用於治療獲得性免疫缺陷症候群的重組靶向融合蛋白的製作方法

2023-07-18 15:29:11

專利名稱：用於治療獲得性免疫缺陷症候群的重組靶向融合蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程蛋白質藥物領域。具體地，本發明涉及靶向性抗HIV/SIV的蛋白質及編碼它的融合基因。本發明還涉及RN-TNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2融合基因、包含所述融合基因的表達型重組體、包含所述表達型重組體的工程菌、由此工程菌表達和分離純化的靶向融合蛋白RN-TNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2以及這些融合蛋白中任意一種的用於治療愛滋病用途。
背景技術：
獲得性免疫缺陷症候群(acquired immunodeficiency syndrome AIDS)即愛滋病，是一種嚴重危害人類健康的疾病。AIDS是由人免疫缺陷性病毒(humanimmunodeficiency virus HIV)感染引起。HIV主要感染表達CD4分子的T細胞、單核/巨噬和樹突狀細胞，以及中樞神經細胞。據WHO2003年的數據，全球HIV感染者已超過6000萬，其中1/3已死亡。在今後20年內，估計死亡人數將達到6800萬。目前全球HIV/AIDS人數已居各種疾病的首位，愛滋病已成為全球的瘟疫.2003年的最新數據表明，中國愛滋病實際感染者已達一百餘萬人，以青壯年為主，其中已經死亡的約20萬。如果不採取有效的控制措施，到2010年感染者數量有可能達到1000萬。若防治得力在2010年可將感染者數量控制在150萬以內。中國愛滋病防治形勢相當嚴峻。
儘管目前高活性抗逆轉錄病毒療法(High Active Antiretrovirus Therapy，HAART)在發達國家中取得了矚目的成績，但大多數HIV感染者都集中在經濟不發達地區，HAART昂貴的價格限制了它在這些發展中國家的應用。全球HIV感染者接受抗逆轉錄病毒治療的不足100萬。同時HAART本身存在一些無法克服的缺點，如HAART的毒副作用大、容易導致病毒的耐藥和病毒的潛伏，而且價格昂貴。動物實驗表明，此類藥物長期給藥有致癌的危險性。HAART不能徹底根治愛滋病。愛滋病疫苗雖然一度給人們帶來了巨大的希望，但實際上，從疫苗的研發到真正應用於人類仍然是困難重重。不僅如此，現有的各種治療手段，包括其它各種藥物治療，基因治療均未取得成功。
靶向性治療技術又稱為「生物飛彈」技術，正越來越引起人們的關注。一種生物飛彈的設計思路是將單克隆抗體與藥物、抗生素或核素偶聯在一起用於臨床治療，其主要問題是靶向性差；另一種生物飛彈的設計思路是運用基因工程技術將不同的功能區段拼接所構建的融合蛋白作為「分子導向」型飛彈，如人工構建的融合蛋白CD4178-PE40用於治療愛滋病。臨床研究結果表明，此類融合蛋白雖具有良好的導向作用，但PE40毒素蛋白質對人體而言是異源蛋白，具有很強的免疫原性，可迅速誘導體內產生特異針對PE40的抗體，抗體產生中和效應使融合蛋白失效，無法應用於臨床治療。
所以在治療AIDS領域急需低毒高效的靶向性藥物。

發明內容
為了研究高效低毒且無免疫原性的治療愛滋病的藥物，本發明提供了運用於抗HIV/SIV的三類融合蛋白，所述融合蛋白是包含受體多肽與來源於人體的具有殺細胞作用的殺傷多肽的靶向性融合蛋白。
在人體內，僅有被HIV感染的細胞才會表達gp120蛋白。可與gp120特異結合的靶向分子能將具有殺細胞作用的TNFαm1和TNFαm2導向被HIV感染的細胞。被HIV/SIV感染的細胞有內化(Internalization)功能，通過gp120介導的內化作用而將TNFαm1和TNFαm2導入到細胞內部引發細胞凋亡。正常細胞由於不表達gp120，靶向融合蛋白不會與其結合，不會殺傷正常組織細胞。因此該類藥物具有良好的安全性。本發明由於靶向設計，可以既有效降低TNFα的毒性，又可以將TNFα的殺傷作用集中於受HIV/SIV感染的細胞，更有效發揮融合蛋白的殺傷作用，同時兼顧安全和高效。融合蛋白在殺傷受HIV/SIV感染細胞的同時，其靶向分子RN、XE還能中和游離的HIV/SIV，實現對正常細胞的保護。因此這三種融合蛋白都是雙功能的活性多肽。並且，實驗設計得到細胞試驗結果的支持。同時，由於RN、XE和TNFαm均來自人體，最大限度降低了免疫原性。不僅如此，在RN、XE和TNFαm之間還分別引入了富含柔性胺基酸的胺基酸序列，可以幫助靶向分子RN、XE和效應分子TNFαm各自保持獨立的的三維空間結構來行使其功能，並各自獨立作為人體內源蛋白被免疫系統識別而不被免疫系統錯誤識別為異源蛋白產生免疫反應，避免最終導致藥物失效。本發明涉及兩種人HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體或輔助受體多肽的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO1，3所示。所述的SEQ ID NO1，3的核苷酸序列用於融合蛋白的導向作用。
本發明進一步涉及兩種人HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽，它的胺基酸序列如SEQ ID NO2，4所示。
本發明進一步涉及一種TNF-α的變異體的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ IDNO5所示。
本發明進一步涉及一種TNF-α的變異體，它的胺基酸序列如SEQ ID NO6所不。
本發明進一步涉及一種TNF-α的變異體的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ IDNO7所示。
所述的SEQ ID NO5和7的核苷酸序列用於融合蛋白的殺滅作用。
本發明進一步涉及一種TNF-α的變異體，它的胺基酸列如SEQ ID NO8所示。
本發明進一步涉及三種靶向融合蛋白，其特徵在於所述的融合蛋白為包含能夠結合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽和具有殺細胞作用的殺傷多肽的靶向性融合蛋白。
所述的受體多肽優選是RN或XE，或者它們的相關片斷，類似物或突變體；所述的殺傷多肽是包括TNFα、TNFβ、TNFγ或其衍生物或其突變體的TNF家族成員；或TNF超家族成員，如Trail，Light或者是它們的活性功能區域、突變體或類似物；或所述的多肽是來源於人體的穿孔素、補體成分C9及顆粒溶解素；或者來源於人體的顆粒酶家族的顆粒酶A，B，C，D，E、絲氨酸酯酶；或蛋白激酶C、蛋白激酶A、天冬氨酸激酶、細胞色素或DNA核酸內切酶；或可以抵禦細菌的多肽和酶，如溶菌酶、防禦素；或抗癌基因及其編碼的蛋白質，如P53，以及一切來源於人體的具有致死細胞功能的基因及其編碼蛋白質、或者是它們的活性功能區域、突變體或類似物。
優選地，編碼所述的RN的基因序列為SEQ ID NO1所示的序列。
優選地，所述的RN基因編碼的胺基酸序列為SEQ ID NO2所示的胺基酸序列。
優選地，所述的殺傷多肽是TNFα的突變體TNFαm1，編碼它的cDNA序列為SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
優選地，所述的TNFαm1基因編碼的胺基酸序列為SEQ ID NO6所示的胺基酸序列。
優選地，所述的殺傷多肽是TNFα的突變體TNFαm2，編碼它的cDNA序列為SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
優選地，所述的殺傷多肽是TNFαm2，它的胺基酸序列為SEQ ID NO8所示的胺基酸序列。
本發明進一步涉及包括SEQ D NO1的cDNA和SEQ ID NO5的cDNA的融合基因的重組體p30a-RNTNFαm1；包括SEQ ID NO3的cDNA和SEQ IDNO5的cDNA的融合基因的重組體pCW-XETNFαm1。
本發明進一步涉及包括SEQ ID NO2的cDNA和SEQ ID NO7的cDNA的融合基因的重組體pCW-XETNFαm2。
本發明還涉及含有上述重組體的載體。
本發明還涉及含有能表達上述融合蛋白的構建質粒載體的真核或原核細胞，優選為原核細胞。
本發明還涉及製備上述的融合蛋白的方法，包括用所述的表達載體轉化宿主細胞，培養轉化體，獲得重組的包含能夠結合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽和具有殺細胞作用的殺傷多肽的靶向性融合蛋白。
本發明還涉及一種含有上述融合蛋白的靶向藥物。
本發明進一步涉及所述的融合蛋白在製備用於治療獲得性免疫缺陷症候群的藥物中的用途。
優選地，其通過殺滅受HIV/SIV感染的細胞或中和游離的HIV/SIV來完成。
本發明還提供了靶向融合蛋白RNTNFαm1和XE-TNFαm1、XE-TNFαm2分別對受HIV/SIV感染細胞具有特異殺傷作用以及對血循環中游離病毒的中和作用的細胞試驗證據。


圖1為重組體p30RN-TNFαm1的構建示意圖。
圖2為重組體pCW XE-TNFαm1的構建示意圖。
圖3為重組體pCW XE-TNFαm2的構建示意圖。
圖4為重組體p30RN-TNFαm1、pCW XE-TNFαm1的酶切鑑定示意圖。
1.PBR322/BstNI(1875，1060，929，383，121)2.pET-30RNTNFαm1/BamHI+NdeI(5276，587)；3.pCW-XETNFαm1/BamHI+NdeI(4887，587)；4.λDNA/HindIII(23130，9416，6557，4361，2322，2027，564)；圖5為重組體pCW XE-TNFαm2的酶切鑑定示意圖。
1.λDNA/HindIII(23130，9416，6557，4361，2322，2027，567)2.pCW-XETNFαm2(4967bp，549bp)3.DNAladder(800，700，600，500，400，300)圖6為融合蛋白XE-TNFαm1 SDS-PAGE電泳圖。1.低分子量蛋白marker，自上而下分別為97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD；2.XE-TNFαm1純化後樣品；3.XE-TNFαm1包涵體樣品；4.XE-TNFαm1誘導樣品；5.XE-TNFαm1未誘導樣品。
圖7為融合蛋白RN-TNFαm1的SDS-PAGE膠電泳圖。1.低分子量蛋白marker(自上而下分別為97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD)；2.RN-TNFαm1切膠回收純化後樣品；3.RN-TNFαm1包涵體樣品；4.RN-TNFαm1誘導樣品；以及5.N-TNFαm1未誘導樣品。
圖8為融合蛋白XE-TNFαm2的SDS-PAGE膠電泳圖。1XETNFαm2未誘導樣品；2XETNFαm2誘導樣品；3XETNFαm2過柱純化樣品；4低分子量蛋白marker，自上而下(自上而下分別為97.4、66.2、43.0、31.0、20.1、14.4KD)。
圖9融合蛋白XE-TNFαm1SDS-PAGE的雷射密度掃描圖。
圖10融合蛋白RN-TNFαm1SDS-PAGE的雷射密度掃描圖。
圖11融合蛋白XE-TNFαm2SDS-PAGE的雷射密度掃描圖。
圖12融合蛋白XETNFαm2反向柱梯度洗脫結果.
