Dna克隆載體質粒及其使用方法
2023-07-12 13:41:11 4
專利名稱：Dna克隆載體質粒及其使用方法
技術領域：
本發明涉及克隆載體質粒領域，以及克隆載體質粒用於構建DNA構建物或轉基因的用途。
背景技術：
重組DNA技術是分子生物學的基礎，在這裡可以概括為出於研究核酸及其蛋白質產物的結構和功能的目的而修飾和擴增核酸。
單個的基因、基因調控區、基因子集、和事實上包含它們的整個基因組都是由反向平行的雙鏈核苷酸序列組成的，核苷酸常規標示為A、T、G、和C。可以將這些DNA序列以及由mRNA分子衍生的cDNA序列切割成不同的片段，分離、並插入載體諸如細菌質粒以研究基因產物。出於研究或生產基因產物的目的，可以對質粒即最初衍生自細菌的染色體外DNA部件進行操作或重新導入宿主細菌。質粒的DNA與所有染色體DNA類似，即它也是由相同的A、T、G、和C組成來編碼基因和基因調控區的，但是它是由少於大約30,000鹼基對或30千鹼基(kb)組成的較小分子。另外，雙鏈質粒的核苷酸鹼基對形成連續環狀分子，這也是質粒DNA與染色體DNA的區別。
質粒增強了細菌生物體之間遺傳物質的快速交換，而且容許細菌生物體快速適應環境的變化，諸如溫度、食物供應、或其它挑戰。所獲得的任何質粒都必須表達有助於宿主存活的一種或多種基因，否則它將被生物體破壞或丟棄，因為維持不必要的質粒將浪費資源。細胞的克隆群含有相同的遺傳材料，包括它可能含有的任何質粒。在這樣的宿主細胞克隆群中使用含有DNA插入片段的克隆載體質粒將擴增目的DNA的可用數量。然後可以分離和回收如此克隆的DNA，用於構建DNA構建物所需步驟的後續操作。由此，應當認識到克隆載體質粒是研究基因功能的有用工具。
儘管在質粒中發現的有些元件是天然存在的，然而其它元件經過改造增強了質粒作為DNA載體的效用。這些元件包括抗生素或化學藥品抗性基因和多克隆位點(MCS)，等等。這些元件中的每一種在本發明以及現有技術中都是有作用的。關於每一種元件所發揮的作用的描述將強調現有技術的限制並展示本發明的效用。
宿主可以通過質粒獲得的一種特別有用的基因是將賦予宿主抗生素抗性的基因。在重組DNA技術的日常實踐中，將抗生素抗性基因用作正或負選擇元件，從而相對於其它質粒優先增強期望質粒的培養和擴增。
為了獲得宿主細菌的維持，質粒還必需包含指導宿主複製質粒的序列區段。稱為複製起點(ORI)元件的序列指導宿主使用它的細胞酶來生成質粒的拷貝。當這樣的細胞分裂時，子細胞將各自保留任何這種質粒的一個或幾個拷貝。派生得到了將這種複製最大化的某些大腸桿菌細菌菌株，每個細菌可生成多達300個拷貝。如此可以增強期望質粒的培養。
任何克隆載體中的另一種必需元件是用於插入目的遺傳材料的位置。這是插入「野生型」質粒從而賦予克隆載體功效的合成元件。任何典型的商品化克隆載體質粒都包含至少一個這樣的區域，稱為多克隆位點(MCS)。MCS通常包含可以由一種或一系列限制性核酸內切酶(下文稱為「限制酶」)切割的核苷酸序列，每一種限制酶都具有獨特的識別序列和切割模式。DNA分子中編碼的所謂識別序列(稱為限制酶「位點」)包含雙鏈迴文序列。對於有些限制酶，少至4-6個核苷酸就足以提供識別位點，而有些限制酶需要8個或更多核苷酸的序列。例如EcoRI酶識別六核苷酸序列5』G-A-A-T-T-C3』，其中5』指通常稱為「上遊」末端的分子末端，而3』同樣指「下遊」末端。識別序列的互補鏈是它的反向平行鏈，3』G-A-A-T-T-C5』。由此，雙鏈識別位點可以在包含它的較大雙鏈分子中如下展現5』……G-A-A-T-T-C……3』3』……C-T-T-A-A-G……5』。
正如許多其它限制酶，EcoRI並非精確的在二分對稱軸處進行切割，而是在兩條DNA鏈中相距四個核苷酸的位置，由「/」指示的核苷酸之間5』……G/A-A-T-T-C……3』3』……C-T-T-A-A/G……5』，使得雙鏈DNA分子斷裂，並在新形成的「末端」具有由此產生的核苷酸結構5』……G3』5』A-A-T-T-C……3』3』……C-T-T-A-A5』3』G……5』。
這種交錯切割產生具有5』突出末端的DNA片段。因為A-T和G-C配對在互相接近時自發形成，所以將諸如這樣的突出末端稱為粘端。這些末端中的任何一個能夠與由相同限制酶切割的任何其它互補末端形成氫鍵。由於含有特異識別序列的任何DNA將與含有相同序列的任何其它DNA以相同方式受到切割，因此那些切割產生的末端將是互補的。因此，由相同限制酶切割的任何DNA分子的末端就像相鄰拼圖碎片的「匹配」一般互相「匹配」，而且能夠由酶連接起來。正是這種特性容許形成重組DNA分子，並且容許將外源DNA片段導入細菌質粒，或是任何其它DNA分子。
在構建重組DNA分子時需要考慮的另一項基本原則是分子中存在的所有限制位點都將受到特定限制酶的切割，而非只是目的位點。DNA分子越大，重新出現任何限制位點的可能性就越大。假設任何限制位點沿著DNA分子隨機分布，那麼平均每44(即256)個核苷酸將出現一個四核苷酸位點，每46(即4096)個核苷酸將出現一個六核苷酸位點，而每48(即114,688)個核苷酸將出現一個六核苷酸位點。由此，容易認識到較短的識別序列將頻繁出現，而較長的識別序列將難得出現。在設計轉基因或其它重組DNA分子的構建時，這是一個至關重要的問題，因為這樣的計劃常常需要裝配不同大小的幾段DNA。這些片段越大，幾段DNA成分中出現希望使用的位點的可能性就越大，最多使得操作變得困難。
頻繁出現的限制酶在本文中稱為常見限制酶(common restrictionenzyme)，而它們的相關(cognate)序列稱為常見限制位點。相關序列超過6個核苷酸的限制酶稱為罕見限制酶(rare restriction enzyme)，而它們的相關位點稱為罕見限制位點。由此，稱謂「罕見」和「常見」並不是指任何具體限制酶的相對豐度或利用率，而是指構成其相關識別位點的核苷酸序列在任何DNA分子或DNA分子分離片段或是任何基因或其DNA序列中的出現頻率。
最近分離得到第二類限制性核酸內切酶，稱為歸巢核酸內切酶((homingendonuclease，HE)。HE酶具有較長的、不對稱的識別位點(12-40個鹼基對)。HE識別位點極其罕見。例如，稱為I-SceI的HE具有18bp的識別位點(5』...TAGGGATAACAGGGTAAT...3』)，根據預測，在每7×1010個鹼基對的隨機序列中只出現一次。這種出現頻率相當於20個哺乳動物大小的基因組中只有一個位點。HE位點的罕見本質大大增加了遺傳工程師能夠切割最終轉基因產物而不破壞轉基因完整性的可能性，如果在克隆載體質粒的適當位置含有HE位點的話。
由於來自任何生物體來源的DNA分子將以相同方式受到其相關限制酶的切割，因此可以用限制酶切割來自任何物種的外源DNA片段，插入已經用相同限制酶切割過的細菌質粒載體，並在合適的宿主細胞中進行擴增。例如，可以用EcoRI在兩個位置切割人類基因，分離具有EcoRI末端的片段，並在通常稱為連接反應或連接混合液的體系中與同樣經過EcoRI切割的質粒混合。在連接混合液中，在合適的條件下，有些分離的人類基因片段將與質粒分子的末端匹配。這些重新接合的末端能夠連接起來，並用酶將質粒再環化，質粒此時含有它的新DNA插入片段。然後將連接混合液導入大腸桿菌或其它合適的宿主，而重新改造的質粒將隨細菌的分裂而擴增。如此可以由細菌獲得和收穫相對較大數目的人類基因拷貝。然後可以出於研究、分析、或生產其基因產物蛋白質的目的而進一步操作這些基因拷貝。
重組DNA技術在所謂「轉基因」的生成中得到頻繁體現。轉基因通常包含衍生自一種或多種供體生物體且導入宿主生物體的多種遺傳材料。通常，使用克隆載體作為計劃的起點或「主鏈」來構建轉基因，而且設計一系列複雜的克隆步驟在該載體中裝配最終產物。包含核苷酸序列的轉基因的元件包括但不限於1)調控啟動子和/或增強子元件，2)將表達為mRNA分子的基因，3)為mRNA信息提供穩定性的DNA元件，4)模仿哺乳動物內含子基因區域的核苷酸序列，和5)mRNA加工信號，諸如添加在天然存在的mRNA末端的polyA尾。在有些情況中，實驗設計可能需要添加定位信號，從而將基因產物運輸至特定的亞細胞位置。這些元件中的每一種都是切自供體基因組的較大DNA分子的片段，或者在有些情況中是在實驗室中合成的。以精確的順序和5』-3』取向將每一種片段與其它片段一起連接到克隆載體質粒中。
