Rna展示的改良方法

2023-07-06 17:10:36 1

專利名稱：Rna展示的改良方法
技術領域：
本公開內容涉及RNA展示，且具體涉及允許選擇可溶性和細胞表面抗原的RNA展示方法。
背景技術：
可以選擇以高特異性和親和力與幾乎任何結構表位結合的抗體且將其常規用作研究工具和FDA批准的治療劑。因此，治療用和診斷用單克隆抗體構成全世界數十億美元的市場。使動物免疫接種以獲得抗體的傳統方法是緩慢且麻煩的。因此，已開發了使用合成抗體文庫用於先體外後體內選擇針對所需靶分子的抗體的方法。在一些方法中，抗體或其片段的文庫展示在生物的表面上，(例如，噬菌體、病毒、酵母細胞、細菌細胞或哺乳動物細胞)，並且就所需抗體的表達選擇生物。在其他方法中，在無細胞體外系統中表達且選擇抗體文庫。在稱為RNA展示的一個此種系統中，所表達的蛋白質或肽與其編碼mRNA共價或通過緊密的非共價相互作用連接，以形成RNA/蛋白質融合分子。可以就與所需靶的結合選擇RNA/蛋白質融合物的蛋白質或肽組分，並且通過測序所附著的編碼mRNA組分來測定蛋白質或肽的特性。目前的體外RNA展示系統儘管善於表達單個抗體可變結構域，但在表達多結構域抗體例如單鏈抗體(scFv)分子方面無效。這主要是由於目前的體外表達系統的反應條件和通過經由PCR的反覆擴增喪失來自文庫的全長scFv cDNA的趨勢。因此，本領域需要改良的體外展示方法用於選擇針對所需靶的scFv抗體。發明概述
本發明通過提供改良的體外RNA展示方法解決了前述問題，以允許從表達文庫中可靠表達和選擇scFv分子。儘管特別適合於表達和選擇scFv分子，但本發明的方法對於所有類別蛋白質的體外展示也是有利的，包括可溶性和細胞表面抗原。因此，本發明具有幾個優點，這包括但不限於提供改良的體外RNA展示方法，其執行比先前描述的方法更簡單且更不耗時。此外，本發明的方法允許含鏈內二硫鍵的蛋白質例如scFv抗體分子增強的功能表達。在一個方面，本發明提供了篩選scFv抗體RNA展示文庫的方法，該方法包括步驟 (a)提供嘌呤黴素或其類似物交聯的scFv mRNA分子，所述分子包括編碼5』 scFv和3』間隔區序列的mRNA，所述分子與單鏈核酸接頭交聯，所述接頭包括在3』末端上的嘌呤黴素或其類似物和在5』末端上的補骨脂素C6 ;(b)在標記的存在下，在GSSG(氧化穀胱甘肽)/GSH (還原穀胱甘肽)和PDI (蛋白質二硫鍵異構酶)的存在下和在不存在二硫蘇糖醇的情況下， 在使得形成標記的嘌呤黴素交聯的scFv mRNA/蛋白質分子的條件下，體外翻譯嘌呤黴素交聯的scFv mRNA ； (c)純化標記的嘌呤黴素交聯的scFv mRNA/蛋白質分子；(d)用至少一種抗原對純化的標記的嘌呤黴素交聯的scFv mRNA/蛋白質分子實施抗原選擇；和(e)使用基於親和力的磁珠回收純化的標記的嘌呤黴素交聯的scFv mRNA/蛋白質分子。在一個實施方案中，該方法進一步包括步驟(g)在抗原選擇後使scFv mRNA逆轉錄，以製備cDNA。在另一個實施方案中，該方法進一步包括步驟(h)擴增cDNA。在一個實施方案中，標記是放射性標記，例如mS甲硫氨酸或半胱氨酸。在一個實施方案中，3』間隔區序列包括約0 -約200個胺基酸，例如約16個胺基酸，和/或3』間隔區包括親和標記。在一個實施方案中，接頭從5』到3』包括補骨脂素C6、包括序列UAGCGGAUGC(SEQ ID NO 20)的2』 OMe核糖核苷酸、6個三甘醇或PEG-150部分、2個胞苷殘基和嘌呤黴素。在一個實施方案中，scFv mRNA分子通過UVA與DNA接頭光交聯。在另一個實施方案中，scFv mRNA分子包括選自T7、SP6和T3的5』啟動子。在具體實施方案中，scFv mRNA 分子包括菸草花葉病毒5』非翻譯區。在一個實施方案中，通過寡脫氧胸苷酸層析純化標記的嘌呤黴素交聯的scFv mRNA/蛋白質分子。在另一個實施方案中，使用抗FLAG M2單克隆抗體瓊脂糖珠純化標記的嘌呤黴素交聯的scFv mRNA/蛋白質分子。在另外一個實施方案中，通過寡脫氧胸苷酸層析和抗FLAG M2單克隆抗體瓊脂糖珠純化標記的嘌呤黴素交聯的scFv mRNA/蛋白質分子。在一個實施方案中，抗原是生物素化肽、蛋白質或半抗原。在另一個實施方案中， 抗原是具有人免疫球蛋白可結晶片段(Fe)或具有鼠免疫球蛋白可結晶片段(Fe)的融合蛋白，或抗原是細胞群體。在具體實施方案中，根據本發明的抗體是抗IL-12抗體、抗血凝素 (抗HA)抗體、鼠抗體或人抗體。在一個實施方案中，在GSSH/GSH的存在下執行嘌呤黴素交聯的scFv mRNA的體外翻譯。在一個實施方案中，該方法不包括mRNA加帽步驟。在另一個實施方案中，該方法不包括在純化步驟前的體外逆轉錄步驟。在另外一個實施方案中，在步驟(a)到(g)中的任何一個之前、期間或之後添加RNA酶抑制劑。在一個實施方案中，純化步驟包括在不存在二硫蘇糖醇(DTT)的情況下的mRNA逆轉錄，以產生cDNA。在特定實施方案中，通過在約pH=8.0 -約pH=10. 0的鹼水解洗脫cDNA。可替代地，通過足以使DNA:RNA雜交物(hybrids)變性的熱、通過在約pH=3. 0 -約pH=6. 0的酸、 或通過RNA酶H消化洗脫cDNA。在一個實施方案中，通過聚合酶鏈反應擴增cDNA。在一個實施方案中，聚合酶鏈反應採用熱穩定的DNA聚合酶或選自Platinum HiFi和KOD的DNA聚合酶。在另一個實施方案中，珠選自鏈黴抗生物素蛋白_iC80、中性抗生物素蛋白 (neutravidin) H\C80、SA-M270、NA-M270、SA-MyOne、NA-MyOne、SA-瓊脂糖、和 NA-瓊脂糖。本發明的其他特徵和優點根據下述詳述和權利要求將是顯而易見的。附圖簡述
激7描述了在本發明的一些實施方案中關於mRNA-scFv展示技術的一般方案。激描述了在本發明的其他實施方案中關於mRNA-scFv展示技術的一般方案。圖3描述了文庫DNA構建體的一般描述。
圖4a描述了顯示功能性scFv可以作為mRNA-scFv分子生成的結果。圖4b描述了游離scFv分子和mRNA-scFv分子的模型。激5描述了顯示在mRNA-scFv分子形式中附著的scFv在功能上等價於游離scFv 分子的結果。激6描述了具有不同3』間隔區長度的3種D2E7 mRNA-scFv構建體。激7描述了顯示較短的間隔區長度改善mRNA-scFv與抗原的結合和mRNA-scFv抗體分子得率的結果。激S描述了 D2E7短、中等和長Ck 3』間隔區的序列(SEQ ID NOS 42-44，分別按出現的次序)。S9a描述了具有短和長間隔區長度的17/9 mRNA-scFv構建體。圖9b描述了顯示較短的間隔區長度改善17/9 mRNA-scFv分子與靶抗原的結合和 mRNA-scFv抗體分子得率的結果。

圖10描述了顯示PDI活性是一些scFv功能所需的結果。圖11描述了顯示在逆轉錄過程中DTT的存在抑制17/9 scFv與血凝素(HA)抗原的結合的結果。圖12描述了顯示DTT不顯著改變逆轉錄過程的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖13描述了在選擇前和後來自具有或不具有DTT和RNaseOUT 的不同RT條件的瓊脂糖凝膠電泳結果。激招描述了顯示與選擇前RT和cDNA的鹼洗脫(左泳道)相比較，在選擇前或後逆轉錄時，Phylos 40 VH序列的回收的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖15描述了顯示在抗原選擇後RNA酶抑制劑保存通過逆轉錄的RNA模板回收的瓊脂糖凝膠電泳結果。厲76描述了在RNaseOUT 的存在或不存在下，CL-長和CL-短間隔區的並排比較結果。 激7 7描述了顯示在RNaseOUT 的存在或不存在下，CL-長和CL-短間隔區回收的並排比較的瓊脂糖凝膠電泳結果。厲7S描述了在一輪mRNA-scFv選擇前和後，定量17/9 scFv的瓊脂糖凝膠電泳結^ ο圖19描述了在D2E7和2SD4之間的嵌合體的一般描述。激^ 描述了在不同嵌合體之間在抗原結合後的回收百分比，從而顯示mRNA展示技術可以用於區別具有不同親和力的結合劑。激湖力描述了在抗原選擇後標準化的回收百分比，從而顯示mRNA展示技術可以用於區別具有不同親和力的結合劑。激描述了 mRNA-scFv分子的熱穩定性。圖22描述了顯示RNA可以在mRNA-scFv分子的高溫處理後回收的瓊脂糖凝膠電泳結果。激恐描述了具有短和長間隔區長度的mRNA-scFv Y61構建體以及在mRNA和scFv 蛋白質之間的DNA接頭上包括聚腺苷酸尾的PF-y61SCGene3構建體。圖24描述了在本發明的其他實施方案中關於mRNA-scFv展示技術的一般方案。
