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鱘魚虹彩病毒TaqMan實時螢光定量PCR試劑盒及應用的製作方法

2023-07-12 01:14:46 2

鱘魚虹彩病毒TaqMan實時螢光定量PCR試劑盒及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了鱘魚虹彩病毒TaqMan實時螢光定量PCR試劑盒及應用,該試劑盒包括無菌雙蒸水、10×Taq反應緩衝液、dNTPs、正向引物5′-TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3′、反向引物5′-AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3′、螢光探針5′-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-3′,螢光探針5′端標記FAM,3′端標記ROX,5U/μL Taq DNA聚合酶,標準陽性模板pMCP。該試劑盒定量準確,檢測速度快,僅1小時,加上DNA提取的製備,共僅需2-3小時;方法易行,操作簡便;可同時進行高通量的樣品檢測,準確率高達98%。
【專利說明】鱘魚虹彩病毒TaqMan實時螢光定量PCR試劑盒及應用

【技術領域】
[0001]本發明屬於鱘魚病害檢測【技術領域】,更具體涉及一種鱘魚虹彩病毒TaqMan實時螢光定量PCR試劑盒,該PCR試劑盒不僅可使用目前存在市場上的所有類型螢光定量PCR儀器,更重要的是能快速地對鱘魚虹彩病毒進行定量檢測。同時還涉及一種鱘魚虹彩病毒TaqMan實時螢光定量PCR試劑盒的用途。
技術背景
[0002]鱘魚隸屬於硬骨魚綱(Osteichthyes)福鰭亞綱(Actinopterygii)軟骨硬鱗總目(Chon drostei)鱘形目(Acipenseriformes),是現存的古老生物種群,廣泛分布於北半球。全世界現有鱘魚2科6屬26種,我國分布有8種,主要分布於長江流域、黑龍江流域和新疆3個區域。隨著鱘魚野生資源的不斷減少,為了保護鱘魚資源,我國水產養殖研究人員和養殖者積極開展鱘魚的人工繁殖和養殖工作,目前國內已開展的養殖品種有中華鱘(Acipenser sinensis Gray)、施氏鱘(A.schrenckii Brandt)、達氏鱘(A.dabryanusDuneril)等,但是隨著鱘魚養殖業的發展,鱘魚的疾病也日漸增多,主要是由細菌和寄生蟲引起[田甜,楊元金,王京樹,張旭.鱘魚病害研究進展[J].湖北農業科學,2012, 51 (3): 559-562.]。國外對鱘魚病毒性疾病的研究相對起步較早,已報導有四種可感染鱘魚並在魚體內分離到的病毒,他們分別是高首鱘虹彩病毒(white sturgeon iridovirus, WSIV),高首鱘皰疫病毒-1, II (white st urgeon herpesviruses-1, II,WSHV-1, II)和伊鋳虹彩病毒(Shovenosesturgeon iridovirus, SSI V)[王獲,劉紅柏,盧影巖,華育平,孫大江.鱘魚病毒性疾病研究進展[J].水產學雜誌,2008,21(2):84-89.],其中WSIV引起的鱘魚病毒性疾病發病率和死亡率最高。隨著鱘魚的人工養殖迅速發展,引種雜交和高密度養殖可能導致國內鱘魚病毒病的爆發,造成巨大經濟損失,有必要建立一種準確、快速、靈敏的檢測方法對其進行監控,保證鱘魚養殖業的健康發展。近年來,實時突光定量PCR(real-time fluorescentquantitative PCR)以其特異性高、靈敏度高、可定量、有效解決PCR汙染問題及自動化程度高等優點,在醫學領域、微生物和動植物疾病檢疫方面得到了廣泛應用。筆者針對鱘魚危害最嚴重的高首鱘虹彩病毒病建立了檢測高首鱘虹彩病毒的實時螢光定量PCR檢測方法,旨在對高首鱘虹彩病毒進行快速定性和定量檢測。而傳統的PCR法約需7個小時左右才能完成。


【發明內容】

