一種應用噬菌體展示文庫篩選鑑定單克隆抗體的方法
2023-08-11 05:43:01 2
專利名稱：一種應用噬菌體展示文庫篩選鑑定單克隆抗體的方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，具體涉及一種應用噬菌體展示文庫篩選 鑑定單克隆抗體的方法。
技術背景傳統的單克隆抗體開發路線是從獲得單一的純化抗原開始，經過免疫 等過程得到針對此抗原的單克隆抗體，這樣得到的單克隆抗體並不能知道 其所針對的抗原的表位(抗原決定基)。而要想得到明確抗原決定基的抗 體，傳統路線只能通過化學合成小片段多肽，並經化學偶聯載體後進行動物免疫製得。這種方法只能一次製備一種抗體。如CN03131796.0號專利文獻公開了一種禾,噬菌體展示技術展示抗原製備抗體的方法。該方法是 將已知抗原的基因插入噬菌體基因內，然後展示在噬菌體表面，構建噬菌 體抗原庫，將此融合噬菌體顆粒作為免疫原進行動物免疫，製備抗體，是 針對cTnl蛋白的抗體。這種方法有一定的難度和複雜性，需要進行基因 工程的操作，抗原不是天然的混合抗原(如完整細胞)，不能在一次免疫 得到的大量單克隆抗體後進行的抗原篩選鑑定。 發明內容本發明的目的是提供一種可以快速開發出數百種單克隆抗體並確定 它們各自針對的抗原決定基的應用噬菌體展示文庫篩選鑑定單克隆抗體 的方法。本發明方法包括以下步驟 一、應用混合抗原免疫動物；
二、 按常規方法製備雜交瘤細胞；三、 應用噬菌體文庫進行篩選將雜交瘤分泌的抗體包被在ELISA 板上，加入噬菌體文庫，洗掉不能結合的噬菌體；四、 鑑定特異性噬菌體將結合的特異性噬菌體洗脫，並感染細菌， 放大和提取菌體裡面的含有外源基因片段的載體，通過DNA序列分析鑑定 出該抗體針對的抗原。所述方法中步驟一進一步是指，混合抗原採用細胞，培養細胞到濃度為1 X 1(T7 X107mL，用注射法進行動物免疫；最好採用消減免疫法進行動物免疫， 將正常細胞免疫動物，之後注射免疫抑制劑(如環磷醯胺)，之後再將另一種細胞(如腫瘤細胞)免疫同只動物。步驟二進一步是指，取免疫動物脾細胞，製備成單細胞與事先培養好 的骨髓瘤細胞融合，篩選、克隆化雜交瘤細胞。步驟三進一步是指，將雜交瘤細胞分泌的上清包被在96孔板中，加 入文庫進行篩選(一) 淘選每個事先包被了抗體的孔內加入一份原始文庫，孵育，移去用畢的文 庫，加入洗滌液洗滌；(二) 回收吸附的噬菌體每孔中加入TG1細胞懸液，孵育後，立即置冰上，收集細胞；(三) 噬菌體的富集1) 、加入培養基到富集的TG1細胞，振蕩；2) 、加入氨苄後，加入噬菌體M13K07，振蕩；3) 、離心，棄上清；4) 、將細胞重新用加了氨苄和卡那的培養基懸浮，振蕩；5) 、離心，將上清轉移至另一管；6) 、再離心，將上清轉移至另一管；7) 、加入阻斷液，孵育；8) 、加APEG，孵育以沉澱噬菌體；9) 、再離心，棄上清，沉澱用緩衝液再懸浮，離心，收集上清；(四)為ELISA篩選製備噬菌體克隆1) 、挑取上述分離好的單克隆於標記有"PCl+克隆號"的離心管內，加入培養基，振蕩，即為PC1;2) 、將PC1培養物轉移到標記有"PC2+克隆號"的管中，加入含有輔 助噬菌體M13K07的培養基，振蕩；3) 、離心，棄上清，用培養基重懸浮細胞，振蕩，即為超感染的單個噬菌體克隆PC2;4) 、純化噬菌體克隆a、 離心，轉移上清到標記有"PC3+克隆號"的管中，加入阻斷液， 培養；b、 加APEG，培養；c、 離心，棄上清，用緩衝液懸浮細胞。