括膠液配製、灌膠、清洗、聚合、拆膠、修整和封裝；
[0016]其中，所述膠液配製是按上述配方配製梯度膠的輕液和重液，其中，TEMED和AP在灌膠前加入，且添加順序依次為TEMED、AP ；
[0017]所述灌膠的具體過程為:將配製好的梯度膠的輕液、重液置於梯度混合儀的相應容器內，同時打開磁力攪拌器進行攪拌，然後排除灌膠管內氣體後當重液和輕液的高度一致時，打開梯度混合儀中間的閥門進行灌膠，液體達到灌膠槽頂部後停止灌膠。
[0018]本發明梯度膠的製備過程中，灌膠前還要進行拼裝夾具等準備工作，將膠夾表面的碎屑清理乾淨，扣緊卡扣，然後將梳子插好，梳子的光滑面朝向板子背面。然後將拼裝好的夾具以數個為單位放入灌膠槽，保證有孔道標記的一面(背面)靠近灌膠槽的背面，且所有的膠夾保持同一方向，防止取膠時損壞膠孔。如留有空隙用擋板填充，安裝灌膠閥門，確保連接處不漏液，然後加水檢測確保灌膠槽不漏液，然後用清水清洗梯度混合儀，保證儀器通暢。
[0019]本發明膠液是由丙烯醯胺聚合形成的高分子，而聚合反應是通過自由基聚合，因此就需要自由基，而本發明加入的AP就是作為引發劑產生自由基，TEMED則是催化AP產生自由基，從而加速丙烯醯胺凝膠的聚合。因此，在膠液配置過程中，TEMED和AP必須在灌膠前才加入膠液中，而且必須嚴格按照先添加TEMED而後添加AP的順序，以保證聚合效果。
[0020]本發明在灌膠過程中，先使膠液流出3-5滴後再將灌膠管接在灌膠槽閥上，以排除灌膠管內的氣體，防止將氣泡引入膠內。當重液和輕液的高度達到一致時，打開梯度混合儀中間的閥門進行灌膠，閥門一般控制在55-65度傾斜，當液體達到頂部後關閉，停止灌膠。在灌膠後採用清水清洗儀器，避免管道堵塞。
[0021]灌膠完成後保證2_3h的聚合時間，聚合時不能移動灌膠槽，以免在膠未聚合前由於移動而影響所形成的梯度。聚合結束後將膠拆下並用清水衝洗乾淨。然後對膠進行修整，修整前首先進行目測，檢查膠體是否有明顯缺陷，包括:①、檢查膠內是否含有氣泡，若有氣泡要把氣泡趕走、檢查膠體表面是否有條紋現象(有條紋現象則屬於次品)、檢查膠體下邊緣是否完整且平整、檢查膠板卡口是否乾淨(若不乾淨則用水衝洗乾淨)、檢查膠孔是否在一直線上。膠體都符合要求後，才開始拔梳齒，且在拔梳齒時保證均勻用力，不能拔斷，拔出後把氣泡趕乾淨，同時檢查膠柱是否完整豎直，切掉突出的膠柱部分，然後進行封裝。
[0022]在上述的一種梯度膠的製備方法中，所述封裝是將修整後的梯度膠進行真空封裝後置於4-8°C進行保存，且封裝時加入300-500 μ L儲存緩衝液。
[0023]在上述的一種梯度膠的製備方法中，所述儲存緩衝液由以下成分(以體積百分比計)組成:凝膠緩衝液(3.5Χ):20-35% ;甘油:l-8%，100mmol/L 的 EDTA:0.1_5%，餘量為去礦物質水。
[0024]與現有技術相比，本發明具有以下幾個優點:
[0025]1.本發明梯度膠外觀較好，表面無殘膠，膠柱無傾斜並且所有膠柱的頂端和膠孔的底端都分別在同一水平線上，膠體表面無條紋，膠體底部無缺損。
[0026]2.本發明梯度膠解析度高，對樣品分子組成的分析更為細緻，獲得更清晰的樣品分子區帶。
[0027]3.本發明梯度膠穩定性好，無論是在電場繼續作用下，還是存放一定時間後，各區帶之間相對位置基本不變。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1為本發明實施例1和2製備得到的梯度膠和對比例的單一濃度的凝膠的電泳檢測結果示意圖。
