一種檢測a群輪狀病毒的試劑盒和寡核苷酸序列的製作方法

2023-07-12 08:07:46 2

專利名稱：：一種檢測a群輪狀病毒的試劑盒和寡核苷酸序列的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種檢測A群輪狀病毒的試劑盒和寡核苷酸，更具體地說，是一種檢測A群輪狀病毒的反轉錄一環介導等溫擴增(RT-LAMP)快速檢測試劑盒，具體而言是指利用RT-LAMP原理快速檢測A群輪狀病毒的寡核苷酸序列、試劑盒和方法，屬生物
技術領域：
。
背景技術：
：輪狀病毒(Rotavirus)屬於呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬。呈球形，直徑60~80nm，雙層衣殼，無包膜，負染後在電鏡下觀察，病毒外形呈車輪狀，故名輪狀病毒。是雙鏈RNA病毒，約18550bp，由ll個基因片段組成，每個片段含一個開放讀碼框架，分別編碼6個結構蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和5個非結構蛋白(NSP1-NSP5)。根據輪狀病毒內衣殼VP6的抗原性，可將其分為7個組(AG)。A群輪狀病毒最為常見，於世界範圍內流行，是嬰幼兒腹瀉的主要原因。據統計，A群輪狀病毒每年可導致600,000800,000兒童死亡，在發展中國家約佔因急性胃腸炎住院病例的3060%。此外，輪狀病毒作為一種重要的食源性病毒，可通過糞一口途徑傳播，汙染的水和食物尤其貝類是傳播的主要載體。貝類作為濾過性攝食動物，很容易富集病毒。目前貝類養殖和收穫後所使用的淨化方法，只對細菌性汙染起作用，對病毒無效。另外，為保持口感鮮嫩，人們喜歡食用生的或半熟的貝類。因此進食生的或者未經適當烹製的貝類，極易引起病毒性腹瀉病的流行和暴發，同時也會給水產業帶來巨大的經濟損失。因此，研究開發針對輪狀病毒的快速檢測方法，可廣泛應用於臨床診斷、衛生防禦、食品安全檢測以及水產養殖等領域，對保護人民健康，促進我國水產和食品貿易的發展都具有重要的意義。以往輪狀病毒的檢驗主要採用電鏡觀察、分離培養和酶聯免疫方法(ELISA)。然而，由於電鏡設備昂貴，檢測靈敏度低，在很大程度上限制了其應用；分離培養方法靈敏度較低，需要特殊培養條件，而且周期長，不適於輪狀病毒的快速檢測；ELISA方法操作簡便，價格低廉，靈敏度和特異性教高，但是其檢測依賴於特異性抗原一抗3體反應，容易受到環境條件和樣品中幹擾物質的影響。近年來以核酸擴增為基礎的分子生物學技術已成為輪狀病毒檢測的主要手段，但仍存在不同的缺陷。如RT-PCR，通常需要45個小時，檢測結果需要通過核酸電泳、紫外觀察，不但容易造成對環境的交叉汙染，對操作人員也具有一定的毒性作用。實時螢光RT-PCR因其靈敏度高、特異性強、可用於定量檢測而倍受歡迎，但同時也對儀器設備和操作人員的技術條件提出了更高的要求，而且試驗中所用試劑和探針等費用較為昂貴，這些都為輪狀病毒檢測的廣泛開展帶來了一定的困難。環介導等溫擴增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技術是2000年由Notomi等人開發的一種新穎的核酸擴增方法。其特點是針對靶基因的68個區域設計46種特異性引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(BstDNApolymerase),在等溫條件(65'C左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。該方法不需要模板的熱變性、長時間溫度循環、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程，亦不需要精密的儀器與昂貴的檢測試劑。因其操作簡單、結果直觀、靈敏度高、特異性強，已被廣泛地應用於病原微生物的檢測和傳染性疾病的診斷。近年來我國已開始著手於致病性細菌的LAMP檢測技術研究，如結核分支桿菌、痢疾志賀氏菌、大腸艾希氏菌、肺炎鏈球菌、耶氏菌以及食品中常見的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌以及副溶血性弧菌等，取得了顯著的成效；而針對病毒的LAMP檢測主要見於國外的部分報導，如B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、皰疹病毒、腺病毒等DNA病毒以及流感病毒、SARS冠狀病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、西尼羅河病毒等RNA病毒。