發明詳述
序列標識號
說明書中提及的核苷酸和胺基酸序列已給予下述序列標識號
SEQID NO:]-MAK195 scFv蛋白質序列的胺基酸序列。
SEQIDNO2-Y61 scFv短蛋白質序列的胺基酸序列。
SEQIDNO3-Y61 scFv長蛋白質序列的胺基酸序列。
SEQIDNO4-Y61 scFv Gene3蛋白質序列的胺基酸序列。
SEQIDNO5-D2E7 scFv短蛋白質序列的胺基酸序列。
SEQIDNO6-D2E7 scFv中等蛋白質序列的胺基酸序列。
SEQIDNO7-D2E7 scFv長蛋白質序列的胺基酸序列。
SEQIDNO8-17/9 scFv短蛋白質序列的胺基酸序列。
SEQIDNO9-17/9 scFv長蛋白質序列的胺基酸序列。
SEQIDNO10-MAK195 scFv核苷酸序列的核酸序列。
SEQIDNO11-Y61 scFv短核苷酸序列的核酸序列。
SEQIDNO12-Y61 scFv長核苷酸序列的核酸序列。
SEQIDNO13-Y61 scFv Gene3PA核苷酸序列的核酸序列
SEQIDNO14-Y61 scFv Gene3核苷酸序列的核酸序列。
SEQIDNO15-D2E7 scFv短核苷酸序列的核酸序列。
SEQIDNO16-D2E7 scFv中等核苷酸序列的核酸序列。
SEQIDNO17-D2E7 scFv長核苷酸序列的核酸序列。
SEQIDNO18-17/9 scFv短核苷酸序列的核酸序列。
SEQIDNO19-17/9 scFv長核苷酸序列的核酸序列。為了本發明可以更容易理解，首先定義了特定術語。I.定義
術語「抗體」包括單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、嵌合抗體、CDR嫁接的抗體、人源化抗體、人抗體、鼠抗體及其片段，例如抗體輕鏈(VL)、抗體重鏈(VH)、單鏈抗體(scFv)、F (ab，)2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、和單結構域抗體片段(dAb)。術語「抗體文庫」指包含可讀框(ORF)的多個DNA或RNA分子，所述可讀框編碼抗體或其片段。它還包括由所述DNA或RNA分子表達的多個抗體蛋白質和核酸/抗體融合分子。術語「重鏈可變結構域」指編碼抗體重鏈可變區的核酸和所述核酸的蛋白質產物。術語「輕鏈可變結構域」指編碼抗體輕鏈可變區的核酸和所述核酸的蛋白質產物。術語「附加表位」指由抗體特異性識別的短胺基酸序列，其與分子化學或遺傳地附著，以允許所述分子通過所述抗體的檢測，例如FLAG標記、HA標記、Myc標記或T7標記。術語「非抗體序列」指在本發明的抗體文庫中出現的任何核酸或胺基酸序列，其不是原始抗體序列的部分。此種序列包括例如附加表位。術語「控制序列」指在具體宿主生物或體外表達系統中表達可操作地連接的編碼序列所需的DNA序列或遺傳元件。此種序列是本領域眾所周知的。適合於原核生物的控制序列例如包括啟動子、任選地操縱基因序列和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、 多腺苷酸化信號和增強子。例如，當核酸置於與另一種核酸序列的功能關係內時，它是「可操作地連接的」。例如，啟動子或增強子與編碼序列可操作地連接，如果它影響序列的轉錄的話，或核糖體結合位點與編碼序列可操作地連接，如果它如此放置，以便促進翻譯的話。 一般地，「可操作地連接的」意指被連接的DNA序列是鄰接的。然而，增強子無需是鄰接的。術語「特異性結合」或「與之特異地結合」指結合分子以至少1 χ 10_6 MU χ ΙΟ"7 MU χ IO"8 MU χ IO"9 MU χ 1(Γ10 Μ、1 χ 1(Γ" Μ、1 χ 1(Γ12 M 或更少的親和力與靶結合， 和/或以是其對於非特異性抗原的親和力至少2倍的親和力與靶結合的能力。術語「靶」指由抗體識別的抗原或表位。靶包括任何肽、蛋白質、糖、核酸或其他分子，包括對於其可以生成特異性抗體的小分子。在一個實施方案中，抗體針對人蛋白質，例如 TNF α、IL-12、IL18、IL-1 α 或 IL-1 β。「保守胺基酸置換」是其中胺基酸殘基由具有相似側鏈的胺基酸殘基替換的置換。 具有相似側鏈的胺基酸殘基家族已在本領域中得到限定。術語「RNA展示」或「mRNA展示」指體外技術，其中所表達的蛋白質或肽與其編碼 mRNA共價或通過緊密的非共價相互作用連接，以形成「RNA/蛋白質融合」分子。可以就與所需靶的結合選擇RNA/蛋白質融合物的蛋白質或肽組分，並且通過測序所附著的編碼 mRNA組分來測定蛋白質或肽的特性。此種方法是本領域眾所周知的，並且例如在美國專利號 7，195，880 ；6，951，725 ；7，078，197 ；7，022，479，6，518，018 ；7，125，669 ；6，846，655 ； 6，281，344 ；6，207，446 ；6，214，553 ；6，258，558 ；6，261，804 ；6，429，300 ；6，489，116 ； 6，436，665 ；6，537，749 ；6，602，685 ；6，623，926 ；6，416，950 ；6，660，473 ；6，312，927 ； 5，922，545 ；和6，348，315中描述；所述專利各自整體引入本文作為參考。術語「單鏈抗體」或「scFv」指使用重組方法通過使得其能夠製備為單條蛋白質鏈的合成接頭連接的輕鏈可變區的抗原結合部分和重鏈可變區的抗原結合部分，其中VL 和VH區配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv)；參見例如，Bird (1988) Science 242:423-426 40^^^0/7^(1988)/^0^. Natl. Acad. Sci. K 5 J 85:5879-5883)。術語「功能部分」指對其與之附著的分子賦予另外功能性的任何生物或化學實體。術語「選擇」指使分子與群體中的其他分子基本上分開。如本文使用的，「選擇」步驟提供在選擇步驟後相對於群體中不希望有的分子，所需分子至少2倍、優選30倍、更優選 100倍、且最優選1000倍富集。如本文指出的，選擇步驟可以重複任何次數，並且不同類型的選擇步驟可以在給定方法中組合。術語「中止序列(pause sequence)，，指促使核糖體減慢或停止其翻譯速率的核酸序列。術語「固體支持體」指但不限於親和複合物可以與之直接或間接(例如通過其他結合配偶體中間物，例如其他抗體或A蛋白)結合，或親和複合物可以包埋入其中(例如，通過受體或通道)的任何柱(或柱材料)、珠、試管、微量滴定皿、固體顆粒(例如，瓊脂糖或瓊脂糖凝膠(s印harose))、微晶片(例如，矽、矽-玻璃或金晶片)、或膜(例如，脂質體或小泡的膜)。術語「接頭區域」指使scFv抗體基因中編碼抗體VH和VL結構域的核酸序列連接的核酸區域。接頭區域與編碼抗體VH和VL的核酸序列符合讀框，從而使得形成包含VH、 VL和接頭區域的鄰接可讀框。該術語還指在scFv蛋白質中連接VH和VL的區域。
術語「肽接納體」指通過核糖體肽基轉移酶功能的催化活性能夠添加到成長中的蛋白質鏈的C末端的任何分子。一般地，此種分子包含(i)核苷酸或核苷酸樣部分(例如， 嘌呤黴素及其類似物)，(ii)胺基酸或胺基酸樣部分(例如，20種D-或L-胺基酸中的任何一種或其任何胺基酸類似物(例如，由Ellman等人，Meth. Enzymol. 202:301，1991描述的 0-甲基酪氨酸或任何類似物)，和(iii》個之間的鍵(例如在3』位置上或較不優選地在2』 位置上的酯、醯胺或酮鍵)；優選地，這種鍵不顯著幹擾來自天然核糖核苷酸構象的環結構。 此外，這個術語包括但不限於與蛋白質編碼序列共價鍵合(直接或通過間插核酸序列間接) 的肽接納體分子，以及通過一些非共價方法與蛋白質編碼序列連接的那種，例如通過使用第二種核酸序列的雜交，所述第二種核酸序列在蛋白質編碼序列的3』末端上或接近3』末端處結合，並且其自身與肽接納體分子結合。II.概沭
