Tem8用作佐劑及其應用的製作方法

2023-07-12 06:34:26

專利名稱：Tem8用作佐劑及其應用的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及免疫學領域。 一般地，本發明公開包括TM8、優選 人TEM8作為活性成分的組合物，並且施用所述組合物用於在動物中，包 括人中增強針對接種的免疫反應。更具體地，本發明涉及TEM8作為佐劑 的應用，所述TEM8具有可以作為疫苗起作用的免疫原性序列。
相關技術描述
疫苗在人和動物中預防疾病的應用是常見的應用，並且已經進行了並 正在進行巨大的努力來擴展這一應用，以使之覆蓋這些患者遭受的更廣泛 數量的疾病。例如，現在狂犬病疫苗在動物中的應用是普通的領域，正努 力獲得適當的疫苗，以針對其他疾病免疫動物。更近地，疫苗治療癌症的 應用正處於熱烈的研究中，並且己經開始用於人類。
然而，在主動免疫過程中頻繁遇到的一個問題是疫苗中所用的抗原免 疫原性不足，不足以誘導強細胞介導的免疫性。在這些弱動物疫苗中，由 滅活的大葉性月市炎嗜血菌(Haemophilus pleuropneumoniae) (Hpp)(其與 豬中的呼吸疾病相關)組成的那些疫苗是最差的。
為了獲得更強的體液和/或細胞反應，通常施用在含有佐劑(免疫強 化劑)的製劑中的疫苗，所述佐劑是一種增強患者對所述疫苗的免疫反應 的物質。對於疫苗最常用的佐劑是油製劑和明礬。尚不明白所述佐劑通過 什麼機制起作用，並且在給定的情形中特定的佐劑製劑是否足夠有效是不
'TEM8是最近發現的與腫瘤-特異性血管生成相關的蛋白家族的一員。 TEM8 RNA最初從人結腸直腸腫瘤中分離，並且據報導其表達限於腫瘤 血管系統(Carson-Walter EB,等，2001; Nanda A，等，2004)。更近地，已經發現TEM8在血管內皮細胞和腫瘤基質中表達。
已知在癌症中TEM8在體內以某種方式作用能夠增強並且增加成功 的免疫反應，並且提議這種反應與腫瘤血管系統中的TEM8的表達相關， 當與癌症特異性抗原聯合給予時產生協同免疫反應。然而，當TEM8作為 DNA疫苗施用時沒有產生對TEM8特異性的免疫反應表明TEM8必定以 不同的方式起作用(Fdicetti等，2007)。因此，在本領域中，TEM8調節 或加強/增強免疫反應的準確機制尚是未知的。
綜上所述，存在對於適於加強用於動物包括人和其他哺乳動物的疫苗 的另外有效佐劑製劑的需求。另外，缺少對TEM8通過什麼機制調節或加 強/增強免疫反應的理解。本發明實現了本領域中的這些長期存在的需求 和願望。
發明概述
在本發明的一個實施方案中，存在一種組合物，其包括免疫原性序列 或其片段，TEM8序列或其片段，藥用載體或它們的組合。
在本發明的另一個相關的實施方案中，存在在受試者中引發增強的免 疫反應的方法。這種方法包括對所述受試者施用免疫學有效量的如同前文 所述的組合物的步驟。
在本發明的另一個實施方案中，存在一種組合物，其包括免疫原性序 列或其片段，與TEM8或其片段的胺基酸序列有至少90%同源性的氨基 酸序列，藥用載體或它們的組合。
在本發明的另一個相關的實施方案中，存在在受試者中引發增強的免 疫反應的方法。這樣的方法包括給所述受試者施用免疫學有效量的如同前 文所述的組合物的步驟。
在本發明的另一個實施方案中，存在一種組合物，其包括免疫原性序 列或其片段，與TEM8或其片段的胺基酸序列有至少80%同源性的氨基 酸序列，藥用載體或它們的組合。
在本發明的另一個相關的實施方案中，存在在受試者中引發增強的免 疫反應的方法。這樣的方法包括給所述受試者施用免疫學有效量的如同前 文所述的組合物的步驟。在本發明的另一個實施方案中，存在一種組合物，其包括TEM8或其
片段以及藥用載體。
在本發明的另一個相關的實施方案中，存在增強免疫原性組合物在受 試者中引發免疫反應的能力的方法。這樣的方法包括給所述受試者施用包
括TEM8或其片段以及藥用載體的組合物的步驟。
在本發明的另一個實施方案中，存在一種組合物，其包括與TEM8 或其片段的胺基酸序列有至少90%同源性的胺基酸序列以及藥用載體。在 本發明的另一個相關的實施方案中，存在增加免疫原性組合物在受試者中 引發免疫反應的能力的方法。這樣的方法包括給所述受試者施用如前文所 述的包括與TEM8或其片段同源的序列以及藥用載體的組合物的步驟。
在本發明的另一個實施方案中，存在一種組合物，其包括與TEM8 或其片段的胺基酸序列有至少80%同源性的胺基酸序列以及藥用載體。在
本發明的另一個相關的實施方案中，存在增加免疫原性組合物在受試者中 引發免疫反應的能力的方法。這樣的方法包括給所述受試者施用如前文所 述的包括與TEM8或其片段同源的序列以及藥用載體的組合物的步驟。
從下述本發明目前優選的實施方案的描述中，本發明的其他以及另外 的方面、特徵和優點將顯而易見。為了公開的目的給出這些實施方案。
附圖簡述


圖1顯示腫瘤特異性T細胞通過在腫瘤內體內擴展而富集。將用卵清 蛋白DNA疫苗免疫3次的小鼠用B16腫瘤(ova-)或M04腫瘤(表達 ova的B16)攻擊。6天後，恢復引流(draining)淋巴結(左版)和基質膠 (matrigel)塞(右版)，並且通過IFN-g ICCA測量ova-特異性CD8 T細胞。
圖2顯示腫瘤-特異性T細胞在腫瘤中富集。將用HER2/neu DNA疫 苗免疫3x的小鼠用233-VSAG-1腫瘤攻擊。10天後，通過ICCA從脾和 基質膠塞測量neu-特異性的CD8 T細胞。
圖3顯示TEM8注射增加neu-特異性T細胞的數目。如所示，小鼠 (5隻/組)接受3次注射，TEM8、大鼠HER2/neu、或組合。在最後一次 注射後5天，將233-VSAG-1腫瘤植入脅部的基質膠中，並且10天後，將塞移開，並且通過ICCA測量TILS。
圖4A-4C顯示TEM8注射增加免疫小鼠的引流淋巴結中的抗原特異 性T細胞的數目。在圖4A中，如所示，小鼠(3隻/組)接受TEM8、大 鼠HER2/neu、或組合的5次注射。在最後一次注射後5天，從引流淋巴 結分離CD8T細胞，並且通過IFN-gELISpot測量。在圖4B中，小鼠(3 只/組)用單獨的hgp75或與TEM8組合免疫。在最後一次注射後5天， 將CD8T細胞從引流淋巴結分離，並且通過IFN-gELISpot測量，以識別 三種免疫顯性gp75肽455、 451和522。在用hgp75免疫的小鼠中，TEM8 增強針對肽455的反應(481和522程度更低)。在圖4C中，小鼠(3隻 /組)用ova DNA+/-TEM8或pING接種3次，或用在Titermax中的SINFEKL (SEQ ID NO: 19)肽接種一次。在第5天，從引流LNs分離CD8 T細胞， 並且通過IFN-y ELISPOT測量。TEM8增加ova-特異性CD8+ T細胞的數 量大約2倍，這表明TEM8增加針對外源和自身抗原的CD8+T細胞反應 的能力。圖4D和4E顯示CD8+ T細胞有助於TEM8免疫性。在圖4D中， FVB/neuNT轉基因小鼠通過肌內注射100嗎pCDNA3， TEM8或Her2/neu (左版)每兩周一次，免疫3次(three times bi-weekly),並且用233-VSAG1 腫瘤細胞攻擊。使用Kaplan-Meier分析報告沒有腫瘤的存活。在腫瘤攻擊 前3天開始，通過注射MAb (53-6.7.2)持續4周，而使另一組用HER2/neu 免疫的小鼠消耗CD8 T細胞。為清楚而言，關於來自同一實驗的其它組 小鼠的沒有腫瘤的存活數據，TEM8 + HER2/neu免疫的小鼠和消耗了 CD8 T細胞的TEM8 + HER2/neu免疫的小鼠表示在右版。在圖4E中，C57BL/6 通過用4嗎編碼TEM8、 hTYRPl/hgp75的DNA或聯合的兩種疫苗每周 一次粒子轟擊而免疫5次。在一組中，小鼠通過在腫瘤攻擊之前3天開始 通過注射MAb (53-6.7.2)持續4周而消耗CD8+ T細胞。使用Kaplan-Meier 分析，報告在用B16F10黑素瘤皮內攻擊後的無腫瘤存活。圖4F顯示TEM8 的佐劑作用增加CD4+ T細胞活化，並且CD8+ T細胞的增加需要CD4+ T 細胞。FVB小鼠接受3次大鼠HER2/neu+/-TEM8或pING的注射。在一 些組中，小鼠在整個免疫過程中消耗CD4+T細胞。在最後一次接種後5 天，通過《^，61^ 0丁測量純化的€08+ (左)或CD4十(右)T細胞。
圖5A-5B顯示TEM8突變的注射降低它的佐劑效果。在圖5A中，小鼠接受3次大鼠HER2/neu (左)或hgp75 (右)，+/- pING, TEM8或突變的 TEM8 (Opt2TEM8) DNA的注射。在第5天，通過ELISPOT測量來自淋 巴結的CD8T細胞。在圖5B中，COS7細胞轉染(FLAG-標記的)Opt-2或 TEM8 DNA。在20小時後，細胞用粘液菌素A脈衝1小時，用PBS洗滌 4次，並且如所示在完全培養基中繼續培養0-24小時。
圖6顯示小鼠前列腺腫瘤中的個體細胞表達TEM8。在閹割後兩天， 將在PteiW- p53-A小鼠中產生的自發性腫瘤用商購的對TEM8特異性的抗 體(ABR， Santa Cruz)染色。
圖7A-70顯示TEM8在乳腺瘤和黑素瘤、人前列腺腫瘤的細胞中和 在單核細胞/巨噬細胞以及樹突細胞中表達。圖7A-7I顯示TEM8在小鼠 乳腺瘤和黑素瘤中的表達。原位雜交檢測在可移植的腫瘤B16F10 (圖 7A-7D)和233-VSGA1 (圖7E-7H)的基質中的TEM8 RNA。暗視野圖像在 (圖7A, 7C，7E和7G)中，亮視野圖像在(圖7B， 7D， 7F禾卩7H)中。 用ATR/TEM8-特異性Ab N19顯色的蛋白質印跡檢測在相同腫瘤類型中 的TEM8蛋白(圖71)。從乳腺瘤和黑素瘤細胞系製備裂解產物(30 [ig 總蛋白)。泳道l， 233-VSGA1乳腺瘤；泳道2， 233-VSGA1體外培養物； 泳道3,B16F10腫瘤；泳道4, B16F10體外培養物；泳道5，FVB正常的腎。 星號表示在233-VSGA1和B16F10腫瘤樣品和正常腎中存在80-kDa的條 帶，而在培養的233-VSGA1或B16F10細胞中不存在(箭頭顯示與TEM8 反義探針雜交的區域)。圖7J-7N顯示抗原呈遞細胞(APC)在體外和在 體內表達TEM8，並且圖70顯示在LPS刺激後TEM8的表達增加。在圖 7J中，在人前列腺癌的石蠟切片中，免疫組織化學分析顯示TEM8(左版) 和CD68 (右版)的表達。在圖7K-7L中，流式細胞術顯示首次用於實驗 的小鼠和攜帶B16的小鼠(TDLN)的腫 瘤(圖7K)和淋巴結(圖7L)內 的APCs中的TEM8表達(紅線)。在不同的培養天數後，通過蛋白質印 跡(圖7M)和在第15天進行流式細胞術(圖7N)分析骨髓來源的樹突細 胞(DCs)中的TEM8表達。在圖70中，小鼠骨髓在GM-CSF中培養10 天以製備DCs，或者在G-CSF中培養5天以製備巨噬細胞(上部)。在第 11天，將DCs用LPS處理3， 6， 9，或12小時(底部)。在第5天，將 巨噬細胞用LPS處理24小時。在兩種情形中，通過定量RTPCR分析測量TNFa和TEM8 RNA。