目前國內外均未見利用RT-LAMP技術對輪狀病毒進行檢測的相關報導。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一組特異性強、靈敏度高的用於檢測A群輪狀病毒的RT-LAMP寡核苷酸。本發明要解決的另一個技術問題是提供一種操作簡單、結果準確的A群輪狀病毒RT-LAMP快速檢測試劑盒。為實現上述目的，本發明採用以下技術方案本發明提供一組檢測A群輪狀病毒的寡核苷酸，由序列表SEQIDNo.l至序列表SEQIDNo.5所示鹼基序列的寡核苷酸組成；其中SEQIDNo.l為外側上遊引物，SEQIDNo.2為外側下遊引物，SEQIDNo.3為內側上遊引物，SEQIDNo.4為內側下遊引4物，SEQIDNo.5為環引物。詳見表l。表1A群輪狀病毒RT-LAMP引物序列引物名稱引物序列(5'-3')序列編號外側上遊TCTTCAAAATGTCATCTCACAASEQID引物(F3)No.l外側下遊CGTCTATAGCATTAATGGGATTSEQID引物(B3)No.2引物(FIP)No.3引物(BIP)No.4環引物GGTCTATGGAACTACCAGATGATGTSEQID(LB)No.5本發明所提供的引物具有以下優點(1)高效靈敏。近年來的研究顯示引入環引物(LoopF或LoopB)將有助於提高靈敏度，縮短反應時間。本發明設計出輪狀病毒特異的環引物(LoopB)，有效提高了檢測靈敏度，在60min的時間內，擴增效率可達到109101個數量級，擴增模板極限可達單拷貝輪狀病毒核酸。(2)特異性強，採用5條引物，共識別輪狀病毒NSP3基因的7個不同位點，充分保證擴增反應的特異性。本發明還提供一種檢測A群輪狀病毒的試劑盒，由以下試劑組成-(1)TRIZOL裂解液購自Invitrogen公司，貨號15596-026;(2)DEPCZK:購自上海生工，貨號D1005;(3)2xRT-LAMP反應液其組分為2xThermoPo1緩衝液、1.6M甜菜鹼、3.6mMdNTPs、8mMMgS04、0.4[iM外側上遊引物(F3)、0.4pM外側下遊引物(B3)、3.2(iM內側上遊引物(FIP)、3.2pM內側下遊引物(BIP)、1.6^M環引物(LB);其中外側上遊引物(F3)是序列表SEQIDNo.l所示的核苷酸序列，外側下遊引物(B3)是序列表SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，內側上遊引物(FIP)是序列表SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，內側下遊引物(BIP)是序列表SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，環引物(LB)是序列表SEQIDNo.5所示的核苷酸序列；引物委託大連寶生物工程有限公司合成；(4)BstDNA聚合酶8U小L，購自NEB公司，貨號M0275L;(5)AMV反轉錄酶，10U/pL，購自Promega公司，貨號M510A;(6)陰性對照生理鹽水；(7)陽性對照體外轉錄的A群輪狀病毒RNA片段或含A群輪狀病毒靶基因的質粒DNA;(8)顯色液SYBRGreenI染料，購自Invitrogen公司，貨號S7563;其中所述2xRT-LAMP反應液中2xThermoPo1緩衝液是由lOxThermoPol緩衝液(購自NEB公司，貨號M0275L)稀釋而成。2xThermoPo1緩衝液含有0.2。/。TritonX-100、20mM(NH4)2S04、20mMKCl、4mMMgS。4和pH8.8的40mMTris-HCl;甜菜鹼購自Sigma公司，貨號107-43-7;10mMdNTPs:購自上海生工，貨號D0056。本發明還提供了一種檢測輪狀病毒試劑盒的使用方法(1)提取樣品的RNA，即模板RNA:按照實施例5所述的病毒RNA的提取方法提取模板RNA，也可以採用其他常規分子生物學方法製備樣品的RNA或cDNA;(2)RT-LAMP反應體系tableseeoriginaldocumentpage6(3)反應條件63t:恆溫反應90120分鐘，85。C2分鐘使酶失活，反應即結束。(4)結果判定濁度觀察反應結果可通過肉眼觀測反應產物濁度來判斷，白色混濁的為陽性，澄清透明的為陰性。