這就是純化後的噬菌體克隆，即PC3;最好(一)至(三)反覆進行3至4次。步驟四進一步是指，鑑定特異性抗原，包括(一)ELISA篩選1) 、加PC3噬菌體至抱被了抗體的ELISA板孔中，孵育；2) 、移掉噬菌體懸液，用洗滌液洗，每孔加pVIII抗體，孵育後，移
除，洗滌；3) 、每孔中加入標記的二抗，孵育後，移除二抗，洗滌；4) 、每孔加入顯色劑，孵育直到變色；5) 、每孔中加入終止液停止顯色反應，讀取吸光率；6) 、根據ELISA的結果，選出PC1或PC3克隆；(二)分析陽性克隆1) 、消除非特異性克隆；2) 、陽性PC1克隆中在氨苄培養基中培養，分離提取出重組質粒；3) 、用提供的引物對分離出的質粒進行測序。 本發明中的抗體生產路線，是先用完整的正常細胞作為抗原進行動物免疫，然後用免疫抑制劑封閉動物對正常細胞抗原的記憶後，再用完整的 腫瘤細胞作為抗原免疫相同動物，這隻動物只會產生針對腫瘤細胞抗原的 免疫反應，而對正常細胞的抗原不產生反應。接下來的幾個步驟與常規 方法一樣，分離脾單細胞，與骨髓瘤細胞進行融合，篩選、克隆化雜交瘤 細胞等。這樣獲得的雜交瘤細胞都可以分泌出針對該腫瘤細胞的抗體，而 且一次性可以獲得大量的細胞株，成為混合雜交瘤細胞克隆庫。 這些可以分泌特異性抗體的細胞株分泌出來的抗體可與腫瘤細胞發生免 疫反應，接下來要用人類cDNA / EST噬菌體表面展示文庫(文庫早已建成) 鑑定這些單克隆抗體是針對哪個抗原決定基的。人類cDNA/EST噬菌體表面展現文庫中含有各種不同的人類EST表現型噬 菌體，不同噬菌體上的人類蛋白質片段也不同，每種蛋白可以就是一種人 類抗原。將製備出的抗體結合在ELISA板上，加入噬菌體文庫，抗體可以 和其對應的表達在噬菌體外的人類蛋白質片段結合，而不能結合的噬菌體 被洗掉。洗脫結合的噬菌體，並感染細菌，放大和提取菌體裡面的含有人
類蛋白質片段的載體，通過DNA序列分析就可以得知是什麼人類蛋白質， 也就鑑定出了該抗體針對的抗原。本方法中的噬菌體包括但不限於M13 絲狀噬菌體，如還包括fd、 fl、 T7、 T4和Lambda噬菌體等，噬菌體 展示文庫不限於人類cDNA文庫，還包括鼠組織cDNA文庫(製備鼠抗體)等。
應用人類cDNA/EST噬菌體表面展現文庫技術對大量的融合雜交瘤細 胞分泌的單克隆抗體進行篩選鑑定，可以極大地縮短抗體從研發到生產制 備的時間，迅速製備出大量抗人類腫瘤細胞的單克隆抗體，從而改變傳統 抗體生產的方式，顯著提高生產效率。傳統方法製備一種單抗，從免疫開 始需要3-4個月，加上克隆、轉化、表達、純化、偶聯抗原等的前期準備 時間，能否成功更是不可預計。隨著製備抗體種類的增加，所用的動物數 量和工作量就會線性擴大；而該發明中的方法則在幾乎相同的時間內，僅 用一隻動物(理論上)進行免疫，就可得到數百種單抗，生產效率大大提 高。
