N-(膦醯基乙醯基)-l-天冬氨酸組合物及其作為廣譜抗病毒的使用方法
2023-07-20 14:28:11
專利名稱：N-(膦醯基乙醯基)-l-天冬氨酸組合物及其作為廣譜抗病毒的使用方法
技術領域：
本發明涉及治療多種人和動物(包括鳥類)病毒感染的方法，其所使用的藥物製劑中的活性成份由N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸(PALA)或其藥物許可的類似物組成。這些組合物具有有效的廣譜抗病毒活性而且既可單獨使用也可與其它的治療劑一起使用，從而治療病毒感染。
PALAPALA是一種化合物，最初是作為天冬氨酸轉氨醯酶的過渡階段類似物抑制劑而進行研製的。見Stark等人，(1974)J.Biol.Chem.2466599。隨後，PALA(NSCNO.224131作為抗癌劑被徹底地研究過。參見例如Johnson等人(1976)CancerRes.362720-2725;Erlichman等人(1982)J.Nat.CancerInst，68227-231。
PALA、其鹽類和類似物，及其製備過程已描述於Schultz等人的美國專利4，179，464、4，215，070、4，267，162、4，348，522，和英國專利GB2008118和GB2051070以及Parsons等人的美國專利4，154，759和4，178，306中。
N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸(PALA)從一開始就抑制嘧啶的生物合成，其原因在於它阻斷了酶，L-天冬氨酸轉氨甲醯酶(ATCase)一這種酶能催化L-天冬氨酯和氨甲醯磷酸的縮合，這一縮合作用是乳清酸和終產品尿苷的合成中所必需的。該抑制作用的最終結果是缺失核苷酸庫，即UTP、CTP以及核苷酸中間產品，即UDP-GlcN、CMP-NeuNAc，這些核苷酸中間產品對於延長低聚糖鏈是必不可少的。見Johnson，R.K.，Aeon，T.，Golden，A.和Stark，G.R.(1985)J.Med.Chem.282720-262。ClinicalBrochure，NSCNo.224131，Div.ofCarnerTreatment，NationalCancerImstitute，Bethesda，MD.1977。因此，當PALA主要通過抑制核苷酸的生物合成而起作用時，其對中間產品的影響也會反映到它的終產品碳水化合物、蛋白質以及核苷酸(RNA和DNA)上。
PALA以氨甲醯磷酸的競爭抑制劑和天冬氨酸的非競爭抑制劑形式而發揮作用。見Hooengraad，N.J.(1974)Arch.Biochem.Biophys.16176-82。其Ka值是天然酶作用物，氨甲醯磷酸的1000倍。見Moore，E.C.，Friedman，J.，Valdivieso，M.，Plunkett，W.Marti，J.R.等人，(1982)BiochemPharmacol.313317-3321。因為它相對地缺少毒性和一些堅固鼠腫瘤系的敏感性，所以PALA已用於實驗腫瘤學研究中。最近的研究表明當與滷代嘧啶例如5-氟尿嘧啶一起在體外和體內使用時，PALA具有獨特的調節活性。見Liang，C.，Donchower，R.C，Chabner，B.A.(1982)Mol，Pharmacol.21224-230;Ardalan，B.，Galzer，R.I.，Kensler，T.W.等人，(1981)Biochem.Pharmcol.302045-2049;Anakarahanonta，T.，Holstege，A.和Keppler，D.O.R.(1980)Eur，J.Cancer161171-1180。最近，PALA作為嘧啶生物合成抑制劑已被公開，它可用於處理自免疫疾病、慢性炎症和器官移植排斥。參見國際申請PCT/US90/05942，WO91/06863，於1991年5月16日公開。
該文獻的一篇評論表明PALA在單獨用於治療癌症(瘤)時在臨床上效果較差。見Valdivies，M.，Moore，E.C.，Burgess，A.M.，Marti，J.R.，Russ，J.Plunkett，W.(1980)CancerTreat.Rep.461301-1305;Ehrichman，C.，StrongJ.M.，Wiernik，P.H.，McAvoy，L.M.，Cohen，M.H.，Levine，A.S.，Hubbard，S.M.，和Chabner，B.(1979)CancerRes.393992-3995;Grem，J.L.King，S.A.，ODwyer，P.J.和Leyland-Jones，B.(1988)Cancer.Res.484411-4454。
一篇涉及膦醯基乙酸(「PAA」)及其類似物的結構活性關係的報告已經問世(Mao，J.C.H.等人，1985，Antimicrob.AgentsChemother.27(2)197-202)。這些工作者們發現PAA是一種選擇性的抗皰疹病毒試劑並且還發現PAA的誘導作用導致較低的活性而無一例外。尤其是，發現PALA的效果顯著低於親代PAA，其倍數在200以上。