可以以DNA片段的形式分離任何基因的啟動子，並置於合成分子諸如質粒內，從而指導期望基因的表達，假設可以提供刺激目的啟動子的必要條件的話。例如，可以分離胰島素基因的啟動子序列，與報導基因一起置於克隆載體質粒中，並用於研究在適當細胞類型中表達胰島素基因所需要的條件。或者，可以在克隆載體質粒中將胰島素基因啟動子與任何目的基因的蛋白質編碼序列相連，並用於驅動目的基因在表達胰島素的細胞中表達，假設如此構建的DNA轉基因中存在所有必需元件的話。
報導基因是某些轉基因類型的特別有用的成員。報導基因所包含的核苷酸序列編碼的蛋白質將在轉基因中與它相連的特定目的啟動子的指導下表達，從而為啟動子活性提供可測量的生化應答。相對於內源細胞蛋白質的背景，報導基因通常易於檢測或測量。常用的報導基因包括但不限於LacZ、綠色螢光蛋白、和螢光素酶，以及其它報導基因，其中許多對於本領域技術人員而言是眾所周知的。
在細菌基因組中沒有發現內含子，但是它是在哺乳動物細胞中正確形成mRNA分子所必需的。因此，在哺乳動物系統中使用的任何DNA構建物必須具有至少一個內含子。可以由任何哺乳動物基因分離內含子，並與容許哺乳動物細胞切除內含子並將剩餘mRNA末端剪接到一起的適當剪接信號一起插入DNA構建物。
mRNA穩定元件指受到保護某些mRNA免於降解的結合蛋白識別的DNA序列。包含mRNA穩定元件通常將提高mRNA在某些哺乳動物細胞類型中的基因表達水平，因而可用於某些DNA構建物或轉基因。可以由天然存在的DNA或RNA分離mRNA穩定元件，或者人工合成並包含在DNA構建物中。
定位信號指編碼目的蛋白亞細胞行程的蛋白質信號的DNA序列。例如，核定位信號將蛋白質引向細胞核；質膜定位信號將它引向質膜，等等。由此可以將定位信號摻入DNA構建物以促進其蛋白質產物轉移至期望的亞細胞位置。
DNA構建物中可能編碼有標籤序列，使得蛋白質產物將具有獨特的附加區域。這個附加區域作為蛋白質標籤，能夠將它與它的內源對應物區分開。或者，它可以擔當可以通過本領域眾所周知的多種技術檢測的鑑別物，包括但不限於RT-PCR、免疫組化、或原位雜交。
對於複雜的轉基因或是包含特別大的DNA區域的轉基因而言，這些DNA片段中存在多個識別位點的可能性增加了。想起每4096bp出現一個編碼任何一種六核苷酸位點的識別序列。如果啟動子序列是3000bp，而且要將1500bp的目的基因裝配到3000bp的克隆載體中，許多6個或更少核苷酸的位點將不能使用在統計學上是很有可能的，因為任何可用的位點只能存在於兩種片段中。此外，位點必須存在於將要裝配的適當分子的適當區域。另外，大多數克隆計劃將需要添加額外的DNA元件，從而增加增長中分子的複雜性和任何特定位點不合時宜重複的可能性。由於任何限制酶切割它在分子中的所有位點，如果限制酶位點重複出現的話，那麼所有不合適的位點將與期望位點一起受到切割，從而破壞分子的完整性。由此必須小心設計每一個克隆步驟，不會因為早已用於摻入前述元件的限制酶對它的切割而破壞增長中的分子。最後，如果研究人員希望將完成後的轉基因導入哺乳動物生物體，那麼通常必須將完整裝配的轉基因構建物在轉基因的至少一個末端在唯一的限制位點處線性化，由此還要求構建物的任何其它區域不存在另一個唯一位點。由於大多數DNA構建物設計用於單一目的，因此對於可能需要進行的任何未來修改沒有太多考慮，從而進一步增加了未來實驗改變的難度。
出於包括下列各項在內的幾個原因，轉基因的設計和構建通常耗費大量的時間和精力1.多種限制酶和HE酶可用於生成一批末端，然而其中大多數彼此不相容。許多限制酶(諸如EcoRI)生成具有5』突出粘端或「尾」的DNA片段；其它酶(例如PstI)生成具有3』突出尾的DNA片段；而還有一些酶(例如BalI)在對稱軸處切割而生成平端片段。其中一些將與由其它限制酶和HE酶切割而形成的末端相容，但是大多數有用的末端並非如此。在設計DNA構建物時必須仔細考慮每一次DNA片段分離中可能生成的末端。
2.必須首先由它們的基因組來源分離裝配DNA構建物或轉基因所需要的DNA片段，置於質粒克隆載體中，並擴增以獲得有用數量。可以使用任何數目的商品化或個別改造的克隆載體來進行上述步驟。每一種不同的商品化克隆載體質粒在極大程度上是獨立開發的，因此含有不同的序列和用於插入目的基因或遺傳元件的DNA片段的限制位點。因此必須根據任何指定的一組實驗的需要個別裁剪基因以適應每一種這樣的載體。通常需要改變相同的DNA片段，進一步用於後續實驗或克隆到新DNA構建物或轉基因的其它組合中。由於每一種DNA構建物或轉基因定製用於一種具體的應用而沒有考慮下次將如何使用它，因此通常必須將它「翻新(retro-fitted)」以用於後續應用。
3.另外，任何指定基因或遺傳元件的DNA序列是不同的，而且可能含有使之與現有載體不相容的內部限制位點，從而使操作變得複雜。在將幾個DNA片段裝配成單一DNA構建物或轉基因時尤其如此。
由此，需要容許用戶將許多DNA片段快速裝配成一個分子的系統，儘管在DNA片段的末端或內部發現有限制位點的冗餘。這樣的系統可能還提供用於快速改變片段的末端從而向其添加其它限制序列的簡單方法。含有單一或相對的HE限制位點對將增加具有可用於克隆的唯一位點的可能性。還容許容易的替代或清除一個或多個片段的系統將提高用戶目前無法獲得的多功能性(verstatility)水平。因此，容許將DNA片段插入或移出克隆載體中側翼為罕見限制位點的「盒(cassette)」區域的「模塊系統(modular system)」在重組DNA技術領域將是特別有用的，且是受歡迎的。
發明概述本發明涉及一種克隆載體質粒，其中編碼模塊結構的序列元件包括三個不可變(non-variable)且唯一的常見限制位點、5』寡核苷酸引物位點、正向取向的唯一HE位點、隨機核苷酸序列側翼的一對不可變且唯一的(non-variable and unique)常見限制位點、限定啟動子模塊5』部分的一組固定的不可變罕見限制位點(fixed grouping of non-variable rare restriction site)、隨機核苷酸序列、限定相對於啟動子/內含子模塊的3』位置和相對於表達模塊的5』位置之間共享接點的一組固定的不可變罕見限制位點、隨機核苷酸序列、限定相對於表達模塊的3』位置和相對於3』調控模塊的5』位置之間接點的一組固定的不可變罕見限制位點、隨機核苷酸序列、限定相對於3』調控模塊的3』位置的一組固定的不可變罕見限制位點、隨機核苷酸序列側翼的一對不可變且唯一的常見限制位點、反向取向的唯一HE位點(與位於5』寡核苷酸引物位點3』的HE位點相同)、反向取向的3′寡核苷酸引物位點、和限定3』插入位點的四個不可變且唯一的常見限制位點。
本發明涉及一種克隆載體質粒，其中編碼分子結構的序列元件包括限定5』插入位點的兩個不可變且唯一的常見限制位點、寡核苷酸引物位點、隨機核苷酸序列側翼的一對相反取向的唯一HE位點、容許在一對唯一HE位點下遊克隆穿梭載體模塊的不可變且唯一的常見限制位點、一組固定的不可變罕見限制位點、隨機核苷酸序列、一組固定的不可變罕見限制位點、正向取向的唯一HE位點、隨機核苷酸序列側翼的一對不可變且唯一的常見限制位點、寡核苷酸引物位點、一對相反取向的唯一BstXI位點(其中BstXI識別位點中的可變核苷酸區限定為與通過反向互補取向安排的兩個相同HE識別位點生成的非互補尾相同的核苷酸)、隨機核苷酸序列側翼的一對相反取向的唯一HE位點、反向取向的寡核苷酸引物位點、隨機核苷酸序列側翼的一對不可變且唯一的常見限制位點、反向取向的唯一HE位點(HE位點與正向取向的HE位點相同)、一組固定的不可變罕見限制位點、隨機核苷酸序列、一組固定的不可變罕見限制位點、不可變且唯一的常見限制位點、隨機核苷酸序列側翼的一對相反取向的唯一HE位點、反向取向的寡核苷酸引物、和三個不可變且唯一的常見限制位點。
本發明還涉及一種用於構建轉基因的方法，包括下列步驟提供包含啟動子模塊、表達模塊、和3』調控模塊的順序排列的克隆載體質粒；將轉基因中包含的第一段核苷酸序列導入穿梭載體；將第一段核苷酸序列由穿梭載體轉移至包含模塊元件的克隆載體質粒；將任何其它所需核苷酸序列順序導入另外的穿梭載體；並將所述其它所需核苷酸序列轉移至所述已經接受了第一段核苷酸序列的克隆載體質粒。
附圖描述
圖1是本發明模塊概念的線性圖譜。
圖2是停泊質粒(Docking Plasmid)圖譜。
圖3的線性限制圖譜圖示了停泊質粒MCS中可以包含的限制酶位點的實例。
圖4是初級停泊質粒(Primary Docking Plasmid)圖譜。
圖5的線性限制圖譜圖示了初級停泊質粒MCS中可以包含的限制酶位點的實例。
