含高濃度人間充質幹細胞分泌活性因子的修復面膜及其製備方法與流程
2023-07-12 15:33:37 4
本發明涉及修復面膜，尤其是一種含高濃度人間充質幹細胞分泌活性因子的修復面膜及其製備方法。
背景技術：
：間充質幹細胞(mesenchymalstemcell，msc)是幹細胞的一種，因能分化為間質組織而得名。msc來源於中胚層間充質，主要存在於生物體全身結締組織和器官間質中。間充質幹細胞廣泛分布於胎兒和成體的骨髓、脂肪、臍帶、臍帶血中，其中臍帶來源的間充質幹細胞質量高，純淨，數量多。間充質幹細胞具有幹細胞的共性，即自我更新、多向分化、組織修復、免疫調節和歸巢的能力。間充質幹細胞具有亞全能分化潛能，在特定的體內、外環境下能夠誘導分化成為神經、心臟、肝臟、骨、軟骨、肌腱、脂肪、上皮等多種組織細胞。間充質幹細胞培養體系中含有多種大量的活性成分，如：幹細胞生長因子(scf)、鹼性成纖維細胞生長因子(bfgf)、表皮細胞生長因子(egf)、內皮細胞生長因子(vegf)、角化細胞生長因子(kgf)、胰島素生長因子(igf)、白細胞介素-6(il-6)、白細胞介素-8(il-8)、超氧化物歧化酶2(superoxidedismutase2，sod2)、膠原蛋白、透明質酸等多種活性物質。這些活性物質能夠影響多種細胞的存活、增殖、遷移和基因表達，促進組織再生，對皮膚組織和細胞有抗氧化保護作用，抑制黑色素的形成，調節細胞外基質重塑，促進血管新生，激活成纖維細胞促進傷口癒合，加速表皮再生，增強皮膚修復能力，對於解決皮膚的乾燥、粗糙、皺紋、色素沉著、傷口癒合等各種問題都有很好的效果。在面膜基礎配方中另外添加的寡肽-1能促進皮膚修復，促進細胞的增殖分化，以新生細胞代替衰老細胞和死亡細胞。寡肽-2能夠促進成纖維細胞增殖分化，促進成纖維細胞透明質酸和真皮中膠原蛋白的合成。寡肽-5能夠促進表皮角質細胞生長，修復受損細胞，加速細胞的新陳代謝。目前，已經有將人間充質幹細胞分泌的活性因子應用於皮膚的修復及治療的報導，但是用於化妝品中修復面部皮膚的各種問題未有報導。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是，提供一種具有高效修復活性的含高濃度人間充質幹細胞分泌活性因子的修復面膜及其製備方法，利用人間充質幹細胞分泌的多種細胞因子用於皮膚的修復、保溼、美白、除皺、傷口癒合等問題，使皮膚細膩有光澤。為了解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是：一種含高濃度人間充質幹細胞分泌活性因子的修復面膜的製備方法，包括以下步驟：(1)人間充質幹細胞培養：從細胞庫中選取p2-p6的人間充質幹細胞復甦，接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；細胞接種完成，放於二氧化碳培養箱培養，溫度37℃，二氧化碳體積比濃度5％；(2)第一批次細胞融合度達到70％-80％時，以生理鹽水清洗細胞2次，用複方電解質注射液進行飢餓培養；(3)飢餓培養12-24小時後，第一批次細胞融合度達90％-95％，收取細胞培養上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉澱，取離心後上清備用；(4)取培養的第二批次細胞，當細胞融合度達到70％-80％，以生理鹽水清洗第二批次細胞2次，用步驟(3)中細胞培養上清進行飢餓培養；(5)飢餓培養12-24小時後，第二批次細胞融合度達90％-95％，收取細胞培養上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉澱，取離心後上清備用；(6)取培養的第三批次細胞，當細胞融合度達到70％-80％，以生理鹽水清洗第三批次細胞2次，用步驟(5)中細胞培養上清進行飢餓培養；(7)飢餓培養12-24小時後，第三批次細胞融合度達90％-95％，收取細胞培養上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉澱，取離心後上清，得到高濃度人間充質幹細胞活性因子提取物；(8)將步驟(7)中得到的高濃度人間充質幹細胞活性因子提取物按照質量比1:10到1:100的比例與面膜基礎配方進行充分混合。