圖8A-8C顯示共同注射HER2/neu和TEM8 DNA賦予腫瘤保護作用。 在圖8A中，FVB/NT轉基因小鼠通過用100昭編碼TEM8、 HER2/neu 的DNA或聯合的兩種疫苗每兩周一次(bi-weekly)肌內注射進行免疫。對 照小鼠組接受空載體pCDNA3。使用Kaplan-Meier分析顯示在用 233-VSGA1腫瘤攻擊後的無腫瘤存活。在圖8B中，FVB/N母體、非轉 基因小鼠通過用4昭編碼TEM8、 HER2/neu的DNA或聯合的兩種疫苗每 周一次粒子轟擊而進行免疫5次。在TEM8 + HER2/neu組中，在第1天， 將小鼠用TEM8疫苗免疫，並且在第+3天，用HER2/neu免疫。對照小鼠 組不接受免疫(首次用於實驗)。使用Kaplan- Meier分析顯示在用 233-VSGA1腫瘤攻擊後隨時間的無腫瘤存活。在圖8C中，生長曲線針對 在圖8B所述的實驗中所用的個體小鼠而繪製。在用TEM8+HER2/neu免 疫的15隻小鼠中有4隻在初始腫瘤生長之後表現出腫瘤排斥作用(虛線)。
圖9A-9B顯示施用編碼TEM8、 hTYRPl/hgp75, HER2.neu的DNA或 它們的組合的作用。圖9A顯示結合的TEM8和bTYRPl/hgp75 DNA疫苗 增加針對B16F10黑素瘤的攻擊的保護作用。C57B16小鼠通過用4嗎編 碼TEM8、hTYRPl/hgp75的DNA或聯合的兩種疫苗每周一次粒子轟擊而 進行免疫5次。對照小鼠組不接受免疫(首次用於實驗)。使用Kaplan-Meier 分析顯示在用B16F10黑素瘤皮內攻擊後的無腫瘤存活。圖9B顯示 在免疫後沒有檢測到針對TEM8的抗體。小鼠用指定的疫苗通過每周一次 粒子轟擊進行免疫5次。在最後一次接種後5天收集血清，合併並且利用 蛋白質印跡分析來分析對重組TEM8特異性的抗體。H140多克隆抗體用 作陽性對照。
圖10顯示TEM8施用增加樹突細胞從皮膚到淋巴結的遷移。小鼠接 受TEM8DNA或空載體(模擬)基因槍的單次施用。在指定的天數，小 鼠用FITC致敏，以追蹤DC遷移。24小時後，通過流式細胞術測量在淋 巴結DCs中的FITC含量。上部分析在CD3-CD19-DAPI-細胞中CDllcint MHCII類高DC群體(左)的FITC含量(右)。底部報告淋巴結中的 CDllc+FITC+細胞的百分數。每個符號代表一隻小鼠。
圖11顯示在轉染了所選擇的TEM8 siRNA的COS7細胞中TEM8RNA減少了。 COS7細胞轉染siRNA弁l,弁2，弁3或弁AM。在24小時後， TEM8 DNA通過qRT-PCR定量，針對未處理的細胞和18S RNA標準化。
圖12A-12B顯示TEM81oxP敲入耙向策略。圖12A顯示TEM8基因， 其為200Kb長，並且包含22個外顯子。靶向載體包含由兩個翻轉酶重組 位點(Frt)側連的新黴素盒(NEO)、外顯子2和3 (外顯子)、兩個LoxP位 點以及5' (5臂)和3' (3臂)DNA序列，以允許同源重組。圖12B顯示DNA 印跡分析，其中探針X和y在EcoR V消化的C57B6 DNA上檢測。
圖13A-13C顯示人TEM8的序列。圖13A-13B顯示人TEM8的核苷 酸序列(SEQ ID NO: 1)。圖13C顯示人TEM8的胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)。
圖14A-14C顯示小鼠TEM8的序列。圖14A-14B顯示小鼠TEM8的 核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)。圖14C顯示小鼠TEM8的胺基酸序列(SEQ ID NO: 4)。
發明詳述
定義
當用於本文時，術語"一個(a)"或"一種(an)"可以意指一個或多個。 當用於本文的權利要求中時，當與詞語"包括"聯合使用時，詞語"一個" 或"一種"可以意指一個或多於一個。當用於本文時，"另一個"或"其它"意 指至少第二個或更多個相同的或不同的主張要素或其成分。
當用於本文時，術語"佐劑"具有它的常規意思，即，增強針對特定 的抗原的免疫反應的能力。這樣的能力通過免疫介導的保護作用的顯著增 加而顯現。體液免疫性的增強典型地通過針對所述抗原產生的抗體的滴度 的顯著增加(通常〉10%)而顯現。類似地，細胞免疫性的增強典型地通 過相對應的CD8+或CD4+T細胞數量的顯著增加(通常>10%)而顯現。
當用於本文時，"TEM8"是指從組織培養物或通過重組技術獲得的多 肽，其表現出這種蛋白特有的活性譜。該詞語不但包括人TEM8 (hTEM8)， 而且包括其它哺乳動物的TEM8，諸如例如，狗、貓、小鼠、大鼠、兔、 靈長類、馬、豬和牛TEM8。天然人TEM8的核苷酸序列和胺基酸序列顯 示在圖13A-13C中。這種一級胺基酸和核苷酸序列可以作為天然的蛋白/DNA從天然來源獲得或者可以重組衍生獲得。
當用於本文時，術語"DNA疫苗"定義為質粒DNA的純化的製劑， 所述質粒DNA設計成包含一種或多種基因或這些基因的片段以及調節遺 傳元件，以使得能夠在細菌宿主系統中生產。典型地，這些質粒具有用於 在細菌中選擇和複製所必需的DNA序列。另外，它們包含真核啟動子和 增強子以及轉錄終止/多腺苷酸序列，以促進基因在疫苗受體中的表達， 並且可以包含免疫調節元件。
通用方法
技術領域：
本發明的目的是提供一種製劑，其包括編碼腫瘤相關的或病原體相關 的抗原的核酸分子，或它們的免疫原性或它們的蛋白產物，全長或片段或 衍生物，以及TEM8基因或蛋白產物，全長或片段，它們可以同時、分開 或順序地用於癌症或傳染病的預防性或治療性治療。
本發明提供新型疫苗組合物和將佐劑添加到疫苗中的方法，所述方法 使用佐劑TEM8，意欲在接種的宿主哺乳動物中提供針對特定的病原體或 針對特定的癌症的保護性細胞介導的免疫反應。最理想地，本發明涉及這 樣的疫苗，所述疫苗依賴於增強接種的宿主的細胞介導的免疫性，即激發 輔助和細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)和激活的吞噬細胞，以提供針對由所選 擇的病原體的感染或在腫瘤免疫性的情形中針對腫瘤發展的保護。
在這方面，本發明表明在動物中注射TEM8增加樹突細胞遷移和與之 一致的針對疫苗的T細胞反應。先前表明TEM8注射以CD8 T細胞-依賴 性方式增加腫瘤免疫性，而不管針對TEM8的特異性免疫反應的明顯的缺 少。本發明表明在TEM8注射之後觀察到的增加的腫瘤免疫性是由於 TEM8 DNA的佐劑作用引起的，並且TEM8 DNA注射增加樹突細胞從皮 膚向引流淋巴結的遷移，並且還增加了 CD4+和CD8+T細胞反應。
與早先關於TEM8表達的研究相反，在其中據報導它的定位限於腫瘤 血管系統，在小鼠和人中發現TEM8在鄰近所述腫瘤的激活的抗原呈遞細 胞(APC)中表達。本發明表明在剛分離的小鼠骨髓中沒有檢測到TEM8， 但是在GM-CSF中體外培養後TEM8在樹突細胞中表達，並且所述表達 通過用LPS刺激這些細胞的成熟而進一步增加。TEM8還在LPS-活化的巨噬細胞中和在存在於小鼠乳腺瘤中的CDllb+巨噬細胞中表達，並且
TEM8細胞與CD68+細胞(巨噬細胞)共同定位在人乳腺瘤和前列腺瘤中。 從TEM8的結構，表達位點和在血管內皮細胞中參與細胞遷移，並且 TEM8增加引流淋巴結(dLN)中的抗原呈遞細胞的數目或移動的事實， 在本文推論TEM8增加抗原呈遞。CD8 T細胞的增加可能反映在細胞因子 周圍的變化或者促進巨噬細胞成熟為Ml細胞而不是M2也是可能的。
TEM8/ATR在樹突細胞和巨噬細胞上表達，並且炭疽感染引起針對感 染的功能性反應的深刻的減少。TEM8在進化上非常保守，並且必定具有 與其作為炭疽受體的作用不相關的重要的生物學功能。除了它們作為抗原 呈遞細胞和吞噬細胞的作用外，巨噬細胞在乳房發育、乳房芽塑形和胎盤 發育中起作用。正常乳房和胎盤中的TEM8+細胞可能是巨噬細胞。TEM8 與膠原蛋白相互作用，並且它在細胞遷移中很重要，並且己經參與腫瘤的 血管生成。
本文描述的數據提供對TEM8在抗原呈遞中的作用的支持。對於增加 T細胞反應，需要TEM8的完整的細胞外結構域，並且從這些初始結果來 看，似乎TEM8蛋白在增加抗原呈遞中具有活性作用，並且對於所述活性 需要在vWf結構域中的突變。可以檢測這些相同的突變，檢測它們抑制 細胞遷移和炭疽結合的能力，以仔細研究這些生物學活性。
關於TEM8影響抗原呈遞的機制存在兩種假設。在抗原呈遞細胞上的 TEM8可以與另一種蛋白相互作用以增加運動性、吞噬作用或成熟是可能 的。在這種情形中，注射TEM8DNA可以增加TEM8在抗原呈遞細胞中 的表達並且擴大這種作用。備選地，如果TEM8正常作用抑制抗原呈遞細 胞活化，那麼TEM8 DNA可以提供可溶的TEM8，其可以幹擾這種相互 作用，諸如sTEM8幹擾炭疽結合一樣。所述數據支持第一種假說，原因 在於更長的TEM8構建體，包含跨膜結構域，仍然有作為佐劑的活性。清 楚地，由於TEM8已經被描述為通用的免疫佐劑，在腫瘤免疫學領域和病 原體疫苗領域都將是有用的。換言之，本文所述的免疫原性組合物將有效 用於腫瘤免疫治療和傳染病的減輕或預防性治療。最重要地，這些組合物 不但用於流行病時期，而且在士兵和平民暴露於或懷疑暴露於生物武器時 同樣地用於他們。這些組合物還可以用於相伴的動物。本發明還考慮設計TEM8的小分子抑制劑，並且確定它們是否取代TEM8 DNA注射。
在本發明的一個實施方案中，TEM8可以作為全長TEM8或作為 TEM8片段施用。 一種可能的片段是包括TEM8的胺基酸28-278的片段， 或編碼圖14A-14C的小鼠TEM8序列的28-278胺基酸的相對應的核酸序 列。另外，普通技術人員將容易地認識到TEM8胺基酸序列或核酸序列可 以進行操作，以產生與圖14的蛋白或核酸序列不是100%相同的有用的 TEM8。例如，普通技術人員將找到與圖14的序列有80%或90%同源性 的蛋白或核酸是有效的。胺基酸序列的基本相同性意指所述序列是相同的 或者有一個或多個胺基酸改變(添加、取代)的不同，所述胺基酸改變不 引起合成的蛋白和天然人TEM8之間的不利的功能不相似性。
本發明涉及一種組合物，其包括免疫原性序列或其片段，TEM8或其 片段，藥用載體或它們的組合。所述免疫原性序列或其片段和TEM8或其 片段通常可以是重組蛋白或肽。所述重組蛋白或肽可以包括修飾的氨基 酸、未修飾的胺基酸或二者。組合物中的TEM8或其片段可以具有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列。
備選地，可以將編碼免疫原性序列或其片段的核苷酸序列和編碼 TEM8或其片段的核苷酸序列插入到載體中。在這種情形中的載體可以是 質粒、病毒載體或細菌載體。另外，編碼TEM8或其片段的核苷酸序列可 以包括至少60個核苷酸。此外，組合物中編碼TEM8或其片段的核苷酸 序列可以具有SEQIDNOS: 1或3所示的序列。所述免疫原性序列或其片 段可以是腫瘤相關抗原或病原體相關抗原的免疫原性序列或其片段。腫瘤 相關抗原的實例可以包括但不限於，Her2/neu， gp75， Her2/NEU， gp75/TYRP-l， PSMA, TRYP-2, NY-ESO-l, MAGE-1， MAGE-3, CEA， PSA, 酪氨酸酶，突變體p53，突變體p21,突變體cdk4，突變體L9， BCR-ABL 或HPV16的E6/E7，並且病原體相關抗原的那些可以包括但不限於細菌 脂多糖，炭疽致死因子，炭疽水腫因子，HlVgpl20或瘧疾抗原諸如CSP, TRAP/SSP2, LSA1， MSP1和AMA1 。
本發明還涉及在受試者中引發免疫反應的方法，所述方法包括給所述 受試者施用免疫學有效量的如前文所述的組合物的步驟。組合物中的 TEM8或其片段可以增加組合物中的免疫原性序列或其片段在受試者中引發針對與腫瘤相關的抗原或針對病原體的抗體反應、CD4 T細胞反應、
