納米材料抑制酶活性的測定方法
2023-07-12 10:55:36 2
專利名稱：：納米材料抑制酶活性的測定方法
技術領域：
：本發明屬於納米材料的環境毒理測定領域，具體涉及一種納米材料抑制酶的活性的測定方法。
背景技術：
：微米技術是20世紀科學技術的象徵，而納米技術則是21世紀科學技術的象徵。由於納米材料獨特的物理化學性質，如小尺寸效應、大的比表面積、極高的反應活性、量子效應等，導致異常的吸附能力、化學反應能力、分散與團聚能力等，使納米科學與生命科學、信息科學共同成為當今世界的三大支柱科學。近年來隨著納米科技的迅速發展，已經創造出無數的人工納米材料(至少有一維小於lOOnm的材料)，包括碳納米管、巴基球和納米氧化物顆粒等，其在光電、生物醫藥、化妝品、能源及催化等領域的應用日益廣泛。目前在世界範圍內，每年的使用量達1，000~2，000噸，並將在2011-2020年達到10,000-IOO，OOO噸(英國皇家學會和英國皇家工程學院，2004)。隨著納米材料的廣泛使用，各種形式的納米材料會通過不同的途徑進入我們賴以生存的環境當中，可能會對人體及生態環境造成汙染，從而危及人類健康。由於納米材料的本身物理化學特性決定了其對生物體及環境具有潛在的影響，許多研究已經表明其潛在的毒理效應己引起廣大學者的廣泛關注，因此需要對納米材料的安全性進行系統評估，以引導納米技術的健康、持續發展。酶由生物體內細胞產生的一種生物催化劑，是細胞賴以生存的基礎，高效率地催化各種生物化學反應，促進生物體的新陳代謝。細胞新陳代謝包括的所有化學反應幾乎都是在酶的催化下進行的，如果受某些物質的影響造成酶的活性減弱，均可導致該酶催化的反應異常，使物質代謝紊亂，甚至發生疾病，這些物質稱為酶的抑制劑。為了決定抑制劑對酶的活性產生的抑制作用，需要測定抑制劑存在情況下酶的活性的變化。從廣義上說，任何一種可以測定反應物變化速度的分析技術都可用來測定酶的活性，但是從歷史和發展來看，酵的活性測定的常用技術和方法主要有分光光度法，另外也有滴定法等其他方法。現有酶的活性抑制率測定方法的一般測定程序是將酶溶液和抑制物作用一段時間後，再加入相應酶的底物，測定酶的活性，進而得到納米材料對酶的活性的抑制率。但是，由於納米材料的特殊的吸附效應，會對反應系統中的物質產生不同程度的吸附，影響測定的精確度；還應該強調，採用現有方法時，由於納米材料懸浮液的不穩定性，有些通過分光光度計測定酶促反應速率的變化表示酶的活性的測定方法，無法用來測定納米材料對酶的活性的抑制率；另外，又由於納米材料懸浮液不是澄清透明狀的溶液，有些採用滴定法測定酶的活性的方法難以判斷滴定終點，也無法用來測定納米材料對酶的活性的抑制率。因此，為了確定納米材料對酶的活性產生的抑制作用，也就是測定納米材料對酶的活性的抑制率，常常不能按照現有的一般測定方法進行分析，而大大限制了納米材料對酶的活性的抑制率的測定。
發明內容本發明的目的是提供一種納米材料抑制酶的活性的測定方法，以彌補現有技術的不足。本發明的測定程序是將酶溶液和納米材料懸浮液混合相互作用後，先離心分離上清液和沉澱物，並按照常規酶的活性的測定方法測定出該上清液中的酶的活性，進而得到納米材料對酶的吸附率E;再向上述離心後的沉澱物中加入相應酶的緩衝液，重新懸浮，充分解吸後離心，測定以解吸附率D表示的納米材料吸附酶的活性，即納米材料所吸附酶的解吸附率D;最後利用公式IE=E-D，計算納米材料對酶的活性的抑制率IE。本發明的技術方案是首先將酶溶液和作為抑制物的納米材料的懸浮液混合相互作用一段時間後，再加入相應酶的底物，測定酶的活性，進而得到納米材料對酶的活性的抑制率；其特徵是將酶溶液和納米材料懸浮液混合相互作用後，先離心分離出上清液和沉澱物，並按照常規酶的活性的測定方法測定出該上清液中的酶的活性，進而得到納米材料對酶的吸附率E;再向上述離心後的沉澱物中加入相應酶的緩衝液重新懸浮，充分解吸後離心，測定以解吸附率表示的納米材料吸附酶的活性，即納米材料所吸附酶的解吸附率D;最後利用公式IE=E-D，計算納米材料對酶的活性的抑制率IE。