檢測鈉/鈣交換體「正向模式」調節化合物的基於螢光的測定法的製作方法

2023-07-09 01:44:26 2

專利名稱：檢測鈉/鈣交換體「正向模式」調節化合物的基於螢光的測定法的製作方法
技術領域：
本發明涉及鈉/鈣交換體(sodium/calcium exchanger)和檢測其活性的方法。 更準確地講，本發明涉及用於檢測鈉/鈣交換體「正向模式」調節化合物的基於螢光的測定 法。本發明還涉及包含表達鈉/鈣交換體的細胞的組件試劑盒(kit of parts)及組件試 劑盒的用途。
背景技術：
生命的一個基本的必要條件是區室化——以生物膜作為實現這一原則的天然工 具。然而，脂雙層——構成細胞膜基礎的結構——對大多數離子和化合物是不滲透的，而這 些離子和化合物的轉運是維持細胞和生物體的生命機能所必需的。這種反論的答案在於細 胞膜的半滲透性質——必須跨過膜的溶質通過特定的膜蛋白轉運。這些轉運蛋白負責離子 梯度的產生和維持，營養物的攝取，代謝產物的轉運，信號轉導分子的重攝取以及毒性和廢 棄化合物的清除。因此，在這種情況下，轉運蛋白是允許直接影響疾病相關性異常狀況的潛 在的藥物靶標。人鈉/鈣交換體基因家族(亦稱為NCX或SLC8)包括三種截然不同的蛋白，NCXl、 NCX2 和 NCX3。SLC8 與 SLC24 —起構成 Na+/Ca2+ 反向轉運蛋白(countertransporter)的超 家族。SLC24家族成員還轉運K+，亦稱為NCKX。NCXl是該家族中表徵最充分的成員，在人衰竭性心臟中它的表達被上調，並在心 肌梗死後參與缺血-再灌注損傷(ischemia-r印erfusion damage)。抑制NCXl使衰竭性心 髒的心肌收縮性正常化，並且在缺血再灌注後發揮心臟保護作用(Flesch等，Circulation 1996 ；Komuro 禾口 Ohtsuka，Journal of Pharmacological. Sciences. 2004)。 NCX2 主要在大 腦中表達，NCX3主要在大腦和骨骼肌中表達，其生理作用不詳。鈉/鈣交換體是從不同細胞中去除Ca2+的重要機制。在心臟中，它排除通過Ca2+ 通道進入的Ca2+引起收縮，同時使Na+進入心臟細胞。其在心血管疾病中的關聯性參見 例如 Hobai，JA 禾口 0』 Rourke，B (2004) Expert Opin. Investig. Drugs，13，653—664。因此， 製藥業已開發出抑制NCX的化合物，參見例如Iwamoto，Τ.等(2004) J. Biol. Chem.，279， 7544-7553。對於以相反方向移動的每個Ca2+，Na+/Ca2+交換體以產生電的方式轉運3_4個 Na+，例如Hinata，M.等(2002) J. Physiol. 545，453-461中的電生理學方法所示。NCX能夠 維持低於胞外Ca2+濃度([Ca2+]入)3-4個數量級的胞質Ca2+濃度([Ca2+]出)。然而，淨 Ca2+轉運的方向取決於Na+的電化學梯度。有研究提出Na+和Ca2+轉運的同時轉運模型和 相繼轉運模型，大量證據支持後者。轉運蛋白是一個新興的靶標家族，具有巨大的潛力，可提供科學和經濟機會。另一 方面，就藥物開發技術而言轉運蛋白是困難的靶標類別。鑑定例如通過阻斷鈣的流動和/或抑制鈣通道的活化來調節通道活性的化合物 是相當有價值的。這樣做的一種標準方法是通過採用膜片鉗實驗。在這些實驗中，必須由技術嫻熟的操作人員，通過測量在響應膜電位變化和/或試驗化合物應用時跨越細胞膜的鈣流，依次個別地對細胞進行評價。研究了 Sea0400(NCX 的一種新的特異性抑制劑)對狗心室乳頭肌的動作電位的作用，參見K. Acsai在「2004年 ESC 大會，，期間發表於 Munich on Poster Nr. 2886 的文獻(標題Effect of a specific sodium-calcium exchanger blocker Sea0400on the ventricular action potential and triggered activity in dog ventricular muscle and Purkinje fiber (特異j"生 內 _ f丐 交換體阻斷劑Sea0400對心室動作電位的作用和引發的狗心室肌和浦肯野纖維的活性)) 以及 C· Lee 等(The journal of pharmacology and experimental therapeutics ；第 311 卷748-757，2004 ；標題！