本發明的特徵在於體外RNA展示的改良方法，其允許從表達文庫中可靠表達和選擇 scFv抗體分子。RNA展示方法一般涉及蛋白質或肽文庫的表達，其中所表達的蛋白質或肽與其編碼mRNA共價或通過緊密的非共價相互作用連接，以形成RNA/蛋白質融合分子。可以就與所需靶的結合選擇RNA/蛋白質融合物的蛋白質或肽組分，並且通過測序所附著的編碼mRNA 組分來測定蛋白質或肽的特性。目前的RNA展示方法不是對於scFv抗體表達最佳的，這是因為幾個步驟在還原條件下進行，這阻止scFv鏈內二硫鍵的形成且從而阻止scFv抗體分子的正確摺疊。目前方法另外在選擇過程中利用VH或VL抗體片段。本發明通過在溫和還原條件下執行體外RNA展示測定，解決了這個技術問題，所述溫和還原條件有利於scFv鏈內二硫鍵且從而有利於scFv抗體分子的正確摺疊。使用 scFv形式而不是單個可變結構域(例如，單個可變重(VH)結構域)還消除了對於所選擇的 VH結構域轉化為完全IgG抗體所需的鑑定相容的可變輕(VL)結構域的需要。因此，儘管特別適合於表達和選擇scFv抗體分子，但本發明的方法對於所有類別蛋白質的體外RNA展示也是有利的。本發明的方法還提供了用於執行RNA展示的更短和更簡單的規程。這部分通過避免在用靶選擇前使RNA-蛋白質融合物中的mRNA逆轉錄為cDNA的費時步驟來達到。III. 改良的體外RNA展示篩選方法
在一個方面，本發明的特徵在於改良的體外RNA展示篩選方法。一般方法如下 1)RNA/蛋白質融合物的形成
使一種或多種體外抗體DNA表達文庫轉錄，以生成mRNA。任何體外抗體表達文庫都是合適的(例如，VH、VL或scFv文庫)，然而，本發明的方法特別良好地適合於scFv文庫。任何領域公認的轉錄方法都是合適的。在RNA轉錄後，去除DNA文庫模板。這可以使用任何領域公認的方法完成，例如通過用DNA酶I消化。在DNA去除後，使肽接納體與文庫mRNA的3』末端附著。這可以使用任何領域公認的方法完成。在一個實施方案中，使用包括5』 (補骨脂素C6)2』0Me (U AGC GGA UGOXXX XXX CC (嘌呤黴素)3』 (SEQ ID NO :20)的接頭(其中X是三甘醇或PEG-150，並且CC是標準DNA主鏈)。首先通過互補鹼基配對允許接頭與文庫mRNA的3』末端結合。隨後通過補骨脂素C6分子的UV活化使接頭與mRNA交聯。
在肽接納體添加後，隨後在體外系統中翻譯文庫mRNA。任何領域公認的體外翻譯方法都是合適的，例如兔網織紅細胞裂解物。然而，為了允許在scFv分子中的正確鏈內二硫鍵形成，將蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)添加到體外翻譯反應中，和/或在溫和氧化條件下執行反應。在一個實施方案中，將溫和氧化劑(例如GSSG/GSH，例如IOOmM GSSG /IOmM GSH) 添加到體外翻譯反應中。在另一個實施方案中，還原劑(例如，二硫蘇糖醇(DTT))從體外翻譯反應中省略。一種或多種標記的胺基酸或其衍生物可以添加到體外翻譯系統中，從而使得標記的胺基酸摻入所得到的抗體內。預期任何領域公認的標記的胺基酸，例如放射性標記的胺基酸，例如mS標記的甲硫氨酸或半胱氨酸。在體外翻譯反應過程中，mRNA分子經由在3』末端上融合的肽接納體(例如，嘌呤黴素)與其蛋白質產物共價連接。從體外翻譯反應混合物中純化掉這些RNA/蛋白質融合分子。預期了任何領域公認的從反應混合物中分離RNA/蛋白質融合分子的方法。在一個實施方案中，使用聚脫氧胸苷(polydeoxythimidine) (Poly dT)樹脂通過層析分離RNA/蛋白質融合蛋白。在另一個實施方案中，通過與對於RNA/蛋白質融合蛋白的抗體組分中存在的表位特異的抗體結合，分離RNA-抗體融合蛋白。表位可以是摻入RNA-抗體融合蛋白的抗體組分的胺基酸序列內的胺基酸序列標記，例如FLAG或HA標記，例如在N末端、C末端上或在可變區間接頭中。本發明的RNA/蛋白質融合物涉及裸RNA的使用。在優選實施方案中，接觸RNA/ 蛋白質融合物的所有試劑用RNA酶抑制劑試劑進行處理，例如RNaseOUT 、酵母tRNA、 SUPERaseIn , RNasin 和本領域已知的其他RNA酶抑制劑。2)針對所需靶篩選抗體
就與所需靶的體外結合篩選RNA/蛋白質融合物的文庫。一般而言，靶分子與固體支持體例如瓊脂糖珠結合。在一個實施方案中，靶分子與固體基質直接連接。在另一個實施方案中，靶分子首先進行修飾，例如生物素化，隨後使修飾的靶分子經由修飾與固體基質結合，例如鏈黴抗生物素蛋白H\G80、中性抗生物素蛋白H\C80、SA-M270、NA-M270、SA-MyOne、 NA-MyOne、SA-瓊脂糖、和NA-瓊脂糖。在其他實施方案中，固體支持體進一步包括磁珠，例如Dynabeads。此種磁珠允許使用磁體從測定混合物中分離固體支持體和任何結合的RNA/ 抗體融合物。在RNA/蛋白質融合物結合後，使固體支持體洗滌一次或多次，以去除未結合的 RNA/蛋白質融合物，並且隨後擴增RNA。在一個實施方案中，使與抗體或多種抗體在物理上結合的mRNA擴增，以產生更多mRNA。預期了任何領域公認的RNA複製方法，例如使用RNA 複製酶。在另一個實施方案中，在通過PCR擴增前，可以使與抗體或多種抗體在物理上結合的mRNA轉錄成cDNA。可以對PCR擴增的庫實施一輪或多輪篩選，以富集最高親和力抗體。另外或可替代地，在擴增核酸組分前，可以從固體支持體中洗脫RNA/蛋白質融合物。預期了任何領域公認的洗脫方法。在一個實施方案中，使用鹼性條件例如使用約8.0 -10. 0的pH，洗脫RNA/蛋白質融合物。在另一個實施方案中，使用酸性條件例如使用約3. 0 -6.0的pH，洗脫RNA/蛋白質融合物。在一個實施方案中，在擴增核酸組分前，不洗脫RNA/ 蛋白質融合物，而是將RNA/蛋白質融合物直接添加到擴增反應混合物中。另外或可替代地，核酸的PCR擴增庫可以使用單個分子測序方法進行測序，以測
10定每一種選擇的RNA/蛋白質分子的核酸序列。在一個實施方案中，PCR擴增可以使用高保真度的校正聚合酶完成，例如來自Thermococcms kodakaraensis的KODl熱穩定性DNA聚合酶或 Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen)0另外或可替代地，核酸序列可以在導致突變引入擴增的DNA的條件下擴增，從而將進一步的多樣性引入所選擇的核酸序列內。可以對這種DNA分子突變庫實施進一步的篩選循環。IV.文庫構建
本發明的文庫可以由能夠與靶結合的任何抗體片段生成。在一個實施方案中，生成抗體可變結構域的文庫。這些可以是VH和/或VL結構域。在另一個實施方案中，生成scFv 文庫。本發明的文庫還可以包括編碼在可變區外的區域的抗體核酸序列，例如其恆定區或片段，或鉸鏈區。本發明的核酸文庫可以包括RNA、DNA或包含RNA和DNA元件的雜交物。核酸與肽接納體的連接
抗體核酸文庫可以進行修飾以包含肽接納體部分。這可以促進核酸表達文庫的個別成員與其關連蛋白質產物的共價附著。預期了任何領域公認的肽接納體與核酸附著的方法， 包括例如在美國專利號5，643，768、美國專利號5，658，754、美國專利號7，195，880和美國專利號6，951，725中描述的方法，所述專利的內容引入本文作為參考。在一個方面，本發明的特徵在於用於使肽接納體與核酸文庫附著的新方法和組合物。在一個實施方案中，可以合成包括補骨脂素C6分子和肽接納體分子的連接分子，其中補骨脂素C6分子和肽接納體分子與核酸序列融合，其中所述核酸序列與核酸文庫的3』末端上的序列互補。此種連接分子可以經由互補鹼基配對與核酸文庫克隆的3』末端結合。 補骨脂素C6對紫外(UV)線敏感，並且將使接頭與核酸文庫克隆交聯，從而使肽接納體與核酸文庫克隆共價連接。在另一個實施方案中，接頭分子的核酸部分可以包含修飾的核苷酸， 例如2』甲氧基(2』 OMe)核糖核苷酸。在另一個實施方案中，接頭分子進一步包括使包含補骨脂素C6分子和肽接納體分子的核酸區域分離的三甘醇或PEG-150接頭。在一個實施方案中，接頭從5』到3』可以包括補骨脂素C6、包括序列UAGCGGAUGC (SEQ ID NO 20)的 2』 OMe)核糖核苷酸、6個三甘醇或PEG-150部分、2個胞苷殘基和嘌呤黴素。此種接頭可以通過例如 TriLink BioTechnologies, Inc 定製合成。V. 一般篩選方法