本發明的納米材料抑制酶的活性是以納米材料對酶的活性的抑制率IE來表達。本發明的納米材料包括在水中不能溶解的所有人工納米材料。即上述的納米材料為在水中不能溶解的人工納米材料都適用本發明。本發明的酶包括能用分光光度法或滴定法測定其活性的所有酶，也就是本發明廣泛適用於能用分光光度法或滴定法測定其活性的酶，即上述的酶是限定能用分光光度法或滴定法測定其活性的若干種酶。因此本發明有廣泛的適用性。本發明方法通過納米材料和酶作用後離心除去納米材料，克服了現有技術測定程序中納米材料對後續加入物質及反應產物的吸附而對結果造成的影響；而且，通過充分解吸，測定納米材料吸附的酶的活性，因此更準確地計算出納米材料對酶的抑制率，大大提高了測定納米材料抑制酶的活性的精確度和重現性，適用於在水中不能溶解的人工納米材料以及能用分光光度法和滴定法測定其活性的若干種酶，而具有廣泛的適用性，特別是採用現有方法，由於納米材料懸浮液的不穩定性，有些通過分光光度計測定酶促反應速率的變化表示酶的活性的測定方法，無法用來測定納米材料對酶的活性的抑制率。另外，由於納米材料懸浮液不是澄清透明狀的溶液，有些採用滴定法測定酶的活性的方法難以判斷滴定終點，採用現有方法也無法用來測定納米材料對酶的活性的抑制率，而本發明不受這些因素的限制。因此可望成為納米材料抑制酵的活性的標準測定方法。具體實施例方式本發明先將酶溶液和納米材料懸浮液在玻璃容器中混勻後，使納米材料和酶作用10min-2h，再用冷凍離心機在10000卬m-15000卬m4。C離心3-10min，分離上清液與離心後的沉澱物，(其中沉澱物中包括納米材料及其吸附的酶)。然後按照常規酶的活性的測定方法測定出該上清液中的酶的活性，進而得到納米材料對酶的吸附率E;(納米材料所吸附酶的活性通過解吸附率D表示)，再向上述離心後的沉澱物中加入酶的緩衝液，重新懸浮，在4。C下劇烈振蕩10-60min，使吸附的酶充分解吸，再用冷凍離心機在10000rpm-15000rpm和4。C離心3-10min,然後再測定上清液中的酶的活性，進而得到酶的解吸附率D;最後利用吸附率和解吸附率計算納米材料對酶的活性的抑制率IE。即以公式計算出抑制率IE-E-D,(即抑制率-吸附率一解吸附率)。以下選用八種納米材料和不同的各種酶為例，並以現有方法進行比對。實施例l以乙醯膽鹼酯酶為例現有方法用pH8.0的磷酸緩衝液製備5U/ml的乙醯膽鹼酯酶溶液和250mg/L、25mg/L、12.5mg/L的納米材料懸浮液，選用以下八種納米材料，包括多壁碳納米管(L-MWNTs-1020)、單壁碳納米管(L-SWNTs)、Cu、Al、碳包銅(Cu-C)、Ti02、Si02及八1203，向每種納米材料懸浮液中加入乙醯膽鹼酯酶溶液，混合均勻，使納米材料和乙醯膽鹼酯酶作用15min後，再加入乙醯膽鹼酯酶的底物，測定酶的活性，進而得到納米材料對乙醯膽鹼酯酶的抑制率。本發明方法用pH8.0的磷酸緩衝液製備5U/ml的乙醯膽鹼酯酶溶液和250mg/L、25mg/L、12.5mg/L的納米材料懸浮液，選用以下八種納米材料，包括多壁碳納米管、單壁碳納米管、Cu、Al、碳包銅(Cu-C)、Ti02、Si02及八1203，向每種納米材料懸浮液中加入乙醯膽鹼酯酶溶液，混合均勻，使納米材料和乙醯膽鹼酯酶作用15min後，用冷凍離心機在12000rpm4'C離心5min，分離上清液和沉澱物，並測定該上清液中乙醯膽鹼酯酶的活性，進而得到納米材料對乙醯膽鹼酯酶的吸附率E;再向上述離心後的沉澱物中加入pH8.0的磷酸緩衝液，重新懸浮，劇烈振蕩30min，使納米材料吸附的乙醯膽鹼酯酶充分解吸後離心，測定以解吸附率D表示的納米材料吸附乙醯膽鹼酯酶的活性，即納米材料所吸附乙醯膽鹼酯酶的解吸