圖6是穿梭載體P(SVP)質粒圖譜。
圖7的線性限制位點圖譜圖示了SVP MCS中可以包含的限制酶位點的實例。
圖8是穿梭載體E(SVE)質粒圖譜。
圖9的線性限制位點圖譜圖示了SVE MCS中可以包含的限制酶位點的實例。
圖10是穿梭載體3(SV3)圖譜。
圖11的線性限制位點圖譜圖示了SV3MCS中可以包含的限制酶位點的實例。
序列表簡述SEQID 01是PE3停泊質粒MCS的核苷酸序列實例。
SEQID 02是PE3停泊質粒的核苷酸序列實例。
SEQID 03是初級停泊質粒MCS的核苷酸序列實例。
SEQID 04是初級停泊質粒的核苷酸序列實例。
SEQID 05是SVP質粒MCS的核苷酸序列實例。
SEQID 06是SVP質粒的核苷酸序列實例。
SEQID 07是SVE質粒MCS的核苷酸序列實例。
SEQID 08是SVE質粒的核苷酸序列實例。
SEQID 09是SV3質粒MCS的核苷酸序列實例。
SEQID 10是SV3質粒的核苷酸序列實例。
用於描述本發明的術語的定義在用於本文時，術語「克隆載體」和「克隆載體質粒」可以互換使用，指最低限度包含複製起點、用於對容納質粒的宿主細胞進行正選擇的手段諸如抗生素抗性基因、和多克隆位點的環狀DNA分子。
在用於本文時，術語「複製起點」(ORI)指指導質粒在宿主細胞中複製的核苷酸序列。
在用於本文時，術語「多克隆位點」指出於將DNA片段克隆到克隆載體質粒中的目的而包含限制位點的核苷酸序列。
在用於本文時，術語「克隆」指將DNA分子連接到質粒中並將其轉移到適當宿主細胞中用於在宿主繁殖過程中複製的過程。
在用於本文時，術語「DNA構建物」指通過克隆載體質粒中的連續克隆步驟而合成的，且常用於在任何適當細胞宿主(諸如體外的培養細胞或體內的轉基因小鼠)中指導基因表達的DNA分子。用於生成這種小鼠的轉基因也可以稱為DNA構建物，尤其是在設計和合成轉基因的那段時間裡。
在用於本文時，術語「穿梭載體」指本發明中用於生成中間分子的專用(specialized)克隆載體質粒，所述中間分子將更改DNA片段的末端。
在用於本文時，術語「停泊質粒」指本發明中用於將DNA片段裝配到DNA構建物中的專用克隆載體質粒。
在用於本文時，「限制性核酸內切酶」或「限制酶」指與相關DNA序列結合併在該序列內的精確位置切割DNA分子的一類催化分子的一個或多個成員。
在用於本文時，術語「相關序列(cognate sequence)」指限制酶結合併切割DNA分子或基因所需要的最小限度的一段核苷酸。
在用於本文時，術語「DNA片段」指任何分離的DNA分子，包括但不限於編碼蛋白質的序列、報導基因、啟動子、增強子、內含子、外顯子、polyA尾、多克隆位點、核定位信號、或mRNA穩定信號，或是任何其它天然存在的或合成的DNA分子。或者，DNA片段可以完全是合成起源的，在體外生成的。另外，DNA片段可以包含分離的天然存在和/或合成片段的任意組合。
在用於本文時，術語「基因啟動子」或「啟動子」(P)指基因表達所必需的核苷酸序列。
在用於本文時，術語「增強子區域」指不是靶基因表達所必需的但在適當條件下將提高基因表達水平的核苷酸序列。
在用於本文時，術語「報導基因」指所編碼的蛋白質可用於監測特定目的啟動子活性的核苷酸序列。
在用於本文時，術語「染色質修飾結構域」(CMD)指與維持和/或改變染色質結構相關的多種蛋白質相互作用的核苷酸序列。
在用於本文時，術語「polyA尾」指通常在信使RNA(mRNA)分子末端處發現的一串腺嘌呤核苷酸。將polyA尾信號摻入DNA構建物或轉基因的3』末端有助於表達目的基因。
在用於本文時，術語「內含子」指基因中在兩個蛋白質編碼區或外顯子之間發現的非蛋白質編碼區的核苷酸序列。
在用於本文時，術語「非翻譯區」(UTR)指涵蓋mRNA分子中的非蛋白質編碼區的核苷酸序列。這些非翻譯區可以位於mRNA分子的5』端(5』UTR)或3』端(3』UTR)。
在用於本文時，術語「mRNA穩定元件」指受到某些結合蛋白識別的DNA序列，所述結合蛋白被認為是保護某些mRNA免於降解。
在用於本文時，術語「定位信號」(LOC)指編碼目的蛋白亞細胞行程的信號的核苷酸序列。
在用於本文時，術語「標籤序列」(TAG)指編碼容許進行檢測或在有些情況中與任何內源對應物進行區分的獨特蛋白質區域的核苷酸序列。
在用於本文時，術語「引物位點」指DNA模板中單鏈DNA寡核苷酸能夠與它退火從而啟動DNA測序、PCR擴增、和/或RNA轉錄的核苷酸序列。
在用於本文時，術語「基因表達宿主選擇基因」(GEH-S)指在用適當抗生素或化學藥品進行處理時能夠賦予細胞或生物體以抗性或毒性的遺傳元件。
在用於本文時，術語「重組臂」指促進轉基因DNA與基因組DNA之間進行同源重組的核苷酸序列。成功的重組要求在要通過同源重組摻入宿主基因組的轉基因DNA區的側翼存在左重組臂(LRA)和右重組臂(RRA)。
在用於本文時，術語「pUC19」指本領域技術人員熟知的質粒克隆載體，它在NCBI基因庫資料庫中的編號是L09137。
在用於本文時，術語「隨機核苷酸序列」指與編碼相同分子之成分的其它元件之序列不同的核苷酸序列的任意組合。
在用於本文時，術語「唯一(unique)」指在DNA分子中的其它區域沒有發現的任何限制性核酸內切酶或HE位點。
發明詳述本發明是經過優化降低了將多個DNA片段重新裝配成DNA構建物或轉基因通常所需的操作量的一組克隆載體。初級載體(本文中稱為停泊質粒)所包含的多克隆位點(MCS)具有以線性模式排列的三套罕見限制位點和/或HE位點。這種排列限定了這樣的模塊體系結構，它容許用戶將多個插入片段裝配成一個轉基因構建物，但不會打亂在先前的克隆步驟中早已摻入停泊質粒中的DNA元件的完整性。
將至少三種HE的兩個識別位點以相反取向置於三個模塊區的側翼，用於生成不能自我退火的基因盒接收位點。因為HE位點是不對稱的且非回文的，所以有可能通過以相反取向安置兩個HE識別位點而生成不互補的3』突出粘性尾。由此，HE I-SceI如「/」所示切割其相關識別位點5』...T A G G G A T A A/C A G G G T A A T...3』，3』...A T C C C/T A T T G T C C C A T T A...5』。
MCS中反向安置的第二個位點將生成兩個不互補的粘性突出尾5』...TAGGGATAA CCCTA...3』3』...ATCCC AATAGGGAT...5』。
這在必須將較大轉基因亞克隆到載體中時是特別有用的。由於插入片段的大小，載體在熱力學上更加有利於自身退火而非接受大插入片段。通過這樣安排限制位點而生成的非互補尾的存在為抵消自我連接的熱力學傾向提供了化學力。
大多數HE突出尾的不對稱本質在聯合BstXI限制酶位點(5』CCANNNNN/NTGG3』)使用時還產生了強大的克隆工具。在排除自我退火的同時，BstXI的序列中性區域(sequence-neutral domain)可用於生成與兩個相反取向的HE突出尾相容的粘端。
BstXI(正向I-SceI) 正向I-SceI 反向I-SceI BstXI(反向I-SceI)5』-CCAGATAACAGGGTAAT//ATTACCCTGTTAT GTGG-3』3』-GGTCTATTGTCCCATTA//TAATGGGAC AATACACC-5』本發明的次級載體(本文稱為穿梭載體)所包含的多克隆位點具有側翼為罕見限制位點和/或HE位點的常見限制位點。穿梭載體設計用於將DNA片段克隆到罕見位點之間的常見限制位點中。隨後可以通過罕見限制位點或HE位點處的切割釋放所克隆的片段，並使用在穿梭載體中發現的相同罕見限制位點和/或HE位點摻入停泊質粒。
由此，與常規克隆載體不同的是，MCS的設計容許將DNA片段的「盒」或模塊插入停泊質粒的模塊區域。同樣，可以使用相同的罕見限制酶和/或HE酶容易的將每一個切除，並用任何其它目的DNA片段取代。這種特徵容許用戶快速且容易的改變實驗計劃的方向，無需重建整個DNA構建物。由此，本發明的克隆載體質粒容許用戶使用常見限制位點將DNA片段克隆到中間載體中，產生接受盒的模塊(cassette-accepting module)，然後藉助罕見限制位點將該片段轉移至最終構建物的期望模塊處。另外，它容許將來改變分子，用其它盒模塊取代停泊質粒中的個別模塊。下面的描述強調了本發明相對於現有技術的區別。