在一個方面，本發明的特徵在於篩選本發明的表達文庫的方法，以鑑定能夠與所需靶結合的抗體。預期了基於抗體與靶分子的結合，允許從表達文庫中選擇抗體的任何體外或體內篩選方法。在一個實施方案中，本發明的表達文庫可以使用領域公認的體外無細胞表型-基因型連接的展示進行篩選。此種方法是本領域眾所周知的，並且例如在美國專利號 7，195，880 ；6，951，725 ；7，078，197 ；7，022，479,6, 518，018 ；7，125，669 ；6，846，655 ； 6，281，344 ；6，207，446 ；6，214，553 ；6，258，558 ；6，261，804 ；6，429，300 ；6，489，116 ； 6，436，665 ；6，537，749 ；6，602，685 ；6，623，926 ；6，416，950 ；6，660，473 ；6，312，927 ； 5, 922, 545 ；和6，348，315中描述。這些方法涉及以這樣的方式從核酸體外轉錄蛋白質，從而使得蛋白質與它源於其的核酸在物理上締合或結合。通過用靶分子選擇表達的蛋白質， 同樣選擇編碼蛋白質的核酸。為了改善SCFv蛋白質的表達，上文提及的體外篩選測定可能需要特定試劑的添加或去除。在一個實施方案中，蛋白質二硫鍵異構酶可以添加到體外表達系統中，以改善功能scFv分子的生產。在另一個實施方案中，溫和氧化劑(例如GSSG/GSH，例如IOOmM GSSG /IOmM GSH)可以添加到scFv蛋白質的體外翻譯反應混合物中，以允許scFv分子的VH和VL 區中的鏈內二硫鍵形成。在另一個實施方案中，還原劑(例如，二硫蘇糖醇(DTT ))可從scFv 的體外翻譯反應混合物中去除。在另一個實施方案中，一種或多種標記的胺基酸或其衍生物可以添加到體外翻譯系統中，從而使得標記的胺基酸摻入所得到的抗體內。預期了任何領域公認的標記的胺基酸，例如放射性標記的胺基酸，例如35S標記的甲硫氨酸或半胱氨酸。在一個實施方案中，本發明的體外篩選測定需要在抗體或多種抗體的體外選擇後，可以使與抗體或多種抗體在物理上結合的mRNA逆轉錄，以生成編碼所述抗體或多種抗體的cDNA。預期了用於逆轉錄的任何合適方法，例如酶介導的逆轉錄，例如莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶。在本發明中採用的篩選方法可能需要擴增編碼與所需靶特異性結合的抗體的核酸。在一個實施方案中，可以使與抗體或多種抗體在物理上結合的mRNA擴增，以產生更多 mRNA。預期了任何領域公認的RNA複製方法，例如使用RNA複製酶。在另一個實施方案中， 在通過PCR擴增前，可以首先使與抗體或多種抗體在物理上結合的mRNA逆轉錄成cDNA。在一個實施方案中，PCR擴增可以使用高保真度的校正聚合酶完成，例如來自Thermoco⑶us AotZa^araefl1Si1S 的 KODl 熱穩定性 DNA 聚合酶或 Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen)0在另一個實施方案中，PCR擴增可以在將突變引入擴增的DNA內的條件下執行，例如易錯PCR。在另一個實施方案中，本發明的表達文庫可以通過在細胞、病毒或噬菌體表面上展示，並且實施使用固定化靶分子的選擇進行篩選。合適的篩選方法在美國專利號 7，063，943 ；6，699，658 ；6，423，538 ；6，696，251 ；6，300，065 ；6，399，763 ；6，114，147 和 5，866，344 中描述。在本發明中採用的篩選方法可能需要通過引入核酸置換和/或缺失將多樣性引入抗體文庫內，這可以導致在表達的抗體分子中的一個或多個胺基酸置換和/或缺失。預期了任何領域公認的誘變方法，例如隨機誘變、「步移(walk through)"誘變和「審核(look through)」誘變。可以使用例如易錯PCR、酵母或細菌的「增變」株、或在所有或部分抗體的從頭開始合成過程中隨機或限定的核酸改變的摻入來達到抗體的此種誘變。在一個實施方案中，可以生成抗體分子的文庫，其中一個或多個胺基酸是隨機突變的。在另一個實施方案中，可以生成抗體分子的文庫，其中一個或多個胺基酸突變為一個或多個預定的胺基酸。在本發明中採用的篩選方法還可能需要增加靶-結合篩選測定的嚴格性，以選擇對於靶具有改善的親和力的抗體。可以考慮增加抗體-靶相互作用測定的嚴格性的任何領域公認的方法。在一個實施方案中，可以改變一種或多種測定條件(例如，測定緩衝液的鹽濃度)，以減少抗體分子對於所需靶的親和力。在另一個實施方案中，可以減少允許抗體與所需靶結合的時間長度。在另一個實施方案中，競爭結合步驟可以添加到抗體-靶相互作用測定中。例如，可以首先允許抗體與所需固定化靶結合。隨後可以添加特定濃度的非固定化靶，其用來與固定化靶競爭結合，從而使得從固定化靶中洗脫對於抗原具有最低親和力的抗體，從而導致具有改善的抗原結合親和力的抗體富集。通過增加添加到測定中的非固定化靶的濃度，可以進一步增加測定條件的嚴格性。本發明的篩選方法還可能需要多輪選擇，以富集具有改善的靶結合的一種或多種抗體。在一個實施方案中，在每輪選擇時，進一步的胺基酸突變可以使用領域公認的方法引入抗體內。在另一個實施方案中，在每輪選擇時，可以增加與所需靶結合的嚴格性，以選擇對於所需靶具有增加的親和力的抗體。本發明的篩選方法可能需要從體外翻譯系統的組分中純化RNA-抗體融合蛋白。 這可以使用任何領域公認的分離方法完成。在一個實施方案中，使用聚脫氧胸苷(poly dT) 樹脂通過層析分離RNA-抗體融合蛋白。在另一個實施方案中，通過層析使用對於RNA-抗體融合蛋白的抗體組分中存在的表位特異的抗體，可以分離RNA-抗體融合蛋白。表位可以是摻入RNA-抗體融合蛋白的抗體組分的胺基酸序列內的胺基酸序列標記，例如FLAG、Myc 或HA標記，例如在N末端、C末端上或在可變區間接頭中。從本發明的文庫中選擇抗體可能需要使用固定化的靶分子。在一個實施方案中， 靶分子與固體基質例如瓊脂糖珠直接連接。在另一個實施方案中，靶分子首先進行修飾， 例如生物素化，隨後使修飾的靶分子經由修飾與固體支持體結合，例如鏈黴抗生物素蛋白 H\C80、中性抗生物素蛋白 H\C80、SA-M270、NA-M270、SA-MyOne, NA-MyOne, SA-瓊脂糖、 和NA-瓊脂糖。本發明的例證(EXEMPLIFACTION)
實施例自始至終，使用下述材料和方法，除非另有說明。材料與方法
一般而言，除非另有說明，否則本發明的實踐採用化學、分子生物學、重組DNA技術、免疫學(尤其是例如免疫球蛋白技術)和畜牧業的常規技術。參見例如，Sambrook，Fritsch和 Maniatis,Molecular Cloning :Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology),510, Paul, S. , Humana Pr (1996) ；Antibody Engineering :A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed. , Irl Pr (1996) ；Antibodies :A Laboratory Manual, Harlow ^A, C. S. H. L. Press, Pub. (1999) ;Current Protocols in Molecular Biology,編輯 Ausubel 等人，John Wiley & Sons (1992)。用於scFv的mRNA展示規程
mRNA展示可以根據圖2中所示的方法進行。這種方法的具體實施方案在下文更詳細地描述。這些實施方案預期舉例說明本發明的方法，並且不應解釋為限制性的。1.抗體文庫模板的設計