Inhibitory profile of SEA0400 [2-[4-[ (2, 5-Difluorophenyl) methoxy]phenoxy]-5-ethoxyaniline]assessed on the cardiac Na+/Ca2+exchanger， NCXl·l(評價SEA0400[2-[4-[(2，5-二氟苯基)甲氧基]苯氧基]_5_乙氧基苯胺]對心臟 NaVCa2+交換體NCX1. 1的抑制特徵))。採用離子選擇電極技術定量測定巨膜片(giant patch)中離子流的研究表明，心 髒 Na+/Ca2+交換體具有多種轉運模式(Tong Mook Kang 和 Donald W. Hilgemann ；Nature ； % 427 2004 ^ 2 B 5 H ；豐示H :Multiple transport modes of the cardiac Na+/Ca2+ exchanger (心臟Na+/Ca2+交換體的多種轉運模式))。這些實驗雖然有效並提供大量信息，但卻非常耗時而且不適於對調節鈣離子通道 活性的化合物進行高通量測定。多種技術已發展成為電生理學標準方法的備選方法。例如，已採用放射性流量 測定法(radioactive flux assay)，其中將細胞暴露於放射性示蹤物(例如45Ca)中並 監測放射性標記的Ca流量。將負載有示蹤物的細胞暴露於化合物中，增加或減少示蹤物 流出的那些化合物被鑑定為潛在的細胞膜離子通道的激活劑或抑制劑。一個具體實例 0β Τ. Kuramochi φ ；Bioorganic & Medicinal Chemistry ； 12 (2004) 5039-5056 ； feH Synthesis and structure-activity relationships of phenoxypyridine derivates as novel inhibitors of the sodium-calcium exchanger (作為 內 _ f丐交換體新型才IpfU齊[J的 苯氧基吡啶衍生物的合成和結構_活性關係)。EP1031556公開了其中使用肌膜囊泡測定 NaVCa2+交換體活性的方法，通過測量45Ca的放射性來測定肌膜囊泡中Ca2+攝取的濃度。多种放射性離子轉運蛋白測定法的靈敏度有限，因此數據質量不佳。另外，與放射 性篩選技術有關的成本和安全問題是妨礙廣泛應用的障礙。在上述藥物開發技術中，應用放射性流量測定法來鑑定調節離子通道和離子轉運 蛋白活性的化合物是與本發明最接近的現有技術，因為該技術可以通過監測細胞的Ca2+流 量來將試驗化合物鑑定為潛在激活劑或抑制劑。放射性測定法的主要問題出在檢測每秒約1-1000個分子的離子轉運蛋白的周轉 受限(小於大多數離子通道的約104倍)的困難上。因此，由現有技術水平所產生的問題是確定在高通量篩選鈉/鈣交換體調節劑和 分析其特徵方面具有極佳靈敏度和實用性的穩健測定法。本發明提供了對此問題的解決方案。發明概述本發明的一個主題涉及用於測定鈉/鈣交換體活性的測定法，其中a)提供表達鈉/鈣交換體的細胞；