可以作為由穿梭載體轉移至PE3停泊位置質粒的模塊來裝配轉基因的各個成分(啟動子增強子P、表達的蛋白質E、和/或3』調控區3)。如果需要更高級別的複雜性，那麼可以將裝配好的轉基因或其它核苷酸序列轉移到初級停泊質粒中。由更加複雜的PE3停泊位置質粒和初級Docing質粒開始，下文將更為詳細的說明五類克隆載體質粒中的每一種，從而能夠理解摻入每一種質粒的成分。
PE3停泊質粒(圖2)包含pUC19的主鏈但具有下列修改，其中所述序列是依照編號L09137的pUC19基因庫序列文件編號的1.停泊質粒中只使用了806至2617(Afl3-Aat2)的序列，2.pUC19中1729處的BspHI位點由TCATGA突變成GCATGA，3.pUC19中1493處的AclI位點由AACGTT突變成AACGCT，4.pUC19中1120處的AclI位點由AACGTT突變成CACGCT，5.pUC 19中的AhdI位點由GACNNNNNGTC突變成CACNNNNNGTC，6.在上表突變步驟2之後，將編碼BspHI/I-PpoI/BspHI的序列插入pUC19中唯一剩餘的BspHI位點。
PE3停泊質粒的多克隆位點(MCS)(圖3)以所列順序包含下列序列元件1.限定突變後pUC19載體的5』插入位點的三個不可變且唯一的常見限制位點(例如AatII、BlpI、和Eco0109I)，2.一個T7引物位點，3.一個唯一的HE位點(例如I-SceI(正向取向))，4.可以擔當染色質修飾結構域接受模塊(RNAS-CMD-1)的隨機核苷酸序列側翼的一對不可變且唯一的常見限制位點(例如KpnI和AvrII)，5.限定啟動子模塊5』部分的一組固定的不可變罕見限制位點(例如AsiSI和SgrAI)，6.可以擔當啟動子/內含子接受模塊的隨機核苷酸序列(RNAS-P)，7.限定啟動子/內含子模塊的3』部分和表達模塊的5』部分之間共有接點的一組固定的不可變罕見限制位點(例如PacI、AscI、和MluI)，8.可以擔當表達接受模塊的隨機核苷酸序列(RNAS-E)，9.限定表達模塊的3』部分和3』調控模塊的5』部分之間接點的一組固定的不可變罕見限制位點(例如SnabI、NotI、和SalI)，10.可以擔當3』調控結構域接受模塊的隨機核苷酸序列(RNAS-3)，11.限定3』調控模塊的3』部分的一組固定的不可變罕見限制位點(例如SwaI、RsrII、和BsiWI)，12.可以擔當染色質修飾結構域接受模塊的DNA隨機核苷酸序列(RNAS-CMD-2)側翼的一對不可變且唯一的常見限制位點(例如XhoI和NheI)，
13.反向取向的唯一HE位點，與上文第3項的HE位點相同，14.反向取向的T3引物位點，和15.限定上文所述突變後pUC19載體的3』插入位點的四個不可變且唯一的常見限制位點(例如BspEI、PmeI、SapI、和BspHI)。
初級停泊質粒(圖4)可用於裝配最初在PE3停泊位置質粒(DockingStation Plasmid)中構建的兩個完整轉基因或構建基因靶向轉基因所需要的兩個同源臂，或是用於導入兩類正或負選擇元件的。初級停泊質粒的多克隆位點(MCS)(圖5)以所列順序包含下列序列元件1.限定上文所述突變後pUC19載體的5』插入位點的兩個不可變且唯一的常見限制位點(例如AatII和BlpI)，2.M13反向引物位點，3.可以擔當基因組表達宿主選擇基因接受模塊(RNAS-GEH-S1)的DNA隨機核苷酸序列側翼的一對唯一HE位點(例如PI-SceI(正向取向)和PI-SceI(反向取向))，4.容許在所述HE對位點下遊克隆穿梭載體模塊的不可變且唯一的常見限制位點(例如Eco0109I)，5.限定左重組臂模塊的5』部分的一組固定的不可變罕見限制位點(例如SgrAI和AsiSI)，6.可以擔當左重組臂接受模塊的隨機核苷酸序列(RNAS-LRA)，7.限定左重組臂接受模塊的3』部分的一組固定的不可變罕見限制位點(例如PacI、MluI、和AscI)，8.唯一的HE位點(例如I-CeuI(正向取向))，9.可以擔當染色質修飾結構域接受模塊(chromatin modification domainacceptor module)(RNAS-CMD-1)的DNA隨機核苷酸序列側翼的一對不可變且唯一的常見限制位點(例如KpnI和AvrII)，10.T7引物位點，11.可以擔當複雜轉基因接受模塊(complex transgene acceptor module)的DNA隨機核苷酸序列(RNAS-PE3-1)側翼的一對相反取向的唯一BstXI位點(其中BstXI識別位點中的可變核苷酸區限定為與通過反向互補取向安排的兩個相同HE識別位點生成的非互補尾相同的核苷酸，例如PI-SceI(正向取向)和PI-SceI(反向取向))，
12.可以擔當複雜轉基因模塊的DNA隨機核苷酸序列(RNAS-PE3-2)側翼的一對相反取向的唯一HE位點(例如I-SceI(正向取向)和I-SceI(反向取向))，13.反向取向的T3引物位點，14.可以擔當染色質修飾結構域接受模塊的DNA隨機核苷酸序列(RNAS-CMD-2)側翼的一對不可變且唯一的常見限制位點(例如XhoI和NheI)，15.反向取向的唯一HE位點，與上述第8項的HE位點相同，16.限定右重組臂模塊的5』部分的一組固定的不可變罕見限制位點(例如SnaBI、SalI、和NotI)，17.可以擔當右重組臂接受模塊的隨機核苷酸序列(RNAS-RRA)，18.限定右重組臂接受模塊的3』部分的一組固定的不可變罕見限制位點(例如RsrII、SwaI、和BsiWI)，19.容許在一對HE位點上遊克隆穿梭載體模塊的不可變且唯一的常見限制位點(例如BspEI)，20.可以擔當基因組表達宿主選擇基因接受模塊的DNA隨機核苷酸序列(RNAS-GEH-S2)側翼的一對相反取向的唯一HE位點(例如PI-PspI(正向取向)和PI-PspI(反向取向))，21.以反向取向安置的M13正向引物位點，22.限制上文所述突變後pUC19載體的3』插入位點的三個不可變且唯一的常見限制位點(例如PmeI、SapI、和BspHI)。
本發明的三種克隆載體質粒稱為穿梭載體。穿梭載體，像PE3和初級停泊質粒，也是由pUC19主鏈構建而成的。正如PE3和初級停泊質粒，每一種穿梭載體對pUC19主鏈進行了上文所列1-6的相同修改。各種穿梭載體(SV)鑑別為啟動子/內含子穿梭載體(P)、表達穿梭載體(E)、和3』調控穿梭載體(3)；自此以後，分別以SVP、SVE、SV3表示。下文更加詳盡的描述了每一種穿梭載體。
穿梭載體P(SVP)SVP是可用於製備將裝配到轉基因構建物中的啟動子和內含子序列的克隆載體質粒(圖6)。SVP質粒的實例可以以所列順序在MCS中包含下列序列元件(圖7)
1.限定上文所述突變後pUC19載體的5』插入位點的兩個不可變且唯一的常見限制位點(例如AatII和BlpI)，2.T7引物位點，3.容許在T7引物位點下遊有效克隆穿梭載體模塊的不可變且唯一的常見限制位點(例如Eco0109I)，4.限定啟動子模塊的5』部分的一組固定的不可變罕見限制位點(a fixedgrouping of non-variable rare restriction sites)(例如AsiSI和SgrAI)，5.包含穿梭載體中唯一的任何分組的常見或罕見限制位點的可變MCS(例如圖7所示一系列限制位點)，6.限定啟動子模塊的3』部分的一組固定的不可變罕見限制位點(例如PacI、AscI、和MluI)，7.容許在T3引物位點上遊有效克隆穿梭載體模塊的不可變且唯一的常見限制位點(例如BspEI)，8.反向取向的T3引物位點，和9.限定上文所述突變後pUC19載體的3』插入位點的兩個不可變且唯一的常見限制位點(例如PmeI和SapI)。
穿梭載體E(SVE)這是可用於製備將裝配到轉基因構建物中的、由轉基因表達的序列的克隆載體質粒(圖8)。SVE質粒的實例可以以所列順序在MCS中包含下列序列元件(圖9)1.限定上文所述突變後pUC19載體的5』插入位點的兩個不可變且唯一的常見限制位點(例如AatII和BlpI)，2.T7引物位點，3.容許在T7引物位點下遊有效克隆穿梭載體模塊的不可變且唯一的常見限制位點(例如Eco0109I)，4.限定表達模塊的5』部分的一組固定的不可變罕見限制位點(例如PacI、AscI、和MluI)，5.由穿梭載體中唯一的任何分組的常見或罕見限制位點組成的可變MCS(例如圖9所示一系列限制位點)，6.限定表達模塊的3』部分的一組固定的不可變罕見限制位點(例如SnaBI、NotI、和SalI)，