附率D;最後利用公式IE3-D，計算結果如下表l:表1不同濃度的八種納米材料對乙激tableseeoriginaldocumentpage5tableseeoriginaldocumentpage6實施例2以硝酸還原酶為例現有方法用pH7.5的磷酸緩衝液製備5U/ml的硝酸還原酶溶液和50mg/L、25mg/L、12.5mg/L的納米材料懸浮液，選用以下八種納米材料，包括多壁碳納米管、單壁碳納米管、Cu、Al、碳包銅(Cu-C)、Ti02、Si02及八1203，向每種納米材料懸浮液中加入硝酸還原酶溶液，混合均勻，使納米材料和硝酸還原酶作用30min後，再加入硝酸還原酶的底物，通過分光光度法測定酶的活性，進而得到納米材料對硝酸還原酶的抑制率。本發明方法用pH7.5的磷酸緩衝液製備5U/ml的硝酸還原酶溶液和50mg/L、25mg/L、12.5mg/L的納米材料懸浮液，選用以下八種納米材料，包括多壁碳納米管、單壁碳納米管、Cu、Al、碳包銅(Cu-C)、Ti02、Si02及八1203，向每種納米材料懸浮液中加入硝酸還原酶溶液，混合均勻，使納米材料和硝酸還原酶作用30min後，用冷凍離心機在12000rpm4'C離心5min,分離上清液和沉澱物，並通過分光光度法測定該上清液中硝酸還原酶的活性，進而得到納米材料對硝酸還原酶的吸附率E;再向上述離心後的沉澱物中加入pH7.5的磷酸緩衝液，重新懸浮，劇烈振蕩30min，使米材料吸附的硝酸還原酶充分解吸後離心，測定以解吸附率D表示的納米材料吸附硝酸還原酶的活性，即納米材料所吸附硝酸還原酶的解吸附率D;最後利用公式IE=E-D,計算結果如下表2:表2不同濃度的八種納米材料對硝酸還原酶的活性的抑制率實施例3以過氧化物酶為例現有方法用pH7.0的磷酸緩衝液製備5U/ml的過氧化物酶溶液和100mg/L、50mg/L、10mg/L的納米材料懸浮液，選用以下八種納米材料，包括多壁碳納米管、單壁碳納米管、Cu、Al、碳包銅(Cu-C)、Ti02、Si02及Al2Cb，向每種納米材料懸浮液中加入過氧化物酶溶液，混合均勻，使納米材料和過氧化物酶作用30min後，再加入過氧化物酶的底物，通過分光光度法測定酶的活性隨時間的變化率，進而得到納米材料對過氧化物酶的抑制率。本發明方法用pH7.0的磷酸緩衝液製備5U/ml的過氧化物酶溶液和100mg/L、50mg/L、10mg/L的納米材料懸浮液，選用以下八種納米材料，包括多壁碳納米管、單壁碳納米管、Cu、Al、碳包銅(Cu-C)、Ti02、Si02及Al203，向每種納米材料懸浮液中加入過氧化物酶溶液，混合均勻，使納米材料和過氧化物酶作用30min後，用冷凍離心機在12000卬m4'C離心5min，分離上清液和沉澱物，並通過分光光度法測定該上清液中過氧化物酶的活性隨時間的變化率，進而得到納米材料對過氧化物酶的吸附率E;再向上述離心後的沉澱物中加入pH7.0的磷酸緩衝液，重新懸浮，劇烈振蕩30min,使米材料吸附的過氧化物酶充分解吸後離心，測定以解吸附率D表示的納米材料吸附過氧化物酶的活性，即納米材料所吸附過氧化物酶的解吸附率D;最後利用公式IE=E_D，計算結果如下表3。過氧化物酶的活性的測定是通過分光光度法測定酶促反應速率的變化表示酶的活性，由於納米材料懸浮液的不穩定性，採用現有方法無法測定酶促反應速率的變化，因而無法得到納米材料對酶的活性的抑制率，採用本發明測定的抑制率見下表3。表3不同濃度的八種納米材料對過氧化物酶的活性的抑制率tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage9實施例4以過氧化氫酶為例基本方法用pH7.0的磷酸緩衝液製備5U/ml的過氧化氫酶溶液和100mg/L、50mg/L、lOmg/L的納米材料懸浮液，選用以下八種納米材料，包括多壁碳納米管、單壁碳納米管、Cu、Al、碳包銅(Cu-C)、Ti02、Si02及Al2Cb，向每種納米材料懸浮液中加入過氧化氫酶溶液，混合均勻，使納米材料和過氧化氫酶作用30min後，再加入過氧化氫酶的底物，通過滴定法測定酶的活性，進而得到納米材料對過氧化氫酶的抑制率。