b)提供用於測定胞內鈣的有色物質；c)使細胞與鈉/鈣交換體激活劑接觸；和d)將來自所述有色物質的發光信號中鈣介導的變化與對照實驗中產生的發光信 號相比較。本發明另一個主題涉及用於測定在響應化合物的加入中鈉/鈣交換體的活性的 測定法，其中a)提供表達鈉/鈣交換體的細胞；b)提供用於測定胞內鈣的有色物質；c)使細胞與化合物接觸，其中所述細胞在用所述化合物處理前已經過鈉/鈣交換 體激活劑處理；和d)將來自所述有色物質的發光信號中鈣介導的變化與對照實驗中產生的發光信 號相比較。一般而言，所用鈉/鈣交換體來源於哺乳動物，特別來源於人。鈉/鈣交換體選自 下列鈉 / 鈣交換蛋白之一 NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6 和 / 或 NCX7，特別是 NCXl、 NCX2和/或NCX3 ；和/或選自下列鈉/鈣/鉀交換蛋白之一 NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4 禾口 / 或 NCKX5。一般而言，用於本發明測定法的細胞可來源於任何真核生物。在一個優選的 實施方案中，細胞是哺乳動物細胞。在一個更優選的實施方案中，細胞是CH0(CCL-61)、 HEK(CCL-1573)、C0S7(CRL-1651)和 / 或 JURKAT (CRL-1990)細胞。用於本發明測定法的鈉/鈣交換體激活劑特別為洛諾黴素(ionomycin)。在一個優選的實施方案中，將作為染料前體的能夠進入細胞並能夠水解成染料 的所述有色物質加入細胞中，從而染料與鈣在所述細胞中絡合併且發出發光信號。此外， 所述染料前體可優選為乙醯氧基甲基酯衍生物，並且所述染料可優選為鈣敏感螢光染料 fluo-4。在一個更優選的實施方案中，所述發光信號是螢光，所述監測步驟c)採用FLira
直ο本發明還涉及採用前述測定法檢驗化合物作為鈉/鈣交換體的激動劑或拮抗劑 的活性。在另一個優選的實施方案中，本發明涉及採用前述測定法診斷與鈉/鈣交換體表 達發生改變有關的疾病。本發明還涉及包含以下組件試劑盒a)表達(expriming)鈉/鈣交換體的凍幹細胞；b)有色物質；c)化合物緩衝液；和d)有色物質緩衝液。在本發明組件試劑盒的一個優選的實施方案中，所述有色物質是鈣敏感螢光染料 fluo-4。在另一個優選的實施方案中，所用的鈉/鈣交換體來源於哺乳動物，特別來源於 人。鈉/鈣交換體選自下列鈉/鈣交換蛋白之一 NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6和/ 或NCX7，特別是NCX1、NCX2和/或NCX3 ；和/或選自下列鈉/鈣/鉀交換蛋白之一 =NCKXl、 NCKX2、NCKX3、NCKX4 禾口 / 或 NCKX5。本發明還涉及採用前述組件試劑盒檢驗化合物作為鈉/鈣交換體的激動劑或拮抗劑的活性。在另一個優選的實施方案中，本發明涉及採用前述組件試劑盒診斷與鈉/鈣 交換體表達發生改變有關的疾病。發明詳述術語「測定法」是指測定某一系統或對象的性質的方法。測定法是常用術語生物測定法的省略形式，並且是體外實驗的一種類型。通常進 行測定法以測量某一物質對活生物體的作用。測定可以是定性或定量的，它們在新藥開發 中是必不可少的。主題測定法提供大的動態範圍(dynamic range)，使得可以測定鈉/鈣交換體的 活性。特別是本發明可提供快速有效的測定法，用於篩選與鈉/鈣交換體進行特異性相互 作用並調節其活性的藥學上有效的化合物並分析該化合物的特徵。在本發明的情況中，術語「鈉/鈣交換體」或「NCX」可以是指下列Na+/Ca2+交換 蛋白中單獨或彼此組合的任一種NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6，NCX7 ；或者下列Na+/ Ca2VK+交換蛋白中單獨或彼此組合的任一種NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5。尤其優選的是SLC8家族成員NCXl、NCX2和/或NCX3，其胺基酸序列分別對應於 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO :3。這類鈉/鈣交換體可來源於任何脊椎動物，特別是哺乳動物物種(例如狗、馬、牛、 小鼠、大鼠、犬科動物、兔、雞、類人猿、人等)。鈉/鈣交換體可以從這類有脊椎生物的組織 探查物(probes)中分離，或者可以藉助能夠表達鈉/鈣交換體的重組生物材料製備。