[0003]本發明目的是在於提供了一種高首鱘虹彩病毒TaqMan實時螢光定量PCR試劑盒,該PCR試劑盒不僅可使用目前存在市場上的所有類型螢光定量PCR儀器,更重要的是能快速地對高首鱘虹彩病毒進行定量檢測。一次可檢測32-384個樣品,這樣也減少了人力資源的浪費。
[0004]本發明的另一個目的是在於提供了一種高首鱘虹彩病毒TaqMan實時螢光定量PCR檢測試劑盒在高首鱘虹彩病毒病原檢測中的應用,螢光定量PCR方法定量重複性好,定量準確,而且,螢光定量PCR檢測試劑盒對樣品的檢測僅需2-3個小時就能完成,使用該試劑盒可以大大縮短檢測時間。
[0005]為了實現上述的目的,本發明採用以下技術措施:
[0006]一種高首鱘虹彩病毒TaqMan實時螢光定量PCR檢測試劑盒,該試劑盒包括以下組分:
[0007]A).陽性模板 pMCP
[0008]為含有高首鱘虹彩病毒MCP基因519個核苷酸片段(SEQ ID N0.4所示)的pMD19-T載體,即質粒pMCP。該載體可在大腸桿菌E.coli DH5 a中增殖。
[0009]B).螢光定量反應液:
[0010]1XTaq反應緩衝液、dNTPs、正向引物和反向引物、螢光探針、Taq DNA聚合酶、無菌雙蒸水。
[0011]正向引物為5' -TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3';
[0012]反向引物為5' -AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3';
[0013]螢光探針:5'-FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-R0X-3'。
[0014]優選的,突光定量反應的體系為:
[0015]1XTaq 反應緩衝液 2μ 1、2.5mmol/L dNTPs 0.4 μ 1、50 μ mol/L 正向引物和反向弓丨物各0.4μ l、25ymol/L的螢光探針0.4μ l、5U/y I Taq DNA聚合酶(λ 4 μ 1、無菌雙蒸水14 U I,待測樣品2 μ I。
[0016]優選的,陽性模板pMCP轉化大腸桿菌Ε.coli DH5 a增殖後用鹼裂解法提取,經DNA純化試劑盒純化,用分光光度計測A26tl (所測樣品在吸收波長為260nm紫外線照射下的光密度)的定量並稀釋至I X 17Copies/ μ L,-20°C保存。
[0017]在本發明提供高首鱘虹彩病毒快速定量檢測高首鱘虹彩病毒螢光定量PCR試劑盒中,有一條兩端標記有螢光基團的特異性螢光探針,在探針完整時,兩基團在空間結構上距離相互靠近,5'端報告基團產生的螢光因為螢光共振能量轉移(FRET)而被3'端淬滅基團淬滅,故體系中沒有螢光信號的變化。在PCR退火和延伸過程中,探針與模板特異性結合,隨著引物的延伸,Taq DNA聚合酶利用其5' -3'外切活性對探針進行切割釋放出報告基團,這樣破壞了兩基團之間的FRET(螢光共振能量轉移),報告基團所釋放的螢光可以被內置在定量檢測儀內的螢光計檢測,螢光量的增加與PCR產物的積累量呈比例關係。對高首鱘虹彩病毒的定量可通過與標準品的循環域值(Ct, Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中,螢光量的積累超過基底螢光量的循環圈數,Ct值與起始模數呈一定比例關係,Ct值越小,起始模板數越多,相反,Ct值越大,起始模板數越少。利用陽性梯度標準模板的Ct值製成標準曲線,再根據待測樣品的Ct值可準確測出該樣品的起始拷貝數。
[0018]一種高首鱘虹彩病毒TaqMan實時螢光定量PCR檢測試劑盒在製備高首鱘虹彩病毒檢測試劑盒中的應用,其步驟如下:
[0019]A)用標準陽性模板製備陽性標準品,並用紫外分光光度計定量;
[0020]B)用DNA裂解液從待測標本中提取DNA ;
[0021]C)分別取B)步中的DNA和同樣量的系列稀釋的A)步中的陽性標準品加入到含Taq D NA聚合酶和螢光定量反應液的PCR反應體系中用螢光定量檢測儀進行PCR檢測;
[0022]D)通過比較待測樣品和標準品的循環域值而對待測樣品的起始拷貝數進行定量。
