一種海參幼體的螢光標記方法
2023-07-07 06:29:51 2
專利名稱：一種海參幼體的螢光標記方法
技術領域：
本發明屬於海洋生物的標記方法領域，特別涉及一種海參幼體的螢光標記方法。
背景技術：
海參是珍貴的海產品之一，野生的海參資源日益匱乏。通過人工增殖放流是恢復野生海參資源的重要方法。為了評估增殖放流效果，需要定期回捕放流個體，因此必須有效區分人工增殖個體與野生個體。海參身體含有較高的自溶酶，國內外研究表明，採用傳統的物理標記，如在體表穿刺、皮下埋植標記，穿刺或埋植部位容易發生炎症反應，附著物很快被清除，達不到有效標記的目的。
發明內容
本發明克服了現有技術的缺陷，提供了一種簡便、安全的海參幼體的螢光標記方法。本發明是通過以下技術方案實現的一種海參幼體的螢光標記方法，其特徵在於使用鈣黃綠素溶液標記海參幼體。海參幼體為3-10g的小型個體時，鈣黃綠素溶液是通過浸泡的方式標記海參幼體；浸泡步驟為 將待標記的海參幼體置於裝有海水的不透光容器中，加入鈣黃綠素溶
液；②黑暗環境下將海參幼體在濃度為200mg/L的鈣黃綠素海水溶液混合液中浸泡20-24 小時後，用新鮮的海水置換容器內的混合液，幼體標記完成。當海參幼體為10_30g的大型個體時，鈣黃綠素溶液是通過注射的方式標記海參幼體；注射步驟為將待標記的海參幼體置於裝有4/5容器體積海水的不透光容器中，將
濃度為200mg/L的鈣黃綠素溶液注射入海參幼體體腔,②黑暗環境下將注射過鈣黃綠素溶
液的海參幼體放置20-24小時，用新鮮的海水置換容器內的混合液，幼體標記完成。鈣黃綠素溶液由鈣黃綠素母液稀釋而成；鈣黃綠素母液由鈣黃綠素和滅菌水配製成；鈣黃綠素母液濃度為200mg/ml，於4°C避光保存。浸泡標記法裡的海水或鈣黃綠素海水混合液的水體溶解氧濃度不小於5. Omg/L ； 注射標記法裡的海水的水體溶解氧濃度不小於5. Omg/L。使用浸泡方法時，新鮮海水置換混合液的方法為每隔8小時向容器內添加等體積的新鮮海水，添加3次。使用注射方法時，注射鈣黃綠素溶液使用劑量為0. 3-0. 5 ml/尾海參幼體；注射部位為海參體後三分之一位置的體側。海參的體壁分布了大量的骨片，骨片主要成份為碳酸鈣，針對這一特性，本發明通過鈣黃綠素在黑暗環境浸泡或者注射的方式將其置入海參體腔進行標記。標記後海參幼體體壁中50%以上的骨片將染上鈣黃綠素，通過紫外光手電筒在暗環境現場照射檢測，標記個體的體表產生螢光，或取少量組織分離骨片，通過螢光顯微鏡對海參骨片檢測，可以看到標記個體的部分骨片產生螢光，而野生個體的骨片不會產生螢光。與現有技術相比，本發明的有益效果為
(1)本發明的標記方法不會影響海參幼體的攝食與生長。(2)本發明的標記方法長久耐用，標記可有效保持12個月以上，此種標記方法12 個月以後標記個體的骨片螢光檢出率仍在5%以上。(3)本發明的標記方法是安全有效的海參人工增殖放流化學標記法。由於商品海參一般需要經過2年以上的養殖才能達到上市規格，而本發明的標記物質將通過海參的新陳代謝在2年內從海參幼體體內徹底清除，不會影響食品安全。
具體實施例方式實施例1
取個體平均重量為4. 50g的糙刺參幼體，採取浸泡方式標記，具體實施方式
如下 1、將鈣黃綠素(Calcein)用滅菌水配製成200mg/ml濃度的母液，於4°C避光保存。2、將欲標記的海參幼體收集，置於50L體積的不透光敞口盆，加海水10L，並連續充氣，使水體溶解氧達到5. Omg/L。3、將IOml鈣黃綠素母液添加至敞口盆海水中，使終濃度為200mg/L，輕輕攪動使母液分布均勻。4、用遮光布將敞口盆遮光，並保持連續充氣，使水體溶解氧達到5. Omg/L，放置22 小時。5、放置22小時後，向盆內添加IOL新鮮海水，每隔8小時再添加1次，共添加3次。6、用新鮮的海水置換盆內的所有海水，幼體標記完成。7、檢驗標記效果，用紫外光手電筒在黑暗環境照射，標記過的幼體發出黃綠色的螢光；或取標記過的幼體少量皮膚組織於培養皿中，用3%的次氯酸鈉溶液將組織溶解析出骨片，用蒸餾水清洗骨片後在螢光顯微鏡下觀察骨片，可以看到部分骨片發出黃綠色的螢光。隨機選擇不同視野計數，發光骨片的比率為52. 3%至54. 9%。8、將浸泡標記過的海參幼體與同批次未標記的幼體放在同一個養殖池中，採用同樣的方法養殖M個月，每3個月分別隨機各取30尾測量體長體重，並計數兩者的成活率， 檢測標記個體的發光骨片比率，結果證實，螢光標記個體的體長、體重及成活率與未標記個體無顯著差異；第6、12、18、24月的骨片發光率分別為21. 8%、7· 6%、2· 5%和0%。實施例2