【具體實施方式】
[0029]以下是本發明的具體實施例，並結合【專利附圖】
【附圖說明】對本發明的技術方案作進一步的描述，但本發明並不限於這些實施例。
[0030]實施例1:
[0031]首先，配製4% -20% SDS-PAGE梯度膠的輕液和重液，其中，梯度膠的輕液由以下成分組成:凝膠緩衝液(3.5X):23mL 汸液:14mL，雙蒸水:43mL，AP:300 μ L,TEMED:30μ L ；重液由以下成分組成:凝膠緩衝液(3.5 X):20mL ；A液:46mL，甘油:4mL，AP:200 μ L，TEMED:20 μ L。原料中的凝膠緩衝液是通過將262g Bis-Tris溶於去礦物質水配製成IL的標準液，pH為6.4 ;A液為30%的Acr-Bis水溶液，Acr與Bis的質量比為19:1。按以上配方配製4^-20% SDS-PAGE梯度膠的輕液和重液，而TEMED和AP在各液體加完後在灌膠前加入,且添加順序依次為TEMED、AP。
[0032]在配製膠液的同時，進行膠夾的拼接，將膠夾表面碎屑清理乾淨，扣緊各卡扣，然後將梳子插好，梳子的光滑面朝向板子背面。拼裝好的膠夾以12個為單位放入灌膠槽，保證有孔道標記的一面(背面)靠近灌膠槽的背面，且所有的膠夾保持同一方向，防止取膠時損壞膠孔。如留有空隙用擋板填充，安裝灌膠閥門，確保連接處不漏液。然後擰緊膠槽各螺絲，以防漏液。最後加水檢測確保灌膠槽不漏液後，打開恆流泵，將流速調整到最大，用水清洗梯度混合儀，確保儀器暢通後，關閉恆流泵。
[0033]然後將配製好的膠液按輕液，重液分別置於梯度混合儀相應容器內(此時混合儀由重液流向輕液的閥門保持關閉)，同時打開磁力攪拌器，攪拌速度為使指針指向6的位置。然後將恆流泵流速調至3.0,打開恆流泵，使膠液流出3?5滴再將灌膠管接在灌膠槽的閥上，以排除灌膠管內的氣體，防止將氣泡引入膠內。當重液和輕液的高度達到一致時，打開梯度混合儀中間的閥門，閥門一般控制在60度傾斜，當灌膠槽的液體到達頂部先關閉恆流泵再關閉灌膠槽閥門，停止灌膠。灌好膠後要用清水清洗恆流泵和梯度混合儀，避免管道堵塞。
[0034]灌膠完成後聚合2h，聚合時不能移動灌膠槽，以免在膠未聚合前由於移動而影響所形成的梯度。聚合結束後將膠拆下並用清水衝洗乾淨。然後對膠進行修整，修整前首先進行目測，檢查膠體是否有明顯缺陷，包括:①、檢查膠內是否含有氣泡，若有氣泡要把氣泡趕走、檢查膠體表面是否有條紋現象(有條紋現象則屬於次品)、檢查膠體下邊緣是否完整且平整、檢查膠板卡口是否乾淨(若不乾淨則用水衝洗乾淨)、檢查膠孔是否在一直線上。膠體都符合要求後，才開始拔梳齒，且在拔梳齒時保證均勻用力，不能拔斷，拔出後把氣泡趕乾淨，同時檢查膠柱是否完整豎直，切掉突出的膠柱部分，然後進行真空封裝，置於4-8°C保存。在封裝時加入400 μ L儲存緩衝液，儲存緩衝液由60mL的凝膠緩衝液(3.5X)，1mL的甘油，3mL的100mmol/L的EDTA與去礦物質水配成總體積為220mL的溶液。
[0035]實施例2:
[0036]首先，配製8^-16% SDS-PAGE梯度膠的輕液和重液，其中，梯度膠的輕液由以下成分組成:凝膠緩衝液(3.5X):20mL 汸液:15mL，雙蒸水:39mL，AP: 135 μ L7TEMED:13μ L ；重液由以下成分組成:凝膠緩衝液(3.5Χ):20mL ；A液:30mL，雙蒸水:7.5mL，甘油:7.5mL，AP: 135 μ L，TEMED:13 μ L。原料中的凝膠緩衝液(3.5X)是通過將262g Bis-Tris溶於去礦物質水配製成IL的標準液，pH為6.4 ;A液為30%的Acr-Bis水溶液，Acr與Bis的質量比為19:1。按以上配方配製4% -20% SDS-PAGE梯度膠的輕液和重液，而TEMED和AP在各液體加完後在灌膠前加入，且添加順序依次為TEMED、AP。