CD8 T細胞反應或它們的組合的能力。與癌症和病原體相關的抗原的代表 性實例與前文所述相同。另外，受益於所述方法的受試者可以包括但不限 於，患有乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤、結腸癌、慢性髓性白血病或宮頸癌 的受試者，或者已經暴露於或懷疑暴露於瘧疾、炭疽、HIV或生物武器的
受試者。
本發明還涉及一種組合物，其包含免疫原性序列或其片段，與TEM8 或其片段的胺基酸序列具有至少90%同源性的胺基酸序列，藥用載體或其 組合。TEM8或其片段的胺基酸序列可以具有在SEQIDNO: 2或SEQ ID NO: 4中顯示的序列。另外，免疫原性序列或其片段和與TEM8或其片 段同源的序列可以是重組蛋白或肽。重組蛋白或肽可以包括修飾的氨基 酸，未修飾的胺基酸或兩者。
備選地，編碼所述免疫原性序列或其片段的核苷酸序列和編碼與 TEM8或其片段同源的序列的核苷酸序列可以被插入到載體中。在這種情 形中的載體可以是質粒、病毒載體或細菌載體。另外，編碼與TEM8或其 片段同源的序列的核苷酸序列可以包括至少60個核苷酸。此外，組合物 中編碼TEM8或其片段的核苷酸序列可以具有SEQ ID NOS: 1或3的序 列。另外，所述免疫原性序列或其片段的類型的實例與前文所述的相同。
本發明還進一步涉及在受試者中引發免疫反應的方法，所述方法包括 給所述受試者施用免疫學有效量的如前文所述的組合物的步驟。所述組合 物中與TEM8或其片段同源的序列可以增加所述免疫原性序列或其片段 在受試者中引發針對與腫瘤相關的抗原或針對病原體的抗體反應、CD4T 細胞反應、CD8T細胞反應或它們的組合的能力。與癌症和病原體相關的 抗原的代表性實例以及受益於所述方法的受試者的類型與前文所述相同。
本發明還涉及一種組合物，其包括免疫原性序列或其片段，與TEM8 或其片段的胺基酸序列有至少80%同源性的胺基酸序列，藥用載體或它們 的組合。TEM8的胺基酸序列或其片段可以具有SEQIDNO: 2或SEQ ID NO:4所示的序列。另外，所述免疫原性序列或其片段以及與TEM8或其 片段同源的序列可以是重組蛋白或肽。所述重組蛋白或肽可以包括修飾的 胺基酸、未修飾的胺基酸或二者。備選地，可以將編碼所述免疫原性序列或其片段的核苷酸序列和編碼
與TEM8或其片段同源的序列的核苷酸序列插入到載體中。在這種情形中 的載體可以是質粒、病毒載體或細菌載體。另外，編碼與TEM8或其片段 同源的序列的核苷酸序列可以包括至少60個核苷酸。此外，組合物中編 碼TEM8或其片段的核苷酸序列可以具有SEQ ID NOS: 1或3的序列。另 外，所述免疫原性序列或其片段的類型的實例與前文所述的相同。
本發明還涉及在受試者中引發免疫反應的方法，所述方法包括給所述 受試者施用免疫學有效量的前文所述的組合物的步驟。組合物中與TEM8 或其片段同源的序列可以增加在所述組合物中的免疫原性序列或其片段 在所述受試者中引發針對與腫瘤相關的抗原或針對病原體的抗體反應、 CD4T細胞反應、CD8T細胞反應或它們的組合的能力。與癌症和病原體 相關的抗原的代表性實例以及受益於所述方法的受試者的類型與前文所 述相同。
本發明還涉及一種組合物，其包括TEM8或其片段和藥用載體。所述 TEM8或其片段可以是重組蛋白或肽。所述重組蛋白或肽可以包括修飾的 胺基酸、未修飾的胺基酸或二者。組合物中的TEM8或其片段可以具有 SEQIDNO:2或SEQ IDNO: 4中所示的胺基酸序列。
備選地，可以將編碼所述免疫原性序列或其片段的核苷酸序列和編碼 TEM8或其片段的核苷酸序列插入到載體中。在這種情形中的載體可以是 質粒、病毒載體或細菌載體。另外，編碼TEM8或其片段的核苷酸序列可 以包括至少60個核苷酸。此外，組合物中編碼TEM8或其片段的核苷酸 序列可以具有SEQ ID NOS: 1或3的序列。
本發明還涉及增加免疫原性組合物在受試者中引發免疫反應的能力 的方法，所述方法包括給所述受試者施用包括TEM8或其片段以及藥用載 體的組合物的步驟。這種方法可以進一步包括給所述受試者施用免疫原性 序列或其片段。所述免疫原性序列或其片段可以在包括TEM8或其片段的 組合物施用之前、同時或隨後施用。所施用的免疫原性序列或其片段可以 是腫瘤相關抗原或病原體相關抗原的免疫原性序列或其片段。關於腫瘤相 關抗原的類型、病原體相關抗原的類型和增加的免疫反應的受試者的所有 其他方面都與前文所述相同。本發明還涉及一種組合物，其包括與TEM8或其片段有至少90%同源 性的胺基酸序列以及藥用載體。TEMS的胺基酸序列或其片段可以具有 SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所示的胺基酸序列。此外，與TEM8同源
的序列或其片段可以是重組蛋白或肽。所述重組蛋白或肽可以包括修飾的 胺基酸、未修飾的胺基酸或二者。
備選地，編碼與TEM8或其片段同源的序列的核苷酸序列可以插入到 載體中。在這種情形中的載體可以是質粒、病毒載體或細菌載體。另外， 編碼與TEM8或其片段同源的序列的核苷酸序列可以包括至少60個核苷 酸。此外，組合物中編碼TEM8或其片段的核苷酸序列可以具有SEQID NOS: 1或3的序列。
本發明進一步涉及增加免疫原性組合物在受試者中引發免疫反應的 能力的方法，所述方法包括給所述受試者施用包括與TEM8或其片段有至 少90%同源性的序列和藥用載體的組合物的步驟。這種方法可以進一步包 括給所述受試者施用免疫原性序列或其片段。關於施用所述免疫原性序列 或其片段的方式、免疫原性序列或其片段的類型以及增加免疫反應的受試 者的所有其他方面都與前文所述相同。
本發明還涉及一種組合物，其包括與TEM8或其片段有至少80%的同 源性的胺基酸序列以及藥用載體。TEM8或其片段的胺基酸序列可以具有 SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列。此外，與TEM8或其 片段同源的序列可以是重組蛋白或肽。所述重組蛋白或肽可以包括修飾的 胺基酸、未修飾的胺基酸或二者。
備選地，編碼與TEM8或其片段同源的序列的核苷酸序列可以插入到 載體中。在這種情形中的載體可以是質粒、病毒載體或細菌載體。另外， 編碼與TEM8或其片段同源的序列的核苷酸序列可以包括至少60個核苷 酸。此外，組合物中編碼TEM8或其片段的核苷酸序列可以具有SEQID NOS:l或3的序列。
本發明進一步涉及增加免疫原性組合物在受試者中引發免疫反應的 能力的方法，所述方法包括給所述受試者施用包括與TEM8或其片段有至 少80%同源性的序列以及藥用載體的組合物的步驟。這種方法可以進一步 包括給所述受試者施用免疫原性序列或其片段。關於施用所述免疫原性序列或其片段的方式、免疫原性序列或其片段的類型以及增加免疫反應的受 試者的所有其他方面都與前文所述相同。
當用於本文時，"與TEM8或其片段有至少90。/。同源性的序列"可以 包括與TEM8或其片段有99%， 98%, 97%， 96%, 95%, 94%, 93%, 92%， 91% 或90%的同源性的序列。類似地，當用於本文時，"與TEM8或其片段有 至少80%同源性的序列"可以包括與TEM8或其片段有99。/。， 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%或80%的同源性的序列。
包括腫瘤相關抗原或病原體相關抗原的免疫原性序列或其片段的免 疫原性組合物可以與TEM8或其片段、或者與TEM8或其片段有至少90% 或至少80%的同源性的序列一起包含在同一組合物中，或者可以包含在不 同的組合物中。另外，所述免疫原性序列可以包括一種抗原或多種不同的 抗原。同樣地，所述免疫原性組合物可以在施用TEM8或其片段、或者與 TEM8或其片段有至少90%或至少80%的同源性的序列之前、同時或隨後 施用。無論何種方式，這樣的共同施用的組合作用增強所述免疫原性組合 物對免疫反應的引發。
本文所述的一種或多種組合物可以系統或局部施用，施用通過本領域 任何方法標準進行，例如，皮下、靜脈內、腸胃外、腹膜內、皮內、肌內、 局部地、腸、直腸、鼻、頰、陰道、或通過吸入噴霧劑、通過藥物泵或包 含在透皮貼片內或植入物內。本文所述的組合物的劑量製劑可以包括適合 施用方法的常規無毒的、生理的或藥用載體或賦形劑，並且對於本領域內 的普通技術人員是公知的。
本文所述的組合物可以獨立地一次或多次進行給藥，以實現、維持或 提高治療效果。確定劑量或者本文所述的組合物的適當劑量是否可以包括 單次施用劑量或多次施用劑量對於技術人員來說是容易地。適當的劑量取 決於受試者的健康、免疫反應的引發和/或癌症或病原體相關疾病的治療、 施用途徑和所用的製劑。
提供下述實施例是為了舉例說明本發明的多個實施方案的目的，並不 意欲以任何方式限制本發明。所述實施例以及本文所述的方法、步驟、治 療、分子和特異性化合物目前是優選實施方案的代表。本領域的技術人員應該容易理解本發明很好地適合實施目的並且獲得所提及的目標和優點， 以及本文固有的那些目的、目標和優點。本發明的技術人員應該找到包含 在由權利要求的範圍所定義的本發明的精神內的其中的改變以及其他應 用。
小鼠
關於活化的大鼠neu癌基因的轉基因MMTV-FVB/neuNT小鼠(品系 233) (Muller等，1988)購自Charles River (Calco，義大利)。通過PCR對4 周齡的雌鼠進行關於轉基因的常規篩選，如前所述。FVB/N小鼠購自 Taconic Farms，公司(White Plains,紐約)，並且C57BL/6小鼠購自傑克遜 實驗室(The Jackson Laboratory) (Bar Harbor, ME)。所有小鼠都依據由 Memorial Sloan-Kettering癌症中心(Memorial Sloan-Kettering of Cancer Center) (MSKCC)機構動物護理和使用委員會評論和核准的流程下的機構 指南籠養在無病原體的飼養室中。所有的雌性小鼠在6-8周齡進入研究中。
細胞系和組織培養物
233-VSGA1乳腺瘤細胞系來源於在關於活化的大鼠neu轉基因的 FVB/neuNT小鼠中產生的小鼠乳腺癌。這種細胞系如前述那樣維持(Nanni 等，2000)，並且是由Pier-LuigiLollini博士 (博洛尼亞大學(University of Bologna),博洛尼亞，義大利)饋贈的。B16F10是C57BL/6來源的自發 性小鼠黑素瘤，並且是由Isaiah Fidler博士 (安德森博士癌症中心(MD Anderson Cancer Center), Houston, TX)饋贈的。這種腫瘤細胞系如前述那 樣維持(Hara等，1995)。
實施例3
DNA構建體
大鼠HER2/neu的細胞外結構域通過聚合酶鏈式反應從pCMVneuNT 質粒擴增(Amici等，1998)，反應使用高保真性Platinum TAq DNA聚合酶 (Invitrogen， carlsbad, CA， 美國)禾Q 引物 FW 5'-CGAAGCTTACCATGGAGCTGGCGGCCTGG-3， (SEQ ID NO: 5)與 REV 5'畫CGGAATTCTTATGTCACCGGGCTGGC-3， (SEQ ID NO: 6)進行。 將HindIII-EcoRI片段克隆在pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)中。作為 編碼TEM8的cDNA來源，從分離自FVB/neuNT轉基因小鼠的乳房瘤提 取總RNA。使用下述引物通過PCR擴增TEM8的細胞外結構域的片段(aa 13-357): 5'- GGACTCTGCGTGGCTGCACTCGTGC-3' (SEQ ID NO: 7)和 5'- AGAGCAGCGCCAGGGCCAGCAGCAG-3' (SEQ ID NO: 8)。