大量抗人類腫瘤細胞的單克隆抗體的面市，將會為臨床腫瘤病理檢測 試劑與試劑盒、單克隆抗體腫瘤治療藥物等的研發提供豐富原料。 下面通過實施例進一步說明本發明方法。
具體實施方式
實施例1本發明方法採用以下步驟一、 以細胞作為抗原進行動物免疫 將細胞作為免疫原進行小鼠免疫，每隻小鼠注射0.3mL濃度為IX1(T7X10VraL細胞懸液。二、 製備雜交瘤
取免疫小鼠脾，製備成脾單細胞，與SP2/0骨髓瘤細胞融合，用HAT 培養基篩選出陽性克隆，每個陽性克隆進行克隆化，得到雜交瘤單克隆細 胞株。
三、應用噬菌體文庫進行篩選
(一) 、淘選1 、將噬菌體文庫等分加入到事先包被了雜交瘤細胞株分泌的抗體的 96孔板中。2、 第一輪淘選，用一份109個克隆的原始文庫，加入到l個孔內(lcm3 ) 進行淘選，通常足夠識別中等豐度或極低豐度的cDNA。3、 37"C孵育1小時，也可以25'C或4"C孵育最長4小時。4、 移去用畢的文庫，每孔加入約200 u l洗滌液，洗滌5至20次。
(二) 、回收吸附的噬菌體1、 孔中加入預冷的TGl細胞懸液O. lml2、 37。C孵育30分鐘，立即置冰上或4。C,收集細胞3、 將富集的TG1細胞移至乾淨的小離心管內，4X:可以保存3天，或者 加入終濃度15%的無菌甘油，-70。C可以保存l年。
(三) 、噬菌體的富集1、 加入2XYT/甘油培養基lm到501ul富集TGl細胞，37°C， 250rpm 搖l小時2、 加入終濃度100ug/ml的氨苄3、 立即加入5X10Vfu的輔助噬菌體M13K07 (約O. lml)到培養基中， 37°C， 250rpm搖l小時4、 2,000 x g 4。C或室溫離心10分鐘，棄上清5、 將細胞重新用加了氨苄和卡那的2XYT培養基懸浮，37°C， 250rpm
搖過夜6、 10， 000 x g4。C離心20分鐘，將上清轉移至另一管。7、 10， 000 x g化再離心10分鐘，將上清轉移至一無菌的聚丙烯管中。8、 加入10ml阻斷液到10ml富集的噬菌體庫中，4"C孵育10分鐘9、 加入4ml20y。PEG， 4。C孵育30分鐘以沉澱噬菌體10、 10， 000 x g4。C再離心20分鐘，棄上清，沉澱用lml PBS再懸浮， 轉移至一隻無菌小離心管中，14,000 rpm 4"C離心10分鐘。11、 收集上清，這就是富集後的噬菌體文庫。 如此重複4遍淘選。(四)、為ELISA篩選製備噬菌體克隆 1 、在預先標記好的l. 5ml離心管內加入400 u 12 X YT氨苄葡萄糖培養 基，標記為PCl+該克隆的數字。2、 用無菌的吸頭挑取44-88個分離好的單克隆，分別培養於小管中， 37°C 250rpm搖過夜，這就是TG1裡的單克隆噬菌體，叫做PC13、 將培養過夜的PCl培養物50u l轉移到標記著PC2+克隆號的管中。4、 加入400u 12XYT氨苄葡萄糖培養基到PC2管中，其中含有5x 108pfu 輔助噬菌體M13K07 (約10iU) ， 37°C200-250rpm搖l-2小時5、 25。C14000rpm離心5分鐘6 、棄上清。用2 X YT/氨苄/卡那培養基400 " 1重懸浮細胞。37。C250rpm 搖過夜。這些雙重感染的單個噬菌體克隆就是PC2 7、純化噬菌體克隆a) 25 。