圖13融合蛋白XETNFαm2反向柱梯度洗脫後的SDS-PAGE圖。1.收集峰1；2.收集峰2；3.收集峰3；4.包涵體5.收集峰4；6.收集峰5；7.低分子量蛋白marker，自上而下97.4、66.2、43.0、31.0、20.1KD。
圖14融合蛋白RN-TNFαm1、XE-TNFαm1及TNFα在殺傷試驗中對SIV感染細胞的殺傷作用。
圖15融合蛋白XE-TNFαm2及TNFα在殺傷試驗中對SIV感染細胞的殺傷作用。
圖16融合蛋白XE-TNFαm1、RN-TNFαm1在中和試驗中對SIV感染細胞的保護作用。
圖17融合蛋白XE-TNFαm2在中和試驗中對SIV感染細胞的保護作用。
圖18融合蛋白XE-TNFαm1、RN-TNFαm1在殺傷試驗後的病毒滴度。
圖19融合蛋白XE-TNFαm1、RN-TNFαm1在殺傷試驗後的病毒滴度。
圖20融合蛋白XE-TNFαm2在中和試驗後的病毒滴度。
圖21融合蛋白XE-TNFαm2在中和試驗後的病毒滴度。
圖22-1，2顯示殺傷試驗前後細胞的形態的螢光照片，其中圖20-1為靶向性融合蛋白殺傷試驗前細胞染色照片；圖20-2為靶向性融合蛋白殺傷試驗後細胞染色照片，放大倍數均為200X。
圖23-1，2顯示中和試驗前後細胞的形態的螢光照片，其中圖21-1為靶向性融合蛋白中和試驗前細胞染色照片；圖21-2為靶向性融合蛋白中和試驗後細胞染色照片，放大倍數均為200X。
圖24中和試驗對照組NC+SIV，凋亡率為20.3％。
圖25中和試驗XE-TNFαm2，凋亡率為11.3％。
圖26殺傷試驗對照組NC/SIV，凋亡率為21.2％。
圖27殺傷試驗對照組TNFαm2，凋亡率為20.8％。
圖28殺傷試驗XE-TNFαm2，凋亡率為47.1％。
圖29重組質粒pET30-RNTNFαm1的上遊測序圖。
圖30重組質粒pET30-RNTNFαm1的下遊測序圖。
圖31重組質粒pCW-XETNFαm1的上遊測序圖。
圖32重組質粒pCW-XETNFαm1的下遊測序圖。
圖33重組質粒pCW-XETNFαm2的測序圖。
圖34融合蛋XETNFαm2N端15個胺基酸序列的測定。
圖35融合蛋白XETNFαm2的MALDI-TOF MS檢測鑑定。
具體實施方案本發明中融合蛋白是由靶向分子和殺傷分子兩部分組成，這種靶向設計的關鍵是實現靶向分子的特異性結合和殺傷分子對目標細胞的高效殺傷。依據文獻報導，我們截取了CCR5的N端共30個胺基酸(N端1-30位)作為融合蛋白的靶向分子，CXCR4的共27個胺基酸(第二胞外區1-27位)，分別命名為RN、XE。儘管一些HIV病毒株需要CD4，CCR5和CXCR4的協同作用才能感染細胞，但研究表明，許多HIV病毒株僅依賴CCR5或CXCR4即可獨立感染細胞，不需要其它受體的參與。我們分別選用了RN、XE作為融合蛋白的靶向分子。並且，為了在E.coli系統獲得高表達，通過DNA合成以及PCR技術，RN、XE的胺基酸編碼序列均採用E.coli嗜好的密碼子。殺傷分子是腫瘤壞死因子α(TNFα)或其衍生物，其中兩種為TNFαm1和TNFαm2。靶向分子RN、XE是作為gp120識別靶細胞的通用錨定物。因為只有游離的HIV病毒以及被HIV感染的細胞才會特異性地表達病毒的包膜蛋白gp120，因而利用RN、XE或其衍生物作為靶向分子可實現與被HIV感染細胞和游離病毒的特異性結合。而正常的未受病毒感染的細胞由於不表達gp120不會受到融合蛋白的殺傷。可與gp120特異結合的RN、XE能將具有殺細胞作用的TNFαm1和TNFαm2導向被HIV感染的細胞。被HIV/SIV感染的細胞有內化(Internalization)功能，通過gp120介導的內化作用而將TNFαm導入到細胞內部引發細胞凋亡。RN-TNFα、XE-TNFα編碼基因及其突變型可經真核或原核系統表達獲得融合蛋白。
TNFα是一種單核因子，主要由單核細胞和巨噬細胞產生。此外，中性粒細胞、星狀細胞、內皮細胞、平滑肌細胞，也可產TNFα。TNFα發現於1975年，是一種人源性的細胞毒性因子，其毒性作用主要是通過與受體結合與內化，進而引發一系列的信號傳遞過程，導致細胞死亡。TNFα引起兩種主要的細胞反應，細胞毒和選擇性的轉錄激活。在NK和巨噬細胞介導的細胞毒中TNFα的作用是Ca2+非依賴性的。TNFα三聚體同受體(主要是P55)結合，聚集成簇，受體複合物內化，內化的TNFα受體複合物可傳遞多種信號。一個可能的機制是通過G蛋白偶聯的活化作用激活磷脂酶A2通路，合成前列腺素和白三烯。同時，花生四烯酸等多不飽和脂肪酸的釋放和代謝在線粒體的電子傳遞系統被擾亂，開始產生自由基，最終通過某些酶、脂的氧化和DNA降解作用殺死細胞。另一方面信息會很快導致轉錄因子NF KappaB的激活，活化的NF KappaB進入細胞核，激活一系列基因的轉錄。TNFα在已知細胞因子中的抗腫瘤活性最強。對包括神經纖維瘤、肺癌、乳腺癌、肌肉瘤和淋巴瘤等在內的多種腫瘤細胞系都具有明顯的殺傷作用，所以，美國政府早在1985年就批准了用TNFα來治療惡性腫瘤的臨床試驗申請。但由於原型TNFα過強的毒副作用，以致迄今未能成為臨床可用的治療惡性腫瘤的常規藥物。我們的一個關鍵的設計思想是認為，TNFα的殺細胞活性是它的基本功能，從其作用機制看，如能將其準確導入受HIV/SIV感染的細胞，同樣可以把被HIV/SIV感染的細胞殺滅，從而阻止HIV/SIV病毒的複製和繁殖。因此，運用DNA重組技術將之構建成表達融合蛋白RNTNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2的表達重組體，經真核或原核表達系統表達出融合蛋白，然後純化復性。細胞試驗結果表明，三種融合蛋白可特異強烈殺滅被HIV/SIV感染的細胞，與此同時，該融合蛋白的靶向分子RN、XE還能高效中和游離的HIV/SIV，而使其失活。因此這三種融合蛋白都是雙功能的活性多肽。並且，未被HIV/SIV感染的正常細胞在加入這兩種融合蛋白以後，其生長不受影響，證明融合蛋白有良好的安全性。作為對照，原型TNFα既不能殺傷受HIV/SIV感染的細胞，也不能中和游離的HIV/SIV病毒，進一步驗證了我們的設計。同時，由於RN、XE和TNFαm均來自人體，最大限度降低了免疫原性。因此，本發明構建的三種融合蛋白用於抗HIV/SIV有著良好的特異性和安全性，是一種富有前景的治療愛滋病的潛在藥物。
另外，關於該融合蛋白是否具有免疫原性，RN、XE與TNFα均為人源蛋白，原則上說，已經儘可能地減小了免疫原性。儘管E.coli系統研製的多數活性多肽藥物均有一定的免疫原性，但並不影響其臨床應用。本發明選取密碼子為E.coli.嗜好的編碼CCR5的N末端(RN)的30個胺基酸(N末端第1位至30位)的編碼序列作為靶向分子，與利用PCR技術得到的強效腫瘤壞死因子alpha(TNFα)的衍生物TNFαm1構建表達重組體p30a-RNTNFαm1。選取人工合成的密碼子為E.coli.嗜好的編碼CXCR4的第二胞外環區(XE)的27個胺基酸(第二胞外環區第1位至27位)基因編碼序列作為靶向分子，與利用PCR技術得到的強效腫瘤壞死因子α(TNFα)的衍生物TNFαm1和TNFαm2的基因片段重組，構建表達重組體pCW-XETNFαm1和pCW-XETNFαm2。
將以下描述的表達型重組體pCW-XETNFαm1、pCW-XETNFαm2和p30a-RNTNFαm1分別轉化大腸桿菌DH5α和BL21，經篩選獲高表達工程菌pCW-XETNFαm1/DH5α、pCW-XETNFαm2/DH5α和p30a-RNTNFαm1/BL21。行SDS-PAGE膠分析，重組融合蛋白XETNFαm1、RNTNFαm1和XETNFαm2分別約佔菌體總蛋白的27.4％、15.6％、38.6％。對pCW-XETNFαm1/DH5α、p30a-RNTNFαm1/BL21高表達株進行大規模培養誘導，提取包涵體，8M尿素溶解，經SDS-PAGE凝膠切割後電洗脫回收蛋白。經冰凍酸性丙酮除去SDS，經過透析、復性。融合蛋白XETNFαm2經反相高效液相色譜柱純化，目的蛋白主要在30％RB處被洗脫(層析條件為起始緩衝液RA10％乙睛，0.05％TFA；洗脫緩衝液RB90％乙睛，0.05％TFA)。
蛋白定量後，殺傷試驗中，融合蛋白RNTNFαm1和XE-TNFαm1藥物終濃度分別為8、16、32、64、128μg/ml；XE-TNFαm2的藥物終濃度分別為1、2、4、8、16μg/ml，於24孔細胞培養板中分別處理2.0×105/ml被SIV感染的CEMx-174細胞及未被病毒感染的正常細胞。設立正常的CEMx-174細胞對照組和1640培養基的調零孔。在殺傷試驗中，以蛋白處理過的感染SIV的CEMx-174細胞為試驗組，以未加蛋白的感染SIV的CEMx-174細胞為對照組。同時為評價融合蛋白的安全性和證實融合蛋白作用的靶向性，設立融合蛋白作用於正常細胞的對照組；為證實融合蛋白作用的機制，設立了野生型TNFα作用於SIV感染細胞的對照組。殺傷試驗的結果顯示，三種種融合蛋白在各自的劑量範圍內對SIV感染細胞有明顯的殺傷作用，並且呈良好的劑量-效應關係。這些數據說明，三種融合蛋白對正常的未感染SIV的CEMx-174細胞無統計學意義的殺傷作用，融合蛋白的安全性得以保障，並證實了靶向性融合蛋白的特異性殺傷作用，符合實驗設計要求。同時，在中和試驗中，實驗組OD值均顯著高於對照組，在各自的劑量範圍內對SIV感染細胞有明顯的保護作用，並且呈良好的劑量-效應依賴關係。同時還有滴度試驗支持以上結果。而對於經液相色譜純化的融合蛋白XE-TNFαm2，還通過流式細胞儀測定各試驗組的凋亡率進一步驗證試驗設計。