[0037]在配製膠液的同時，進行膠夾的拼接，將膠夾表面碎屑清理乾淨，扣緊各卡扣，然後將梳子插好，梳子的光滑面朝向板子背面。拼裝好的膠夾以13個為單位放入灌膠槽，保證有孔道標記的一面(背面)靠近灌膠槽的背面，且所有的膠夾保持同一方向，防止取膠時損壞膠孔。如留有空隙用擋板填充，安裝灌膠閥門，確保連接處不漏液。然後擰緊膠槽各螺絲，以防漏液。最後加水檢測確保灌膠槽不漏液後，打開恆流泵，將流速調整到最大，用水清洗梯度混合儀，確保儀器暢通後，關閉恆流泵。
[0038]然後將配製好的膠液按輕液，重液分別置於梯度混合儀相應容器內(此時混合儀由重液流向輕液的閥門保持關閉)，同時打開磁力攪拌器，攪拌速度為使指針指向6的位置。然後將恆流泵流速調至3.0,打開恆流泵，使膠液流出3?5滴再將灌膠管接在灌膠槽的閥上，以排除灌膠管內的氣體，防止將氣泡引入膠內。當重液和輕液的高度達到一致時，打開梯度混合儀中間的閥門，閥門一般控制在60度傾斜，當灌膠槽的液體到達頂部先關閉恆流泵再關閉灌膠槽閥門，停止灌膠。灌好膠後要用清水清洗恆流泵和梯度混合儀，避免管道堵塞。
[0039]灌膠完成後聚合3h，聚合時不能移動灌膠槽，以免在膠未聚合前由於移動而影響所形成的梯度。聚合結束後將膠拆下並用清水衝洗乾淨。然後對膠進行修整，修整前首先進行目測，檢查膠體是否有明顯缺陷，包括:①、檢查膠內是否含有氣泡，若有氣泡要把氣泡趕走、檢查膠體表面是否有條紋現象(有條紋現象則屬於次品)、檢查膠體下邊緣是否完整且平整、檢查膠板卡口是否乾淨(若不乾淨則用水衝洗乾淨)、檢查膠孔是否在一直線上。膠體都符合要求後，才開始拔梳齒，且在拔梳齒時保證均勻用力，不能拔斷，拔出後把氣泡趕乾淨，同時檢查膠柱是否完整豎直，切掉突出的膠柱部分，然後進行真空封裝，置於4-8°C保存。在封裝時加入400 μ L儲存緩衝液，儲存緩衝液由60mL的凝膠緩衝液(3.5X)，1mL的甘油，3mL的100mmol/L的EDTA與去礦物質水配成總體積為220mL的溶液。
[0040]對比例1:
[0041 ] 市售濃度為8 %的SDS-PAGE凝膠。
[0042]對比例2:
[0043]市售濃度為10 %的SDS-PAGE凝膠。
[0044]對比例3:
[0045]市售濃度為12%的SDS-PAGE凝膠。
[0046]先對本發明實施例1和2製得的梯度膠進行外觀檢測，結果為:梯度膠的表面無殘膠，膠柱無傾斜並且所有膠柱的頂端和膠孔的底端都分別在同一水平線上，膠體表面無條紋，膠體底部無缺損。
[0047]再將本發明實施例1和2製得的梯度膠和對比例1-3單一濃度的凝膠對樣品為JWllO空菌裂解液進行電泳檢測，電泳檢測過程中所採用的電泳緩衝液(1X)由60.6g的Tris base, 104.6g的MOPS, 1g的SDS和3g的EDTA溶於去礦物質水配製成IL的標準液；轉印緩衝液(20X)由60g的Tris base和81.6g的Bicine溶於去礦物質水配製成IL的標準液；上樣緩衝液(5X)由Ig的SDS, 5mL的甘油，25mg的Bromophenol Blue, 150mg的Tris base和ImL的2-Mercapoethanol溶於去礦物質水配製成1mL的標準液，pH為6.8。電泳檢測結果如圖1所示。