術語「鈉/鈣交換蛋白」是指多肽、多態變體(polymorphic variant)、突變體和種 間同源物，其胺基酸序列優選在至少約25、50、100、200個或500個以上胺基酸的區域內與 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3中所含胺基酸序列相比有超過約80%胺基酸 序列同一性、85%、90%、優選91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上氨 基酸序列同一性。術語「生物材料」是指含有遺傳信息和能夠自體複製或在生物系統中複製的任何 材料。重組生物材料是通過本領域技術人員熟知的重組技術產生、改變或修飾的任何生物 材料。下列參考文獻是克隆特定NCX蛋白的實例Nicoll，D Α.等人克隆了犬Na+/Ca2+ 交換體NCXl (Science. 250(4980) :562_5，1990 ；標題Molecular cloning and functional expression of the cardiac sarcoIemmalNa (+) -Ca2+exchanger (Na (+) -Ca2+ ^ 換體的分子克隆和功能性表達))。Komuro, I.等(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 89 (10), 4769-4773,1992 ； f 示 IS :Molecular cloning and characterization of the human cardiacNa+/Ca2+ exchanger cDNA (人心臟 Na+/Ca2+ 交換體 cDNA 的分子克隆與表徵)) 和 Kofuji，P.等(Am. J. Physiol. 263 (Cell Physiol. 32) :C 1241-C 1249，1992 ；標題 Expression of the Na-Ca exchanger in diverse tissues -.a study using the cloned human cardiac Na-Ca exchanger (不同組織中Na-Ca交換體的表達使用克隆的人心臟 Na-Ca交換體的研究))克隆了人NaVCa2+交換體NCXl。Li，Z.等人克隆了人Na+/Ca2+交換體 NCX2 (J. Biol. Chem. 269(26) 17434-9，1994 ；標題Cloning of the NCX2 isoform of the plasma membrane Na(+)-Ca2+ exchanger (質膜Na(+)_Ca2+交換體的NCX2 同種型的克隆))。 Nicoll，DA.等人克隆了大鼠 Na+/Ca2+交換體 NCX3(J. Biol. Chem. 271(40) :24914_21，1996 ；標題Cloning of a third mammalian Na+/Ca2+ exchanger, NCX3 (第三型哺乳動物 Na+/ Ca2+交換體 NCX3 的克隆))。Gabellini，N.等人克隆了人 Na+/Ca2+交換體 NCX3 (Gene. 298 1_7，2002 ；標題The human SLC8A3gene and the tissue-specific Na+/Ca2+exchanger 3isoforms (人SLC8A3基因和組織特異性Na+/Ca2+交換體3同種型))。術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用，是指胺基酸殘基的聚合體。 該術語適用於其中一個或多個胺基酸殘基是相應天然存在的胺基酸的人工化學模擬物的 胺基酸聚合體，並適用於天然存在的胺基酸聚合體和非天然存在的胺基酸聚合體。術語「鈉/鈣交換體的活性」是指從細胞去除胞內Ca2+的機制。在心臟中，它排除 通過Ca2+通道進入的Ca2+引起收縮，同時Na+進入心臟細胞。其在心血管疾病中的關聯性 參見例如 Hobai，JA 禾口 0』 Rourke，B (2004) Expert Opin. Investig. Drugs，13，653—664。