PCR進行35個循環，每個循環在95。C l分鐘、64°C 1分鐘、72°C 2分鐘，而後在72。C IO分鐘。純化PCR產物，並且利用標準技術克隆到 pGEM T easy載體中(普洛麥格(Promega), Madison, WI)，以產生質粒 pGEMTEM8。對於TEM8在真核細胞中和在體內的表達，從pGEMTEM8 擴增編碼細胞外結構域的部分(aa28-279)的TEM8基因的片段，並且亞 克 隆 至U pcDNA3.1 (Invitrogen) 中。 引 物 為 5'-GGGGGTACCGCAATGGGCCGCCGCGAGGATGGGGGA陽3' (SEQ ID NO: 9)和5'-GGTGGAATTCCTAGCACAGCAAATAAGTGTCTTC-3' (SEQ ID. NO: 10)。 PCR按上述進行。
然後將PCR產物用Kpnl禾P EcoRI消化，並且克隆到pcDNA3.1 (Invitrogen)中，以產生pcDNATEM8。大規模的質粒製備通過使用Qiagen 質粒Giga或Maxi試劑盒(Qiagen， Venlo， The Netherlands)鹼裂解進行。 hTYRPl/hgp75先前克隆在WRG/BEN質粒(Weber等，1998)中。
實施例4
原位雜交
使用下述引物5'- GAAGACGATGATGGTTTGCCA-3' (SEQ ID NO: ll)和5'- GTGGTAGGTGTTGTTCAGGGG-3' (SEQ ID NO: 12)，通過PCR
擴增小鼠TEM8的細胞內結構域，並且克隆到pGEM T easy載體(普洛 麥格(Promega))中。對克隆的產物進行測序，並且針對GENEBANK數 據庫(NCBI)進行篩選，以驗證小鼠TEM8的特性和在所述載體內部的方 向。然後，在用NcoI或SalI分別消化後，利用T7和SP6聚合酶(羅氏應用科學(Roche Applied Science), Indianapolis, IN)產生反義和有義探針。 對來自233-VSGA1乳腺瘤的福馬林固定的、石蠟包埋的塊進行切 片(8mm厚度)、去除石蠟、再水合併且預處理，用於原位雜交。雜交用 3￥-標記的RNA在65'C過夜進行。在去除未結合的核糖核酸探針後，對 切片進行清洗和脫水。載玻片浸在放射自顯影乳液中(NTB-2; Kodak, Rochester,紐約)並且在乾燥箱中在4匸溫育。在暴露2周後進行放射自顯 影檢測。載玻片在Gill蘇木精中染色，脫水，然後用Permoimt (西格瑪，St. Loius, MO)封固。
實施例5
TEM8重組蛋白
利用Gateway克隆技術試劑盒(Invitrogen)中提供的載體和方法，在細 菌中過量生產TEM8重組蛋白。使用引物attBlbis-5'GGATGGGGGA-3' (SEQ ID NO: 13)和attB2bis-5'- GGGGACCACTTT GTACAAGAAAGCTGGGTCGCACAGCAAATAAGTGTCTTC -3' (SEQ ID NO: 14)，從pGEMTEM8擴增TEM8 DNA。將重組構建體引入到大腸杆 菌(E. coli) BL21 Star(DE3)感受態細胞中。
將陽性轉化體在LB培養基中培養，直到它們達到對數中期階段 (OD600 = 0.4-0.6)，並且蛋白用0.5 M異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導。 HiTrap螯合HP親和柱(安瑪西亞生物科學(Amersham Biosciences), Piscataway， NJ)用來從細胞裂解物富集TEM8蛋白。對於獲得在考馬斯染 色後具有單一條帶的TEM8製備物，利用單Q陰離子交換柱(安瑪西亞 (Amersham))通過FPLC進一步純化是必要的。純化的蛋白用NaCl梯度 從單Q樹脂上洗脫下來。TEM8蛋白在0.1 MNaCl時被洗脫下來。
實施例6
蛋白質印跡分析
製備蛋白樣品，全裂解物或重組TEM8蛋白。對於裂解物，將107個 細胞在裂解緩衝液中在冰上溫育30分鐘，所述裂解緩衝液為25 mMTris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl， 1% NP-40, 0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS, 100mg/ml苯甲基磺醯氟(PMSF)， 1 mMNa3V04， 2 mg/ml牛胰蛋白酶抑制 劑，1 mg/ml亮抑蛋白酶肽和1 mg/ml胃蛋白酶抑制劑(西格瑪)。通過在4 。C以12,000 xg離心IO分鐘而清除裂解物，並且每個泳道上樣30mg。樣 品在7.5% Tris-甘氨酸PAGE預製凝膠(Cambrex生物科學公司(Cambrex Bio Science, Inc.) East Rutherford, NJ)上分離。在電轉移後，將硝基纖維 素膜(PROTRAN, Schleicher &Schuell,倫敦，英國)用在具有0.05%的吐溫 的PBS中的5。/。脫脂幹奶粉(Bio-Rad實驗室，Hercules, CA)封閉1小時。
在室溫下用1:500稀釋的兩種多克隆抗-ATR/TEM8抗體中的一種； 在5%脫脂幹奶粉PBS/T中的N19 (圖1B)或H140 (圖81)或H140(圖9B) (Santa Cruz生物技術公司(Santa Cruz Biotechnology, Inc.), Santa Cruz, CA)，或者用1:100稀釋的收集的小鼠血清探測膜1小時。使用兔抗-山羊、 山羊抗-兔或山羊抗-小鼠IgG-HRP綴合物(Jackson免疫研究實驗室公司 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), West Grove, PA)檢觀lj結合的 抗體，在適當時，用ECL試劑盒(安瑪西亞)顯現。
實施例7
DNA和肽免疫
如報導(Ross等，1997)，通過氦氣推動的金粒子轟擊免疫FVB/N和 C57BL/6雌鼠。簡言之，在免疫之前，將小鼠的腹部皮膚剃毛，並且用 Nair (Church禾卩Dwight，公司，Princeton, NJ)去毛，並且利用氦氣推動的 基因槍(PowderMed,公司，牛津，英國)在400 psi的壓力下，將攜帶DNA 的金粒子注射到麻醉的小鼠腹部皮膚中。
遞送4次注射，每一次注射到腹部的4個分區之一，每隻小鼠總共4 pg質粒DNA。免疫每周重複，持續3-5周。用兩種不同DNA質粒的組 合處理的小鼠每周注射兩次(在第-3天和第0天)。
對於在基質膠凝膠中的腫瘤細胞的注射和細胞內細胞因子染色 (ICCA)， FVB/N小鼠(3隻/組)通過粒子轟擊用neu或FL-neu DNA每周注 射一次持續3周，或者保持未處理作為陰性對照(首次用於實驗的)。在 最後一次接種後5天，將用基質膠(百克頓迪克森(Becton Dickinson) ，SanJose， CA)混合的HER2/neu+乳房瘤細胞系(233-VSGAl)皮下注射到每隻 小鼠的右脅(250 ml基質膠中106個腫瘤細胞/小鼠)。在IO天后收集基 質膠塞和脾，並且進行ICCA(細胞內細胞因子染色)。效應器細胞在體外 用T2Dq靶細胞(E:T比例為10:1)再刺激，所述T2Dq靶細胞用免疫顯性的 HER2/neu肽(RNeu 420)脈衝。加入Golgi Stop (BD Pharmingen, San Diego, CA)，以促進分泌的細胞因子在內質網中的積累。在過夜再剌激時期後收 集細胞，用螢光團-綴合的抗體染色，並且通過流式細胞術分析IFN-Y的 產生。對於肽免疫，將50 mg肽與TiterMax (西格瑪奧爾德裡奇，St. Louis, MO)混合(l:l比例)，並且注射到每個爪墊中(100 mg肽/小鼠)。在單一 肽注射後7天，處死小鼠，並且收集胭LNs。如上文所述進行Elispot檢
腫瘤攻擊和體內CD8+T細胞消耗
將如上文所述免疫的FVB/N和C57BL/6小鼠在脅部分別用5xl04 233-VSGA1或用B16F1025K腫瘤細胞進行皮內攻擊。通過每周用卡鉗確 定兩個垂直直徑3次而測量腫瘤，並且在它們在任何直徑達到2 mm並繼 續生長時，計分為陽性。當腫瘤潰爛或在任何直徑達到1 cm時，將小鼠 處死。對於體內CD8+消耗，在相對腫瘤攻擊的第-2,+5,+12和+19天，將 來自大鼠抗-小鼠CD8雜交瘤53-6.7.2 (Guevara-Patino等，2006)的生物反 應器培養物上清腹膜內注射到小鼠中。前兩次注射由250嗎53-6.7.2組成， 並且對於第三次和第四次注射由500嗎53-6.7.2組成。在它用於免疫的小 鼠之前，關於CD8+T細胞的消耗，檢測每一批次的抗體。
製備骨髓-來源的樹突細胞
從FVB/N非轉基因小鼠的股骨收集骨髓，用PBS洗滌，在ACK裂 角率緩衝液(Cambrex生物科學(Cambrex Bio Science), Walkersville, MD，美 國)中消耗RBC，並且在24孔板中以lX10"ml培養在RPMI 10% FCS, NEAAP/S L-Glu—bme, HEPES和20 ng/mL重組小鼠GM-CSF (R&D系統,Minneapolis,,,美國)中。在2、 4和5天給養培養物。在第6天加入重 組TEM8蛋白(50 mg/lXl6樹突細胞(DC))。對照DC培養物不包含 TEM8蛋白。在第7天分離未黏附的細胞(不成熟的DC)，以lX106/2mL 重新接種在含有GM-CSF的完全培養基中，並且用另外50 mg重組TEM8 蛋白脈衝。在第8天，將細胞的整分試樣用對B7.1和CDUc特異的Ab 染色，並且93%的細胞表達兩種標記。其餘的細胞用作細胞內細胞因子分 泌測定的呈遞物(presenters)。
實施例10
細胞內細胞因子分泌測定
從用空載體、TEM8、 HER2/neu或HER2/neu+/TEM8免疫的小鼠的 引流淋巴結製備單細胞懸浮液。來自首次用於實驗的小鼠的淋巴結作為另 外的對照。DC (未脈衝或用TEM8蛋白脈衝)用完全RPMI培養基洗滌。 將細胞接種(1Xl(^LN細胞+ 0.33 105 DC，在lnL最終體積中)在完全 培養基中，2小時，並且加入10 |iL IX BFA (BD Pharmingen,聖地牙哥, CA，美國)。在16-20小時後，利用由供應商(BDPharmingen)提供的試 劑和流程，關於表面CD3、 CD4、 CD8和細胞內IFNg對細胞進行染色。 在FACSCAN (BD生物科學，Franklin Lakes, NJ，美國)獲得事件(IOO 000)， 並且利用FloJo (FloJo LLC,阿什蘭,OR，美國)6.3軟體評價數據。
ELISpot測定