7.容許在T3引物位點上遊有效克隆穿梭載體模塊的不可變且唯一的常見限制位點(例如BspEI)，8.反向取向的T3引物位點，和9.限定上文所述突變後pUC19載體的3』插入位點的兩個不可變且唯一的常見限制位點(例如PmeI和SapI)。
穿梭載體3(SV3)這是可用於製備將裝配到轉基因構建物中的3』調控序列的克隆載體質粒(圖10)。SV3質粒的實例可以以所列順序在MCS中包含下列序列元件(圖11)1.限定上文所述突變後pUC19載體的5』插入位點的兩個不可變且唯一的常見限制位點(例如AatII和BlpI)，2.T7引物位點，3.容許在T7引物位點下遊有效克隆穿梭載體模塊的不可變且唯一的常見限制位點(例如Eco0109I)，4.限定3』調控模塊的5』部分的一組固定的不可變罕見限制位點(例如SnaBI、NotI、和SalI)，5.由穿梭載體中唯一的任何分組的常見或罕見限制位點組成的可變MCS(例如圖11所示一系列限制位點)，6.限定3』調控模塊的3』部分的一組固定的不可變罕見限制位點(例如SwaI、RsrII、和BsiWI)，7.容許在T3引物位點上遊有效克隆穿梭載體模塊的不可變且唯一的常見限制位點(例如BspEI)，8.反向取向的T3引物位點，和9.限定上文所述突變後pUC19載體的3』插入位點的兩個不可變且唯一的常見限制位點(例如PmeI和SapI)。
儘管本發明公布了用於在質粒克隆載體中構建轉基因的方法，然而可以使用類似方法在較大染色體外DNA分子中構建轉基因，諸如粘粒或人工染色體，包括細菌人工染色體(BAC)。可以摻入質粒克隆載體的多種遺傳元件還容許通過少許操作或無需更多操作就將最終的轉基因產物轉移到多種宿主生物體中。
作為實踐本發明的方法的實例，可以構建包含這些元件的轉基因
1.表面活性蛋白C(SP-C)的人類啟動子的核苷酸序列，2.編碼小鼠基因粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子受體βc(GMRβc)的蛋白質產物的序列，3.兔β球蛋白內含子序列，和4.SV40 polyA信號。
SP-C序列包含內部BamHI位點，而且只能用NotI和EcoRI由其親本質粒中釋放出來。GMRβc具有內部NotI位點，而且可以用BamHI和XhoI由其親本質粒中切割出來。兔β球蛋白內含子序列可以用EcoRI由其親本質粒中切割出來。SV-40 polyA尾可以用XhoI和SacI由其親本質粒中切割出來。因為幾種限制位點的冗餘，這些親本質粒都不能用於裝配所有的所需片段。
用於在PE3停泊質粒發明中構建期望轉基因的步驟如下1.由於NotI和PspOM1生成相容粘端，因此用NotI和EcoRI切出人類SP-C啟動子序列，並克隆到穿梭載體P的PspOM1和EcoRI位點中。將該反應的產物稱為pSVP-SPC。
2.在本領域技術人員熟知的擴增和回收步驟之後，將兔β球蛋白內含子序列克隆到pSVP-SPC的EcoRI位點中。通過對稱為pSVP-SPC-rβG的由此產生的中間構建物進行測序來確認內含子在所述中間構建物中的取向。
3.使用AsiSI和AscI切出並克隆啟動子和內含子作為來自pSVP-SPC-rβG的一個相連片段。同時，用AsiSI和AscI切割PE3停泊質粒，準備與啟動子/內含子區段進行連接。將啟動子/內含子片段連接到停泊質粒中，擴增，並回收。
4.使用本領域技術人員熟知的技術補平GMRβc片段的XhoI位點以產生3』平端。然後將它克隆到pSVP-SPC-rβG的BamHI位點和末端補平的Pvu2位點。擴增並回收由此產生的質粒(pDP-SPC-GMRβc-rβG)。
5.最後的克隆步驟是添加SV-40的polyA尾。用XhoI和SacI切出SV-40polyA片段，正如受體載體pDS1-SPC-GMRβc-rbβG。將這兩種DNA片段進行凝膠純化和回收。以SV-40polyA與pDS1-SPC-GMRβc-rβG以10∶1摩爾比製備連接混合液。擴增並回收連接產物。新質粒pDS1-SPC-GMRβc-rβG-pA含有轉基因所需要的所有元件，包括3』末端的唯一限制位點，可用於將整個pDS1-SPC-GMRβc-rβG-pA質粒線性化，以轉染到真核細胞中或顯微注射到受精卵的原核中。
序列表110英特裡克松公司(Intrexon Corporation)120DNA克隆載體質粒及其使用方法13060/417,282140US 10/682,7641412003-10-0915060/417,2821512002-10-0916010170PatentIn version 3.321012113452212DNA213人工合成的DNA分子220
223合成的構建物220
221misc_feature222(98)..(347)223″n″是a，c，g，或t220
221misc_feature222(411)..(430)223″n″是a，c，g，或t220
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221misc_feature222(1163)..(1182)223″n″是a，c，g，或t220
221misc_feature222(1240)..(1489)223″n″是a，c，g，或t4001tgagcagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ceatgattac tctgtagcat60ctatgtcggg tgcggagaaa gaggtaatga aatggcannn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn120nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn180nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn240nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn300nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnntgc catttcatta360cctctttctc cgcacccgac atagataggc cctgcgccgg cggcgatcgc nnnnnnnnnn420nnnnnnnnnn ttaattaaac gcgtggcgcg cctaactata acggtcctaa ggtagcgagg480taccgctggc cctagggtaa tacgactcac tatagggcca cataagtggn nnnnnnnnnn540nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn600
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223PE3停泊質粒MCS220
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223初級停泊質粒220
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221misc_feature222(1163)..(1182)223″n″是a，c，g，或t220