因 此，製藥業已開發出抑制NCX的化合物，參見例如Iwamoto，Τ.等(2004) J. Biol. Chem.，279， 7544-7553。對於以相反方向移動的每個Ca2+，Na+/Ca2+交換體以產生電的方式轉運3_4個 Na+，例如Hinata，M.等(2002) J. Physiol. 545，453-461中的電生理學方法所示。NCX能夠 維持低於胞外Ca2+濃度([Ca2+]出)3-4個數量級的胞質Ca2+濃度([Ca2+]入)。然而，淨 Ca2+轉運方向取決於Na+的電化學梯度。有研究提出Na+和Ca2+轉運的同時轉運模型和相 繼轉運模型，大量證據支持後者。通過測量合適的有色物質與鈣絡合所產生的增強的發光， 來測定鈉/鈣交換體的活性。術語「表達鈉/鈣交換體的細胞」是指內源性表達目標交換體的細胞或重組細胞。當提及例如細胞、或核酸、蛋白質或載體時，術語「重組」是指通過導入異源核酸或 蛋白質或者改變天然核酸或蛋白質而被修飾的細胞、核酸、蛋白質或載體，或者所述細胞來 源於經如此修飾的細胞。因此，例如重組細胞表達天然(非重組)形式的細胞內不存在的 基因，或者表達異常表達、表達不足或根本不表達的天然基因。在本發明中，這通常是指用 編碼鈉/鈣交換體的核酸序列轉染的細胞。僅通過使細胞生長在有合適培養基的適當容器中，便可進行該測定法。細胞可以 是天然存在的細胞、天然細胞、建立的細胞系、市售細胞、遺傳修飾的細胞等，只要細胞在測 定期間能夠維持，並且適宜在培養基中生長即可。用於進行主題測定法的合適細胞包括原核生物、酵母或高等真核細胞，尤其是哺 乳動物細胞。原核生物包括革蘭氏陰性生物和革蘭氏陽性生物。細胞一般可為哺乳動物 細胞，例如人細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、中國倉鼠細胞等。被認為是合適的細胞包括CH0、 C0S7、JURKAT, HeLa, HEKs, MDCK 和 HEK293 細胞。細胞可以用眾所周知的方法製備(Current protocols in cell biology, John Wiley & Sons Inc，ISBN :0471241059)，或者可以購買(Invitrogen Corp.，Sigma-Aldrich Corp.，Stratagene)。術語「有色物質」尤其是指鈣敏感螢光染料。染料前體的特徵在於在測定條件下不發光，是一種酯，能夠進入細胞並且在胞內 水解成發光的含氧化合物，而且與鈣絡合時發光增強。選擇易被胞內水解酶水解的酯。術語「能夠進入細胞」是指前體能夠跨細胞膜並且在細胞中被水解，染料前體在特 定的PH、溫度等條件下進入細胞，以不同的速度進入細胞，或者在特定條件下不進入細胞。採用眾所周知的方案，將有色物質加入細胞中(Current protocols in cellbiology, John Wiley & Sons Inc，ISBN :0471241059)。所使用的有色物質是常用的市售試劑(Invitrogen Corp.)，並且可以使用在實驗 室合成的試劑。滿足上述要求的多種市售染料是已知的。用於監測Ca2+的螢光染料是眾所周知 的，詳情可參見Molecular Probes目錄第20. 1-20. 4節，第9版。它們通常具有兩個與熒 光核(例如螢光素、羅丹明、香豆素、氨基苯基吲哚等)連接的雙-羧甲基氨基。該化合物 大部分是3，6_ 二氧基取代的咕噸，在前體中氧基是取代的，在發光染料中則是未取代的。 通常存在保護酚和酸的乙醯氧基甲基。參見例如Fluo3/4、Fura2/3、鈣螢光素綠(calcein green)等。乙醯基的水解產生發光產物。前體能夠跨過細胞膜並在細胞中水解。術語「發光，，是指「冷光」，光來自其它能量源，可發生在常溫和較低溫度下。在發 光時，一些能量源將原子的電子拋出其「基」(最低能量)態進入「激發」(較高能量)態; 然後電子返還光形式的能量，因此可以回到其「基」態。有若干種發光類型，各自根據能量 源是什麼或是什麼引起發光而命名。