[0023]在本發明中提供的高首鱘虹彩病毒快速定量檢測高首鱘虹彩病毒螢光定量PCR試劑盒可對高首鱘虹彩病毒進行定量檢測,並可替代一直沿用的傳統的PCR檢測方法。
[0024]本發明與現有技術相比具有以下優點和效果:
[0025]1、定量準確;準確性好,標準偏差為0.1,變異係數為0.52% ;最低可檢測到10個病毒核酸分子拷貝數,特異性好。
[0026]2、檢測速度快,僅I小時,加上DNA提取的製備,共僅需2_3小時;
[0027]3、方法易行,操作簡便;
[0028]4、可同時進行高通量的樣品檢測,準確率高達98%。
[0029]5.在本發明提供檢測高首鱘虹彩病毒螢光定量PCR試劑盒中,針對高首鱘虹彩病毒檢測中的特殊性,對不同的靶片段進行反應體系,如引物和探針濃度、退火溫度等的優化,並將FQ-PCR技術(螢光定量PCR技術)和定量檢測系統相結合,將其用於高首鱘虹彩病毒定量檢測。通過優化方案,反覆實驗,建立了檢測高首鱘虹彩病毒螢光定量PCR方法,並研製出檢測高首鱘虹彩病毒螢光定量PCR試劑盒,該試劑盒的靈敏度可在每個反應體系中檢出10拷貝數,完全可以滿足快速鑑別診斷高首鱘虹彩病毒的要求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為高首鱘虹彩病毒實時螢光定量PCR檢測標準曲線圖。
[0031]結果:拷貝數(X)與Ct的關係為:Ct = -3.2591gX+38.137 ;相關係數(R2)達到
0.9933,斜率為-3.259 ;
[0032]圖2為施氏鱘脾臟組織細胞出現病變的核酸提取物的擴增曲線圖。
[0033]結果:為陽性;

【具體實施方式】
[0034]下面結合具體實施例,進一步闡述本發明。應當理解,這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明要求保護的範圍,下列實施例中未註明具體實驗條件和方法,通常按照常規條件如:J.薩姆布魯克等主編,科學出版社,1992,分子克隆實驗指南(第二版);D.L.斯佩克特等,科學出版社,2001,細胞實驗指南;呂鴻聲,科學出版社,1982,或接照製造廠商所建議的條件。
[0035]實施例1:
[0036]高首鱘虹彩病毒螢光定量PCR試劑盒組成:
[0037]A).陽性模板 pMCP
[0038]為含有高首鱘虹彩病毒MCP基因519個核苷酸片段(SEQ ID N0.4所示)的pMD19-T載體。
[0039]B).螢光定量反應液:
[0040]1XTaq反應緩衝液、2.5mmol/L dNTPs、50 μ mol/L正向引物和反向引物、25 μ mol/L突光探針、5U/μ L Taq DNA聚合酶、無菌雙蒸水。
[0041]正向引物為5' -TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3';
[0042]反向引物為5' -AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3';
[0043]螢光探針:5'-FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-R0X-3'。
[0044]自備試劑:20% PEG、蛋白酶K(5?lOmg/ml)、酚:氯仿(體積比1:1)、3mol/L醋酸鈉、70%乙醇、無水乙醇。
[0045]用於以下實施例。
[0046]實施例2:
[0047]高首鱘虹彩病毒螢光定量PCR試劑盒標準曲線的建立。
[0048]A).模板製備:
[0049]將含有高首鱘虹彩病毒MCP基因519個核苷酸片段(SEQ ID N0.4所示)連接入PMD19-T載體,陽性質粒pMCP轉化大腸桿菌DH5 α增殖後用鹼裂解法提取,經DNA純化試劑盒純化,用分光光度計測定陽性重組質粒濃度為450 μ g/mL, A260/A280值為1.88。
[0050]並根據以下方法計算重組質粒的DNA拷貝數。
[0051]分子拷貝數(copies/μ L) = DNA質量濃度/DNA分子量,其中:DNA質量濃度=260nm吸光度X稀釋倍數X 6.02 X 123 ;DNA分子量=DNA鹼基數X 324.5。