221misc_feature222(1240)..(1489)223″n″是a，c，g，或t4003tgagcagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac tctgtagcat60ctatgtcggg tgcggagaaa gaggtaatga aatggcannn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn120nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn180nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn240nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn300nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnntgc catttcatta360cctctttctc cgcacccgac atagataggc cctgcgccgg cggcgatcgc nnnnnnnnnn420nnnnnnnnnn ttaattaaac gcgtggcgcg cctaactata acggtcctaa ggtagcgagg480taccgctggc cctagggtaa tacgactcac tatagggcca cataagtggn nnnnnnnnnn540nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn600nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn660nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn720nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc780cacttatgtg gtagggataa cagggtaatn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn840nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn900
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atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 3240gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 3300tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 3360ctcatgcgcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 3420acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc gc345221042111628212DNA213人工序列220
223初級停泊質粒MCS220
221misc_feature222(114)..(363)223″n″是a，c，g，或t220
221misc_feature222(427)..(446)223″n″是a，c，g，或t220
221misc_feature222(546)..(795)223″n″是a，c，g，或t220
221misc_feature222(826)..(1075)223″n″是a，c，g，或t220
221misc_feature222(1179)..(1198)223″n″是a，c，g，或t220
221misc_feature222(1256)..(1505)223″n″是a，c，g，或t4004gagagagaga cgtcgctgag cagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat60gattactctg tagcatctat gtcgggtgcg gagaaagagg taatgaaatg gcannnnnnn120nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn180nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn240nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn300nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn360nnntgccatt tcattacctc tttctccgca cccgacatag ataggccctg cgccggcggc420gatcgcnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnttaa ttaaacgcgt ggcgcgccta actataacgg480tcctaaggta gcgaggtacc gctggcccta gggtaatacg actcactata gggccacata540agtggnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn600nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn660nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn720nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn780
nnnnnnnnnn nnnnnccact tatgtggtag ggataacagg gtaatnnnnn nnnnnnnnnn 840nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 900nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 960nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1020nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnattac 1080cctgttatcc ctatcccttt agtgagggtt aattctcgag gcaggagcta gctcgctacc 1140ttaggaccgt tatagttata cgtagtcgac gcggccgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnncg 1200gtccgattta aatcgtacgt ccggatggca aacagctatt atgggtatta tgggtnnnnn 1260nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1320nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1380nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1440nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1500nnnnnaccca taatacccat aatagctgtt tgccagctac agagtttact ggccgtcgtt 1560ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc ggtttaaacg ctcttccgct tccttcatga 1620gagagaga 162821052112092212DNA213人工序列220