術語「螢光」是指主要作為冷體(cold body)中的光學現象而存在的發光，其中分 子吸收光子引起發射出另一個具有較長波長的光子。吸收光子與發出光子之間的能量差以 分子振動或熱結束。通常吸收光子在紫外線區，發射光在可見區，但是這取決於具體螢光團 的吸光度曲線和斯託克司頻移。螢光以礦物熒石的名字命名，礦物熒石由通常具有這種現 象的氟化鈣組成。可用發光計或螢光成像儀測量來自指示劑染料的螢光。一種優選的檢測儀是 焚光成像讀板儀(Fluorometric Imaging Plate Reader, FLI PR) (Molecular Devices, Sunnyvale,Calif.)0 FLII3R非常適於應用本發明方法的高通量篩選，因為它將能夠將同時 移液至微量滴定板的96孔或384孔的集成液體處理與採用與電荷耦合器件攝影機連接的 氬雷射器進行快速動力學檢測結合在一起。使用鈣指示劑染料的一種備選方法是使用水母發光蛋白系統。水母發光蛋 白系統利用蛋白質脫輔基水母發光蛋白(apoaequorin)，它與親脂性發色團腔腸素 (coelenterazine)結合，形成脫輔基水母發光蛋白與腔腸素的組合(稱為水母發光蛋白)。 脫輔基水母發光蛋白具有3個鈣結合部位，在鈣結合時，水母發光蛋白的脫輔基水母發光 蛋白部分的構象發生改變。構象的這種改變使腔腸素被氧化成coelenteramide、CO2和藍 光(466nm)的光子。可以使用合適的儀器檢測這種光子。有關使用水母發光蛋白的綜述可參見Cr6ton等，1999，Microscopy Research and Technique 46 :390_397 ；Brini 等，1995，J. Biol. Chem. 270 9896-9903 ；Knight 和 Knight, 1995，Meth. Cell. Biol. 49 :201_216。同樣有價值的可為美國專利第5，714，666號，它描述 了通過將腔腸素輔因子加入表達脫輔基水母發光蛋白的哺乳動物細胞中來測量哺乳動物 細胞的胞內鈣的方法。「抑制劑」是例如結合鈉/鈣交換蛋白、部分或完全阻斷其活性、降低、阻止鈉/鈣 交換蛋白的活性或表達、延遲鈉/鈣交換蛋白活化、使鈉/鈣交換蛋白失活、脫敏或者下調 鈉/鈣交換蛋白的活性或表達的化合物，例如拮抗劑。「激活劑」是增加、開啟、激活、促進鈉/鈣交換體活性、促進其活化、敏化、刺激或上 調鈉/鈣交換體活性的化合物。一種優選的鈉/鈣交換體激活劑是洛諾黴素，一種源自密團鏈黴菌(Streptomyces conglobatus)的離子載體。抑制劑、激活劑或調節劑還包括鈉/鈣交換蛋白的遺傳修飾形式，例如活性發生 改變的形式，以及天然存在和合成的配體、拮抗劑、激動劑、肽、環肽、核酸、抗體、反義分子、 核酶、有機小分子等。術語「化合物」或「試驗化合物」或「試驗候選物(test candidate)」或其語法等 同術語是指將要被測定調節鈉/鈣交換體活性的能力的任何天然存在或合成的分子，例如 蛋白質、寡肽、有機小分子、多糖、脂質、脂肪酸、多核苷酸、寡核苷酸等(Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons Inc, ISBN :0471250961)。試驗化合物可 以是試驗化合物文庫的形式，例如提供足夠多樣性範圍的組合文庫或隨機文庫(Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons Inc，ISBN :0471250937)。試驗化合 物任選與融合配偶體連接，融合配偶體例如靶向化合物、拯救化合物(rescue compound)、 二聚化合物、穩定化合物、可尋址化合物(addressable compound)和其它功能性部分。按 慣例，通過鑑定具有某些所需性質或活性(例如活性升高)的試驗化合物(稱為「先導化合 物」)、產生先導化合物的變體以及評價這些變體化合物的性質和活性，來產生具有有益性 質的新的化學實體。優選將高通量篩選(HTS)方法應用於這類分析。