也可將PCR管12,000rpm離心2分鐘，反應陽性的可在管底見到白色沉澱。顏色變化向反應終體系加入2.5pl顯色液即SYBRGreenI螢光染料，陽性反應呈螢光綠色，而陰性反應則保持SYBRGreenI染料的螢光橙色。電泳檢測RT-LAMP法的擴增產物是各種不同長度的莖一環狀結構DNA，因此陽性反應通過2%瓊脂糖電泳檢測呈梯形條帶，而陰性反應則沒有梯形擴增條帶出現，可作為輔助檢測方法。本發明的優點是(1)等溫，合理避免了常規PCR對溫度循環的特殊要求所帶來的種種不便。(2)高效靈敏，設計出A群輪狀病毒特異的環引物(LoopB)，進一步提高檢測靈敏度，在60min的時間內，擴增效率可達到109101個數量級，擴增模板極限可達單拷貝A群輪狀病毒核酸。(3)特異性強，設計5條特異性引物，共識別輪狀病毒NSP3基因的7個不同位點，保證擴增的特異性。(4)費用低，不需要昂貴的精密儀器和特殊試劑，僅需一個恆溫水浴即可。(5)操作簡便，不需要進行雙鏈核酸的預變性，在一管內即可以完成全部檢測。(6)檢測簡單，在核酸大量合成時，產生副產物一焦磷酸鎂沉澱，有極高的特異性。只要用肉眼觀察沉澱濁度就能夠判斷擴增與否。(7)擴增RNA模板，反應體系中加入逆轉錄酶，即可一步實現對RNA的高效擴增。下面結合說明書附圖和具體實施方式對本發明作進一步說明，凡依照本發明公開內容所做的任何本領域的等同替換，均屬於本發明的保護範圍。圖1檢測A群輪狀病毒的試劑盒的靈敏性分析結果，l:4.8xl8拷貝；2:4.8xl07拷貝；3:4.8xl6拷貝；4:4.8乂105拷貝；5:4.8《104拷貝；6:4.8乂103拷貝；7:4.8x102拷貝；8:4.8xl(^拷貝;9:4.8拷貝;10:4.8xl0"拷貝；11:陰性對照；12:100bpDNALadder;圖2檢測A群輪狀病毒的試劑盒的特異性分析結果，1:DL2000;2:星狀病毒；3:A肝病毒；4:GI型諾如病毒；5:GII型諾如病毒；6:輪狀病毒；7:陰性對照。具體實施方式實施例1:RT-LAMP引物的設計選取A群輪狀病毒NSP3基因(GenBankaccessionNo.X81436)的高度保守序列，利用PrimerExplorerV4.0在線軟體(http:〃primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)，設計A群輪狀病毒的特異性RT-LAMP引物，引物如表l所示。引物Tm值介於59'C和62。C之間；末端自由能(G)均小於-4cal/mo1,可保證引物足夠高的穩定性；GC含量均在40%左右；引物3'端不存在互補序列，可有效防止引物內部二級結構的形成。本發明所設計的輪狀病毒特異性環引物(LoopB)，有助於提高檢測靈敏度，縮短反應時間。5條引物，共識別輪狀病毒NSP3基因的7個不同位點，充分保證擴增反應的特異性。引物委託大連寶生物工程有限公司合成，要求PAGE純或HPLC純。實施例2:A群輪狀病毒RT-LAMP檢測體系的建立與優化1.方法1)Mg^濃度按照表2的反應體系配製反應混合液，分別調節MgS+濃度至2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、12mM，於65。C保溫90min後，85。C反應2min終止反應。比較不同Mg^濃度對擴增效率的影響。2)dNTPs濃度按照表2的反應體系配製反應混合液，分別調節dNTPs終濃度至0mM、0.2mM、0.6mM、1.0mM、1.4mM、1.8mM，於65。C保溫90min後，85°C反應2min終止反應。比較不同濃度dNTPs對擴增效率的影響。3)甜菜鹼濃度按照表2的反應體系配製反應混合液，並調節甜菜鹼濃度至0M、0.4M、0.8M、1.2M，於65。C保溫90min後，85。C反應2min終止反應。比較不同濃度甜菜鹼對擴增效率的影響。4)內外引物濃度比按照表2的反應體系配製反應混合液，並調節內外引物濃度比分別為1:1、1:2、1:4、1:8，於65°C保溫90min後，85。C反應2min終止反應。比較不同內外引物濃度比對擴增效率的影響。5)反應時間按照表2的反應體系配製反應混合液，分別於65'C保溫15min、30min、45min、60min、90min、120min,85。C反應2min終止反應。比較反應時間長短對擴增效果的影響。6)反應溫度按照表2的反應體系配製反應混合液，分別於55'C、58°C、60°C、63°C、65°C、68。C保溫90min後，85。C反應2min終止反應。比較不同反應溫度對擴增效果的影響。