取個體平均重量為15. 40g的糙刺參幼體，採取注射方式標記，具體實施方式
如下 1、將鈣黃綠素(Calcein)用滅菌水配製成200mg/ml濃度的母液，於4°C避光保存。2、將欲標記的海參幼體收集，置於50L體積的不透光敞口盆，加海水40L，並連續充氣，使水體溶解氧達到5. Omg/L。3、在黑暗環境下，取0. Iml鈣黃綠素母液於乾淨的燒杯中，用99. 9ml滅菌海水將母液稀釋，使終濃度為200mg/L，避光保存。4、用2ml的無菌注射器吸取稀釋後的鈣黃綠素稀釋溶液，按每尾0. 3ml的劑量注射入海參體腔，注射部位為海參體後三分之一位置的體側。5、用遮光布將敞口盆遮光，並保持連續充氣，使水體溶解氧達到5. Omg/L，放置20小時。6、用新鮮的海水置換盆內的所有海水，幼體標記完成；
7、檢驗標記效果，用紫外光手電筒在黑暗環境照射，標記過的幼體注射部位會發出黃綠色的螢光。8、將浸泡標記過的海參幼體與同批次未標記的幼體放在同一個養殖池中，採用同樣的方法養殖24個月，每3個月分別隨機各取30尾測量體長體重，並計數兩者的成活率， 檢測標記個體的發光骨片比率，結果證實，注射螢光標記個體的體長、體重及成活率與未標記個體無顯著差異 』第6、12、18、24月的骨片發光率分別為20. 3%、6· 5%、1· 7%和0%。
權利要求
1.一種海參幼體的螢光標記方法，其特徵在於使用鈣黃綠素溶液標記海參幼體。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於當海參幼體為3-10g的小型個體時，鈣黃綠素溶液是通過浸泡的方式標記海參幼體；浸泡步驟為 ①用海水稀釋鈣黃綠素溶液成為濃度為200mg/L的鈣黃綠素海水溶液；￡黑暗環境下將海參幼體在濃度為200mg/L的鈣黃綠素海水溶液混合液中浸泡20-M小時後，用新鮮的海水置換容器內的混合液，幼體標記完成。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於當海參幼體為10-30g的大型個體時，鈣黃綠素溶液是通過注射的方式標記海參幼體；注射步驟為>t將待標記的海參幼體置於裝有海水的不透光容器中，將濃度為200mg/L鈣黃綠素溶液注射入海參幼體體腔，②黑暗環境下將注射過鈣黃綠素溶液的海參幼體放置20-M小時，用新鮮的海水置換容器內的混合液，幼體標記完成。
4.如權利要求2或3所述的任一方法，其特徵在於所述的鈣黃綠素海水溶液或鈣黃綠素溶液由鈣黃綠素母液稀釋而成；鈣黃綠素母液由鈣黃綠素和滅菌水配製成；鈣黃綠素母液濃度為200mg/ml，於4°C避光保存。
5.如權利要求2或3所述的任一方法，其特徵在於所述海水或鈣黃綠素海水混合液的水體溶解氧濃度不小於5. Omg/L。
6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於注射鈣黃綠素溶液使用劑量為0.3-0.5 ml/ 尾海參幼體；注射部位為海參體後三分之一位置的體側。
全文摘要
本發明提供了一種海參幼體的螢光標記方法。海參是珍貴的海產品之一，野生的海參資源日益匱乏。通過人工增殖放流是恢復野生海參資源的重要方法。為了評估增殖放流效果，需要定期回捕放流個體，如何有效區分人工增殖個體與野生個體，建立標記方法，成為行業急需。海參的體壁分布了大量的骨片，骨片主要成份為碳酸鈣，針對這一特性，本發明提供了一種海參幼體的螢光標記方法，通過使用200mg/L濃度的鈣黃綠素，在黑暗環境浸泡海參幼體20-24小時；或者通過注射的方式將200mg/L濃度的鈣黃綠素注射入海參體腔進行標記。標記後體壁中50%以上的骨片將染上鈣黃綠素，且養殖1年後標記個體的骨片螢光檢出率仍在5%以上。此種標記方法不會影響海參幼體的攝食與生長，經2年後標記物鈣黃綠素將通過海參的新陳代謝徹底清除體內。
文檔編號A01K61/00GK102165924SQ20111002282
公開日2011年8月31日 申請日期2011年1月20日 優先權日2011年1月20日
發明者夏建軍, 張呂平, 胡超群, 趙哲 申請人:中國科學院南海海洋研究所