細胞試驗的結果表明，本發明中的三種融合蛋白RNTNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2，用於抗HIV/SIV，有著良好的特異性和安全性，是一種富有前景的治療愛滋病的潛在藥物。
本發明提供了包含所述融合蛋白基因以及含該基因的表達型重組體。
優選地，所述融合蛋白中的受體多肽是能夠與gp120和/或gp41特異性結合的RN、XE，或者它們的相關片斷，類似物或突變體。
優選地，由於CCR5N端30個胺基酸(RN)對於CCR5結合gp120分子是足夠的，截取了CCR5N端30個胺基酸(RN)作為受體多肽，其胺基酸序列如SEQ ID NO2所示。優選地，由於CXCR4第二胞外環區27個胺基酸(XE)對於CXCR4結合gp120分子是足夠的，截取了CXCR4全長中的第二胞外環區27個胺基酸(XE)作為受體多肽，其胺基酸序列如SEQ ID NO4所示。
更優選地，為了實現融合蛋白在E.coli.系統中的高效表達，RN基因片段系人工合成的突變的E.coli.嗜好的DNA序列，其DNA序列如SEQ ID NO1所示。XE基因片段系人工合成的突變的E.coli.嗜好的DNA序列，其DNA序列如SEQ IDNO2所示。
優選地，所述的功能多肽是TNF家族成員，如TNFα，TNFβ(又名淋巴毒素，lymphotoxin，LT)，TNFγ，或其衍生物或其突變體，或TNF超家族成員，如Trail(Tumor related Apoptosis induced ligand)，Light(for homologous tolymphotoxins，exhibitsInducible expression，and competes with HSVGlycoprotein DforHVEM，a receptor expressed byTlymphocytes，Light；，又稱為HEVMLherpesvirus entry mediator ligand)以及是它們的活性功能區域、突變體或類似物。或者是具有裂解細胞作用來源於人體的穿孔素(human perforin，HP；pore formingprotein，PFP)，可形成補體攻擊複合物的補體成分C9，顆粒溶解素(granulysin)；或者可引起凋亡的來源於人體的顆粒酶家族的顆粒酶A，B，C，D，E(GranzymeA，B，C，D，E)，絲氨酸酯酶(serine esterases)；直接參與細胞凋亡的的蛋白激酶C(PKC)，蛋白激酶A(APK)，天冬氨酸激酶(caspases)，細胞色素，DNA核酸內切酶；可以抵禦細菌的多肽和酶，如溶菌酶(Lysosome)，防禦素(defensin)；具有抑制腫瘤作用的P53以及是它們的活性功能區域、突變體或類似物。
更優選地，其中所述功能多肽是TNFα的突變體TNFαm1和TNFαm2。本發明依據相關文獻的報導，採用兩種方式改造TNFα的結構，其一是在TNFαN端第一位胺基酸Val前增加兩個胺基酸Gly，Thr在其後增加三個胺基酸Arg，Gly，Pro成為採用TNFαm1；其二是將原型TNFα的N端前7個胺基酸缺失突變，並將Pro8，Ser9，Asp10突變為Arg8，Lys9，Arg10，獲得減毒增效的TNFαm2，以降低其毒副作用使之可以更適用於臨床，同時提高其抗腫瘤活性。
本發明提供了三種編碼抗愛滋病的新型靶向融合蛋白RNTNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2，分別具有SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ IDNO13的核苷酸序列。
另一方面，本發明提供了包含所述基因RNTNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2的表達型重組體pET30RNTNFαm1、pCWXE-TNFαm1、pCWXE-TNFαm2以及工程菌p30a-RNTNFαm1/BL21、pCW-XETNFαm1/DH5α和pCW-XETNFαm2/DH5α。以及大量製備、純化和復性蛋白的技術路線。
以下通過實施例進一步描述本發明，而非限制本發明。
實施例1.溫控型表達型重組體pET30a-RNTNFαm1的獲得1.1PCR引物及其序列1.1.1博亞公司合成TNFαm1引物Forward primer 25bp含KpnI位點Reverse primer 25bp含BamHI位點1.1.2博亞公司合成pCW111的測序引物Forward primer 5』-AAAAAGGGCATCAAATTAAACC-3』Reverse primer 5』-TCGGCGATATAGGCGCCAGC-3』1.1.3博亞公司合成RN引物上遊引物1 27bp含NdeI位點下遊引物 27bp含KpnI位點
1.2突變型TNFαm1的獲得PCR反應條件為94℃變性3分鐘後開始循環94℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒。經25個循環後，72℃延伸10分鐘。使用的擴增酶高保真Pfu。以1.0％瓊脂糖凝膠回收PCR產物中的目的片段，得到514bp左右的DNA片段。
利用TNFαm1 PCR引物對對本實驗室構建的TNFαcDNA。進行特異擴增，其結果是在TNFαcDNA的5』端引入1個KpnI位點(GGT ACC)和幾個額外的編碼胺基酸的密碼子GGT ACCGTAAGA GGT CCA(其中帶下劃線的為較原型比多出來的密碼子)，這段DNA序列對應的胺基酸序列為Gly ThrValArg Gly Pro(帶下劃線的為較原型比多出來的胺基酸).同時，還在其3』端引入1個BamHI位點(GGATCC)和2個終止密碼子(UAA UGA)。
1.3RN片斷的獲得PCR反應條件為94℃預變性3分鐘開始循環94℃變性30秒，58℃退火35秒，72℃延伸30秒。經過25個循環後，72℃延伸10分鐘。使用高保真的pfu酶，以2.5％瓊脂糖凝膠回收，得到約90bp的PCR產物。
利用TNFαm1 RN引物對對本實驗室構建的CCR5cDNA為模板經PCR得到含CCR5N端前30個胺基酸的編碼序列，即RN，同時在上遊引入NdeI位點、下遊引入KpnI位點。
1.4.重組表達質粒pET30a-RNTNFαm1的構建用BamH I及Nde I雙酶切處理pCW111質粒，回收4887bp的酶切產物，與經NdeI、KpnI雙酶切處理的RNPCR產物，經BamHI、KpnI雙酶切處理的TNFαm1 PCR產物連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5α，塗布在含氨苄青黴素(100μg/ml)的LB瓊脂平板上，利用藍白板篩選陽性克隆。按照《分子克隆實驗指南》(第二版)(J.薩姆布魯克，等.主編，金冬雁等譯，科學出版社，1992)的鹼裂解法小量製備抗性克隆的質粒DNA，限制性分析證實質粒插入片段大小與目的基因相符，獲得重組質粒pCW-RNTNFαm1。由於RNTNFαm1融合基因在pCW111中不表達，將重組質粒pCW-RNTNFαm1和載體pET30a(+)分別用BamH I及Nde I雙酶切處理，將片斷RNTNFαm1平移至pET30a(+)獲得表達重組質粒pET30a-RNTNFαm1。重組體構建示意圖見圖1，酶切鑑定見圖4，測序結果見圖29，30。
實施例2.表達型重組體pCW-XETNFαm1的構建對用pfu酶擴增獲得的TNFαm1的平端PCR產物與經EcoRV酶切處理的pBSks質粒片段平端連接。轉化前取約0.1μlEcoRV處理酶連產物，置37℃水浴一小時。將因通過EcoRV酶切位點自連而形成的pBSks空質粒線性化，有效降低載體的自連。因插入方向不同，得到兩種產物，通過BamHI單酶切，捨去無法切出約500bp的片段反向插入產物，用ApaI、KpnI雙酶切處理定向的pBS-TNFαm1正向連接產物，回收534bp的片段。人工合成的質粒pGEM-XE含大腸桿菌嗜好的編碼CXCR4N端的前27個胺基酸(即XE)的編碼序列。將質粒pGEM-XE和用ApaI、KpnI雙酶切處理後回收大片段，與同樣經過ApaI和KpnI雙酶切處理後回收的pBS-TNFαm1酶切產物小片段連接，獲得質粒pGEM-XETNFαm1。用BamHI、NdeI雙酶切處理質粒pGEM-XETNFαm1及載體pCW111，將融合基因XETNFαm1平移至載體pCW111，獲得表達重組體pCW-XETNFαm1。重組體構建示意圖見圖2，酶切鑑定見圖4，測序結果見圖31，32。