在細胞生長後，所述抑制劑、激活劑和試驗化合物可通過注入培養基中而加入細 胞內，或者它們可在細胞生長前就存在於培養基中(Current protocols in cell biology, John Wiley & Sons Inc, ISBN :0471241059)。細胞可以在抑制劑、激活劑和/或試驗化合物中生長到適當數目，或者將抑制劑、 激活劑和/或試驗化合物加入其中使用而細胞沒有進一步生長。細胞可與抑制劑、激活劑 和/或試驗化合物結合，或者在將細胞置於孔中或使其在孔中生長的實施方案中，細胞可 以是懸浮在孔內液體中的懸液細胞。術語「對照實驗」是指可以同時進行的不同類型的實驗。技術人員應了解的是，與 本文所述方法一起進行對照實驗一般是有益的。例如，對於測定鈉/鈣交換體活性的測定法，具有對照通常是有益的，其中細胞優 選與用於該測定法的細胞基本相同，不同之處在於這些細胞不會表達目標鈉/鈣交換體。此外，對於測定在響應化合物的加入中鈉/鈣交換體的活性的測定法，具有對照 通常是有益的，其中在本發明的測定法中檢驗化合物，所述化合物針對的是優選與該測定 法中所用的細胞基本相同的細胞，不同之處在於這些細胞不表達目標鈉/鈣交換體。這樣 可以確定通過所述測定法鑑定的化合物確實是通過目標鈉/鈣交換體而不是通過某些意 料之外的非特異性機制起作用。這類對照細胞的一種可能性可以是非重組親本細胞，其中 實際實驗中的該細胞表達目標鈉/鈣交換體。對於測定在響應化合物的加入中鈉/鈣交換體的活性，用於該測定法的其它對照 可以是在不加入試驗化合物(低水平對照(low control))時進行所述測定法以及用高濃 度的試驗化合物(高水平對照(high control))進行所述測定法。其它類型的對照可包括將通過本發明的測定法鑑定的化合物作為目標鈉/鈣交 換體的激動劑或拮抗劑，和用現有技術的方法測試這些化合物以證實這些化合物在所述現 有技術方法測試中同樣也是激動劑或拮抗劑。此外，本領域技術人員應了解的是，還需要通過比較測定值與標準值來進行統計學分析。術語「激動劑」和「拮抗劑」是指通過受體調節信號轉導的受體效應分子。受體效 應分子能夠與受體結合，但不一定在天然配體的結合部位。受體效應子當單獨使用時可調 節信號轉導，即可以替代配體，或者可以在天然配體存在下，通過天然配體提高或抑制信號 轉導來改變信號轉導。例如「拮抗劑」是阻斷或降低受體信號轉導活性的分子，例如，它們 可以競爭性、非競爭性和/或變構性地抑制來自受體的信號轉導，而「激動劑」則增強、誘導 或提高受體的信號轉導活性。術語「與鈉/鈣交換體表達發生改變有關的疾病」是指擴張型心肌病、冠心病、心
律失常、心力衰竭等。為方便起見，有色物質和測定法的其它組分可以試劑盒提供，其中有色物質可作 為可復溶粉末存在，或者可作為冰浴中緩衝溶液的冷卻溶液存在。試劑盒還可包括緩衝液、 激活劑、抑制劑、試驗化合物、表達(expriming)鈉/鈣交換體的細胞等。細胞可作為凍幹 細胞存在。所述組件試劑盒可以用作診斷試劑盒，用於診斷擴張型心肌病、冠心病、心律失
常、心力衰竭等。下列附圖
和實施例將更詳細地說明本發明，並披露了基於螢光的細胞鈉/鈣交換 體測定法的典型結果，但不限制保護的範圍。
實施例1.測定步驟試驗試劑下列化學試劑組成用作測定法的試劑
權利要求
一種用於測定鈉/鈣交換體活性的測定法，所述測定法包括e)提供表達鈉/鈣交換體的細胞；f)提供用於測定胞內鈣的有色物質；g)使細胞與鈉/鈣交換體激活劑接觸；和h)將鈣介導的來自所述有色物質發光信號的變化與對照實驗中產生的發光信號進行比較。
2.權利要求1的測定法，其中所述鈉/鈣交換體是下列NCX蛋白NCX1、NCX2、NCX3；或 下列 NCKX 蛋白NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5。
3.權利要求1的測定法，其中所述鈉/鈣交換體是下列NCX蛋白NCX1、NCX2、NCX3。
4.權利要求1-3的測定法，其中所述鈉/鈣交換體來源於哺乳動物，優選來源於大鼠、 小鼠、狗、牛、豬、猿或人。
5.權利要求1-4的測定法，其中所述細胞選自CH0、HEK、C0S7和JURKAT細胞。