2.結果直接肉眼觀察上述擴增產物的濁度變化，或在上述擴增產物中加入SYBRGreenl染料，觀察顏色變化，或進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果發現Mg"濃度選用4mM、dNTPs濃度選用1.8mM、甜菜鹼濃度為0.8M、內外引物濃度比達1:8時，於63。C反應90120min時所得擴增效果最佳，故以此做為試劑盒組成的依據和推薦反應條件。實施例3:檢測A群輪狀病毒的試劑盒的組成一、試劑盒的組成(保存於-20'C)(1)TRIZOL裂解液:購自Invitrogen公司，貨號15596-026;(2)DEPCtK:購自上海生工，貨號D1005;(3)2xRT-LAMP反應液其組分為2xThermoPo1緩衝液、1.6M甜菜鹼、3.6mMdNTPs、8mMMgS04、0.4外側上遊引物(F3)、0.4外側下遊引物(B3)、3.2pM內側上遊引物(FIP)、3.2^M內側下遊引物(BIP)、1.6pM環引物(LB);其中外側上遊引物(F3)是序列表SEQIDNo.l所示的核苷酸序列，外側下遊引物(B3)是序列表SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，內側上遊引物(FIP)是序列表SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，內側下遊引物(BIP)是序列表SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，環引物(LB)是序列表SEQIDNo.5所示的核苷酸序列；引物委託大連寶生物工程有限公司合成，要求PAGE純或HPLC純；(4)BstDNA聚合酶8U/|iL,購自NEB公司，貨號M0275L;(5)AMV反轉錄酶，10U/VL，購自Promega公司，貨號M510A;(6)陰性對照生理鹽水；(7)陽性對照體外轉錄的A群輪狀病毒RNA片段或含A群輪狀病毒靶基因的質粒DNA;(8)顯色液SYBRG認I染料，購自Invitrogen公司，貨號S7563。其中所述2xRT-LAMP反應液中2xThermoPo1緩衝液是由lOx丁hermoPol緩衝液(購自NEB公司，貨號M0275L)稀釋而成。2xThermoPo1緩衝液含有0.2。/。TritonX-100、20mM(NH4)2S04、20mMKCl、4mMMgS04和pH8.8的40mMTris-HCl;甜菜鹼購自Sigma公司，貨號107-43-7;lOmMdNTPs:購自上海生工，貨號D0056。二、陽性對照品的製備以A群輪狀病毒RNA(由中國疾病預防控制中心病毒病所提供)為模板，利用引物F3和B3，擴增出約193bp的特異性片斷，稱之為NSP3(NSP3包含RT-LAMP的擴增靶基因)；T-A克隆構建重組質粒pCR2.1-NSP3(pCR2.1-T載體購自Invitrogen公司)，於上海生工公司進行序列測定，並將測序結果與GenBank中A群輪狀病毒的基因序列(accessionNo.X81436)進行同源性分析，保證其同源性達95%以上。提取並純化質粒DNA，以其為模板，用Promega公司的RiboMAXTMLargeScaleRNAProductionsystem-T7試劑盒(貨號P1300)進行體外轉錄(按試劑盒操作說明書進行)，體外轉錄產物用DNase消化，去除其中的DNA。利用RNeasyMin正luteCleanupkit(購自QIAGEN公司，貨號74204)進一步純化RNA。紫外分光光度計測定質粒DNA或體外轉錄RNA的濃度，並分別通過以下公式計算模板分子的拷貝數。將含A群輪狀病毒靶基因的質粒DNA或體外轉錄RNA稀釋至1000拷貝/pL，分裝後於-80。C保存，作為試劑盒的陽性對照。質粒DNA拷貝數/^={6.022><1023x[5xl0-8g小L]xOD260}/[質粒分子鹼基數x6.58x102]體外轉錄RNA拷貝數&L=[總含量(g/pL)/(轉錄分子鹼基數x340)]x6.023x1023實施例4:檢測A群輪狀病毒的試劑盒的特異性和靈敏性試驗1.檢測靈敏度分析(1)方法將陽性對照質粒進行10倍梯度稀釋至單拷貝&L，各取lpL，利用實施例3所述的試劑盒進行RT-LAMP檢須'j，反應體系見表2，於63C溫育90min後，85°C2min終止反應。