實施例3.表達型重組質粒pCW-XETNFαm2的構建3.1TNFαm2片段的獲得以pCW-XETNFαm1為模板，博亞公司合成引物上遊引物 30bp含PstI和KpnI位點下遊引物 25bp含BamHI位點PCR反應條件為94℃預變性3分鐘開始循環94℃變性30秒，56℃退火35秒，72℃延伸50秒。經過25個循環後，72℃延伸10分鐘。使用高保真的pfu酶，以1.5％瓊脂糖凝膠回收，得到約477bp的PCR產物。利用TNFαm2PCR引物對對質粒pCW-CD4V1TNFαm1進行特異擴增，其結果是獲得將原型TNFα的N端前7個胺基酸缺失突變，並將Pro8，Ser9，Asp10突變為arg8，Lys9，Arg10，獲得的減毒強效突變的TNFαm2。同時，還在其3』端引入1個BamHI位點(GGA TCC)和2個終止密碼子(UAA UGA)。將pfu酶擴增得到的PCR產物經BamHI和XhoI雙酶切，玻璃奶回收酶切產物後，與經過BamHI和XhoI雙酶切處理的PBSSK粘端連接，獲得重組質粒pBS-TNFαm2。
3.2重組質粒pCW-XETNFαm2的構建將pBS-TNFαm2經KpnI和BamHI雙酶切處理，回收477bp的酶切產物，與經過同樣雙酶切處理的pCW-XETNFαm1回收得到的載體連接，獲得表達型重組質粒pCW-XETNFαm2。其重組質粒構建見圖3，酶切鑑定見圖5，測序結果見圖33。
實施例4.融合蛋白XE-TNFαm1、RNTNFαm1和XE-TNFαm2在大腸桿菌中的表達4.1目的蛋白的表達與鑑定將表達重組體pCW-XETNFαm1、pCW-XETNFαm2轉化DH5α，然後接種於5ml LB培養基，同時加入終濃度為100mg/ml的氨苄青黴素，32℃振搖培養過夜。按2％接種量重新接種兩管5ml LB/Amp+培養液。在32℃下振搖培養至OD600約為0.6時。然後分出一管置於42℃搖床，振搖培養誘導5h；另一管繼續在32℃振蕩培養5h，作為對照。將p30a-RNTNFαm1轉化BL21，然後然後接種於5ml LB培養基，同時加入終濃度為100mg/ml的卡那黴素，37℃振搖培養過夜。在37℃下振搖培養至OD600約為0.6時。然後分出一管加入1mMIPTG，置於37℃搖床，振搖培養誘導5h；另一管繼續在37℃振蕩培養5h，作為對照。4000g離心收集菌體，加入上樣緩衝液(50mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，100mmol/L DTT，2％SDS，0.1％溴酚藍，10％甘油)，混勻，置於100℃沸水浴保持5min。10000g離心1min，取上清進行聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。目的蛋白質表達量通過Chromscan3快速凝膠掃描儀於626nm波長處掃描，並計算表達量。詳細方法參見參見盧聖棟主編的《現代分子生物學實驗技術》第二版，365-387頁。
4.2結果經SDS-PAGE分析顯示，pCW-XETNFαm1/DH5α、p30a-RNTNFαm1/BL21表達的目的蛋白分別在約21kD、21kD處有明顯的蛋白帶出現，而未誘導樣品在相應位置上沒有該條帶，蛋白大小與預期一致，初步斷定為目的蛋白，見圖6，圖7。經SDS-PAGE凝膠雷射掃描分析，XETNFαm1、RNTNFαm1目的蛋白分別佔細胞總蛋白的27.4％、15.6％，見圖9、10。pCW-XETNFαm2/DH5α在大約20kD處有特異的蛋白表達條帶，見圖8，與預期分子量一致。經雷射密度掃描，其表達蛋白在總蛋白中的含量分別為38.6％，見圖11。
實施例5.融合蛋白XE-TNFαm1、RNTNFαm1和XE-TNFαm2的大量製備與純化、復性。
5.1大體積培養工程菌pCW-XETNFαm1/DH5α、pCW-XETNFαm2/DH5α接種於50m1 LB培養基，同時加入終濃度為100mg/ml的氨苄青黴素，32℃振搖培養過夜。按2％接種量重新接種於兩瓶分別含有500ml LB/Amp+培養液的2L三角瓶中。在32℃下振搖培養至OD600約為0.6時。然後置於42℃繼續振搖培養誘導5h。工程菌p30a-RNTNFαm1/BL21接種於50ml LB培養基，同時加入終濃度為100mg/ml的卡那黴素，37℃振搖培養過夜。按2％接種量重新接種於兩瓶分別含有500ml LB/Ka+培養液的2L三角瓶中。在37℃下振搖培養至OD600約為0.6時，加入IPTG1mM，繼續振搖培養誘導5h。4000g離心、收集菌體，置於-20℃反覆凍融。
5.2包涵體的製備5.2.1洗滌細胞
6000g×15分鐘離心收集細菌，稱重溼菌體。
用3％Triton X-100洗滌菌體，攪拌器上攪勻30分鐘，6000g×15分鐘離心收集用量為10ml-50ml緩衝液/1g溼菌體(包括下列各種洗滌緩衝液)。
5.2.2破細胞用緩衝液將細胞懸浮，緩衝液配製50mmol/L Tris.Cl(pH8.5-9.0)，2mmol/LEDTA，100mmol/L NaCl，0.5％Triton X-100，溶菌酶1mg/ml)。用攪拌器在室溫下攪拌，使得懸浮液因溶菌酶的作用而粘稠。
5.2.3超聲處理每次超打10秒，間隔15秒，20-50次作用(視菌體濃度而定)，至菌體不再粘稠為止。然後離心收集，6000g×15分鐘。上述操作應在冰水中進行，為防止炭化，超聲功率不宜過大，在玻璃燒杯中進行較好，超聲波探頭深入液面大於3釐米，距杯底2釐米位好。
5.2.45％Triton X-100洗滌用緩衝液徹底懸浮沉澱，攪拌並超聲波處理30次，參見上述步驟2.3。緩衝液為50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，2mmol/L EDTA，5％TritonX-100。離心收集沉澱，6000g×15分鐘。
5.2.5包涵體的保存與溶解用少量8M尿素逐漸溶解包涵體，取20μl溶液加入2X上樣緩衝液，混勻，沸水中煮3-5分鐘。取20ul進行SDS-PAGE電泳分析。其餘包涵體可凍存於-70℃。
5.3.目的蛋白的純化取上述的包涵體溶液，加入等體積2x上樣緩衝液中，進行15％的SDS-PAGE電泳。
5.3.1.融合蛋白XE-TNFαm1、RNTNFαm1和XE-TNFαm2的純化5.3.1.1凝膠切割切下蛋白Marker泳道所在的膠條和少部分樣品膠條，將其放入快速染色液中速染15分鐘，剩餘凝膠用保鮮膜包好置於4℃冰箱。速染的膠條脫色顯出條帶後，將膠條與剩餘的凝膠對比，切下含目的帶部分的凝膠條。
5.3.1.2.電洗脫將切下的凝膠條及凝膠浸泡液裝入透析袋中並置於水平電泳槽中，加入蛋白電泳洗脫進行恆壓100v電泳。電泳10～12h後將洗脫液還位透析液再電泳10～12h。將透析袋中的浸泡液倒入50ml離心管中，如溶液較多可先用適量PEG10000濃縮。
5.3.1.3.痕量SDS的去除在離心管中加入5倍體積以上的冰凍酸性丙酮-甲醇蛋白沉澱液，20℃沉澱過夜。10,000r/m離心10分鐘，去掉上清收集沉澱。將收集的沉澱用蛋白沉澱液洗滌1次。
5.3.2.融合蛋白XE-TNFαm2的純化在反向柱純化過程中，通過梯度洗脫髮現該蛋白的洗脫峰在30％左右，見圖12，13。因此收集該峰並進行凍幹。將凍幹樣品溶解於生理鹽水中，0.22μm過濾膜後電泳以觀察該重組蛋白的溶解情況，電泳發現該當蛋白的純度較高時，能夠較好地溶解於生理鹽水中，當含有雜蛋白時，會出現乳白色沉澱。將收集到的樣品溶解於生理鹽水後過0.22μm濾膜，凍幹，完全去除乙腈後保存至-80℃冰箱。層析條件層析注Waters AP-1空柱自填6mlSource15RPC樹脂；起始緩衝液RA10％乙睛，0.05％TFA；洗脫緩衝液RB90％乙睛，0.05％TFA；樣品每次上樣2ml；流速2ml；梯度0-100％，15min收集目的蛋白主要在30％RB處被洗脫。
5.4融合蛋白的復性5.4.1融合蛋白XE-TNFαm1和RNTNFαm1的復性將洗滌後的蛋白沉澱用變性緩衝液(6mol/L鹽酸胍，0.1mol/Ltris-HCl，PH 8.6，1mmol/L EDTA，0.05mmol/L NaCl，10mmol/L DDT)在冰浴中溶解後轉入透析袋內，同時在透析袋內加入蛋白復性液(50mmol/L Tris-HCl，PH8.0，1mmol/LEDTA，0.25mol/L NaCl，0.25mol/L左旋精氨酸，5mmol/L DDT)中，於蒸餾水中4℃透析48小時以使蛋白復性。
5.4.2融合蛋白XE-TNFαm2的復性反相柱收集到的蛋白含有乙腈這樣的有機溶劑，儘管冷凍抽乾已經將有機溶劑完全去除，但為了更好地使蛋白復性，在細胞試驗前一天，用細胞培養基溶解蛋白乾粉，在蛋白透析復性緩衝液中透析24小時，然後將復性好的蛋白溶液過濾除菌，同時定量。
蛋白復性緩衝液的配製Tris-HCI 20mM(pH7.2).
GSH/GSSG 4mM/1mM精氨酸0.1M透析液的配製Tris-HCI 20mM(pH7.2)實施例6.融合蛋白XE-TNFαm2理化指標的測定6.1融合蛋XETNFαm2胺基酸序列的測定將凍幹的蛋白樣品由中國醫學科學院基礎醫學院中心實驗室利用ABI Procise491型測序儀，進行N端胺基酸測序。結果表明其序列為MNVSEADDRYIXDRF。與理論值完全符合。詳細結果見「胺基酸序列分析鑑定書」(見附錄1)。
6.2融合蛋白XETNFαm2的MALDI-TOF MS檢測鑑定