根據本領域已知的抗體文庫生成方法可以設計文庫DNA構建體。在一個實施方案中， 文庫構建體可以編碼抗體片段，即抗體輕鏈片段(VL)或抗體重鏈片段(VH)。在一個示例性實施方案中，文庫構建體可以編碼單鏈可變片段(scFv)。2.革巴抗原的製備
一般地，mRNA展示抗體文庫可以針對生物素化抗原進行選擇。雖然關於每種靶的最佳抗原應基於具體情況(case-by-case)進行測定，但下述考慮可以用作一般指導。靶抗原一般是充分表徵的，並且是相關或顯性遺傳同種型，如通過多態性(SNP和單元型)和/或藥物遺傳學分析測定的。靶抗原另外可以具有合理生物活性(可與天然抗原比較)、良好可溶性以及良好的化學和物理性質，並且可以以足夠量製備以用於文庫選擇或篩選和下遊生物測定。3.文庫DNA的製備
文庫DNA及其選擇輸出可以通過PCR進行擴增。PCR擴增可以使用本領域已知的方法執行。PCR反應一般包含DNA模板、反應緩衝液、dNTP、用於擴增的引物、DNA聚合酶和水。 多個反應管可以由主混合物同時設立，以增加擴增的DNA得率。25個PCR循環一般給出足夠擴增，但多達35個循環可以用於獲得更多產物。4.文庫DNA純化
如果產物是正確大小(對於scFv 850 bp，對於VH或VL文庫 500 bp)且包含最低限度非特異性產物，那麼產物可以直接用於轉錄反應中。可替代地，通過切出正確大小的特異性條帶，可以在製備型瓊脂糖凝膠上純化產物。DNA濃度可以在分光光度計上進行測量。5. RNA 轉錄
來自文庫DNA的RNA轉錄可以使用本領域已知的標準方法執行。大反應體積可以用於轉錄足夠的DNA模板，以取樣整個文庫多樣性。在示例性實施方案中，1 χ IO13文庫模板拷貝可以用於RNA轉錄反應中。RNA轉錄一般包含5-10 μδ PCR產物、反應緩衝液、ATP、CTP、 GTP、UTP和T7 RNA聚合酶。RNA轉錄反應可以在37°C運行2小時至過夜。在初始選擇循環後可以使用較短的時間，然而，過夜溫育可以使反應的RNA得率達到最大。在RNA轉錄後， DNA模板可以通過DNA酶I消化從反應混合物中去除。6.通過NAP柱層析的RNA純化
在轉錄後，RNA可以使用NAP-10柱進行分級分離。最高達約1 mL轉錄反應可以裝載到NAP-10柱上用於RNA純化。在分級分離前，柱可以使用DEPC處理的dH20進行平衡。RNA 可以使用約1. 5X反應體積DEPC處理的dH20 (例如750 μ L/500 μ L轉錄反應)從柱中洗脫。總洗脫體積可以小於約150%的轉錄反應體積。RNA可以另外或可替代地使用ΝΑΡ-25 柱進行分級分離。7. RNA質量控制和定量
RNA樣品的大小和得率可以使用凝膠電泳，或可替代地通過測量收集的級分中RNA濃度在沈0 nm下的OD (OD26tl)進行分析。例如，scFv RNA的摩爾濃度可以如下計算 [RNA] (μ M)= [RNA] (mg/mL) X IO6 / (850 X 330) =OD260 X 稀釋因子 X 40 (Pg/mL) X 1000 / (850 X 330)。RNA 得率(nmol)= [RNA] ( μ Μ) X 體積(μ L)/ 1000
RNA得率一般達到每500 μ L轉錄反應約20 nmol/mL的最大限度。8. RNA與接頭的連接
在其3』末端上包含肽接納體分子的DNA接頭可以通過UV交聯與每種RNA分子的3』 末端共價連接。可以進入核糖體A位點且與新生多肽鏈的羧基末端共價偶聯的肽接納體， 可以最終使得mRNA (基因型)能夠與由這種RNA編碼的蛋白質(表型)共價結合。可以使用具有下式的示例性PEG6/10接頭5'(補骨脂素 C6) 2，OMe (U AGC GGA UGC) XXX XXX CC (嘌呤黴素)3，(SEQ ID NO:
20)
補骨脂素C6 5'修飾是光敏感的，並且作用於通過UV交聯在接頭和mRNA之間產生共價鍵。2，OMe (U AGC GGA UGC) (SEQ ID NO :20)主鏈區域與 mRNA 上的 FLAG 序列 3，的接頭退火位點退火(參見圖1)。在上文序列中，X指示「間隔區9」，可替代地稱為三甘醇或 PEG-150。這個間隔區已得到最優化，以提供用於嘌呤黴素插入真核核糖體A位點內的柔性。CC包括標準DNA主鏈。嘌呤黴素3'修飾插入核糖體A位點內，以在接頭和新生肽之間產生穩定連接。關於本文描述的接頭的消光係數可以是約147.7 0D26(l/ymOle。因為這種接頭是光敏感的，所以包含這種接頭的溶液應被保護不受光。對於文庫選擇的初始循環，可以推薦大規模連接反應(約5 nmol或約3. 1 X IO15 轉錄的RNA分子)，以取樣具有約IO12 - IO13的估計多樣性的首次用於實驗的抗體文庫的整個多樣性。這種RNA量可以確保足夠模板摻入翻譯反應內，以產生 10 pmol功能mRNA展示分子。在隨後循環中，RNA輸入可以減少至約0.5 nmol/選擇。在示例性實施方案中，RNA 連接反應可以包含下述組分RNA、水、化學連接緩衝液和PEG6/嘌呤黴素接頭(ImM)。在示例性實施方案中，總反應體積是約100 UL0在優選實施方案中，接頭/RNA摩爾比可以大於約1. 5。在一個實施方案中，反應中的最終接頭濃度是約15 μ M，並且反應中的RNA濃度範圍可以為約3 - 10 μ M (= 0.3 - 1 nmol RNA輸入)。作為參考，1 mg/mL的850 nt scFv RNA= 3.56 μ M和可達到的最大限度連接濃度將是約3. 16 μ M (約0. 32 nmol)。退火反應(這使接頭與轉錄的RNA退火)可以在熱循環儀中執行。在優選實施方案中，通過在約85°C溫育樣品約30秒，隨後在約4°C，可以執行退火反應，其中使用約0.3°C/ 秒的斜升速率。反應隨後可以在約4°C保持。退火的接頭/RNA的連接可以通過UV交聯完成。這可以使用本領域技術人員已知的任何方法進行。在一個實施方案中，反應管可以置於冷凍製冷器包之上，並且直接置於手提式長波長(約365 nm) UV燈下，並且在黑暗中交聯約15分鐘。一般連接效率是約50 -90%。一般不需要純化。連接產物可以貯存於_80°C。9.翻譯反應
在示例性實施方案中，在所有反應和純化後，約輸入RNA可以製備成mRNA展示分子。體外翻譯使用本領域技術人員已知的方法和試劑進行。在一個實施方案中，使用scFv 文庫的翻譯反應使用在約15 mL的反應體積中的約5 nmol RNA模板連同約10 mL網織紅細胞裂解物。在用於翻譯反應的製備中，GSSG/GSH (氧化穀胱甘肽/還原穀胱甘肽)溶液可以以約100 mM GSSG/10 mM GSH的終濃度製備。通過使PDI粉末溶解於dH20內製備PDI，以達到約1單位/ μ L的濃度。PDI溶液可以貯存於_20°C。示例性翻譯反應可以如下設立翻譯反應可以在30°C水浴中溫育1 - 2小時，並且RNA/蛋白質融合物形成應無延遲地執行。當翻譯體積超過3 mL時，可以觀察到RNA/蛋白質融合物得率中的顯著降低；因此， 如果反應體積大於3 mL，那麼可以製備翻譯反應的主混合物，並且隨後分成小等分試樣。10. RNA/蛋白質融合物形成
在翻譯反應後，對於每300- μ L翻譯反應混合物，可以添加約100 μ L 2Μ KCl和約20 μ L IM MgCl2，並且在室溫溫育約1小時，或在-20°C過夜。可替代地，對於每1.5 ml翻譯反應混合物，可以添加約500 μ L 2M KCl和約100 μ L IM MgCl2，並且在室溫溫育約1小時，或在_20°C過夜。這使在mRNA模板末端上的中止的核糖體穩定，並且允許在DNA接頭的末端上的嘌呤黴素進入中止的核糖體的A位點，這使翻譯的scFv蛋白質與其mRNA模板永久連接。如果反應在-20°C貯存過夜，那麼室溫溫育可以縮短。反應可以通過分別添加約 50 μ L或約250 μ L 0. 5 M EDTA / 300 μ L或1. 5 ml翻譯反應以破壞核糖體得到終止。 反應可以貯存於-20°C。可以取出5-10 μ L等分試樣用於隨後閃爍計數。11. 通過寡脫氧胸苷酸纖維素的RNA/蛋白質融合物純化