觀察各擴增產物的濁度變化；或者在各擴增產物中加入SYBRGreenI染料2.5^L，觀察顏色變化；也可進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析本發明所述試劑盒所能檢測到的最低限。(2)結果發現利用本發明所述試劑盒，在90min內，可檢測到單拷貝的陽性對照DNA。結果見圖1。2.檢測特異性分析(1)材料輪狀病毒、星狀病毒、A肝病毒、GI型諾如病毒和GII型諾如病毒RNA均由中國疾病預防控制中心病毒病所提供。(2)方法使用本發明所述試劑盒，對常見的腹瀉病毒包括輪狀病毒、星狀病毒、A肝病毒、GI型諾如病毒和GII型諾如病毒RNA進行RT-LAMP擴增檢測，觀察該試劑盒有無非特異性反應的發生。(3)結果對擴增產物經濁度觀察、SYBRGreenI染色、2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現只有A群輪狀病毒出現特異性擴增，其餘病毒經RT-LAMP檢測均呈陰性，10證明該方法具有良好的特異性。結果見圖2。實施例5:檢測A群輪狀病毒的試劑盒對臨床樣品的檢測1.材料於首都兒童醫院檢驗科收集嬰幼兒的腹瀉糞便標本，共16份。用PBS將糞便樣品製成10%(wt/v)的懸液，5000g，離心5min，取上清保存於-8(TC凍存，備用。2.方法(1)病毒RNA的提取利用傳統Trizol法提取糞便RNA,具體操作如下①在100pL糞便樣品中加入1mLTrizol，震蕩30s後，室溫放置5min;②加入250pL氯仿—異戊醇，劇烈震蕩30s，室溫放置5min;4°C，12000g，離心5min;③將上清液轉入新離心管中，加入500pL的異丙醇劇烈震蕩混勻30s，室溫放置5min;4°C，5000g，離心5min;⑤小心移去上清，沉澱用lmL70%乙醇清洗後12000g，4。C，離心5min(儘可能吸走上清，離心管置於超淨臺上將沉澱吹乾)；⑥加入50nL無Rnase水溶解RNA(為了使病毒RNA更好的溶解，置60。C加熱10min);⑦提取的RNA於-80°(:保存備用。(2)逆轉錄用SuperscriptTMfirst-strandsynthesissystemforRT-PCR試劑盒(購自Invitrogen公司，貨號18080-051)進行逆轉錄反應，按該試劑盒操作說明進行。獲得cDNA用於下面試驗。(3)RT-PCR和實時螢光RT-PCR檢測RT-PCR反應體系(25j^L)中含有10xPCR緩衝液2.5|_iL、dNTP(2.5mmoI/L)2pL、10[imol/L上遊引物(5，-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG-3，，序列表中的編號為SEQIDNo.6)和下遊引物(5，-GATCCTGTTGGCCATCC-3，，序列表中的編號為SEQIDNo.7)各0.5^L、Taq酶(5U/(iL)0.2pL以及cDNA模板5piL。於ABI9700PCR儀中按以下條件進行反應94"預變性5min;94。C變性45s，53。C退火45s，72。C延伸45s，35個循環，72°C，8min，4"保存。PCR反應結束後，取10產物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察結果並拍照。25的實時螢光RT-PCR反應體系包括2xMastermix(ABI公司，貨號4304437)12.5|iL、10pmoI/L上遊引物(5，-ACCATCTACACATGACCCTC-3，，序列表中的編號為SEQIDNo.8)和下遊引物(5，-GGTCACATAACGCCCC-3，，序列表中的編號為SEQIDNo.9)各1^L、10pmoI/L探針(5，-FAM-ATGAGCACAATAGTTAAAAGCTAACACT-GTCAA-TAMRA-3',序列表中的編號為SEQIDNo,lO，所述探針序列的5'端標記螢光報告基團FAM,3'端標記淬滅螢光基團TAMRA)0.1以及cDNA模板5pL。於ABI7000PCR儀中按以下條件進行反應50。C2min，95。C10min;95°C15s,60°C1min，40個循環。(4)RT-LAMP檢測利用本發明所述的試劑盒、反應體系(如表2)和條件(如