C 14000ipm離心5分鐘b) 轉移300u l上清到標記了PC3+克隆號的小管中c) 加入300ul阻斷液，4。C培養10分鐘d) 加入120 u 12(Fo無謝EG， 4"C培養30分鐘e) 4。C10，000xg離心20分鐘f) 棄上清，用100yl PBS懸浮細胞。這就是純化後的噬菌體克隆， 叫做PC3。四、鑑定特異性抗原(一) 、ELISA篩選1、 加50ulPC3噬菌體到包被了抗體的ELISA板孔中，25。C孵育2小時。2、 移掉噬菌體懸液，用洗滌液洗3次，每次200ul。3、 用阻斷液l:50稀PpVIII抗體，每孔加50ul， 25。C孵育l小時，移 除一抗。4、 用洗滌液洗三次，每次200ul5、 用阻斷液1:50稀釋HRP標記的二抗，每孔中加入50ul， 25'C孵育1小時6、 移除二抗，用洗滌液洗三次，每次200ul7、 每孑L加入50ulTMB， 25r孵育直到出現穩定的藍色。8、 每孔中加入10ul鵬S04停止顯色反應，藍色 L會變成黃色，讀405 或410nm的吸光率。9、 根據ELISA的結果，選出PC1或PC3克隆，保留所有的陽性克隆和少 量陰性克隆做後續實驗的對照。(二) 、分析陽性克隆1、 消除非特異性克隆2、 陽性PCl克隆中在2xYT/氨苄培養基中培養，分離提取出重組質粒3、 用提供的引物對分離出的質粒進行測序 實施例2 本方法的應用混合抗原免疫動物步驟中採用消減免疫法進行動物免 疫，將正常細胞免疫動物，之後注射環磷醯胺，之後再將另一種腫瘤細胞 免疫同只動物。其餘與實施例1相同實施例3本方法的應用噬菌體文庫進行篩選步驟中，(一)淘選、(二)回收吸附的噬菌體、(三)噬菌體的富集反覆4次，其餘與實施例l相同。
權利要求
1、一種應用噬菌體展示文庫篩選鑑定單克隆抗體的方法，其特徵是包括以下步驟一、應用混合抗原免疫動物；二、按常規方法製備雜交瘤細胞；三、應用噬菌體文庫進行篩選將雜交瘤分泌的抗體包被在ELISA板上，加入噬菌體文庫，洗掉不能結合的噬菌體；四、鑑定特異性噬菌體將結合的特異性噬菌體洗脫，並感染細菌，放大和提取菌體裡面的含有外源基因片段的載體，通過DNA序列分析鑑定出該抗體針對的抗原。
2、 根據權利要求1所述的應用噬菌體展示文庫篩選鑑定單克隆抗體的方法，其特徵是步驟一所述的應用混合抗原免疫動物是指混合抗原採 用細胞，培養細胞到濃度為lXl(T7X107mL，用注射法進行動物免疫。
3、 根據權利要求1所述的應用噬菌體展示文庫篩選鑑定單克隆抗體 的方法，其特徵是步驟二所述的按常規方法製備雜交瘤細胞是指取免疫動物脾細胞，製備成單細胞與事先培養好的骨髓瘤細胞融合，篩選、克隆 化雜交瘤細胞。
4、 根據權利要求1所述的應用噬菌體展示文庫篩選鑑定單克隆抗體 的方法，其特徵是步驟三所述的應用噬菌體文庫進行篩選是指將雜交瘤 細胞分泌的上清包被在96孔板中，加入文庫進行篩選，包括(一) 淘選每個事先包被了抗體的孔內加入一份原始文庫，孵育，移去用畢的文庫，加入洗滌液洗滌；(二) 回收吸附的噬菌體 