通過標準ELISpot測定(Hawkins等，2000)確定TEM8-特異性INF-y生 產。在三次DNA注射的最後一次後5天，從TEM8-免疫的或對照C57BL/6 小鼠收集引流淋巴結(DLN)。將DLN在完全RPMI中機械分解，並且通 過用磁性抗-CD8珠子(Miltenyi生物技術公司(Miltenyi Biotec Inc), Aubum: CA，美國)培養而陽性選擇CD8+T細胞。CD8+T細胞(1x10v孔)與用 10 mg/mL的4種TEM8肽中的一種脈衝的H2-b靶細胞(EL-4， 1x10v孔) 一起培養20小時。這些TEM8肽，艮卩ACYGGFDL (SEQ ID NO: 15), SVL朋額EI (SEQ ID NO: 16), IYYFVEQL (SEQ ID NO: 17)和NSQGYRTA(SEQIDNO: 18)，預計與H2-Kb或H2 Db結合。作為陰性對 照，靶細胞未進行脈衝或者用不相關的卵清蛋白肽SIINFEKL (SEQ ID NO: 19)脈衝。斑點顯色如其它地方所述(Herr等，1996)進行，並且利用立體顯 微鏡和自動化計算機(Carl Zeiss公司，Munchen-Hellbergmoos,德國)計數 斑點，在40倍放大倍數進行計數。
另外，在最後一次DNA注射後5天從免疫的和對照FVB/N小鼠收集 腹股溝和腋窩淋巴結(LNs)。將LNs在完全RPMI中機械分解。通過用磁 性抗-CD8珠子(Milteny生物技術(Milteny Biotec)， Auburn, CA)溫育而 陽性選擇CD8+ T細胞。在將CD8+ T細胞(1X10V孔)與用RNEU420-429 肽(10mg/ml)脈衝的T2Dq靶細胞(1X10V孔)溫育20小時後，通過標準 ELISPOT測定確定HER2/neu-特異性IFN-g生產。RNEU420-429表位已 經表現出對於H2-Dq單倍型是免疫顯性的，並且它定位在HER2/neu的細 胞外區域(Ercolini等，2003)。作為陰性對照，靶細胞未進行脈衝。
實施例12
增殖測定方法和試劑由細胞增殖ELISA試劑盒(Cell Proliferation ELIS A kit) (羅氏(Roche),米蘭，義大利)提供。從用pcDNA3.1、 TEM8、 HER2/neu 和HER2/neu加TEM8質粒免疫的個體FVB/NT 233小鼠收集脾和淋巴結。 粉碎後，收集脾細胞和淋巴細胞，接種在96孔板(200 000細胞/孔)中， 並且在378C禾n 5% C02用兩劑量的TEM8重組蛋白之一 (25或100 mg/mL)或用ConA(安瑪西亞，米蘭，義大利)(1或3 mg/mL)刺激5天。 然後，將10 mm BrdU (羅氏)(終濃度)加入到所述細胞中持續5-6小時。 在顯色後，使用ELISA平板讀數儀(實驗室系統(Lab Systems), M-Medical Srl，米蘭，義大利)在450nm測量吸光度。
實施例13
統計學分析
進行對數等級分析，以基於Kaplan-Meier圖評估無腫瘤存活中的差
巳
升°實施例14
T細胞反應在腫瘤層得到擴增
先前觀察到，當與第二、腫瘤-限制的DNA疫苗一起施加時，注射
TEM8 DNA增加抗腫瘤免疫性，並且這一作用在很大程度上取決於CD8 T 細胞。這些觀察是使用兩種疫苗，即在FVB小鼠中的HER2/neu，在 C57BL/6小鼠中的hgp75而獲得的，這兩種疫苗自身引發初級抗體反應。
進行了一系列實驗，以在免疫的小鼠中鑑定對TEM8特異的CD8 T 細胞。為了放大弱的T細胞反應，使用基質膠測定，用來擴大並檢測腫瘤 附近的滲透性T細胞(TILS)。卵清蛋白和HER2/neu用作模型抗原。將用 編碼卵清蛋白肽的cDNA免疫的小鼠用在基質膠中的ova+腫瘤攻擊，並 且6天後，比較在引流淋巴結中和在含有腫瘤的基質膠塞中的卵清蛋白-特異性CD8 T細胞的百分數(圖1)。對照包括首次用於實驗的小鼠和用 不表達卵清蛋白的腫瘤攻擊的小鼠(B16)。
在細胞內細胞因子分泌測定中，在所有用ova免疫的小鼠的引流淋巴 結中約1%的CD3+CD8+T細胞識另lj ova肽，而不管腫瘤是否表達卵清蛋 白。然而，在ova+腫瘤的腫瘤層中，存在ova-特異性CD8+T細胞的基本 擴增，以致在基質膠塞中60。/。的CD3+CD8+T細胞是ova-特異性的，而 相比對照cwa-腫瘤為5%。在首次用於實驗的小鼠中不存在ova-特異性T 細胞。
另外，小鼠還用與Flt3-配體(FL-neu)融合的rHER2/neucDNA免疫， 並用在基質膠中的233-VSAG1腫瘤攻擊。在4、 6或10天後，使用從脾、 引流淋巴結和基質膠塞分離的細胞，通過ICCA測量neu-特異性反應。從 第4天開始，觀察到neu-特異性反應(l。/。的CD3+CD8+T細胞)，並且這 在第6天增加到2%，和在第10天是11% (結果未顯示)。在引流淋巴結 或脾中的反應任何時刻都不超過0.3%。為了證實這一結果，將用HER 2/neu或FL-neu免疫的小鼠進行相同的分析，並且當在脾中沒有檢測到響 應的細胞的時刻，在腫瘤層中觀察到neu-特異性CD8+T細胞的明顯擴增 (圖2)。
利用計算機算法來預測具有對小鼠I類MHC Kd和Db的高親和性的TEM8肽，並且在ELIspot和細胞內細胞因子流式細胞術(ICC)測定中， 將用4種這樣的肽脈衝的脾細胞用來刺激來自TEM8免疫的小鼠的T細 胞。儘管使用基質膠測定或標準IFN-gELISPOT，不能證明在免疫的小鼠 中對TEM8特異性的CD8 T細胞。此外，當將來自免疫的小鼠的血清用 於探測用重組TEM8蛋白上載的蛋白質印跡時，沒有觀察到抗體。
在腫瘤位置和在腫瘤首次用於實驗的小鼠的引流淋巴結中，TEM8 DNA 增加針對HER2/neu和hTRP-l DNA疫苗二者的CD8T細胞反應
面對由聯合疫苗引發的整體腫瘤免疫性部分取決於CD8+T細胞，並 且仍沒有觀察到TEM8-特異性CD8+T細胞的事實，利用基質膠測定，在 用單獨的HER2/neu、單獨的TEM8或聯合的兩種DNA免疫的小鼠中定 量針對HER2/neu的CD8 T細胞反應。當給與TEM8和HER2/neu兩種疫 苗時，在攜帶腫瘤的小鼠中觀察到針對存在於腫瘤位置的HER2/neu的 CD8 T細胞反應的兩倍增加(圖3)。空載體(pING)沒有這樣的輔助作 用。
在neu-特異性T細胞中的這種增加可能是由炎症在腫瘤內部引起的 對neii陽性細胞的提高的進入引起的，或是由針對在內皮細胞或基質中表 達的TEM8蛋白的局部免疫反應引起的。還考慮這樣的可能性，即針對 TEM8的弱反應不能通過ICCA和ELISPOT測定檢測到但是仍然足以增 加腫瘤內的炎症。備選地，TEM8可能通過某些未確定的機制改變淋巴結 中的免疫反應。
為了區分這些可能性，將小鼠用TEM8、 HER2/neu或兩種疫苗聯合 免疫。在這些實驗中，不植入腫瘤，但是在最後一次疫苗後5天，收集引 流淋巴結，並且利用IFN-g ELISPOT測定針對免疫顯性meu肽的CD8 T 細胞反應(圖4A)。 TEM8，而不是空載體(pING)，將在免疫的、不攜 帶腫瘤的小鼠的引流LNs中的反應細胞的數目增加了 5倍。當TEM8與 黑素瘤分化抗原、人酪氨酸酶-相關蛋白1 (hgp75)結合時，也觀察到CD8 T細胞的基本上相同的增加(圖4B)。另夕卜，TEM8還增加針對外源抗原、 卵清蛋白的CD8+T細胞反應(圖4C)。這表明TEM8作為免疫佐劑用於腫瘤免疫學和傳染病的多種應用的通用用途。
為了評估CD8T細胞對TEM8-依賴型免疫性的貢獻，恰恰在腫瘤攻 擊之前，將這些細胞從小鼠中消耗掉，並且之後持續3周。CD8+T細胞 的體內消耗通過腹膜內注射大鼠MAb克隆53-6.7.2而進行。僅用 HER2/neu免疫的小鼠部分免於腫瘤攻擊(P=0.0004]，並且相對於 HER2/neu，這種作用被CD8消耗減小，但沒有消除(P^ 0.3)(圖4C，左)。 用聯合疫苗CTEM8+HER2/neu)免疫的小鼠也是部分免於受腫瘤攻擊(P二 0.0009)。在這種情形中，當T細胞消耗(P二0.02)時，完全失去腫瘤保護， 儘管相對於對照組，存在腫瘤生長的延遲(圖4C，右)。在黑素瘤模型中， hTYRPl/hgp75提供部分保護(P二O.l)，並且相對於單獨的hTYRPl/hgp75， 聯合疫苗增強了這種保護作用(P= O.(M)(圖犯)。聯合的 TEM8+hTYRPl/hgp75疫苗保護小鼠免受腫瘤攻擊(PK).0008)，並且T細 胞消耗將腫瘤保護作用減小到與用單獨的hTYRPl/hgp75疫苗觀察到的水 平非常接近的水平(P二0.4)。
當將同系DCs通過電穿孔用HER2/neu RNA轉染時，它們具有並且 呈遞HER2/neu肽的完整補體，所述完整補體能夠結合MHC I和MHC II 分子中的每一種。當這些細胞用作ELISPOT中的靶時，可以定量存在和 不存在TEM8時在接種之後在小鼠中針對所有免疫原性HER2/neu肽的整 體CD8+和CD4+T細胞反應。簡言之，用mRNA對DC進行電穿孔操作
如下
鼠DCs來源於小鼠骨髓(BM)。所述BM從首次用於實驗的小鼠的脛 骨和腿骨流出。將細胞在補充了 GM-CSF (32 ng/ml)的培養基中培養6-7 天。典型地，在第7天，將細胞用於電穿孔。將4 x 106 BM-來源的DCs 用PBS洗滌兩次，並且重懸在100 ml溶液R (Amaxa, Gaithersburg, MD) 中；在加入20 mg HER2/neu mRNA後，細胞用AMAXA NUCLEOFECTOR II裝置(程序U015)脈衝，並且迅速轉移到含有預溫熱的培養基的培養皿 中。在轉染後24小時，DCs用作ELISPOT測定中的靶。使用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra試劑盒(Ambion, Austin, TX)並且按照供應商的指導， 進行編碼HER2/neu的mRNA的體外轉錄。
使用這種方法，當在疫苗中包含TEM8時，在對HER2/neu特異性的整體CD8+ T細胞中觀察到3倍的增加，但是當小鼠在免疫過程中耗盡
CD4+T細胞時，沒有完全失去這種增加。這些小鼠通過腹膜內(i.p.)注 射抗-CD4單克隆抗體而消耗CD4 T細胞，所述抗-CD4單克隆抗體由從 MSKCC單克隆抗體機構(MSKCC Monoclonal Antibody facility)獲得的 雜交瘤克隆GK1.5生產。在第一次DNA免疫前的1天幵始，和在整個免 疫階段的持續過程中，所述抗體施用一周一次(250mg/小鼠)。使用從這 些相同的小鼠獲得的細胞，測量整體CD4+T細胞反應，並且在TEM8處 理的小鼠中在HER2/neu-特異性CD4+ T細胞的數目中存在中等增加(圖 4E)。這些數據表明TEM8部分通過增加CD4+ T細胞反應而起作用，並 且這又增加CD8+T細胞。
突變的TEM8不具有佐劑活性
作為確定TEM8蛋白是否具有免疫佐劑的生物學活性的第一步，將野 生型TEM8與兩種構建體(Opt-l和Opt-2)進行比較，所述構建體每種 具有9個胺基酸變化。將這些突變引入到MHC I錨定殘基中，並且設計 成增加肽與H2-Kb和H2-Db的結合。然而，預計這些變化不會在FVB小 鼠中增加CD8T細胞免疫性。
當Opt-2分別與模型抗原hgp75(hTRYP-l)或HER2/neu聯合用於 C57BL/6或FVB小鼠中時，Opt-2構建體不具有佐劑活性(圖5A)。為了 確定關於降低的活性的原因，COS 7細胞用(FLAG-標記的)Opt-2或TEM8 DNA轉染。簡言之，獲得FLAG-標記的TEM8或opt-2質粒，其將 TEM8/opto2序列克隆在pcDNA3.1/標記載體(FLAG vector)(Invitrogen)中 FLAG的下遊(3')。