[0048]從圖1可知，本發明實施例1和2製得的梯度膠電泳檢測結果為:條帶SHARP，解析度明顯高於對比例單一濃度的凝膠，對樣品JWllO空菌裂解液組成的分析更為細緻，且相鄰條帶清晰可辨，指定細胞裂解同一蛋白條帶在同一水平線上。而且，在37°c下放置一個月，條帶基本沒有發生改變，穩定性相當強。
[0049]實施例3-4與實施例1-2的區別僅在於凝膠緩衝液的pH為6.2。
[0050]實施例5-6與實施例1-2的區別僅在於凝膠緩衝液的pH為6.6。
[0051]實施例7-8與實施例1-2的區別僅在於儲存緩衝液加入量為300 μ L。
[0052]實施例9-10與實施例1-2的區別僅在於儲存緩衝液加入量為500 μ L。
[0053]實施例11-12與實施例1-2的區別僅在於梯度膠為5% -10% SDS-PAGE梯度膠，輕液和重液配比在組成成分及其體積百分比內即可。
[0054]實施例13-14與實施例1-2的區別僅在於梯度膠為3% -12% SDS-PAGE梯度膠，輕液和重液配比在組成成分及其體積百分比內即可。
[0055]實施例15-16與實施例1-2的區別僅在於梯度膠為6% -18% SDS-PAGE梯度膠，輕液和重液配比在組成成分及其體積百分比內即可。
[0056]實施例17-18與實施例1-2的區別僅在於梯度膠為10% -20% SDS-PAGE梯度膠，輕液和重液配比在組成成分及其體積百分比內即可。
[0057]實施例19-20與實施例1-2的區別僅在於梯度膠為10% -30% SDS-PAGE梯度膠，輕液和重液配比在組成成分及其體積百分比內即可。
[0058]實施例21-22與實施例1-2的區別僅在於梯度膠為12% -28% SDS-PAGE梯度膠，輕液和重液配比在組成成分及其體積百分比內即可。
[0059]實施例23-24與實施例1_2的區別僅在於梯度膠為I % -100% SDS-PAGE梯度膠，輕液和重液配比在組成成分及其體積百分比內即可。
[0060]實施例25-26與實施例1-2的區別僅在於梯度膠為5% -80% SDS-PAGE梯度膠，輕液和重液配比在組成成分及其體積百分比內即可。
[0061]實施例27-28與實施例1-2的區別僅在於梯度膠為10% -50% SDS-PAGE梯度膠，輕液和重液配比在組成成分及其體積百分比內即可。
[0062]實施例29-30與實施例1-2的區別僅在於梯度膠為20% -30% SDS-PAGE梯度膠，輕液和重液配比在組成成分及其體積百分比內即可。
[0063]實施例31-32與實施例1-2的區別僅在於梯度膠為30% -50% SDS-PAGE梯度膠，輕液和重液配比在組成成分及其體積百分比內即可。
[0064]實施例33-34與實施例1_2的區別僅在於梯度膠為40% -50% SDS-PAGE梯度膠，輕液和重液配比在組成成分及其體積百分比內即可。
[0065]實施例35-36與實施例1_2的區別僅在於梯度膠為50% -60% SDS-PAGE梯度膠，輕液和重液配比在組成成分及其體積百分比內即可。
[0066]鑑於本發明方案實施例眾多，各實施例實驗數據龐大眾多，不適合於此處逐一列舉說明，但是各實施例所需要驗證的內容和得到的最終結論均接近，故而此處不對各個實施例的驗證內容進行逐一說明，僅以實施例1-2作為代表說明本發明申請優異之處。
[0067]本處實施例對本發明要求保護的技術範圍中點值未窮盡之處，同樣都在本發明要求保護的範圍內。