(9)將無紡布面膜紙浸入步驟(8)得到的混合液，即得到含高濃度人間充質幹細胞分泌活性因子的修復面膜；所述修復面膜基礎配方中如下，百分比為質量百分比：上述製備方法製得的含高濃度人間充質幹細胞分泌活性因子的修復面膜。本發明的有益效果是：將人間充質細胞進行飢餓培養，使得細胞分泌的各種活性成分的濃度都得到了提高，對皮膚組織和細胞有抗氧化保護作用，抑制黑色素的形成，調節細胞外基質重塑，促進血管新生，激活成纖維細胞促進傷口癒合，加速表皮再生，增強皮膚修復能力。附圖說明圖1為本發明實施例1的方法培養的人臍帶間充質幹細胞圖；圖2為本發明實施例2的方法培養的人脂肪間充質幹細胞圖。具體實施方式下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細說明：本發明的的含高濃度人間充質幹細胞分泌活性因子的修復面膜的製備方法，包括以下步驟：(1)人間充質幹細胞培養：從細胞庫中選取p2-p6的人間充質幹細胞復甦，接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；細胞接種完成，放於二氧化碳培養箱培養，溫度37℃，二氧化碳體積比濃度5％；(2)第一批次細胞融合度達到70％-80％時，以生理鹽水清洗細胞2次，用複方電解質注射液進行飢餓培養；(3)飢餓培養12-24小時後，第一批次細胞融合度達90％-95％，收取細胞培養上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉澱，取離心後上清備用；(4)取培養的第二批次細胞，當細胞融合度達到70％-80％，以生理鹽水清洗第二批次細胞2次，用步驟(3)中細胞培養上清進行飢餓培養；(5)飢餓培養12-24小時後，第二批次細胞融合度達90％-95％，收取細胞培養上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉澱，取離心後上清備用；(6)取培養的第三批次細胞，當細胞融合度達到70％-80％，以生理鹽水清洗第三批次細胞2次，用步驟(5)中細胞培養上清進行飢餓培養；(7)飢餓培養12-24小時後，第三批次細胞融合度達90％-95％，收取細胞培養上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉澱，取離心後上清，得到高濃度人間充質幹細胞活性因子提取物；(8)將步驟(7)中得到的高濃度人間充質幹細胞活性因子提取物按照質量比1:10到1:100的比例與面膜基礎配方進行充分混合。(9)將無紡布面膜紙浸入步驟(8)得到的混合液，即得到含高濃度人間充質幹細胞分泌活性因子的修復面膜；所述修復面膜基礎配方中如下，百分比為質量百分比：上述製備方法製得的含高濃度人間充質幹細胞分泌活性因子的修復面膜。本發明人間充質幹細胞在培養過程中會分泌大量的細胞因子，這些細胞因子能夠影響多種細胞的存活、增殖、遷移和基因表達，促進組織再生，對皮膚組織和細胞有抗氧化保護作用，抑制黑色素的形成，調節細胞外基質重塑，促進血管新生，激活成纖維細胞促進傷口癒合，加速表皮再生，增強皮膚修復能力，對於解決皮膚的乾燥、粗糙、皺紋、色素沉著、傷口癒合等各種問題都有很好的效果。其中人間充質幹細胞活性因子為飢餓培養後提取，其餘成分為面膜基礎配方成分，另外添加的寡肽-1能促進皮膚修復，促進細胞的增殖分化，以新生細胞代替衰老細胞和死亡細胞。寡肽-2能夠促進成纖維細胞增殖分化，促進成纖維細胞透明質酸和真皮中膠原蛋白的合成。寡肽-5能夠促進表皮角質細胞生長，修復受損細胞，加速細胞的新陳代謝。實施例1(1)人臍帶間充質幹細胞培養：從細胞庫中選取p4的人臍帶間充質幹細胞復甦，細胞總數4.2*107。接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的60％(每瓶接種細胞數：9*106，接種細胞三瓶)、40％(每瓶接種細胞數：6*106，接種細胞兩瓶)、20％(接種細胞數：3*106，接種細胞一瓶)，培養體系均為40ml。培養細胞所用完全培養基為無酚紅dmem/df12和體積比濃度為10％胎牛血清，接種細胞瓶為t-175培養瓶。