在6孔簇板中，使用fugene6 (羅氏)按照供應商的用法說明，用1 pg DNA轉染COS-7細胞。Munocomycin從密蘇裡州St. Louis的西格瑪獲得。 細胞裂解物在12。/。二-tris丙烯醯胺凝膠上分離，轉移到PVDF膜上，並且 使用與HRP直接綴合的抗-FLAG抗體(西格瑪，St. Louis, MO)和ECL顯色 試劑(皮爾斯(Pierce))檢測FLAG-標記的蛋白。由於TEM8和Opt2蛋白 在轉染到COS 7細胞中以及隨後粘液菌素A處理的24小時後是穩定的(圖5B)，推測降低的活性不可能是由於減小的蛋白穩定性引起的。
這些數據進一步支持TEM8蛋白作用為免疫佐劑並且Opt-2中的突變 使TEM8失活的假說。在Opt-2中的兩種變化位於TEM8與另一種vWF 結構域蛋白共享的vWF結構域中的保守殘基。
實施例17
TEM8在單核細胞/巨噬細胞和樹突細胞中表達
上述數據支持由TEM8 DNA "疫苗"產生的TEM8蛋白不是特異性 免疫反應的靶而是作用為佐劑的可能性。由於現有報導已經表明巨噬細胞 和樹突細胞是炭疽感染的靶，並且由於還已知這些細胞存在於腫瘤中，一 些方法已經用來檢查TEM8在APCs中的表達。
先前表明表達TEM8的細胞在小鼠乳腺瘤和黑素瘤的基質中發現。使 用IHC，表達TEM8的細胞在Pten/p53條件性裸鼠中的自發前列腺腫瘤中 顯現(圖6)。蛋白質印跡已經證實了這種觀察(未顯示)。預測這些TEM8+
細胞中的至少一些是巨噬細胞。
TEM8最初描述為這樣的轉錄體，其表達限於腫瘤內皮細胞，在成年 人組織中具有非常有限的表達。更近來，使用免疫組織化學和蛋白質印跡 分析，在正常小鼠組織中檢測到TEM8蛋白(Bonuccdli等，2005)。本發 明表明TEM8 mRNA在乳腺瘤(233-VSGAl)和黑素瘤(B16F10)的基質中表 達，而對照"有義"探針沒有顯現出雜交信號(圖7A-7H)。在蛋白質印 跡中證實在乳腺瘤和黑素瘤中表達的反應性蛋白的大小為80kDa(圖71)。 這表明，在這些腫瘤中表達的主導蛋白是TEM8，並不是ATR或是sTEM8。 TEM8還表達在正常小鼠的腎臟中，而不表達在培養的233-VSGA1或 B16F10腫瘤細胞中。
本發明還表明在小鼠和人腫瘤基質內的TEM8陽性細胞具有單核細 胞-巨噬細胞種系特有的形態，並且與用泛-巨噬細胞標記CD68染色的細 胞共同定位在同處(圖7J)。使用流式細胞術，觀察到腫瘤內表達TEM8 的細胞是CDllb+和/或Grl+，確證這些細胞是骨髓來源的假說(圖7K)。 令人感興趣地，在首次用於實驗的LN中的相同骨髓群體中表達很少至不 表達TEM8，這表明腫瘤促進TEM8在骨髓細胞中的表達，或者支持腫瘤基質中的丁￡]^8+細胞的補充/增殖。
令人吃驚地，發現，儘管Cdllc+細胞不在腫瘤中表達TEM8 (未顯 示)，但是在腫瘤引流淋巴結(TDLN)中而不是在首次用於實驗的淋巴 結中表達TEM8的細胞主要是CDllc+ B220+類漿細胞(plasmacytoid) 樹突細胞(圖7L)。體外培養來源於骨髓的DC也表達TEM8(圖7M， 7N)。 簡言之，本文所用的技術的流程如下
本發明檢驗人的6例前列腺瘤和9例乳腺瘤。所用的組織用福馬林 固定並且用石蠟包埋。對於每種獨立的情形，切成8mm厚的切片。將載 玻片在二甲苯中脫石蠟30分鐘，使用梯度乙醇濃度再水合，並且在植物 蒸汽機中在檸檬酸緩衝液中在98。C汽蒸30分鐘。在用過氧化氫酶猝滅5 分鐘並且用抗生物素蛋白封閉生物素後，切片用在PBS緩衝液中的1: 200 稀釋的多克隆抗-ATR/TEM8抗體(N 19， Santa Cmz生物技術)稀釋液或1: 100稀釋的抗人CD68 (DakoCytomation)抗體溫育過夜。抗體結合的檢測
使用生物素醯化的二級抗體和辣根過氧化物酶綴合的鏈黴抗生物素蛋白 (DakoCytomation)以及3',3'-二氨基-聯苯胺作為色素原而獲得。載玻片用蘇 木精復染色。適當的陽性和陰性對照載玻片平行染色(圖7J)。
對於在圖7K中所述的結果，LNs和腫瘤從第10天的攜帶B16-基質 膠的小鼠中切下。將腫瘤和LN通過細胞濾器粉碎。另外，將腫瘤在Percoll 梯度上離心，以富集活細胞級分。腫瘤細胞用CDllbAPC，CDllbAPCCY7， TEM8 (+抗-兔PE二抗)和7AAD染色。在染色後，細胞對7AAD-(活) 細胞門控(gated)。
對於圖7L所述的結果，LN細胞用CDllcAPC, B220Percp和TEM8(+ 抗-兔PE 二抗)或CD1 lb APC， CD1 lbAPCCY7和TEM8(+抗-兔PE 二抗) 染色。基於正向和側分斷FSC-SSC)形態，在C中所示的分析在活細胞上 門控\。對於圖7M所述的結果，DCs來源於C57B16小鼠股骨的骨髓，並 且用RPMI 10%FBS、 Gln、 PEN-STREP、 (3-巰基乙醇、30ng/ml GM-CSF 培養指定的天數。將含有10嗎總蛋白的裂解物上樣到10。/。二-tris丙烯醯 胺凝膠上，進行蛋白質印跡。對於在圖7N中所述的結果，流式分析在 DAPI-活細胞上門控(顯示CDllcAPC， TEM8+抗rabPE染色)。除了抗 -TEM8 (兔)購自親和生物試劑(Affinitybioreagents)之外，用於流式細胞術的所有抗體都購自BD。
此外，還觀察到在用多克隆激活劑脂多糖(LPS)刺激後，培養的
Dcs或巨噬細胞顯著增加TEM8的表達(圖70)。 LPS增加共同刺激標記 CD86的表面表達，並且誘導細胞因子IL-6和IL-12在DCs中的分泌。 TEM8的表達以與TNFa相同的動力學發生。
簡言之，DC如前文所述來源於骨髓，並且將骨髓用RPMI7.5。/。FBS, Gin, PEN- STREP, 10ng/ml M-CSF培養而獲得巨噬細胞。第10天的DC和 第5天的巨噬細胞用1 pg/ml LPS (西格瑪)處理。在LPS刺激後24小時收 集巨噬細胞，DC在指定時刻收集。使用TRIZOL (invitrogen)按照供應商 的使用說明提取RNA。使用高能力cDNA archive試劑盒(High Capacity cDNA archive kit) (ABI)，將2叱RNA反轉錄。60 ng cDNA用作qPCR 反應的模板。
使用商購的TEM8， TNFa和18S特異性TAQman探針(應用生物系 統(Applied Biosystems))。反應使用標準混合物(ABI)和ABI 7500熱循環儀 (ABI)進行。結果表示相對於相關的18S的表達，並且相對於未處理樣品 在相同時刻的表達標準化的所指RNA的表達倍數增加。綜合考慮，這些 實驗表明TEM8可以是活化的抗原呈遞細胞(APCs)的新標記，其對於 腫瘤免疫性和抗原呈遞具有特別的相關性。
實施例18
當與編碼HER2/neu或TYRPl/gp75的DNA疫苗組合時，TEM8 DNA增 強腫瘤免疫性
編碼大鼠HER2/neu細胞外結構域的DNA疫苗在自髮乳腺瘤發生轉 基因小鼠模型中抑制腫瘤發生和生長(Amid等，1998, Esserman等，1999; Piechocki等，2001; Foy等，2001; Quaglino等，2004)，並且這種作用被細胞 因子增強(Chen等，1998; Pilon等，2001; Disis等，2003; Croci等，2004; Lin 等，2004; Spadaro等，2005)。當將HUVEC與大鼠HER2/neu DNA聯合注 射時，還提高了對內源性乳腺瘤的保護作用(Venanzi等，2002)。
為了開發更容易轉變為臨床應用的分子定義的疫苗，確定將血管標記 結合到本發明的疫苗中而不是HUVEC細胞中。選擇TEM8作為免疫靶點，並且全細胞HUVEC疫苗用編碼TEM8細胞外結構域部分(aa 28- 279) 的cDNA取代。將具有活化的大鼠neu癌基因的乳房表達的雌性轉基因 FVB/neuNT小鼠(品系233)每兩周一次免疫三次(three times bi-weekly),免 疫使用肌內注射進行，並且然後用233-VSGA1腫瘤細胞攻擊。出於統計 學原因選擇這種模型，因為植入的腫瘤比內源性乳腺瘤生長更快更均勻。 此外，植入的腫瘤在活動物中更容易監測。作為單一試劑的HER2/neu疫 苗提供部分腫瘤保護(P-0.0002)，而單獨的TEM8沒有活性。
在用單獨的ECD免疫的小鼠中，在腫瘤攻擊後56天，50%是沒有腫 瘤的，而編碼TEM8和HER2/neu的DNA的共同注射在這種小鼠模型中 賦予完全的腫瘤保護作用；與單獨的HER2/neu相比，這代表顯著的提高 (P=0.06)(圖8A)。在用不同的DNA遞送方法即粒子轟擊法免疫的親本、 非轉基因FVB/N小鼠中觀察到非常相似的結果。代替肌內免疫所用的共 同注射時間表，採用每周一次的時間表。每周，在HER2/neu DNA注射前 3天，小鼠(15隻/組)注射TEM8 DNA。在用單獨的HER2/neu免疫的 小鼠中觀察到對233-VSGAl腫瘤攻擊的部分保護作用(15%)( =0.01)，而 單獨的TEM8沒有活性。並列施用HER2/neu和TEM8兩種疫苗在60%的 小鼠中誘導長期(IOO天)的腫瘤保護作用(圖8B)。由聯合疫苗提供的 保護作用顯著比在對照動物(PB/0.0001)中和在接受單獨的TEM8 (P^.0001)或HER2/neu (P-0.01)的小鼠中觀察到的保護作用更好。感興趣 地，還觀察到，用聯合疫苗(TEM8 + HER2/neu)免疫的15隻FVB/N小鼠 中有4隻在它們完全排斥腫瘤之前多達50天表現出初始腫瘤生長(圖 8C)。
為了研究與其它腫瘤Ag組合的TEM8 DNA注射是否還增加對其它 腫瘤類型的抗腫瘤免疫性，TEM8與編碼黑素細胞分化Ag、異源(人) hTYRPl/hgp75的DAN疫苗組合。先前表明，異源黑素細胞分化Ag誘導 針對在小鼠黑素瘤B16F10中表達的對應小鼠Ag的交叉反應保護性免疫 性。例如，人TYRP-l/hgp75DNA提供對小鼠黑素瘤B16F10的部分保護 作用，所述DNA表達相關性接近的小鼠TYRP- (80%相同性和90%同源 性)(Naftzger等，1996; Bowne等，1999; Pcrales等，2002)。使用同前的每 周一次時間表，小鼠用單獨的hTYRPl/hgp75或與TEM8 DNA聯合免疫數周，並且用4—/104 B16F10黑素瘤細胞攻擊。結果與使用HER2/neu系 統觀察到的那些相似單獨的TEM8 DNA對腫瘤生長沒有作用，而單獨 的hTYRPl/hgp75 DNA延遲腫瘤生長並且提供部分腫瘤保護作用(P二 0.1)。聯合疫苗進一步將沒有腫瘤的存活提高與在對照組中測量的水平顯 著不同的水平(P二 0.002)。這在攻擊後31天是明顯的，那時單獨的 hTYRPl/hgp75提供57%的沒有腫瘤的存活，並且hTYRPl/hgp75和TEM8 的組合提供93%的沒有腫瘤的存活(圖9A)。
實施例19
針對TEM8 DNA的免疫反應
在嘗試測量針對TEM8的免疫反應中，分析來自用單獨的TEM8 DNA 或與HER2/neu DNA結合免疫的小鼠的血清的TEM8-特異性Ab。 TEM8 的細胞外結構域在細菌中過量表達，並且TEM8重組蛋白用作用來自每組 小鼠的血清集合顯影的蛋白質印跡中的Ag來源。在用TEM8 DNA疫苗 或聯合疫苗(TEM8+HER2/neu)免疫的小鼠中都沒有檢測到針對TEM8的 Ab反應性(圖9B)。