本發朋方法用pH7.0的磷酸緩衝液製備5U/ml的過氧化氫酶溶液和100mg/L、50mg/L、lOmg/L的納米材料懸浮液，選用以下八種納米材料，包括多壁碳納米管、單壁碳納米管、Cu、Al、碳包銅(Cu-C)、Ti02、Si02及Alz03，向每種納米材料懸浮液中加入過氧化氫酶溶液，混合均勻，使納米材料和過氧化氫酶作用30min後，用冷凍離心機在12000rpm4'C離心5min，分離上清液和沉澱物，並通過滴定法測定該上清液中過氧化氫酶的活性，進而得到納米材料對過氧化氫酶的吸附率E。再向上述離心後的沉澱物中加入pH7.0的磷酸緩衝液，重新懸浮，劇烈振蕩30min，使米材料吸附的過氧化氫酶充分解吸後離心，測定以解吸附率D表示的納米材料吸附過氧化氫酶的活性，即納米材料所吸附過氧化氫酶的解吸附率D;最後利用公式IE=E-D,計算結果如下表4。過氧化氫酶的活性是通過滴定法進行測定，由於納米材料懸浮液不是澄清透明狀的溶液,採用現有方法測定時難以判斷滴定終點，因而無法得到納米材料對酶的活性的抑制率，採用本發明測定的抑制率見下表4。表4不同濃度的八種納米材料對過氧化氫酶的活性的抑制率tableseeoriginaldocumentpage10權利要求1、納米材料抑制酶的活性的測定方法，將酶溶液和作為抑制物的納米材料的懸浮液混合相互作用一段時間後，再加入相應酶的底物，測定酶的活性，進而得到納米材料對酶的活性的抑制率；其特徵是將酶溶液和納米材料懸浮液混合相互作用後，先離心分離出上清液和沉澱物，並按照常規酶的活性的測定方法測定出該上清液中的酶的活性，進而得到納米材料對酶的吸附率E；再向上述離心後的沉澱物中加入相應酶的緩衝液重新懸浮，充分解吸後離心，測定以解吸附率表示的納米材料吸附酶的活性，即納米材料所吸附酶的解吸附率D；最後利用公式IE＝E-D，計算納米材料對酶的活性的抑制率IE。2、如權利要求l所述的納米材料抑制酶的活性的測定方法，其特徵是上述的納米材料為在水中不能溶解的人工納米材料。3、如權利要求2所述的納米材料抑制酶的活性的測定方法，其特徵是上述的人工納米材料為碳納米管、納米金屬和納米金屬氧化物。4、如權利要求3所述的納米材料抑制酶的活性的測定方法，其特徵是上述的碳納米管為多壁碳納米管和單壁碳納米管。5、如權利要求3所述的納米材料抑制酶的活性的測定方法，其特徵是上述的納米金屬是Cu、Al和碳包銅。6、如權利要求3所述的納米材料抑制酶的活性的測定方法，其特徵是上述的納米金屬氧化物是Ti02、Si02和A1203。7、如權利要求l所述的納米材料抑制酶的活性的測定方法，其特徵是上述的酶是限定能用分光光度法或滴定法測定其活性的若干種酶。全文摘要本發明涉及一種納米材料抑制酶的活性的測定方法。其特徵是首先將酶液和納米材料懸浮液混合作用後離心，測定上清液中的酶的活性，得到納米材料對酶的吸附率E；再向上述沉澱物中加入酶的緩衝液，充分解吸後離心，測定納米材料對酶的解吸附率D。最後利用公式IE＝E-D計算納米材料對酶的活性的抑制率IE。本發明克服了納米材料對後續加入物質及反應產物的吸附效應造成的影響，通過納米材料吸附的酶的活性的測定，大大提高了測定納米材料抑制酶的活性的精確度和重現性，適於在水中不能溶解的所有人工納米材料，其中酶是限定能用分光光度法或滴定法測定其活性的若干種酶，因此具有廣泛的適用性。可望成為納米材料抑制酶的活性的標準測定方法。文檔編號G01N21/25GK101329255SQ20081013840公開日2008年12月24日申請日期2008年7月16日優先權日2008年7月16日發明者李鋒民,王震宇,建趙,高冬梅申請人:中國海洋大學