細胞接種完成，放於二氧化碳培養箱培養，溫度37℃，二氧化碳濃度5％；(2)培養30小時，此時第一批次細胞融合度達到75％時，見圖1，以生理鹽水清洗細胞2次，每瓶用40ml複方電解質注射液(中國大冢製藥有限公司生產的複方電解質葡萄糖mg3注射液)進行飢餓培養；(3)飢餓培養18小時後，第一批次細胞融合度達95％，收取細胞培養上清，4000g條件下離心8min除去沉澱，取離心後上清放於4℃備用；(4)取培養的第二批次細胞，此時細胞融合度達到70％，以生理鹽水清洗第二批次細胞2次，用步驟(3)中細胞培養上清40ml進行飢餓培養；(5)飢餓培養18小時後，第二批次細胞融合度達95％，收取細胞培養上清，4000g條件下離心8min除去沉澱，取離心後上清放於4℃備用；(6)取培養的第三批次細胞，此時細胞融合度達到70％，以生理鹽水清洗第三批次細胞2次，用步驟(5)中細胞培養上清40ml進行飢餓培養；(7)飢餓培養24小時後，第三批次細胞融合度達90％，收取細胞培養上清，4000g條件下離心8min除去沉澱，取離心後上清，得到高濃度人臍帶間充質幹細胞活性因子提取物。(8)將步驟(7)中得到的高濃度人臍帶間充質幹細胞活性因子提取物按照質量百分比1:80比例與面膜基礎配方進行充分混合，基礎配方為：名稱添加量範圍(質量百分比％)水73.0991甘油20甘油聚甲基丙烯酸酯3甘油聚甲基丙烯酸酯/丙二醇3卡波姆0.2三乙醇胺0.5透明質酸鈉0.1羥苯甲脂0.1寡肽10.0003寡肽20.0003寡肽50.0003(9)將無紡布面膜紙浸入25ml步驟(8)中得到的混合液，即得到含高濃度人臍帶間充質幹細胞分泌活性因子的修復面膜。實施例2(1)人脂肪間充質幹細胞培養：從細胞庫中選取p5的人脂肪間充質幹細胞復甦，細胞總數3.84*107。接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的50％(每瓶接種細胞數：8*106，接種細胞三瓶)、35％(每瓶接種細胞數：5.6*106，接種細胞兩瓶)、20％(接種細胞數：3.2*106，接種細胞一瓶)，培養體系均為40ml。培養細胞所用完全培養基為無酚紅amem和體積比濃度為10％胎牛血清，接種細胞瓶為t-175培養瓶。細胞接種完成，放於二氧化碳培養箱培養，溫度37℃，二氧化碳濃度5％；(2)培養35小時，此時第一批次細胞融合度達到70％時，見圖2，以生理鹽水清洗細胞2次，每瓶用40ml複方電解質注射液進行飢餓培養；(3)飢餓培養18小時後，第一批次細胞融合度達95％，收取細胞培養上清，4000g條件下離心8min除去沉澱，取離心後上清放於4℃備用；(4)取培養的第二批次細胞，此時細胞融合度達到70％，以生理鹽水清洗第二批次細胞2次，每瓶用步驟(3)中細胞培養上清40ml進行飢餓培養；(5)飢餓培養18小時後，第二批次細胞融合度達95％，收取細胞培養上清，4000g條件下離心8min除去沉澱，取離心後上清放於4℃備用；(6)取培養的第三批次細胞，此時細胞融合度達到75％，以生理鹽水清洗第三批次細胞2次，用步驟(5)中細胞培養上清40ml進行飢餓培養；(7)飢餓培養24小時後，第三批次細胞融合度達90％，收取細胞培養上清，4000g條件下離心8min除去沉澱，取離心後上清，得到高濃度人脂肪間充質幹細胞活性因子提取物。(8)將步驟(7)中得到的高濃度人臍帶間充質幹細胞活性因子提取物按照質量百分比1:30比例與面膜基礎配方進行充分混合，基礎配方為：(9)將無紡布面膜紙浸入25ml步驟(8)中得到的混合液，即得到含高濃度人臍帶間充質幹細胞分泌活性因子的修復面膜。典型案例：例1：宋某，女性，20歲，到海南旅遊後皮膚被曬傷，面部皮膚乾燥、脫皮、泛紅、色素沉著，在使用了普通曬後修復面膜約一個月後未見明顯好轉，於是宋某使用了實施例1中步驟(9)得到的含高濃度人臍帶間充質幹細胞分泌活性因子的修復面膜，使用一周後，面部泛紅情況明顯好轉，皮膚逐漸恢復彈性、有光澤，脫皮情況也有所減輕，連續使用三周後，曬傷情況基本消退，恢復健康容貌。例2：範某，女性，35歲，由於生活壓力與工作壓力過大，內分泌紊亂，面部長出許多紅腫的痘，於某用手擠掉紅腫的痘後在面部留下了許多痘印痘坑。使用了市面上普通的祛痘印痘坑產品後無明顯效果，於是範某使用了實施例2中步驟(9)得到的含高濃度人脂肪間充質幹細胞分泌活性因子的修復面膜，使用兩周後，痘印痘坑明顯減輕，繼續使用一個月後，痘印痘坑幾乎完全消失。綜上所述，本發明的內容並不局限在上述的實施例中，相同領域內的有識之士可以在本發明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發明的範圍之內。當前第1頁12