進行了數個實驗，以評估免疫小鼠中針對TEM8的T細胞反應。BM 細胞在GM-CSF和IL-4中培養7天。得到的不成熟DC用重組TEM8蛋 白脈衝2天，並且用作離體(ex-vivo) IFNg細胞內細胞因子測定的靶， 所述測定使用從用TEM8 DNA免疫的小鼠的DLN分離的細胞進行。沒有 觀察到特異性的識別。從一級TEM8序列合成肽，其具有與H2Kb或H2Db 的高預測結合。在來自用TEM8 DNA免疫的小鼠的CD8+ T細胞的離體 刺激後，在潛在的同源肽的存在下沒有IFN-g釋放。
此外，其中用重組TEM8蛋白刺激來自免疫的小鼠的脾細胞的增殖測 定也沒有給出特異性識別的證據。因為TEM8在一些正常組織中表達，以 一周的時間間隔注射5次TEM8 DNA的小鼠進行了完全的屍檢，以鑑定 任何自我免疫病理的區域。除了脾臟中較少的血漿細胞增生和輕度多病灶 竇組織細胞增生反應以及在C57BL/6小鼠中常見的膽囊透明變性之外， 在所檢查的25個器官中沒有報告顯著的病理損傷。心、肝、肺、腎、脾、 子宮和皮膚都表現正常。實施例20
TEM8注射增加DC從皮膚到引流淋巴結的遷移
本發明檢查上文所討論的TEM8增強免疫反應的機制。為了做到此， 比較了在注射TEM8 DNA或空載體後的DC遷移。簡言之，使用基因槍 對小鼠注射空載體或TEM8 DNA。在1 ， 3, 5或7天後的小鼠(在腹部剃 毛)用10 |_d含有3.3% FITC和5%DMSO的皮膚-致敏溶液(1:1丙酮鄰 苯二甲酸二丁酯)處理。
在FITC染色後24小時，收集引流的LNs，並且處理如下以用於流 式細胞術首先，將組織在37X:在具有1 mg/ml膠原酶的PBS中溫育1 小時。然後，將LNs通過細胞濾器粉碎，並且用PBS洗滌。將兩百萬個 細胞用CDllcAPC、 MHCIIpe、 CD3APCCY7、 CD19TexasRED染色。觀 察到，在TEM8施用後第3天和第5天，與用空載體處理的小鼠相比較， 在DCs從皮膚到引流淋巴結的遷移百分數中存在顯著增加(圖10)。
為了進一步研究TEM8在抗原呈遞和T細胞激活中的作用，設計幾 種siRNAs，並且在瞬時轉染後檢測它們抑制TEM8 RNA的能力。簡言之， 將NIH-3T3細胞接種在12孔板中，並且利用脂轉染胺2000 (Invitrogen) 按照供應商的用法說明，用25 nM濃度的指定的siRNA進行轉染。寡聚 物#1, #2, #3和CTR購自Sigma-proligo, #am購自ambion。 24小時後，將 細胞用胰蛋白酶消化，洗滌，並且按上述用Trizol(Iiwitrogen)提取RNA。 如上述製備cDNA，並且通過qPCR進行分析。在檢測的3種siRNAs中， 兩種將TEM8的表達減少至少5倍(圖11 )。這些將用來在體外擊倒APC 中的TEM8，並且檢測APC的運動性，和抗原呈遞。
為了在體內研究TEM8在APC成熟和功能中的作用，生成一系列 TEM8條件性裸鼠。耙載體產生如下通過PCR擴增TEM8基因組的3 個片段。這些是3 Kb側連外顯子2和3的"5'臂"，包括外顯子2禾a 3的 4kb片段，和這些外顯子下遊的5Kb的"3'臂"。克隆並且測序每個片段， 然後如所示引入到所述靶載體中。使用安瑪西亞Readyprime II標記試劑 盒用32P標記的探針X和Y用來在DNA印跡中檢測TEM8基因。
因此，生成了在其中引入了側連TEM8基因座的外顯子2禾n 3的loxp位點的靶載體。當表達Cre重組酶時，在TEM8基因座中的外顯子2和3 將被切除，打斷蛋白的I-結構域以及閱讀框(圖12A-12B)。將這種載體 轉染到ES細胞中，篩選菌落，以選擇準確同源重組事件。在將所選擇的 ES克隆引入到胚胎中後，將小鼠與其它品系雜交，在所述其它品系中， 在DCs、巨噬細胞或其它確定的細胞類型中表達CDR重組酶。
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權利要求
1.一種組合物，所述組合物包括免疫原性序列或其片段；TEM8或其片段；藥用載體；或它們的組合。
2. 權利要求l的組合物，其中所述免疫原性序列或其片段或者TEM8或其片段是重組蛋白或肽。
3. 權利要求2的組合物，其中所述重組蛋白或所述肽包括修飾的氨 基酸、未修飾的胺基酸或二者。
4. 權利要求l的組合物，其中所述TEM8或其片段具有SEQIDNO: 2或SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列。
5. 權利要求1的組合物，其中編碼所述免疫原性序列或其片段的核 苷酸序列以及編碼所述TEM8或其片段的核苷酸序列插入到載體中。
6. 權利要求5的組合物，其中所述載體是質粒、病毒載體或細菌載
7. 權利要求4的組合物，其中所述編碼所述TEM8或它的所述片段 的核苷酸序列包括至少60個核苷酸。
8. 權利要求4的組合物，其中所述編碼所述TEM8或其片段的核苷 酸序列具有SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 3所示的序列。
9. 權利要求1的組合物，其中所述免疫原性序列或其片段是腫瘤相 關抗原或病原體相關抗原的免疫原性序列或其片段。
10. 權利要求9的組合物，其中所述腫瘤相關抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP-l， PSMA， TRYP-2， NY-ESO-l, MAGE-1， MAGE-3， CEA, PSA, 酪氨酸酶，突變體p53,突變體p21，突變體cdk4,突變體L9， BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
11. 權利要求9的組合物，其中所述病原體相關的抗原是細菌脂多糖， 炭疽致死因子，炭疽水腫因子，HlVgpl20或瘧疾抗原，其中所述瘧疾抗 原是CSP, TRAP/SSP2, LSA1, MSP1和AMA陽1 。
12. 在受試者中引起增強的免疫反應的方法，所述方法包括下述步驟給所述受試者施用免疫學有效量的權利要求1的組合物。
13. 權利要求12的方法，其中在所述組合物中的TEM8或其片段增 加所述組合物中的免疫原性序列或其片段在受試者中引發針對與癌症相 關的抗原或針對與病原體相關的抗原的抗體反應、CD4T細胞反應、CD8 T細胞反應或它們的組合的能力。
14. 權利要求12的方法，其中所述與癌症相關的抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP-l， PSMA， TRYP-2， NY-ESO-l, MAGE-l, MAGE-3, CEA, PSA, 酪氨酸酶，突變體p53，突變體p21，突變體cdk4,突變體L9, BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
15. 權利要求12的方法，其中所述與病原體相關的抗原是細菌脂多 糖，炭疽致死因子，炭疽水腫因子，HlVpgl20或瘧疾抗原，其中所述瘧 疾抗原是CSP, TRAP/SSP2, LSA1, MSP1和AMA-1 。
16. 權利要求12的方法，其中所述受試者患有乳腺癌、前列腺癌、 黑素瘤、結腸癌、慢性髓性白血病或宮頸癌，或者己經暴露於或懷疑暴露 於瘧疾、炭疽、HIV或生物武器。
17. —種組合物，所述組合物包括免疫原性序列或其片段；與TEM8的胺基酸序列或其片段具有至少90%同源性的胺基酸序列；藥用載體； 或它們的組合。
18. 權利要求17的組合物，其中所述TEM8或其片段的胺基酸序列 具有SEQ IDNO:2或SEQ IDNO:4所示的序列。
19. 權利要求17的組合物，其中所述免疫原性序列或其片段以及與 TEM8或其片段同源的序列是重組蛋白或肽。
20. 權利要求19的組合物，其中所述重組蛋白或所述肽包括修飾的 胺基酸、未修飾的胺基酸或二者。
21. 權利要求17的組合物，其中編碼所述免疫原性序列或其片段以及與TEM8或其片段同源的所述序列的核苷酸序列插入到載體中。
22. 權利要求21的組合物，其中所述載體是質粒、病毒載體或細菌 載體。
23. 權利要求21的組合物，其中編碼所述與TEM8或它的所述片段 同源的所述序列的核苷酸序列包括至少60個核苷酸。
24. 權利要求21的組合物，其中編碼TEM8或其片段的核苷酸序列 具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3所示的序列。
25. 權利要求17的組合物，其中所述免疫原性序列或其片段是腫瘤 相關的抗原或病原體相關的抗原的免疫原性序列或其片段。
26. 權利要求25的組合物，其中所述腫瘤相關的抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP-l， PSMA， TRYP-2, NY-ESO-1, MAGE-1, MAGE-3， CEA, PSA， 酪氨酸酶，突變體p53,突變體p21,突變體cdk4,突變體L9， BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
27. 權利要求25的組合物，其中所述病原體相關的抗原是細菌脂多 糖，炭疽致死因子，炭疽水腫因子，HlVgpl20或瘧疾抗原，其中所述瘧 疾抗原是CSP, TRAP/SSP2, LSA1， MSP1和AMA畫1 。
28.在受試者中引起增強的免疫反應的方法，所述方法包括下述步驟給所述受試者施用免疫學有效量的權利要求17的組合物。
29. 權利要求28的方法，其中在所述組合物中的與TEM8或其片段 同源的序列增加所述組合物中的免疫原性序列或其片段在受試者中引發 針對與癌症相關的抗原或針對與病原體相關的抗原的抗體反應、CD4 T細 胞反應、CD8T細胞反應或它們的組合的能力。
30. 權利要求29的方法，其中所述與癌症相關的抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP-1 ， PSMA ， TRYP畫2， NY陽ESO-1, MAGE-1, MAGE-3, CEA, PSA， 酪氨酸酶，突變體p53,突變體p21,突變體cdk4，突變體L9, BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
31. 權利要求29的方法，其中所述與病原體相關的抗原是細菌脂多 糖，炭疽致死因子，炭疽水腫因子，HlVgpl20或瘧疾抗原，其中所述瘧 疾抗原是CSP, TRAP/SSP2, LSA1, MSP1和AMA-1 。
32. 權利要求28的方法，其中所述受試者患有乳腺癌、前列腺癌、 黑素瘤、結腸癌、慢性髓性白血病或宮頸癌，或者己經暴露於或懷疑暴露 於瘧疾、炭疽、HIV或生物武器。
33. —種組合物，所述組合物包括 免疫原性序列或其片段；與TEM8或其片段的序列具有至少80%同源性的胺基酸序列； 藥用載體，-或它們的組合。
34. 權利要求33的組合物，其中所述TEM8或其片段的胺基酸序列 具有SEQ ID NO: 2或SEQ IDNO:4所示的序列。
35. 權利要求33的組合物，其中所述免疫原性序列或其片段以及與 TEM8或其片段同源的序列是重組蛋白或肽。
36. 權利要求35的組合物，其中所述重組蛋白或所述肽包括修飾的 胺基酸、未修飾的胺基酸或二者。
37. 權利要求33的組合物，其中將編碼所述免疫原性序列或其片段 的核苷酸序列以及編碼與TEM8或其片段同源的所述序列的核苷酸序列 插入到載體中。