6.2.1考馬斯亮藍染色凝膠膠內酶切肽譜的樣品製備6.2.1.1脫色1)將蛋白帶切下，用刀片將膠帶切成小塊，水洗數次。
2)用約5倍體積的含50％乙氰的25mM碳酸氫銨溶液浸泡片(50-100μl)，振蕩20min，放在室溫1hr.，使膠塊完全脫水(直至無藍色為好)。
3)棄上清，旋轉真空乾燥後，加入25-30μl酶液(25μg/m含25mM碳酸氫銨)，4℃冰箱中放置20-30min，使酶液完全被吸收(如酶液不夠，可補充5-10μl)。
4)37℃保溫反應12小時以上或過夜。
6.2.1.2.肽提取1)加5％TFA-50％ACN 100μl，於37℃保溫1小時。
2)吸出上清液，置於另一個Eppendrof管中，再向膠塊管加入2.5％TFA-50％ACN溶液100μl，於37℃保溫1小時，吸出上清。
3)合併上清液，旋轉真空乾燥。
6.2.1.3.質譜樣品的製備1)樣品含量較高時，用3-6μl 0.5％TFA溶液溶解樣品，取1μl樣品與1μl Matrix混勻，測MALDI-TOF-MS串連質譜分析鑑定出相關蛋白為人屬的腫瘤壞死因子alpha，並測定其分子量為17.4KD，等電點為8.6(見附錄2)。
實施例7重組靶向融合蛋白對SIV感染的CEMX-174的殺傷作用7.1模式細胞的製備由於HIV不感染其它動物的CD4陽性細胞，因而迄今尚無一種人的愛滋病動物模型。猩猩感染HIV-1後僅僅表現為暫時性的T細胞數量的改變以及產生抗體，並不發展成愛滋病臨床症狀。研究發現HIV-2和SIVMAC9亞洲短尾猴種分離的免疫缺陷病毒的核苷酸序列有大約75％甚至更高的同源性，與HIV-1僅有45％的同源性。但由於SIV和HIV-1在感染、複製、和調控方面基本相似，可通過研究SIV引起的靈長類動物愛滋病作為研究人類愛滋病的基礎。因此本實驗採用SIV進行初步的體外實驗來反應靶向融合蛋白地抗HIV/SIV作用。
本試驗所使用的模式細胞為CEMX-174細胞株(中國醫學科學院試驗動物研究所病毒室)。具體地，首先將液氮保存的CEMX-174細胞復甦，轉接於含10％胎牛血清(天津三得利公司)的1640培養基(Gibco-BRL公司，洛克維爾，馬裡蘭州，美國)的100ml的培養瓶中，37℃、5％CO2的培養箱中培養，48小時後換液，隨後在培養液中加入病毒滴度大於5120的SIV，來感染CEMX-174細胞。由於該細胞易於被感染且效率高，所以每隔6-8小時在顯微鏡下觀察細胞被感染情況，包括被感染細胞的百分率以及細胞的形態改變等。經過4-5天的培養和反覆感染，用免疫螢光檢測感染效率，平均感染率約47％。
7.2實驗方法與結果7.2.1MTT法測定細胞活性以往細胞試驗都是通過細胞計數來估計細胞活性的，這樣因其主觀因素和自身許多缺陷使得結果可信度不高。本發明採用MTT法測定細胞活性。MTT的商品名為噻唑藍，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源的MTT還原成難溶性的藍紫色結晶，並沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞碸(DMSO)能溶解細胞中的藍紫色結晶。用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其OD值，可間接反映活性細胞的數量。在一定範圍內，MTT結晶物形成量與細胞數量成正比。所以本發明採用MTT測定細胞活性，提高結果的客觀性、可信度。
7.2.2實驗結果及說明本試驗採用5個劑量組，使融合蛋白XE-TNFαm1、RNTNFαm1藥物終濃度為8、16、32、64、128μg/ml，融合蛋白XE-TNFαm2藥物終濃度為1，2，4，8，16μg/ml。於24孔細胞培養板中分別處理2.0×105/ml被SIV感染的CEMx-174細胞及未被病毒感染的正常細胞。設立正常的CEMx-174細胞對照組和1640培養基的調零孔。在殺傷試驗中，以蛋白處理過的感染SIV的CEMx-174細胞為試驗組，以未加蛋白的感染SIV的CEMx-174細胞為對照組。同時為評價融合蛋白的安全性和證實融合蛋白作用的靶向性，設立融合蛋白作用於正常細胞的對照組；為證實融合蛋白作用的機制，設立了野生型TNFα作用於SIV感染細胞的對照組。48小時後通過螢光染色和計數得出試驗組和各種對照組的SIV感染的螢光百分比(每500個細胞中，計數SIV感染細胞的合胞體形成率)，同時用MTT法測定細胞OD值，算出融合蛋白的殺傷率。對相對應的試驗組和對照組的存活細胞的OD值進行方差分析(analysis of variance)和配對T檢驗，結果顯示(見表1-1，1-2，2-1，2-2)。殺傷試驗的結果顯示，在8、16、32、64、128μg/ml的劑量範圍下，融合蛋白XE-TNFαm1對感染SIV的CEMx-174細胞的殺傷率分別為17.3％，32.9％，38.7％，45.4％，54.9％；融合蛋白RNTNFαm1對感染SIV的CEMx-174細胞的殺傷率分別為16.2％，20.3％，28.2％，31.7％，33.7％。在1，2，4，8，16μg/ml的劑量範圍內，融合蛋白XE-TNFαm2對感染SIV的CEMx-174細胞的殺傷率分別為21.0％，30.0％，37.6％，49.8％，65.3％。由此可見，三種融合蛋白實驗組OD值均顯著低於對照組，在各自的劑量範圍內對SIV感染細胞有明顯的殺傷作用，並且呈良好的劑量-效應關係(見圖14，15)。同時，單獨用TNFα蛋白分別在8、16、32、64、128μg/ml和1、2、4、8、16μg/ml劑量下對感染SIV的CEMx-174細胞後，觀察細胞的生長狀況，MTT法顯示對照組和用藥組細胞的生長情況無統計學意義的差異(**P＞0.20)，可認為TNFα對SIV感染細胞無殺傷作用。說明了單獨的TNFα蛋白由於沒有靶向分子的介導，對感染SIV的CEMx-174細胞不具備殺傷作用。驗證了三種融合蛋白對感染SIV的CEMx-174細胞的殺傷作用必須通過靶向性分子的介導，符合實驗設計要求。表四的數據顯示，三種融合蛋白在各自的劑量下作用於未感染SIV的CEMx-174正常細胞，其細胞的生長情況和正常細胞的生長情況無統計學意義的差異，**P＞0.20。這些數據說明，三種融合蛋白對正常的未感染SIV的CEMx-174細胞無統計學意義的殺傷作用，融合蛋白的安全性得以保障，並證實了靶向性融合蛋白的特異性殺傷作用，符合實驗設計要求。
殺傷率＝1-(對照組OD值-調零組OD值)×對照組感染率÷(試驗組OD值-調零組OD值)×試驗組感染率表1-1.殺傷試驗結果

說明1每組劑量有3個平行孔，每個孔用MTT法測定3次
2NC代表正常的CEMx-174細胞，NC/SIV代表感染了SIV的CEMx-174細胞，螢光計數百分比即為感染率3各融合蛋白作用組測定的OD值與對照組(NC/SIV)相比較，均有顯著性差異*P＜0.054TNFα作用組與對照組(NC/SIV)相比較，無統計學意義的差異(**P＞0.20)5數值的計算方法見正文說明表1-2.殺傷試驗結果

說明1每組劑量有3個平行孔，每個孔用MTT法測定3次2NC代表正常的CEMx-174細胞，NC/SIV代表感染了SIV的CEMx-174細胞，螢光計數百分比即為感染率3各融合蛋白作用組測定的OD值與對照組(NC/SIV)相比較，均有顯著性差異*P＜0.054TNFα作用組與對照組(NC/SIV)相比較，無統計學意義的差異(**P＞0.20)5數值的計算方法見正文說明表2-1.融合蛋白對正常CEMx-174細胞的作用


說明1每組劑量有3個平行孔，每個孔用MTT法測定3次2NC代表正常的CEMx-174細胞3各融合蛋白作用組與對照組(NC/SIV)相比較，無統計學意義的差異(**P＞0.20)表2-2.融合蛋白對正常CEMx-174細胞的作用

說明1每組劑量有3個平行孔，每個孔用MTT法測定3次2NC代表正常的CEMx-174細胞3各融合蛋白作用組與對照組(NC/SIV)相比較，無統計學意義的差異(**P＞0.20)實施例8重組靶向融合蛋白XETNFαm1、RNTNFαm1和XETNFαm2對SIV感染的CEMX-174的保護作用8.1模式細胞的製備同7.18.2實驗方法與結果8.2.1MTT法測定細胞活性同7.2.18.2.2實驗結果及說明用正常培養的CEMx-174細胞作為正常組，以1640培養基為調零組，以蛋白處理過的CEMx-174細胞和SIV病毒顆粒混合物為試驗組，以未加蛋白的CEMx-174細胞和SIV病毒顆粒混合物為對照組，共測試三個加樣組，每組又分5個劑量組，融合蛋白XE-TNFαm1、RNTNFαm1的劑量範圍為2、4、8、16、32μg/ml，融合蛋白XE-TNFαm2的劑量範圍為1、2、4、8、16μg/ml。在2、4、8、16、32μg/ml的劑量範圍內，融合蛋白XE-TNFαm1對CEMx-174細胞的保護率分別為12.7％，15.7％，26.6％，33.5％，40.2％；RNTNFαm1對CEMx-174細胞的保護率分別為13.3％，18.6％，19.5％，24.3％，31.8％。在1、2、4、8、16μg/ml的劑量範圍內，融合蛋白XE-TNFαm2對CEMx-174細胞的保護率分別為13.6％，18.9％，29.1％，38.0％，50.4％。中和試驗的結果表明(見表3-1，3-2))，三種融合蛋白實驗組OD值均顯著高於對照組，在各自的劑量範圍內對SIV感染細胞有明顯的保護作用，並且呈良好的劑量-效應依賴關係(見圖16，17)。