[0052]B).標準曲線製備
[0053]將陽性質粒pMCP 進行 10 倍梯度稀釋,以 1X107、1X106、1X105、1X104、1X103、I X 102、I X 1copies/ μ L作為標準品模板,建立標準曲線。
[0054]分別取不同稀釋梯度的重組質粒2 μ L,依次加入10 X Taq反應緩衝液2 μ L、2.5mmol/LdNTPs 0.4 μ L、50 μ mol/L正向引物和反向引物各0.4 μ L、25 μ mol/L螢光探針引物0.4μ L、5U/y L Taq DNA聚合酶0.4 μ L,無菌雙蒸水14 μ 1,反應總體系為20 μ I。將上述反應體系混勻後進行PCR擴增,反應參數:95°C 1min ;95°C 10s,64°C 45s,共40個循環每個稀釋度設3個重複。
[0055]據質粒拷貝數與Ct值的相關性,分析得到標準曲線(圖1)。橫坐標代表質粒模板拷貝數(X),縱坐標為Ct值,拷貝數(X)與Ct的關係為:Ct = -3.2591gX+38.137 ;相關係數 R2 = 0.9933。
[0056]通過對重組質粒各稀釋度核樣品進行螢光定量PCR檢測。結果顯示,本方法對重組質粒進行擴增最低可檢測到10個病毒核酸分子拷貝數。對同一陽性樣品在同一次試驗間獲得的Ct值進行分析,以檢驗檢驗建立的實時螢光定量PCR法穩定性和重複性,結果表明,同一次試驗內72個平行樣的擴增曲線在閾值線附近基本重合,Ct值讀數範圍為18.82?19.22,標準偏差為0.1,變異係數為0.52% ;統計結果表明,本發明所建立的高首鱘虹彩病毒實時螢光定量PCR檢測方法重複性好,可進行穩定、可靠的檢測。
[0057]實施例3:
[0058]特異性檢測:
[0059]以高首鱘虹彩病毒、高首鱘皰疹病毒-1,I1、鏟鱘虹彩病毒和施氏鱘脾臟組織細胞的基因組總DNA為模板,進行實時螢光定量PCR特異性檢測。
[0060]結果表明,高首鱘虹彩病毒總DNA模板有典型擴增曲線,螢光信號值高,檢測結果為陽性。該樣品的對照組高首鱘皰疹病毒-1,I1、鏟鱘虹彩病毒和施氏鱘脾臟組織細胞的基因組總DNA無特異性擴增信號。
[0061]實施例4:
[0062]一種高首鱘虹彩病毒TaqMan實時螢光定量PCR檢測試劑盒在製備高首鱘虹彩病毒檢測試劑盒中的應用,其步驟如下:
[0063]樣品:接種高首鱘虹彩病毒(WHITE STURGEON IRIDOVIRUS, WSIV),出現病變的施氏鱘脾臟組織細胞。
[0064]1.高首鱘虹彩病毒螢光定量PCR試劑盒組成與配製,
[0065]試劑組成:
[0066]a).DNA 提取試劑:20% PEG、蛋白酶 K(5_10mg/ml)、酚:氯仿(體積比 1:l)、3mol/L醋酸鈉、70%乙醇、無水乙醇。
[0067]b).標準陽性模板pMCP,為含有高首鱘虹彩病毒MCP基因519個核苷酸片段(SEQID N0.4所示)的pMD19-T載體。
[0068]c).螢光定量反應液體系:PCR 1Xbuffer 2 μ 1,正向引物和反向引物各
0.4μ l(50ym ol/L),螢光探針 0.4μ I (25 μ mol/L),dNTPs 0.4 μ I (lOmmol/L), Taq DNA 聚合酶0.4μ 1(5υ/μ 1),無菌雙蒸水14μ I。
[0069]正向引物為5' -TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3';
[0070]反向引物為5' -AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3';
[0071]螢光探針:5'-FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-R0X-3'。
[0072]2.用高首鱘虹彩病毒快速定量檢測的螢光定量PCR試劑盒檢測高首鱘虹彩病毒樣品