發明內容中試劑盒使用時所提供的反應條件)對16份糞便樣本cDNA進行RT-LAMP擴增檢測。3.結果利用RT-LAMP、RT-PCR和實時螢光RT-PCR對16份糞便樣本檢測的結果見表3,可見RT-LAMP的檢出率同實時螢光RT-PCR相當，明顯高於普通RT-PCR。而RT-LAMP方法相比較於RT-PCR和實時螢光RT-PCR，操作更加簡單，不需要進行模板的預變性、長時間溫度循環，亦不需要螢光PCR儀等精密的儀器以及探針等昂貴的檢測試劑，結果直觀可靠，因而更便於現場快速檢測工作的開展。表3兒童糞便樣品篩選結果口_檢測結果_樣品編號RT-LAMP實時螢光RT-PCRRT-PCR1+++2++-3+++4++++++6+++7---8---9++-10---11+++12---13++-14---15+++16+++《68.7568.7550.00序列表中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局—種檢測A群輪狀病毒的試劑盒和寡核苷酸序列10Patentlnversion3.3122DNA人工合成引物F31tcttcaaaatgtcatctcacaa22222DNA人工合成引物B32cgtctatagcattaatgggatt22344DNA人工合成引物FIP3ccttgcaaatcagcttccaactcagcagaatcaaatagcagate44448DNA人工合成引物BIP4gtgtcatcagttgagtggtatctaacaattgaatttaactgctgttca48525DNA人工合成引物LB<400〉5ggtctatggaactaccagatgatgt25628DNA人工合成引物6ggctttaaaagagagaatttccgtctgg28717<212〉DNA人工合成引物7gatcctgttggccatcc820DNA人工合成引物8accatctacacstgaccctc916DNA人工合成引物9ggtcacataacgcccc10說明書第13/14頁17201533DNA人工合成探針10atgagcacaatagttaaaagctaacactgtcaa3權利要求1.一組檢測A群輪狀病毒的寡核苷酸，其特徵在於由序列表SEQIDNo.1至序列表SEQIDNo.5所示鹼基序列的寡核苷酸組成；其中SEQIDNo.1為外側上遊引物，SEQIDNo.2為外側下遊引物，SEQIDNo.3為內側上遊引物，SEQIDNo.4為內側下遊引物，SEQIDNo.5為環引物。2.—種檢測A群輪狀病毒的試劑盒，其特徵在於由以下試劑組成(1)TRIZOL裂解液；(2)DEPC7K;(3)2xRT-LAMP反應液其組分為2xThermoPo1緩衝液、1.6M甜菜鹼、3.6mMdNTPs、8mMMgS04、0.4pM外側上遊引物、0.4pM外側下遊引物、3.2pM內側上遊引物、3.2pM內側下遊引物、1.6pM環引物；外側上遊引物是序列表SEQIDNo.l所示的核苷酸序列，外側下遊引物是序列表SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，內側上遊引物是序列表SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，內側下遊引物是序列表SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，環引物是序列表SEQIDNo.5所示的核苷酸序列；(4)BstDNA聚合酶；(5)AMV反轉錄酶；(6)陰性對照生理鹽水；(7)陽性對照體外轉錄的A群輪狀病毒RNA片段或含A群輪狀病毒靶基因的質粒DNA;(8)顯色液SYBRGreenI染料；其中，所述2xRT-LAMP反應液中，2xThermoPo1緩衝液含有0.2。/。TritonX-100、20mM(NH4)2S04、20mMKCl、4mMMgS04和pH8.8的40mMTris-HCl。全文摘要本發明公開了一種檢測A群輪狀病毒的試劑盒和寡核苷酸序列，具體涉及一組檢測A群輪狀病毒的寡核苷酸，具有序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.5所示的寡核苷酸序列，含有這些寡核苷酸的試劑盒及其檢測方法，本發明所述的試劑盒靈敏度高、特異性強、成本低、操作簡便。檢測時，在核酸大量合成時，產生副產物—焦磷酸鎂沉澱，有極高的特異性，只要用肉眼觀察擴增產物濁度就能夠判斷擴增與否。文檔編號C12R1/93GK101671746SQ20091018000公開日2010年3月17日申請日期2009年10月21日優先權日2009年10月21日發明者琦周,張西萌,靜曾,王金花,魏海燕申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局