6.權利要求1-5的測定法，其中將作為能夠進入細胞並能夠水解成染料的染料前體的 所述有色物質加入細胞中，藉此所述染料與鈣在所述細胞中絡合併且發出發光信號。
7.權利要求1-6的測定法，其中所述發光信號是螢光，所述監測步驟c)採用FLira裝置。
8.權利要求6的測定法，其中所述染料前體是乙醯氧基甲基酯衍生物。
9.權利要求6的測定法，其中所述染料是鈣敏感螢光染料fluo-4。
10.權利要求1-9的測定法，其中所述鈉/鈣交換體激活劑是洛諾黴素。
11.權利要求1-10的測定法在檢驗化合物作為鈉/鈣交換體的激動劑或拮抗劑的活性 中的用途。
12.權利要求1-10的測定法在診斷與鈉/鈣交換體表達發生改變有關的疾病中的用途。
13.一種用於測定在響應化合物的加入中鈉/鈣交換體的活性的測定法，所述測定法 包括a)提供表達鈉/鈣交換體的細胞；b)提供用於測定胞內鈣的有色物質；c)使細胞與化合物接觸，其中所述細胞在用所述化合物處理前已經過鈉/鈣交換體激 活劑處理；和d)將鈣介導的來自所述有色物質發光信號的變化與對照實驗中產生的發光信號進行 比較。
14.權利要求13的測定法，其中所述鈉/鈣交換體是下列NCX蛋白NCX1、NCX2、NCX3； 或下列 NCKX 蛋白NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5。
15.權利要求13的測定法，其中所述鈉/鈣交換體是下列NCX蛋白NCX1、NCX2、NCX3。
16.權利要求13和15的測定法，其中所述鈉/鈣交換體來源於哺乳動物，優選來源於 大鼠、小鼠、狗、牛、豬、猿或人。
17.權利要求13-16的測定法，其中所述細胞選自CH0、HEK、C0S7和JURKAT細胞。
18.權利要求13-17的測定法，其中將作為能夠進入細胞並能夠水解成染料的染料前 體的所述有色物質加入細胞中，藉此染料與鈣在所述細胞中絡合併且發出發光信號。
19.權利要求13-18的測定法，其中所述發光信號是螢光，所述監測步驟c)採用FLira裝置。
20.權利要求18的測定法，其中所述染料前體是乙醯氧基甲基酯衍生物。
21.權利要求18的測定法，其中所述染料是鈣敏感螢光染料fluo-4。
22.權利要求13-21的測定法，其中所述化合物是鈉/鈣交換體拮抗劑。
23.權利要求13-22的測定法，其中所述鈉/鈣交換體激活劑是洛諾黴素。
24.一種組件試劑盒，所述組件試劑盒包括a)表達(expriming)鈉/鈣交換體的凍幹細胞；b)有色物質；c)化合物緩衝液；和d)有色物質緩衝液。
25.權利要求24的組件試劑盒，其中所述有色物質是鈣敏感螢光染料fluo-4。
26.權利要求24和25的組件試劑盒，其中所述鈉/鈣交換體是下列NCX蛋白NCX1、 NCX2、NCX3 ；或下列 NCKX 蛋白NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5。
27.權利要求24-26的組件試劑盒，其中所述鈉/鈣交換體來源於哺乳動物，優選來源 於大鼠、小鼠、狗、牛、豬、猿或人。
28.權利要求24-27的組件試劑盒在檢驗化合物作為鈉/鈣交換體的激動劑或拮抗劑 的活性中的用途。
29.權利要求24-27的組件試劑盒在診斷與鈉/鈣交換體表達發生改變有關的疾病中 的用途。
全文摘要
轉運蛋白是一個新興的靶標家族，具有巨大的潛力，可提供科學和經濟機會。鈉/鈣交換體是從不同細胞中去除Ca2+的重要機制。在心臟中，它排除通過Ca2+通道進入的Ca2+引起收縮，同時Na+進入心臟細胞。鑑定出調節鈉/鈣交換體活性的化合物是相當有價值的。本發明涉及用於檢測NCX和NCKX「正向模式」調節化合物的基於螢光的測定法。本發明還涉及包含表達(expriming)鈉/鈣交換體的細胞的組件試劑盒，以及組件試劑盒在檢驗化合物作為鈉/鈣交換體的激動劑或拮抗劑的活性中的用途。
文檔編號G01N33/68GK101978271SQ200980110622
公開日2011年2月16日 申請日期2009年3月13日 優先權日2008年3月20日
發明者H·福勒特, M·胡格, S·蓋貝爾, T·利歇爾 申請人:賽諾菲-安萬特