包括這個步驟，以從翻譯/融合反應中純化mRNA展示分子和剩餘的RNA模板。對於寡脫氧胸苷酸結合，應估計捕獲所有RNA模板所需的預洗滌的寡脫氧胸苷酸纖維素量。足夠體積的寡脫氧胸苷酸結合緩衝液可以添加到融合反應，以達到約IX終濃度。隨後可以添加預洗滌的寡脫氧胸苷酸纖維素，並且使反應在4°C旋轉1小時。反應可以任選在4°C以約 1500 rpm離心5分鐘，並且棄去上清液。可以轉移寡脫氧胸苷酸纖維素珠，並且使用旋轉柱，用IX寡脫氧胸苷酸結合緩衝液洗滌約6次，並且緩衝液一般通過使柱以約1000 rpm旋轉10秒去除。可以棄去流通物(flow-through)，但可以保存末次洗滌用於閃爍計數。為了減少鹽濃度且促成洗脫，dH20初始漿體積的1/10可以添加到乾燥寡脫氧胸苷酸珠中，這可以立即離心10秒且可以棄去流通物。通過將dH20添加到珠中且在室溫溫育5分鐘，可以洗脫mRNA展示分子(和游離RNA模板)。通過以約4000 rpm (或更高)旋轉20秒收集洗脫物。洗脫一般重複1次，且組合洗脫物。可以取出5 μ L洗脫物用於閃爍計數。任選地，還可以通過在NanoDrop分光光度計機器上在沈0 nm的OD (OD26tl)評估寡脫氧胸苷酸純化的效率。所有剩餘的RNA模板和mRNA展示分子在理論上通過寡脫氧胸苷酸珠回收。5X FLAG 結合緩衝液添加到洗脫物中，以達到約IX終濃度。樣品可以貯存於-80°C，如果未進行至下一個FLAG純化步驟的話。
寡脫氧胸苷酸回收可以如下計算。約5μ L輸入(來自融合反應)、來自末次洗滌的約100 yL、和約5 μ L輸出(來自寡脫氧胸苷酸純化的洗脫物)。末次洗滌用於評估洗滌程度，並且其他2個計數用於計算來自原始RNA模板輸入的RNA/蛋白質融合物回收。RNA/蛋白質融合物得率(pmol)= (CPM輸出X體積輸出X 5 μΜ X體積裂解物)/ [CPM輸人X體積 Λ X (產物中的甲硫氨酸#)]。這個公式假定網織紅細胞裂解物中的5-μ M甲硫氨酸濃度，並且計算中使用的所有體積表示為yL。對於較早的選擇循環，mRNA展示分子的得率一般是0.5 - 2%，但在隨後循環中可以增加至10%。例如，PROfusion文庫中甲硫氨酸的早期循環數目可以是
對於 VH-V κ scFv 約 3 μ M
對於 VH-V λ scFv 約 2 - 3 μ Μ,
對於VH約2 μ Μ,
對於Vk約2 μ Μ，和
對於V λ約1 μ Μ。這些數目是平均值並且基於種系序列，並且本領域技術人員將認識到當文庫針對特異性序列富集時，它們可以隨著選擇循環改變。12. 通過抗FLAG Μ2瓊脂糖的RNA/蛋白質融合物純化
這個步驟設計為從剩餘的RNA模板中純化mRNA展示分子。如果文庫將通過抗原解離速率(off-rate)競爭或通過抗原表達細胞進行選擇，那麼無需進行至這個步驟。可以估計捕獲所有mRNA展示分子所需的預洗滌的抗FLAG M2瓊脂糖珠的量。在一個實施方案中，珠的結合容量可以是約6 nmol融合蛋白/mL 50%漿。為了具有足夠的珠體積用於在結合和洗滌過程中處理，推薦使用至少約200 μ L預洗滌的珠。下文給出的例子用於初始300-μ L 翻譯反應。FLAG純化寬口移液管管尖可以用於將300 μ L預洗滌的抗FLAG M2瓊脂糖轉移至寡脫氧胸苷酸純化的輸出，這隨後可以在4°C旋轉1小時。與抗FLAG M2瓊脂糖溫育可以繼續過夜。抗FLAG M2瓊脂糖可以任選在4°C在離心機中以約1500 rpm旋轉約1分鐘，並且可以棄去上清液。抗FLAG珠可以用約500-700 μ L IX FLAG結合緩衝液洗滌約5_6次， 其中使用旋轉柱(例如hvitrogen Microcentrifuge Spin Column)，並且對於每次洗滌以約1000 rpm離心10秒(應當指出Invitrogen 柱可以以更高速度例如約10,000 rpm旋轉)。可以棄去流通物。通過以約1000 rpm離心10秒，珠可以另外用700 μ L選擇緩衝液 (參見下文)洗滌2次。可以保存末次洗滌用於閃爍計數。通過添加約400 μ L 100 yg/mL FLAG肽(在選擇緩衝液中)且在室溫溫育5分鐘，可以洗脫mRNA展示分子。洗脫物(elute) 可以通過以約3000 rpm (或可能時更高)旋轉20秒進行收集。通過添加約400 μ L 100 Ug/mL FLAG肽，洗脫步驟可以再復一次。2種洗脫物可以組合，並且可以取出約5 yL用於閃爍計數。這個體積的FLAG肽可以足以洗脫最達約1 mL 50%漿，並且如果使用較少的漿和/或需要更高的RNA/蛋白質融合物濃度，那麼可以減半(cut in half) (200 μ L)。 為了預防在貯存和抗原選擇過程中的RNA降解，合適量的本領域已知的RNA酶抑制劑(即， 1 - 2 U/μ L RNaseOUT和0. 02 μ g/mL酵母tRNA)可以添加到純化的mRNA展示文庫中。 如果不進行至下一個抗原選擇步驟，那麼將樣品貯存於-80°C。為了定量FLAG回收，在β計數器上計數約5 μ 洗脫輸出和來自末次洗滌的約100 μ 。可以預期10-30%或更高的回收，並且可以根據下式進行計算 PROfusion分子回收％ = (CPM輸出X體積輸出)/ (CPMfix X體積輸入) 13. 通過生物素化抗原的文庫選擇
設計選擇以在與抗原的文庫結合達到平衡時，富集與目的靶特異性結合的分子。可能需要陰性選擇(預澄清)，以從首次用於實驗的scFv文庫中去除非特異性和基質結合劑，但如果使用由單個模板製備的文庫，例如但不限於基於單個scFv模板進行親和力成熟的製備用於親和力成熟的文庫，那麼可以省略。依賴於靶形式，選擇規程改變。下述是用於與生物素化靶一起使用的示例性選擇規程。這種規程可以進行修飾，以適應以其他形式的靶抗原，並且依賴於所需輸出可以按比例擴大或縮小。Α.在選擇前的製備
鏈黴抗生物素蛋白(SA)磁珠可以用於捕獲，並且一般在使用前預封閉。SA珠可以從原始瓶轉移到1. 5或2 mL管，並且用2 mL IX FLAG結合緩衝液洗滌2次。珠可以用2 mL選擇緩衝液(2小時到過夜)在4°C伴隨旋轉進行封閉。重要的是製備足夠珠用於兩者，預澄清和選擇捕獲。預封閉的珠可以貯存於4°C。約100 PL珠一般用於每10 pmol生物素化抗原，但本領域技術人員將認識到捕獲珠體積應考慮到相對於反應得率的游離生物素結合容量進行計算(例如650-900 pmoles/mg珠，其中珠濃度一般是10 mg/ml)。1.5 mL或2 mL微量離心管(microfuge tube)可以用IX FLAG結合緩衝液預封閉約1小時到過夜。預封閉的管可以用於所有預澄清和選擇步驟。一般地需要4個管用於每個樣品2個用於預澄清，1個用於珠，並且1個用於選擇。最佳結果可以通過使文庫預澄清獲得。FLAG純化的mRNA展示文庫可以添加到珠 (與緩衝液分離)，其中使用等於捕獲體積一半的SA珠體積。珠可以在30°C旋轉約30分鐘。 預澄清的mRNA展示文庫可以使用磁體與珠分離，並且預澄清可以再重複一次。第二種預澄清的SA珠可以如上文所述洗滌且計數，以測定本底是否高。這還可以充當『無抗原』陰性對照。B.文庫選擇結合
對於第一輪選擇，生物素化靶(100 nM)可以添加到整個預澄清的文庫，並且在30°C旋轉1小時。對於隨後的選擇循環，當抗原結合分子的回收預期超過時，預澄清的文庫可以分成2個相等等分試樣。生物素化抗原可以添加到一個等分試樣，並且另一個可以充當 『無抗原』陰性對照。可替代地，洗滌的第二種預澄清珠也可以被視為『無抗原』對照，如上所述，儘管這些珠將具有一次較少的『預澄清』。當抗原結合分子的回收超過5%時，隨後循環中的抗原濃度可能降低。特別地，如果抗原看起來『粘性』且在早期循環中觀察到顯著回收，那麼抗原濃度應減少。當抗原結合分子的回收變得顯著高於本底時(例如相對於無抗原對照)，抗原濃度在隨後循環中可以減少。重要的是注意文庫和抗原之間的化學計量，以確保存在超過文庫PROfusion分子的至少5倍摩爾過量的抗原，尤其是在較低抗原濃度。C.文庫選擇捕獲
用於封閉SA珠用於文庫捕獲的選擇緩衝液可以通過離心和磁性分離去除。抗原結合的文庫可以轉移至預封閉的SA珠(與緩衝液分離)，並且隨後至結合反應，並且在30°C旋轉 5 - 10分鐘。用於捕獲的SA珠的量應基於容量和選擇中使用的靶濃度進行計算(參見上文)。當降低靶濃度以避免SA珠結合劑時，SA珠的量應降低，但一般使用不小於50 yL的珠。D.文庫選擇洗滌