38. 權利要求37的組合物，其中所述載體是質粒、病毒載體或細菌 載體。
39. 權利要求37的組合物，其中編碼所述與TEM8或它的所述片段 同源的所述序列的核苷酸序列包括至少60個核苷酸。
40. 權利要求37的組合物，其中編碼TEM8或其片段的核苷酸序列 具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3所示的序列。
41. 權利要求33的組合物，其中所述免疫原性序列或其片段是腫瘤 相關的抗原或病原體相關的抗原的免疫原性序列或其片段。
42. 權利要求41的組合物，其中所述腫瘤相關的抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP陽l， PSMA， TRYP-2, NY-ESO-l, MAGE-1， MAGE-3, CEA, PSA, 酪氨酸酶，突變體p53,突變體p21,突變體cdk4,突變體L9, BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
43. 權利要求41的組合物，其中所述病原體相關的抗原是細菌脂多糖，炭疽致死因子，炭疽水腫因子，HlVgpl20或瘧疾抗原，其中所述瘧 疾抗原是CSP, TRAP/SSP2， LSA1， MSP1和AMA-1 。
44. 在受試者中引起增強的免疫反應的方法，所述方法包括下述步驟給所述受試者施用免疫學有效量的權利要求33的組合物。
45. 權利要求44的方法，其中在所述組合物中的與TEM8或其片段 同源的序列增加所述組合物中的免疫原性序列或其片段在受試者中引發 針對與癌症相關的抗原或針對與病原體相關的抗原的抗體反應、CD4T細 胞反應、CD8T細胞反應或它們的組合的能力。
46. 權利要求45的方法，其中所述與癌症相關的抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP-l, PSMA, TRYP-2, NY-ESO-l， MAGE-l, MAGE畫3， CEA, PSA, 酪氨酸酶，突變體p53,突變體p21,突變體cdk4,突變體L9, BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
47. 權利要求45的方法，其中所述與病原體相關的抗原是細菌脂多 糖，炭疽致死因子，炭疽水腫因子，HlVgpl20或瘧疾抗原，其中所述瘧 疾抗原是CSP, TRAP/SSP2, LSA1, MSP1和AMA陽1 。
48. 權利要求44的方法，其中所述受試者患有乳腺癌、前列腺癌、 黑素瘤、結腸癌、慢性髓性白血病或宮頸癌，或者已經暴露於或懷疑暴露 於瘧疾、炭疽、HIV或生物武器。
49. 一種組合物，所述組合物包括 TEM8或其片段以及藥用載體。
50. 權利要求49的組合物，其中所述TEM8或其片段是重組蛋白或
51. 權利要求50的組合物，其中所述重組蛋白或所述肽包括修飾的 胺基酸、未修飾的胺基酸或二者。
52. 權利要求49的組合物，其中所述TEM8或其片段具有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列
53. 權利要求49的組合物，其中將編碼所述TEM8或其片段的核苷酸序列插入到載體中。
54. 權利要求53的組合物，其中所述載體是質粒、病毒載體或細菌載體。
55. 權利要求53的組合物，其中所述編碼所述TEM8或它的所述片 段的核苷酸序列包括至少60個核苷酸。
56. 權利要求53的組合物，其中編碼所述TEM8或其片段的核苷酸 序列具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3所示的序列。
57. 增加免疫原性組合物在受試者中引發免疫反應的能力的方法，所 述方法包括下述步驟給所述受試者施用免疫學有效量的權利要求49的組合物。
58. 權利要求57的方法，所述方法還包括.-給所述受試者施用免疫原性序列或其片段。
59. 權利要求58的方法，其中所述免疫原性序列或其片段在施用包 括所述TEM8或其片段的組合物之前、同時或之後施用。
60. 權利要求58的方法，其中所述免疫原性序列或其片段是腫瘤相 關的抗原或病原體相關的抗原的免疫原性序列或其片段。
61. 權利要求60的方法，其中所述腫瘤相關的抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP-l， PSMA， TRYP-2, NY-ESO-1, MAGE-l, MAGE-3， CEA, PSA， 酪氨酸酶，突變體p53,突變體p21,突變體cdk4,突變體L9, BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
62. 權利要求60的方法，其中所述病原體相關的抗原是細菌脂多糖， 炭疽致死因子，炭疽水腫因子，HlVgpl20或瘧疾抗原，其中所述瘧疾抗 原是CSP, TRAP/SSP2， LSA1， MSP1和AMA-1 。
63. 權利要求57的方法，其中所述免疫反應包括抗體反應、CD4 T 細胞反應、CD8T細胞反應或它們的組合。
64. 權利要求57的方法，其中所述受試者患有乳腺癌、前列腺癌、 黑素瘤、結腸癌、慢性髓性白血病或宮頸癌，或者已經暴露於或懷疑暴露 於瘧疾、炭疽、HIV或生物武器。
65. —種組合物，所述組合物包括與TEM8或其片段的胺基酸序列具有至少90%同源性的胺基酸 序列以及藥用載體。
66. 權利要求65的組合物，其中TEM8或其片段的胺基酸序列具有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4所示的序列。
67.權利要求65的組合物，其中與TEM8或其片段同源的序列是重 組蛋白或肽。
68. 權利要求67的組合物，其中所述重組蛋白或所述肽包括修飾的 胺基酸、未修飾的胺基酸或二者。
69. 權利要求65的組合物，其中將編碼所述與TEM8或其片段同源 的序列的核苷酸序列插入到載體中。
70. 權利要求69的組合物，其中所述載體是質粒、病毒載體或細菌 載體。
71. 權利要求68的組合物，其中編碼所述與TEM8或它的所述片段 同源的序列的核苷酸序列包括至少60個核苷酸。
72. 權利要求68的組合物，其中編碼所述TEM8或其片段的核苷酸 序列具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3所示的序列。
73. 增加免疫原性組合物在受試者引發免疫反應的能力的方法，所述 方法包括下述步驟給所述受試者施用免疫學有效量的權利要求65的組合物。
74. 權利要求73的方法，所述方法還包括 給所述受試者施用免疫原性序列或其片段。
75. 權利要求74的方法，其中所述免疫原性序列或其片段在施用包 括與TEM8或其片段同源的序列的組合物之前、同時或之後施用。
76. 權利要求74的方法，其中所述免疫原性序列或其片段是腫瘤相關的抗原或病原體相關的抗原的免疫原性序列或其片段。
77. 權利要求76的方法，其中所述腫瘤相關的抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP-1, PSMA ， TRYP-2， NY-ESO-1, MAGE-1, MAGE-3, CEA, PSA， 酪氨酸酶，突變體p53,突變體p21,突變體cdk4，突變體L9， BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
78. 權利要求76的方法，其中所述病原體相關的抗原是炭疽致死因 子，炭疽水腫因子，HIV gpl20或瘧疾抗原，其中所述瘧疾抗原是CSP， TRAP/SSP2， LSA1， MSP1禾卩AMA-1 。
79. 權利要求73的方法，其中所述免疫反應包括抗體反應、CD4 T細胞反應、CD8T細胞反應或它們的組合。
80. 權利要求73的方法，其中所述受試者患有乳腺癌、前列腺癌、 黑素瘤、結腸癌、慢性髓性白血病或宮頸癌，或者已經暴露於或懷疑暴露 於瘧疾、炭疽、HIV或生物武器。
81. —種組合物，所述組合物包括與TEM8或其片段的胺基酸序列具有至少80%同源性的胺基酸序列以及 藥用載體。
82. 權利要求81的組合物，其中TEM8或其片段的胺基酸序列具有 SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4所示的序列。
83. 權利要求81的組合物，其中與TEM8或其片段同源的序列是重 組蛋白或肽。
84. 權利要求83的組合物，其中所述重組蛋白或所述肽包括修飾的 胺基酸、未修飾的胺基酸或二者。
85. 權利要求81的組合物，其中將編碼所述與TEM8或其片段同源 的序列的核苷酸序列插入到載體中。
86. 權利要求85的組合物，其中所述載體是質粒、病毒載體或細菌 載體。
87. 權利要求85的組合物，其中編碼所述與TEM8或它的所述片段 同源的序列的核苷酸序列包括至少60個核苷酸。
88. 權利要求85的組合物，其中編碼所述TEM8或其片段的核苷酸 序列具有SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 3所示的序列。
89. 增加免疫原性組合物在受試者中引發免疫反應的能力的方法，所 述方法包括下述步驟給所述受試者施用免疫學有效量的權利要求81的組合物。
90. 權利要求89的方法，所述方法還包括 給所述受試者施用免疫原性序列或其片段。
91. 權利要求90的方法，其中所述免疫原性序列或其片段在施用包 括與TEM8或其片段同源的序列的組合物之前、同時或之後施用。
92. 權利要求90的方法，其中所述免疫原性序列或其片段是腫瘤相 關的抗原或病原體相關的抗原的免疫原性序列或其片段。
93. 權利要求92的方法，其中所述腫瘤相關的抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP匿l， PSMA， TRYP-2, NY-ESO-l, MAGE-l, MAGE-3, CEA, PSA， 酪氨酸酶，突變體p53,突變體p21，突變體cdk4，突變體L9, BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
94. 權利要求92的方法，其中所述病原體相關的抗原是細菌脂多糖， 炭疽致死因子，炭疽水腫因子，HlVgpl20或瘧疾抗原，其中所述瘧疾抗 原是CSP, TRAP/SSP2， LSA1, MSP1和AMA-1 。
95. 權利要求89的方法，其中所述免疫反應包括抗體反應、CD4 T 細胞反應、CD8T細胞反應或它們的組合。
96. 權利要求89的方法，其中所述受試者患有乳腺癌、前列腺癌、 黑素瘤、結腸癌、慢性髓性白血病或宮頸癌，或者已經暴露於或懷疑暴露 於瘧疾、炭疽、HIV或生物武器。
全文摘要
本發明公開了一種包括免疫原性序列或其片段和TEM8或其片段的組合物，其中所述TEM8或其片段作用為佐劑，並且增強由所述免疫原性序列或其片段介導的免疫反應的激發。本發明還公開了這樣的組合物在治療癌症或病原體相關的疾病中的應用。
文檔編號C07K14/00GK101595123SQ200780019126
公開日2009年12月2日 申請日期2007年3月23日 優先權日2006年3月23日
發明者波莉·格雷戈爾, 艾倫·休頓 申請人:斯隆-凱特琳癌症研究院