223SVP質粒4005tgagcgtaat acgactcact atagggaggc cctgcgatcg ccgccggcgg atatcggagc 60tgctgggccc agggagcttc tagaggagct ggatccgctg gagaattcgg agctggaaag 120cttggagctg ctctgcaggg agctgcatgc gctggcgcac agctgttaat taaggcgcgc 180cacgcgttcc ggattccctt tagtgagggt taattgttta aacgctcttc cgcttccttc 240atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 300ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 360cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 420tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 480gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 540aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 600tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 660aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 720aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 780ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 840ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 900atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 960atgataacta tgactctctt aaggtagcca aattcatgag attatcaaaa aggatcttca 1020cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 1080cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 1140
ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tggtgtagat aactacgata cgggagggct 1200taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 1260tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 1320ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 1380atagtttgcg caacgtggtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 1440gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 1500tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 1560cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 1620taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 1680ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 1740ctttaaaagt gctcatcatt ggaaagcgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 1800cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 1860ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 1920gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 1980gcatttatca gggttattgt ctcatgcgcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 2040aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc gc 20922106211234212DNA213人工序列220
223SVP質粒MCS4006cgctgagcgt aatacgactc actataggga ggccctgcga tcgccgccgg cggatatcgg 60agctgctggg cccagggagc ttctagagga gctggatccg ctggagaatt cggagctgga 120aagcttggag ctgctctgca gggagctgca tgcgctggcg cacagctgtt aattaaggcg 180cgccacgcgt tccggattcc ctttagtgag ggttaattgt ttaaacgctc ttcc23421072112097212DNA213人工序列220
223SVE質粒4007tgagcgtaat acgactcact atagggaggc cctgttaatt aaggcgcgcc acgcgtgata 60tcggagctgc tgggcccagg gagcttctag aggagctgga tccgctggag aattcggagc 120tggaaagctt ggagctgctc tgcagggagc tgcatgcgct ggcgcacagc tgtacgtagc 180ggccgcgtcg actccggatt ccctttagtg agggttaatt gtttaaacgc tcttccgctt 240ccttcatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 300cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 360ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 420tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 480
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223SVE質粒MCS4008cgctgagcgt aatacgactc actataggga ggccctgtta attaaggcgc gccacgcgtg60atatcggagc tgctgggccc agggagcttc tagaggagct ggatccgctg gagaattcgg120agctggaaag cttggagctg ctctgcaggg agctgcatgc gctggcgcac agctgtacgt180agcggccgcg tcgactccgg attcccttta gtgagggtta attgtttaaa cgctcttcc 23921092112096212DNA213合成DNA分子
4009tgagcgtaat acgactcact atagggaggc cctgtacgta gcggccgcgt cgacgatatc 60ggagctgctg ggcccaggga gcttctagag gagctggatc cgctggagaa ttcggagctg 120gaaagcttgg agctgctctg cagggagctg catgcgctgg cgcacagctg atttaaatcg 180gtccgcgtac gtccggattc cctttagtga gggttaattg tttaaacgct cttccgcttc 240cttcatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 300gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 360gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 420gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 480aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 540ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 600taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 660tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 720gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 780taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 840tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 900tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 960ggtcatgata actatgactc tcttaaggta gccaaattca tgagattatc aaaaaggatc 1020ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 1080taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 1140ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtggtgt agataactac gatacgggag 1200ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 1260gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 1320ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 1380gttaatagtt tgcgcaacgt ggttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 1440tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 1500atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 1560gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 1620tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 1680atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 1740agaactttaa aagtgctcat cattggaaag cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 1800ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 1860tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 1920aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 1980tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg cgcggataca tatttgaatg tatttagaaa 2040aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtcgc 209621010211238212DNA213合成DNA分子
40010cgctgagcgt aatacgactc actataggga ggccctgtac gtagcggccg cgtcgacgat60atcggagctg ctgggcccag ggagcttcta gaggagctgg atccgctgga gaattcggag120ctggaaagct tggagctgct ctgcagggag ctgcatgcgc tggcgcacag ctgatttaaa180tcggtccgcg tacgtccgga ttccctttag tgagggttaa ttgtttaaac gctcttcc 238
權利要求
1.一種克隆載體質粒，其中編碼模塊結構的序列元件包括a)三個不可變且唯一的常見限制位點，b)5』寡核苷酸引物位點，c)正向取向的唯一HE位點，d)隨機核苷酸序列側翼的一對不可變且唯一的常見限制位點，e)限定啟動子模塊5』部分的一組固定的不可變罕見限制位點，f)隨機核苷酸序列，g)限定相對於啟動子/內含子模塊的3』位置和相對於表達模塊的5』位置之間共有接點的一組固定的不可變罕見限制位點，h)隨機核苷酸序列，i)限定相對於表達模塊的3』位置和相對於3』調控模塊的5』位置之間接點的一組固定的不可變罕見限制位點，j)隨機核苷酸序列，k)限定相對於3』調控模塊的3』位置的一組固定的不可變罕見限制位點，l)隨機核苷酸序列側翼的一對不可變且唯一的常見限制位點，m)反向取向的唯一HE位點，與位於5』寡核苷酸引物位點3』的HE位點相同，n)反向取向的3′寡核苷酸引物位點，和o)限定3』插入位點的四個不可變且唯一的常見限制位點。
2.權利要求1的克隆載體質粒，其中序列元件的模塊結構的安排容許導入三個不連續的核苷酸序列區域，使得如此導入的核苷酸序列取代所述啟動子模塊、表達模塊、和3』調控模塊的隨機核苷酸序列。
3.一種克隆載體質粒，其中所編碼的序列元件包括a)限定5』插入位點的兩個不可變且唯一的常見限制位點，b)寡核苷酸引物位點，c)隨機核苷酸序列側翼的一對相反取向的唯一HE位點，d)容許在所述一對唯一HE位點下遊克隆穿梭載體模塊的不可變且唯一的常見限制位點，e)一組固定的不可變罕見限制位點，f)隨機核苷酸序列，g)一組固定的不可變罕見限制位點，h)正向取向的唯一HE位點，i)隨機核苷酸序列側翼的一對不可變且唯一的常見限制位點，j)寡核苷酸引物位點，k)一對相反取向的唯一BstXI位點(其中BstXI識別位點中的可變核苷酸區限定為與通過反向互補取向安排的兩個相同HE識別位點生成的非互補尾相同的核苷酸)，l)隨機核苷酸序列側翼的一對相反取向的唯一HE位點，m)反向取向的寡核苷酸引物位點，n)隨機核苷酸序列側翼的一對不可變且唯一的常見限制位點，o)反向取向的唯一HE位點，HE位點與正向取向的HE位點相同，p)一組固定的不可變罕見限制位點，q)隨機核苷酸序列，r)一組固定的不可變罕見限制位點，s)不可變且唯一的常見限制位點，t)隨機核苷酸序列側翼的一對相反取向的唯一HE位點，u)反向取向的寡核苷酸引物，和v)三個不可變且唯一的常見限制位點。
4.權利要求3的克隆載體質粒，其中序列元件的模塊結構的安排容許導入兩個不連續的轉基因，使得如此導入的核苷酸序列取代隨機核苷酸序列。
5.權利要求3的克隆載體質粒，其中序列元件的模塊結構的安排容許導入兩個不連續的核苷酸序列區域，諸如誘導轉基因進行同源重組以實現基因靶向突變所需要的核苷酸序列。
6.權利要求3的克隆載體質粒，其中序列元件的模塊結構的安排容許導入兩個不同的正或負選擇元件。
7.一種用於構建轉基因的方法，包括下列步驟a)提供包含啟動子模塊、表達模塊和3』調控模塊的順序排列的克隆載體質粒，b)將轉基因中包含的第一段核苷酸序列導入穿梭載體，c)將第一段核苷酸序列由穿梭載體轉移至包含模塊元件的克隆載體質粒，d)將任何其它所需核苷酸序列順序導入另一個穿梭載體，和e)將其它所需核苷酸序列轉移至已經接受了第一段核苷酸序列的克隆載體質粒。
全文摘要
出於基因表達或基因表達分析的目的，本發明涉及用於構建DNA分子(諸如轉基因)的一組克隆載體質粒。本發明還涉及用於在一系列可變的克隆步驟中使用克隆載體質粒生成最終轉基因產物的方法。質粒克隆載體經過改造將載體的最終用戶及其使用方法對DNA片段成分所需的操作量降至最低。使用本發明生成的轉基因可用於具有少許或沒有其它修飾的單一生物體或多種生物體，包括細菌、酵母、小鼠和其它真核細胞。
文檔編號C12P19/34GK1890373SQ200480036792
公開日2007年1月3日 申請日期2004年5月4日 優先權日2003年10月9日
發明者託馬斯·D·裡德 申請人:英特裡克松公司