SA珠可以使用磁體進行收集，並且用約1 mL選擇緩衝液洗滌1分鐘。這個步驟可以重複約5次(總共約6次)。洗滌時間可以在隨後循環中增加，以對一些靶摻入解離速率選擇策略。珠可以用適合於逆轉錄的約1 mL IX緩衝液洗滌最後一次，用磁體收集，並且在水中重懸浮(上文計算的捕獲珠體積的四分之一)。作為另一個例子，可以使用Dynabeads TManvitrogen)，但本領域技術人員將認識到其他珠可以是同樣合適的。Dynabeads 可以通過離心和磁性分離與未結合的文庫分離。 上清液可以用1 mL管尖取出，其中使用一個新過濾的管尖用於每個文庫選擇管，以消除交叉汙染。Dynabeads 可以用1 mL選擇緩衝液洗滌，並且通過輕輕移液或通過使管顛倒多次重懸浮。在處理下一個文庫時，管可以放回到磁支架上用於珠分離。在洗滌所有文庫後， 上清液可以通過1 mL管尖取出，其中使用一個新過濾的管尖用於每個文庫選擇管，以消除交叉汙染。對於5次洗滌重複。Dynabeads 可以用1 mL IX第一鏈緩衝液(Superscript II，Invitrogen)如上所述洗滌2次。在末次洗滌時，如果需要如此，那麼取出文庫的1/10 至分開管用於計數，以測定文庫回收。Dynabeads 可以通過磁性分離捕獲，並且可以保存約 100 μ 1洗滌緩衝液用於本底計數。Dynabeads 可以重懸浮於水中，其中使用如上計算的 %捕獲珠體積)。Ε.文庫選擇計數和回收計算
從第3輪開始，計數約10 - 20%的末次洗滌和珠。計數超過100 PL珠是不可取的， 因為這可以猝滅計數。文庫選擇回收可以根據下式進行計算 選擇回收％ = 100 X CPM總珠/ CPM總輸入
14.通過Fc融合蛋白平衡文庫選擇
在另一個實施方案中，文庫選擇可以對於已與抗體Fc結構域融合的靶抗原(例如，Fc 融合蛋白)執行。可能需要陰性選擇(預澄清)，以從首次用於實驗的抗體文庫中去除非特異性和基質結合劑，但對於親和力成熟可以省略。選擇特異性可以通過使靶抗原與人IgGl和小鼠IgGh融合得到改善。通過在文庫選擇過程中在Fc融合蛋白中具有不同Fc結構域， 可以使鑑定對Fc區特異性的文庫結合劑的危險降到最低。這還將使得文庫結合劑能夠通過2種不同磁珠(G蛋白和抗小鼠IgG)拉下(pulled down)，從而進一步減少回收抗G蛋白或抗抗小鼠IgG結合劑的概率。靶Fc融合蛋白也可以是生物素化的，並且通過本文描述的方法或通過上文章節13中描述的方法進行選擇。應當指出A蛋白磁珠可能不適合於針對 Fc融合蛋白靶選擇，這是因為與抗體VH結構域的特定部分的交叉反應性(例如源於人VH3 家族種系序列的VH)。用於拉下抗原結合scFv-PROfusion分子的合適磁珠包括但不限於， Dynabeads G蛋白、Dynabeads Pan小鼠IgG、和針對人或小鼠IgGs的其他可用的Dynabeads M-280o 一般而言，G蛋白珠容量被視為約25 PgAlgGl Γ167 pmol )/100 yLA/G蛋白磁珠。A.在選擇前的製備
Dynabeads G蛋白或Dynabeads Pan小鼠IgG (如果靶抗原是小鼠Fc融合蛋白)可以用於捕獲，並且一般在使用前預封閉。可以計算對於文庫預澄清和選擇所需的Dynabeads 量。Dynabeads可以從原始瓶轉移到1.5或2 mL微量離心管，並且去除緩衝液。珠可以用1 mL選擇緩衝液(2小時到過夜)在4°C或在室溫1小時進行封閉。重要的是製備足夠珠用於預澄清和選擇捕獲。1. 5 mL或2 mL微量離心管可以用選擇緩衝液預封閉1小時到過夜，並且預封閉的
管應用於所有預澄清和文庫選擇步驟。FLAG純化的scFv PROfusion文庫可以添加到預封閉的珠(與緩衝液分離)，可使用等於捕獲體積⑶卩上計算)一半的Dynabead (G蛋白或Pan小鼠IgG)體積，並且反應在30°C 旋轉30分鐘。預澄清的融合物文庫可以使用磁體與珠分離，並且預澄清再重複一次。第二種預澄清的Dynabeads可以如上文所述洗滌且計數，以測定本底是否高。這還可以充當『無抗原』陰性對照。B.文庫選擇結合
對於第一輪選擇，生物素化靶(100 nM)可以添加到整個預澄清的文庫，並且在30°C旋轉1小時。對於隨後的選擇循環，當抗原結合分子的回收預期超過時，預澄清的文庫可以分成2個等分試樣(依賴於文庫計數，從50/50到80/20)。生物素化抗原可以添加到一個等分試樣(整體的50 - 80%)，而另一個等分試樣可以充當『無抗原』陰性對照。可替代地，洗滌的第二種預澄清珠也可以被視為『無抗原』對照，如上所述，只是它將具有一次較少的『預澄清』。如果抗原看起來『粘性』且在早期循環中觀察到顯著回收，那麼抗原濃度可以減少。此外，當抗原結合分子的回收變得顯著高於本底時(無抗原對照)，抗原濃度在隨後循環中可以減少。重要的是注意文庫和抗原之間的化學計量，以確保存在超過文庫PROfusion 分子的至少5倍摩爾過量的抗原，尤其是在較低抗原濃度下。C.文庫選擇捕獲
用於封閉Dynabeads用於文庫捕獲的選擇緩衝液可以通過離心和磁性分離去除。抗原結合的文庫可以轉移至預封閉的Dynabeads (與緩衝液分離)，並且隨後至結合反應，並且在 30°C旋轉20分鐘。用於捕獲的Dynabeads的量應如上所述基於珠容量和選擇中使用的靶抗原濃度進行計算。為了避免拉下珠粘合劑，當靶抗原濃度減少時，Dynabeads的量應減少 (但不小於500 yg或50 μ L)0D.文庫選擇洗滌
Dynabeads 可以通過離心和磁性分離與未結合的文庫分離。上清液可以用1 mL管尖取出，並且一個新過濾的管尖可以用於每個文庫選擇管，以消除交叉汙染。新移液管管尖可以用於由約1 mL選擇緩衝液洗滌Dynabeads 並且Dynabeads 可以通過輕輕移液或通過使管顛倒多次進行重懸浮。在處理下一個文庫時，管可以放回到磁支架上用於珠分離。在洗滌所有文庫後，上清液可以通過1 mL管尖取出(使用一個新過濾的管尖用於每個文庫選擇管，以消除交叉汙染)。對於5次洗滌可以重複這個步驟。Dynabeads 可以用1 mL IX第一鏈緩衝液(Superscript II，Invitrogen)如上所述洗滌2次。在末次洗滌時，如果需要如此，那麼取出文庫的1/10至分開管用於計數，以測定文庫回收。Dynabeads 可以通過磁性分離捕獲，並且可以保存約100 μ 1洗滌緩衝液用於本底計數。Dynabeads 可以重懸浮於水中，其中使用如上計算的％捕獲珠體積)。Ε.文庫選擇計數
可以如上文章節13 (E)中所述執行。15.通過抗原競爭的解離速率文庫選擇解離速率選擇和平衡選擇之間的主要差異是在FLAG純化前，文庫首先與選擇抗原結合。在FLAG純化後，文庫可以與過量競爭抗原或抗體(例如當競爭者抗原不可用時)溫育， 從而使得在解離速率競爭過程中變得與PROfusion分子不結合的任何預結合的抗原由競爭者替換。競爭者不同於預結合的抗原之處在於，競爭者結合的PROfusion分子不可以在後續回收步驟中回收。它們可以是未修飾的抗原或不同形式的抗原。儘管抗體也可以是競爭者，但一般地它們不是與抗原一樣有效的競爭者，並且它們的效率隨著文庫對於抗原的親和力增加而降低。恰好在選擇前測定文庫的解離速率是有利的，以鑑定競爭的適當持續時間。這種持續時間可以範圍從幾小時到幾周。A 具有生物素化抗原或抗原-Fc融合蛋白的預裝載文庫
PROfusion分子可以如上所述進行翻譯且通過寡脫氧胸苷酸進行純化。寡脫氧胸苷酸純化的文庫可以通過添加5X FLAG結合緩衝液至IX的終濃度(僅僅添加25%的文庫體積) 進行平衡。可以添加抗原(生物素化或Fc-融合物)至足夠高濃度，並且在30°C旋轉30分鐘，以飽和抗原-抗體結合。PROfusion分子可以通過抗FLAG M2瓊脂糖如上所述進行純化。重要的是應當指出FLAG純化的PROfusion文庫應保持在冰上，但不冷凍。重要的是如上所述預封閉足夠量的捕獲珠。B 測定競爭者濃度和文庫基線回收
可以計算來自上述步驟的回收的文庫的量，以測定其摩爾濃度。這代表文庫結合的抗原的最大限度量，並且可以用於計算對於解離速率競爭所需的量(500X至1000X)。10%預封閉的珠可以添加到來自抗原結合的PROfusion文庫的10%等分試樣，並且在約4°C旋轉約20分鐘。珠可以如上所述用1 mL選擇緩衝液洗滌5次。珠可以如下進行計數，以測定在解離速率選擇前通過抗原結合的PROfusion文庫百分比