每孔中加入TG1細胞懸液，孵育後，立即置冰上，收集細胞; (三)噬菌體的富集1)、加入培養基到富集的TG1細胞，振蕩；2)、加入氨苄後，加入噬菌體M13K07，振蕩；3)、離心，棄上清；4)、將細胞重新用加了氨苄和卡那的培養基懸浮，振蕩；5)、離心，將上清轉移至另一管；6)、再離心，將上清轉移至另一管；7)、加入阻斷液，孵育；8)、加APEG，孵育以沉澱噬菌體；9)、再離心，棄上清，沉澱用緩衝液再懸浮，離心，收集上清;(四)為ELISA篩選製備噬菌體克隆1) 、挑取上述分離好的單克隆於標記有"PCl+克隆號"的離心管內， 加入培養基，振蕩，即為PC1;2) 、將PC1培養物轉移到標記有"PC2+克隆號"的管中，加入含有輔 助噬菌體M13K07的培養基，振蕩；3) 、離心，棄上清，用培養基重懸浮細胞，振蕩，即為超感染的單個 噬菌體克隆PC2;4) 、純化噬菌體克隆a、 離心，轉移上清到標記有"PC3+克隆號"的管中，加入阻斷液， 培養；b、 加入PEG，培養；c、 離心，棄上清，用緩衝液懸浮細胞。這就是純化後的噬菌體克 隆，即PC3。
5、 根據權利要求1所述的應用噬菌體展示文庫篩選鑑定單克隆抗體 的方法，其特徵是步驟三所述的鑑定特異性噬菌體是指:鑑定特異性抗原， 包括(一) ELISA篩選1) 、加PC3噬菌體到包被了抗體的ELISA板孔中，孵育；2) 、移掉噬菌體懸液，用洗滌液洗，每 L加pVin抗體，孵育後，移 除，洗滌；3) 、每孔中加入^i己的二抗，孵育後，移除二抗，洗滌；4) 、每 L加入顯色劑，孵育直到變色；5) 、每孔中加入終止液停止顯色反應，讀取吸光率；6) 、根據ELISA的結果，選出PC1或PC3克隆；(二) 分析陽性克隆1) 、消除非特異性克隆；2) 、陽性PC1克隆中在氨苄培養基中培養，分離提取出重組質粒；3) 、用提供的引物對分離出的質粒進行測序。
6、 根據權利要求2所述的應用噬菌體展示文庫篩選鑑定單克隆抗體 的方法，其特徵是應用混合抗原免疫動物採用消減免疫法進行動物免疫， 將正常細胞免疫動物，之後注射環磷翻安，之後再將另一種細胞免疫同只 動物。
7、 根據權利要求l所述的應用噬菌體展示文庫篩選鑑定單克隆抗體的 方法，其特徵是應用噬菌體文庫進行篩選中的(一)至(三)步驟反覆進 行3至4次。
全文摘要
本發明公開了一種應用噬菌體展示文庫篩選鑑定單克隆抗體的方法。包括以下步驟一、應用混合抗原免疫動物；二、按常規方法製備雜交瘤細胞；三、應用噬菌體文庫進行篩選將雜交瘤分泌的抗體包被在ELISA板上，加入噬菌體文庫，洗掉不能結合的噬菌體；四、鑑定特異性噬菌體將結合的特異性噬菌體洗脫，並感染細菌，放大和提取菌體裡面的含有外源基因片段的載體，通過DNA序列分析鑑定出該抗體針對的抗原。應用人類cDNA/EST噬菌體表面展現文庫技術對大量的融合雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體進行篩選鑑定，可以極大地縮短抗體從研發到生產製備的時間，迅速製備出大量抗人類腫瘤細胞的單克隆抗體，從而改變傳統抗體生產的方式，顯著提高生產效率。
文檔編號C12Q1/68GK101126175SQ20061003208
公開日2008年2月20日 申請日期2006年8月14日 優先權日2006年8月14日
發明者彭早元 申請人:長沙三創生物技術有限公司