保護率＝(試驗組OD值-調零組OD值)-(對照組OD值-調零組OD值)÷(試驗組OD值-調零組OD值)表3-1.中和試驗結果

表3-2.中和試驗結果

說明1每組劑量有3個平行孔，每個孔用MTT法測定3次2NC代表正常的CEMx-174細胞，NC+SIV代表混合有SIV顆粒的正常的CEMx-174細胞3試驗組測定的OD值與對照組(NC+SIV)相比較，均有顯著性差異*P＜0.05實施例9殺傷試驗及中和試驗的病毒滴度試驗將融合蛋白殺傷處理後培養48h的細胞培養液混勻，(中和試驗要處理7天)，按照10、20、40、80、160、320、640、1280、2560倍以培養基進行稀釋。分別取各稀釋液100μl於新的無菌96孔板中，加等量的1.0×105/mlCEMx-174細胞，置37℃ CO2培養箱(95％空氣，5％CO2)中孵育，每48小時更換一半新鮮培養基。7天後觀察結果，以細胞融合形成的多核大細胞為指標確定滴度。(結果見表1-1，1-2，3-1，3-2)細胞培養物上清中的病毒完全是由於受病毒感染的細胞在病毒繁殖後裂解而釋放到上清中的。上清中的病毒數量可通過病毒滴度試驗來確定。在一定的稀釋度下，上清中的病毒被稀釋到滴度實驗的檢測靈敏度範圍以下，這樣的稀釋物加入正常細胞培養物中不導致合胞體的產生。我們採用2n梯度稀釋上清以感染細胞的方法，經過一段時間的培養，以培養細胞中合胞體的產生與否為標準確定病毒感染細胞的情況，可以直接得出在何稀釋度下病毒濃度低於滴度試驗的檢測靈敏度範圍的結果。以此為根據可推斷上清中原來含有的病毒的相對濃度，該指標可作為病毒學檢驗的客觀指標。從病毒滴度示意圖(圖18-21)中可看出實驗組與陽性對照組之間在殺傷試驗和中和試驗後病毒滴度結果上均曾現明顯差異，並呈明顯的劑量關係，從圖中可以看出隨著藥物劑量的增加，殺傷組和中和組病毒滴度逐漸下降。
實施例10感染細胞的螢光計數及顯微照相將殺傷試驗和中和試驗中各培養孔的細胞充分混懸，取1ml細胞培養液，3000rpm離心3分鐘，棄上清。再用1ml的PBS洗一次，棄上清，在逐漸加入PBS，混懸細胞，調整細胞濃度為2×105/ml。取15μl混懸液滴加在載玻片上的環內，自然晾乾，在丙酮中4℃固定20分鐘，取出晾乾，加入gp120的抗體(猴抗SIV抗體，來自感染SIV猴的血清)，37℃、水浴30分鐘。然後用pH7.2的PBS衝洗，並置於其中浸泡10分鐘，其間不斷振搖。取出片子後，再加入用萬分之二的Evens蘭配製的兔抗猴抗體(即二抗)，37℃水浴30分鐘，用PBS衝洗，晾乾後在螢光顯微鏡下觀察、計數螢光細胞數並拍照。在螢光顯微鏡下觀察被SIV/HIV感染的細胞在藍色光的激發下發黃綠色螢光，可以看到細胞周邊呈黃綠色，而未被感染的細胞則不呈黃色，呈暗紅色。殺傷試驗和保護試驗結果中的螢光感染率見表1-1，1-2，2-1，2-2。殺傷試驗前後的螢光照片見圖22-1和圖22-2。圖22-1中可見被SIV/HIV感染的細胞，而圖22-2中可見許多細胞碎片，為被融合蛋白殺傷的SIV/HIV感染的細胞。保護試驗前後的螢光照片見圖23-1和圖23-2。圖23-1中可見被SIV/HIV感染的細胞，而圖23-2中多見未受SIV/HIV感染的正常細胞，說明細胞受到了融合蛋白的有效保護。
實施例11流式細胞儀檢測融合蛋白XETNFαm2作用組的細胞凋亡11.1流式細胞儀檢測細胞的凋亡-Annexin-V細胞凋亡檢測試劑盒細胞凋亡是細胞的基本特徵之一，它在機體的胚胎發育，組織修復及內環境的穩定等方面起著重要的作用。細胞凋亡調節的失控可導致臨床各種疾病的發生。細胞凋亡有別與細胞死亡，它有一系列的細胞形態學和生化的改變，包括出現染色體濃縮，DNA降解，凋亡小體形成等。在正常的活細胞，磷脂醯絲氨酸(phosphotidylserine，PS)位於細胞膜的內側，但在凋亡的細胞，PS從細胞膜得內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-V是一種分子量為35-36KD的Ca++依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。因此將Annexin-V進行螢光素(如FITC，PE)或BIOTIN標記，以標記了的Annexin-V作為螢光探針，利用流式細胞儀或螢光顯微鏡檢測細胞凋亡的發生。這是目前公認的靈敏、高效的凋亡細胞的監測方法。
Propidum iodide(PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡晚期的細胞和死亡細胞，PI能夠透過而使其染紅因而將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞以及死細胞區分開來。
試劑盒組成(50/25TESTS)Annexin V-FITC 500/250ul @20ug/mlBinding buffer 40/20mlPBS60/30mlPropidium Iodine(PI)250ul/125ul @50ug/ml操作步驟1.調整待測細胞的濃度為5×105-1×106個/ml2.取1ml細胞，1000rpm4度離心10分鐘，棄上清。
3.加入1ml冷的PBS，輕輕振蕩使細胞懸浮。
4.1000rpm4度離心10分鐘，棄上清5.重複步驟3、4兩次。
6.對於貼壁細胞，先用胰酶消化，再用PBS洗滌。
7.將細胞重懸於200ul的binding buffer8.加入10ulAnnexin V-FITC和5ul的PI，輕輕混勻，避光室溫反應15分鐘或4度反應30分鐘9.加入300ulbinding bufer，立即上機檢測10.若用螢光顯微鏡檢測，將細胞混勻液離心，取細胞沉澱塗片，再進行觀察。
11.2試驗結果如表4所示，在殺傷試驗中，細胞凋亡率如下對照組21.2％；16μg/ml的劑量下，XETNFαm2作用組為47.1％，TNFαm2作用組為20.8％。中和試驗中，對照組20.3％，XETNFαm2作用組為11.3％。初步證實XETNFαm2可特異性地引發HIV/SIV感染細胞的凋亡，同時保護正常細胞。
表4


儘管根據上面的實施例結合附圖已經很好的描述了本發明，但應當理解的是，多種修飾和變化都包含在本發明的精神和範圍內。而限制本發明的僅僅是所附的權利要求。
序列表110中國醫學科學院基礎醫學研究所；中國醫學科學院輸血研究所；以及中國醫學科學院實驗動物研究所120三種用於治療獲得性免疫缺陷症候群的重組靶向融合蛋白130
16014170PatentIn version 3.1210121196212DNA213人4001catatggact accaggtttc cagcccgatc tacgacatca actactacac ttccgaaccg60tgccagaaaa tcaacgttaa acagatcgct gctcgt 96210221132212PRT213人
4002His Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr1 5 10 15Thr Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg20 25 30210321187212DNA213人4003catatgaacg tttccgaagc tgacgaccgt tacatctgcg accgtttcta cccgaacgac60ctgtgggttg tggttttcca gttccag87210421129212PRT213人4004His Met Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe1 5 10 15Tyr Pro Asn Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln20 252105211492
212DNA213人4005ggtaccgtaa gaggtccaag atcatcttct aaaaccccga gtgacaagcc tgtagcccat60gttgtagcaa accctcaagc tgaggggcag ctccagtggc tgaaccgccg ggccaatgcc120ctcctggcca atggcgtgga gctgagagat aaccagctgg tggtgccatc agagggcctg180tacctcatct actcccaggt cctcttcaag ggccaaggct gcccctccac ccatgtgctc240ctcacccaca ccatcagccg catcgccgtc tcctaccaga ccaaggtcaa cctcctctct300gccatcaaga gcccctgcca gagggagacc ccagaggggg ctgaggccaa gccctggtat360gagcccatct atctgggagg ggtcttccag ctggagaagg gtgaccgact cagcgctgag420atcaatcggc ccgactatct cgactttgcc gagtctgggc aggtctactt tgggatcatt480gccctgtgat aa4922106211162212PRT213人4006Gly Thr Val Arg Gly Pro Arg Ser Ser Ser Lys Thr Pro Ser Asp Lys1 5 10 15Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln20 25 30Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu35 40 45
Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr50 55 60Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu65 70 75 80Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val85 90 95Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu100 105 110Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val115 120 125Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro130 135 140Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile145 150 155 160Ala Leu2107211463212DNA213人4007ggtacccgta aacgcaagcc tgtagcccat gttgtagcaa accctcaagc tgaggggcag60ctccagtggc tgaaccgccg ggccaatgcc ctcctggcca atggcgtgga gctgagagat120aaccagctgg tggtgccatc agagggcctg tacctcatct actcccaggt cctcttcaag180ggccaaggct gcccctccac ccatgtgctc ctcacccaca ccatcagccg catcgccgtc240
tcctaccaga ccaaggtcaa cctcctctct gccatcaaga gcccctgcca gagggagacc300ccagaggggg ctgaggccaa gccctggtat gagcccatct atctgggagg ggtcttccag360ctggagaagg gtgaccgact cagcgctgag atcaatcggc ccgactatct cgactttgcc420gagtctgggc aggtctactt tgggatcatt gccctgtgat aaa 4632108211152212PRT213人4008Gly Thr Arg Lys Arg Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln1 5 10 15Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu20 25 30Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu35 40 45Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys50 55 60Pro Ser Thr His ValLeu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val65 70 75 80Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys85 90 95Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro100 105 110Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser
115 120 125Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln130 135 140Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 1502109211594212DNA213人4009catatggact accaggtttc cagcccgatc tacgacatca actactacac ttccgaaccg60tgccagaaaa tcaacgttaa acagatcgct gctcgtggta ccgtaagagg tccaagatca120tcttctaaaa ccccgagtga caagcctgta gcccatgttg tagcaaaccc tcaagctgag180gggcagctcc agtggctgaa ccgccgggcc aatgccctcc tggccaatgg cgtggagctg240agagataacc agctggtggt gccatcagag ggcctgtacc tcatctactc ccaggtcctc300ttcaagggcc aaggctgccc ctccacccat gtgctcctca cccacaccat cagccgcatc360gccgtctcct accagaccaa ggtcaacctc ctctctgcca tcaagagccc ctgccagagg420gagaccccag agggggctga ggccaagccc tggtatgagc ccatctatct gggaggggtc480ttccagctgg agaagggtga ccgactcagc gctgagatca atcggcccga ctatctcgac540tttgccgagt ctgggcaggt ctactttggg atcattgccc tgtgataagg atcc 59421010211193212PRT213人
40010Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr1 5 10 15Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Gly20 25 30Thr Val Arg Gly Pro Arg Ser Ser Ser Lys Thr Pro Ser Asp Lys Pro35 40 45Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp50 55 60Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg65 70 75 80Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser85 90 95Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu100 105 110Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn115 120 125Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly130 135 140Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe145 150 155 160Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp165 170 175Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala180 185 190
Leu21011211585212DNA213人40011catatgaacg tttccgaagc tgacgaccgt tacatctgcg accgtttcta cccgaacgac60ctgtgggttg tggttttcca gttccagggt accgtaagag gtccaagatc atcttctaaa120accccgagtg acaagcctgt agcccatgtt gtagcaaacc ctcaagctga ggggcagctc180cagtggctga accgccgggc caatgccctc ctggccaatg gcgtggagct gagagataac240cagctggtgg tgccatcaga gggcctgtac ctcatctact cccaggtcct cttcaagggc300caaggctgcc cctccaccca tgtgctcctc acccacacca tcagccgcat cgccgtctcc360taccagacca aggtcaacct cctctctgcc atcaagagcc cctgccagag ggagacccca420gagggggctg aggccaagcc ctggtatgag cccatctatc tgggaggggt cttccagctg480gagaagggtg accgactcag cgctgagatc aatcggcccg actatctcga ctttgccgag540tctgggcagg tctactttgg gatcattgcc ctgtgataag gatcc58521012211190212PRT213人40012Met Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr1 5 10 15