[0068]本文中所描述的具體實施例僅僅是對本發明精神作舉例說明。本發明所屬【技術領域】的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種修改或補充或採用類似的方式替代，但並不會偏離本發明的精神或者超越所附權利要求書所定義的範圍。
[0069]儘管對本發明已作出了詳細的說明並引證了一些具體實施例，但是對本領域熟練技術人員來說，只要不離開本發明的精神和範圍可作各種變化或修正是顯然的。
【權利要求】
1.一種梯度膠，其特徵在於，所述梯度膠為梯度膠，所述梯度膠由輕液和重液組成，所述輕液和重液均由以下成分(以體積百分比計)組成:凝膠緩衝液(3.5^):20-35% ；八液:15-70%，雙蒸水:0-60%，甘油:0-15%，八?:0.15-0.4012120:0.015-0.04%，且所述輕液和重液組成成分及含量不同。
2.根據權利要求1所述的一種梯度膠，其特徵在於，所述凝膠緩衝液是通過將2628618-11-18溶於去礦物質水配製成的標準液，邱為6.2-6.6。
3.根據權利要求1所述的一種梯度膠，其特徵在於，所述八液為30%的&1-818水溶液，其中與818的質量比為19:1。
4.根據權利要求1或2或3所述的一種梯度膠，其特徵在於，所述梯度膠為4%-20%808~？^62梯度膠。
5.根據權利要求4所述的一種梯度膠，其特徵在於，所述4%-20% 808~？^62梯度膠的輕液由以下成分組成:凝膠緩衝液(3.5X3:2301減:1?[，雙蒸水:43齓，八?:300^1,丁2腳:30^1 ；重液由以下成分組成:凝膠緩衝液(3.5X3:2001纖:46111匕甘油姐，八?:200 卩 1, 丁腿0:20 卩 I。
6.根據權利要求1或2或3所述的一種梯度膠，其特徵在於，所述梯度膠為8%-16%808~？^62梯度膠。
7.根據權利要求6所述的一種梯度膠，其特徵在於，所述8%-16% 八⑶梯度膠的輕液由以下成分組成:凝膠緩衝液(3.5父〉:2001 ；八液:15111匕雙蒸水:39齓，八?:135比12120:13 ；重液由以下成分組成:凝膠緩衝液(3.5 X): 20^1 ；八液:30^1,雙蒸水:7.5111[，甘油:7.51111,:135111, 12120:139 匕
8.一種梯度膠的製備方法，其特徵在於，所述製備方法主要包括膠液配製、灌膠、清洗、聚合、拆膠、修整和封裝； 其中，所述膠液配製是按上述配方配製梯度膠的輕液和重液，其中，12120和八？在灌膠前加入，且添加順序依次為12腿0、八？； 所述灌膠的具體過程為:將配製好的梯度膠的輕液、重液置於梯度混合儀相應容器內，同時打開磁力攪拌器進行攪拌，然後排除灌膠管內氣體後當重液和輕液的高度一致時，打開梯度混合儀中間的閥門進行灌膠，液體達到頂部後關閉。
9.根據權利要求8所述的一種梯度膠的製備方法，其特徵在於，所述封裝是將修整後的梯度膠進行真空封裝後置於4-81進行保存，且封裝時加入300-500 9 I儲存緩衝液。
10.根據權利要求9所述的一種梯度膠的製備方法，其特徵在於，所述儲存緩衝液由以下成分(以體積百分比計)組成:凝膠緩衝液(3.5^):20-35% ；甘油的201八:0.1-5%，餘量為去礦物質水。
【文檔編號】G01N27/447GK104359964SQ201410609912
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月3日 優先權日:2014年11月3日
【發明者】鄭華安 申請人:寧波市鄞州華謙電子有限公司