[0073]Α)取高首鱘虹彩病毒接種施氏鱘脾臟組織細胞出現病變以後於-80°C至室溫條件反覆凍融三次,4000r離心30min,取上清轉移至35mL超速離心管中,20000r離心2h,用750 μ I水懸浮病毒沉澱,加入等體積預冷的20% PEG 8000,反覆顛倒數次,室溫放置30min ;室溫12000r/min離心5min,棄去上清;加入100 μ I滅菌水,重懸病毒粒子,加入?ομ I蛋白酶K(5-10mg/ml),50°C溫浴Ih ;加入等體積的酚:氯仿(I:1)抽提,室溫12000r/min離心5min,取上清至另一離心管;加入加1/10體積的3mol/L醋酸鈉(pH5.2)和2倍體積冰預冷的無水乙醇,_20°C放置20min ;4°C 12000r/min離心15min,棄上清;加入500 μ I70%乙醇,12000r/min離心5min,棄掉上清,並揮發去乙醇,沉澱用20ul滅菌雙蒸水溶解備用。.
[0074]B)將陽性標準模板(試劑b)系列稀釋為1X107、1X106、1X105、1X104、1X103、I X102、I XlOcopies/μ L,建立標準曲線。
[0075]C)分別取螢光定量PCR反應液(試劑c)各18 μ 1,取第Α)步所得DNA和第B)步稀釋的陽性標準模板各2 μ 1,反應總體系為20 μ 1,並設陰性對照,分別加入不同的PCR反應管,在螢光定量檢測儀上平行做PCR檢測。循環條件為:95°C預變1min ;94V 10s,64V 45s,擴增40個循環。把螢光檢測的程序設置在每個循環的第二步結束時進行,檢測波長為530nm。循環結束後,運用儀器自帶軟體,對樣本進行分析,結果如下:
[0076]該樣品為陽性(圖2實驗組)。Ct值為:22.46,根據標準曲線計算出樣品中病毒核酸量約為 14 81Copies/μ L DNA0
【權利要求】
1.一種高首鱘虹彩病毒TaqMan實時螢光定量PCR試劑盒,其特徵在於: 正向引物為 5' -TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3'; 反向引物為 5' -AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3'; 螢光探針:5' -FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-R0X-3'。
2.根據權利要求1所述的試劑盒,其特徵在於: A).陽性模板pMCP 為含有SEQ ID N0.4所示核苷酸的pMD19-T載體; B).螢光定量反應液: 1 X Taq反應緩衝液、dNTPs、正向引物和反向引物、螢光探針、Taq DNA聚合酶、無菌雙蒸水。 正向引物為 5' -TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3'; 反向引物為 5' -AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3'; 螢光探針:5' -FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-R0X-3'。
3.根據權利要求1所述的試劑盒,其特徵在於:該試劑盒用於高首鱘虹彩病毒TaqMan實時螢光定量PCR的體系如下: 1XTaq反應緩衝液2μ L、2.5mmol/L dNTPs 0.4 μ L、50 μ mol/L正向引物和反向弓丨物各0.4 4 1^、25 4 11101/1的螢光探針0.4 4 1、5~4 1 Taq DNA聚合酶0.4 μ 1、無菌雙蒸水14 U I,待測樣品2 μ I。
4.權利要求1?3所述的任何一個試劑盒在在製備高首鱘虹彩病毒檢測試劑盒中的應用。
【文檔編號】C12R1/93GK104328219SQ201410617814
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月4日 優先權日:2014年11月4日
【發明者】周勇, 曾令兵, 孫愛義, 解旭東, 範玉頂, 徐進, 馬傑 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所, 鎮江水中仙漁業發展有限公司

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