回收％ = 100 X (CPM珠 / CPM輸入)X 10 C:文庫選擇競爭
1000倍摩爾過量的競爭者(例如未修飾的抗原或抗體)可以添加到FLAG純化的 PROfusion文庫，並且在約30°C旋轉預定持續時間，這將施加足夠的選擇壓力，以選擇具有更佳解離速率的克隆。使文庫在冰上冷卻約1 - 2分鐘，以減慢珠捕獲前的解離速率。D 文庫選擇捕獲
用於封閉Dynabeads用於文庫捕獲的選擇緩衝液可以通過離心和磁性分離去除。抗原結合的文庫可以轉移至預封閉的Dynabeads (與緩衝液分離)，並且在4°C旋轉約20分鐘。E 文庫選擇洗滌
Dynabeads可以通過離心和磁性分離從文庫中收集。上清液可以用1 mL管尖取出(使用一個新過濾的管尖用於每個文庫選擇管，以消除交叉汙染，如上所述)。珠可以用約1 mL IX第一鏈緩衝液(Superscript II，Invitrogen)如上所述洗滌 2次。在末次洗滌時，如果需要如此，那麼取出文庫的10 - 20%至分開管用於計數，以測定文庫回收。Dynabeads可以通過磁性分離捕獲，並且可以保存100 μ 1洗滌緩衝液用於本底計數。珠可以重懸浮於水中(如上計算的1/4捕獲珠體積)。F 文庫選擇計數和回收計算
可以計數10 - 20%的末次洗滌和珠。避免使用超過100 μ L珠是可取的，因為這可以猝滅計數。文庫選擇回收可以使用下式進行計算選擇回收％ = 100 X CPM總珠/ CPM總輸入 16.文庫選擇輸出的逆轉錄
逆轉錄可以用 Superscript II Reverse Transcriptase(Invitrogen )完成。每禾中反應的體積可以根據在選擇後的珠體積按比例擴大。輸出可以通過用合適引物對逆轉錄(RT) 進行分析。例如，『Ck反向，或『Ck5-FLAGA20 Rev』引物可以用於κ文庫，『CJL反向，或 『CL5FLAGA20 Rev，引物可以用於 λ 文庫，並且 『Lib_GS_Rev，或 『VH_GSFLAGA20-Rev，引物可以用於人PBMC VH文庫。逆轉錄引物應具有至少與後續PCR反向引物相同的5』末端序列，以避免從逆轉錄反應留下殘留引物，從而產生具有不同3』末端序列的擴增產物。如果較短『Ck反向』、『CJL 反向』或『Lib-GS-Rev』引物用於RT，那麼這是尤其重要的，因為任何殘留量的這些引物可以參與下述PCR，並且產生缺乏聚腺苷酸尾的產物。表1 用於擴增文庫選擇輸出的寡核苷酸引物
示例性RT反應條件
對於200 μ L最終體積的反應，RT反應可以如下設立
權利要求
1.一種篩選scFv抗體RNA展示文庫的方法，所述方法包括步驟(a)提供嘌呤黴素或其類似物交聯的單鏈Fv(scFv) mRNA分子，所述分子包括編碼5』 scFv和3』間隔區序列的mRNA，所述分子與單鏈核酸接頭交聯，所述接頭包括在3』末端上的嘌呤黴素或其類似物和在5』末端上的補骨脂素C6 ；(b)在標記的存在下，在使得形成標記的嘌呤黴素交聯的scFvmRNA/蛋白質分子的條件下，體外翻譯所述嘌呤黴素交聯的scFv mRNA ；(c)純化所述標記的嘌呤黴素交聯的scFvmRNA/蛋白質分子；(d)用至少一種抗原對所述純化的標記的嘌呤黴素交聯的scFvmRNA/蛋白質分子實施抗原選擇；和(e)使用基於親和力的磁珠回收所述純化的標記的嘌呤黴素交聯的scFvmRNA/蛋白質分子。
2.權利要求1的方法，其進一步包括步驟(g)在抗原選擇後使所述scFvmRNA逆轉錄， 以製備cDNA。
3.權利要求2的方法，其進一步包括步驟(h)擴增所述cDNA。
4.利要求1的方法，其中所述標記是放射性標記。
5.利要求4的方法，其中所述標記是35S甲硫氨酸或半胱氨酸。
6.利要求1的方法，其中所述3』間隔區序列包括約0-約200個胺基酸。
7.利要求1的方法，其中所述3』間隔區序列包括約16個胺基酸。
8.利要求1的方法，其中所述3』間隔區序列包括親和標記。
9.權利要求1的方法，其中所述核酸接頭從5』到3』包括 -補骨脂素C6 ；-包括序歹Ij UAGCGGAUGC (SEQ ID NO 20)的 2，OMe 核糖核苷酸； -6個三甘醇或PEG-150部分； -2個脫氧胞苷殘基；和 -嘌呤黴素。
10.權利要求1的方法，其中所述scFvmRNA分子通過UVA與所述DNA接頭光交聯。
11.權利要求1的方法，其中所述scFvmRNA分子包括選自T7、SP6和T3的5』啟動子。
12.權利要求1的方法，其中所述scFvmRNA分子包括菸草花葉病毒5』非翻譯區。
13.權利要求1的方法，其中通過寡脫氧胸苷酸層析純化所述標記的嘌呤黴素交聯的 scFv mRNA/蛋白質分子。
14.權利要求1的方法，其中使用抗FLAGM2單克隆抗體瓊脂糖珠純化所述標記的嘌呤黴素交聯的scFv mRNA/蛋白質分子。
15.權利要求1的方法，其中通過寡脫氧胸苷酸層析和抗FLAGM2單克隆抗體瓊脂糖珠純化所述標記的嘌呤黴素交聯的scFv mRNA/蛋白質分子。
16.權利要求1的方法，其中所述抗原是生物素化肽、蛋白質或半抗原。
17.權利要求1的方法，其中所述抗原是具有人免疫球蛋白可結晶片段(Fe)的融合蛋 白。
18.權利要求1的方法，其中所述抗原是具有鼠免疫球蛋白可結晶片段(Fe)的融合蛋白。
19.權利要求1的方法，其中所述抗原是生物素化肽、蛋白質或半抗原。
20.權利要求1的方法，其中所述抗原是細胞群體。
21.權利要求1的方法，其中所述抗體是抗IL-12抗體。
22.權利要求1的方法，其中所述抗體是抗HA抗體。
23.權利要求1的方法，其中所述抗體是鼠抗體。
24.權利要求1的方法，其中所述抗體是人抗體。
25.權利要求1的方法，其中所述抗體是人源化抗體。
26.權利要求I-M中任一項的方法，其中另外在GSSH/GSH的存在下執行所述嘌呤黴素交聯的scFv mRNA的體外翻譯。
27.權利要求沈的方法，其中另外在蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)的存在下執行所述嘌呤黴素交聯的scFv mRNA的體外翻譯。
28.權利要求I-M中任一項的方法，其中另外在不存在二硫蘇糖醇的情況下執行所述嘌呤黴素交聯的scFv mRNA的體外翻譯。
29.權利要求27的方法，其中另外在不存在二硫蘇糖醇的情況下執行所述嘌呤黴素交聯的scFv mRNA的體外翻譯。
30.權利要求1的方法，其中所述方法不包括mRNA加帽步驟。
31.權利要求1的方法，其中所述方法不包括在所述純化步驟前的體外逆轉錄步驟。
32.權利要求1的方法，其中在步驟(a)到(g)中的任何一個之前、期間或之後添加RNA 酶抑制劑。
33.權利要求1的方法，其中所述純化步驟包括在不存在二硫蘇糖醇(DTT)的情況下的所述mRNA逆轉錄，以產生cDNA。
34.權利要求2或33的方法，其中通過在約pH=8.0 -約pH=10. 0的鹼水解洗脫所述 cDNA。
35.權利要求2或33的方法，其中通過熱洗脫所述cDNA。
36.權利要求2或33的方法，其中通過在約pH=3.0 -約pH=6. 0的酸洗脫所述cDNA。
37.權利要求33的方法，其中通過聚合酶鏈反應擴增所述cDNA。
38.權利要求37的方法，其中所述聚合酶鏈反應採用熱穩定的DNA聚合酶。
39.權利要求37的方法，其中所述聚合酶鏈反應採用選自PlatinumHiFi和KOD的擴增酶。
40.權利要求1的方法，其中所述珠選自鏈黴抗生物素蛋白_iC80、中性抗生物素蛋白-M280、SA-M270、NA-M270、SA-MyOne、NA-MyOne、SA-瓊脂糖、和 NA-瓊脂糖。
全文摘要
本發明的特徵在於體外RNA展示的改良方法，以允許從表達文庫中可靠表達和選擇scFv抗體分子。改良方法部分涉及溫和還原條件的使用，這有利於scFv鏈內二硫鍵且從而有利於scFv抗體分子的正確摺疊。儘管特別適合於表達和選擇scFv抗體分子，但本發明的方法對於所有類別蛋白質的體外RNA展示也是有利的。
文檔編號G01N33/53GK102227638SQ200980147651
公開日2011年10月26日 申請日期2009年9月30日 優先權日2008年9月30日
發明者C·謝, J·E·梅莫特, Y·A·庫茨科瓦 申請人:雅培製藥有限公司