Pro Asn Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln Gly Thr Val Arg20 25 30Gly Pro Arg Ser Ser Ser Lys Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His35 40 45Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg50 55 60Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln65 70 75 80Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu85 90 95Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr100 105 110Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser115 120 125Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala130 135 140Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu145 150 155 160Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp165 170 175Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu180 185 19021013211550212DNA
213人40013catatgaacg tttccgaagc tgacgaccgt tacatctgcg accgtttcta cccgaacgac60ctgtgggttg tggttttcca gttccagggt acccgtaaac gcaagcctgt agcccatgtt120gtagcaaacc ctcaagctga ggggcagctc cagtggctga accgccgggc caatgccctc180ctggccaatg gcgtggagct gagagataac cagctggtgg tgccatcaga gggcctgtac240ctcatctact cccaggtcct cttcaagggc caaggctgcc cctccaccca tgtgctcctc300acccacacca tcagccgcat cgccgtctcc taccagacca aggtcaacct cctctctgcc360atcaagagcc cctgccagag ggagacccca gagggggctg aggccaagcc ctggtatgag420cccatctatc tgggaggggt cttccagctg gagaagggtg accgactcag cgctgagatc480aatcggcccg actatctcga ctttgccgag tctgggcagg tctactttgg gatcattgcc540ctgtgataaa 55021014211180212PRT213人40014Met Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr1 5 10 15Pro Asn Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln Gly Thr Arg Lys20 25 30Arg Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln35 40 45
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權利要求
1.一種編碼靶向融合蛋白的基因，其特徵在於其包含編碼能夠結合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽的基因和編碼具有殺細胞作用的殺傷多肽的基因。
2.如權利要求1所述的靶向融合蛋白基因，其特徵在於所述的編碼能夠結合HIV/SIV的gp120和/或gp41的輔助受體多肽的基因選自SEQ ID NO1和SEQ IDNO3所示的核苷酸序列，所述的編碼具有殺細胞作用的殺傷多肽的基因選自SEQID NO5和SEQ ID NO7的核苷酸序列。
3.如權利要求2所述的靶向融合蛋白基因，其特徵在於所述的基因具有如SEQ ID NO9、11或13所示的核苷酸序列。
4.一種靶向融合蛋白，其特徵在於其包含能夠結合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽和具有殺細胞作用的殺傷多肽。
5.如權利要求4所述的靶向融合蛋白，其特徵在於其中所述的能夠結合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽包括RN或XE，或者它們的相關片斷、類似物或突變體，所述的殺傷多肽是包括TNFα、TNFβ、TNFγ或其衍生物或其突變體的TNF家族成員；或TNF超家族成員；或所述的多肽是來源於人體的穿孔素、補體成分C9及顆粒溶解素；或者來源於人體的顆粒酶家族的顆粒酶A，B，C，D，E、絲氨酸酯酶；或蛋白激酶C、蛋白激酶A、天冬氨酸激酶、細胞色素或DNA核酸內切酶；或可以抵禦細菌的多肽和酶，如溶菌酶、防禦素；或抗癌基因及其編碼的蛋白質；以及一切來源於人體的具有致死細胞功能的基因及其編碼蛋白質、或者是它們的活性功能區域、突變體或類似物。
6.如權利要求5所述的靶向融合蛋白，其特徵在於其中所述的能夠結合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽選自XE和RN，以及所述的殺傷多肽TNFα變異體。
7.如權利要求6所述的靶向融合蛋白，其特徵在於其中所述的能夠結合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示的胺基酸序列，以及所述的殺傷多肽選自SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示的胺基酸序列。
8.如權利要求7所述的靶向融合蛋白，其特徵在於所述的靶向融合蛋白具有如SEQ ID NO10、12或14所示的胺基酸序列。
9.含有SEQ ID NO9或SEQ ID NO11或SEQ ID NO13所示的核苷酸序列的融合基因的重組體p30aRN-TNFαm1、pCW-XETNFαm1和pCW-XETNFαm2。
10.含有權利要求9所述的重組體的表達載體。
11.含有權利要求10所述的載體的真核或原核細胞。
12.如權利要求11所述的真核或原核細胞，其是大腸桿菌。
13.一種製備權利要求4所述的融合蛋白的方法，包括用權利要求10所述的表達載體轉化宿主細胞，培養轉化子，獲得重組的包含能夠結合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽和具有殺細胞作用的殺傷多肽的靶向性融合蛋白。
14.如權利要求4所述的融合蛋白在製備用於治療愛滋病的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及基因工程蛋白質藥物領域。具體地，本發明涉及靶向性抗HIV/SIV的蛋白質及編碼它的融合基因。本發明還涉及XE－TNFαm1、RN－TNFαm1和XE－TNFαm2的融合基因、包含所述融合基因的表達型重組體、包含所述表達型重組體的工程菌、由此工程菌表達和分離純化的靶向融合蛋白XE－TNFαm1、RNTNFαm1和XE－TNFαm2以及這些融合蛋白中任意一種用於治療愛滋病的用途。
文檔編號C12N15/70GK1752211SQ20041008000
公開日2006年3月29日 申請日期2004年9月23日 優先權日2004年9月23日
發明者盧聖棟, 楊晶, 王憬惺, 李濤, 李兆忠, 申景平, 叢哲, 塗新明, 蔣虹, 陳偉京, 路金芝, 佟巍, 魏強, 秦川, 張兵林 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所, 中國醫學科學院輸血研究所, 中國醫學科學院實驗動物研究所