抗病毒藥物的一般發展自從人們發現了滷代核苷酸能作為抗病毒用於皰疹角膜炎的治療以來，在開發用於合成鏈終止劑的複雜工藝之前，有一段很長的滯後期，所述鏈終止劑例如用於HSV的無環鳥苷、2′，3′-二脫氧胸苷類似物例如用於HIV的AZT，ddⅠ，和ddc;用於拉薩熱(Lassa fever)、Hantaan和呼吸合胞病毒的三氮唑核苷(vizazole
);碳環核苷酸、cyclobut-A，它們都對HIV和皰疹病毒(CMV、HSV、水痘)具有廣譜抗病毒活性，還有無環核苷酸，膦醯基-甲氧基乙基腺嘌呤(PMEA)，它們在很寬範圍內具有抗RNA和DNA病毒性。許多這類化合物已經被證明在臨床使用時有劇毒和/或迅速導致抗藥菌株的發育;其中後面的這些病毒，有許多似乎表現出對對照化合物的交叉抗性，例如AZT與ddC，同時;藥品抗性或毒性的發展導致使用組合療法，開始是為HIV，以達到附加和/或協同效應。見Larder，B.A.，Purifoy，D.J.M.，Powell，K.L.和Darby，G.(1987)Nature(Lond)327716-717。DeClercq，Erik E.(1987)Cancer Res.71023-1038。
另外一種抗病毒是2-脫氧-葡萄糖(2-dGlc)，它公開於US4，315，001中。這種化合物對抗「外來」RNA病毒(例如，不是美國固有的那些病毒)幾乎沒有取得成功，據推測可能是因為N-連接糖基化過程在感染過程中似乎沒有起到主要的作用(還有一個事實是在後者基因上只有很少一些低聚糖鏈)。然而，Blough，H.A.，Kefeuver，D.Clausen，H.和Hausen，J.-S(1991)在Proc.Amer.Soc.Trop.Med.Hyg.45168Boston，MA(摘要)中最近報導了原始碳水化合物中一種新抗原的存在，它可能是O-連接在白蛉熱(SFB)和黃熱病(YE)病毒粒子上的;用特異單克隆抗體予處理這些RNA病毒，(對這些碳水化合物)可以中和這些本雅(bunya-)病毒和黃熱病病毒(flaviviruses)。
人們已經知道了一些與HIV的RT結合的新藥和防止病毒融合，以及由此防止病毒進入的糖基化作用抑制劑(例如，2-dGlc)。還已知了細胞激動素(cytokines)(例如幹擾素)、調節基因的抑制劑、阻斷流行性感冒病毒脫殼的金剛胺(adamantidine)和以受體水平為目標的新化合物。然而，很清楚的是在本發明的時候，人們尚不認為廣譜抗病毒是可能的，這主要是因為被公認的毒性以及缺少「目標」。許多新途徑是遺傳學的和/或分子的;反義或無義的寡聚物，用遺傳工程的和/或合成的肽作疫苗，和/或目標蛋白酶抑制劑-都以單病毒為目標(即，那些具有單一的或專門的核苷酸和/或胺基酸序列的)。
考慮到本領域的目前狀態，人們希望有一種廣譜抗病毒試劑，它既能單獨使用也能與其它治療結合使用，特別是與另外的抗病毒一起使用，從而治療或防止病毒感染。很清楚，就結合治療而論，這樣的一種廣譜抗病毒試劑可以降低現時使用的抗病毒的毒性或有害作用，由此提供了較好的治療指數。
本發明涉及治療或防止人、動物和鳥類病毒感染的方法，它採用有效量的PALA或藥物許可類似物，單獨使用或與其它治療試劑一起使用均可。本發明另一方面涉及用於治療或防止人或獸類病毒感染的藥物組合物和配方，其中所述組合物包含有效量的PALA或其藥物許可的類似物。本發明部分是基於這樣一個發現，即雖然據報導PALA在單獨使用時，在治癌方面相當無效，但當PALA用作抗病毒時其反面卻是真實的，即單獨使用時，PALA具有廣譜抗病毒活性，而當它與其它藥物(包括但不限於抗病毒試劑和/或病毒複製抑制劑)一起起作用時，則PALA具有附加的和/或協同效應。
因此，本發明的目的是提供一種抗病毒化合物，該化合物對廣譜抗病毒是有效的。
本發明第二個目的是提供組合治療，該治療能阻止病毒對PALA抑制作用的可能迴避。另外，本發明進一步的目的是提供組合治療，它能降低PALA和/或與PALA一同使用的治療試劑的毒性。
本發明第三個目的是治療遭受病毒(包括反轉錄病毒)感染(或可能向病毒暴露的)的人、動物和鳥類的方法，並且提供防止在人、動物和鳥中發生這類感染(化學預防)的方法。
本發明的第四個目的上提供用於治療遭受病毒感染的(或可能向病毒暴露的)人、動物和鳥類的藥物組合物。對於防止在人、動物和鳥類中發生這類傳染，這種藥物組合物也是有效的。
本發明第五個目的是提供廣譜抗病毒化合物，它具有低水平的毒性，因而具有較高的治療指數。
本發明第六個目的是提供廣譜抗病毒試劑，當將它單獨或與其它藥物(包括但不限於抗病毒試劑和/或病毒複製抑制劑)結合使用時，它對於抗藥性病毒菌株具有極好的使用價值。
本發明第七個目的是提供藥物許可的PALA類似物，口服給藥時它能顯示出抗病毒活性。
根據本說明書和所附權利要求書，本發明的種種目的對於所屬技術領域的一般技術人員來說是明顯的。
圖1是AD169HCMV滴定圖，它是由對接種DHPG(ganciclovir)後的上清液測試中獲得的。
圖2是與AD169細胞結合的HCMV滴定圖，它是由接種DHPG、PALA後或空白對照物的經過超聲處理的細胞球獲得的。
圖3是HCMV臨床分離物滴定圖，它是由接種DHPG、PALA後或空白對照物的上清液測試中獲得的。
圖4是與HCMV細胞結合的臨床分離物滴定圖，它是由接種DHPG、PALA後或空白對照物的經過超聲處理的細胞球獲得的。
圖5是HCMVDHPG抗性分離物滴定圖，它是由對接種DHPG、PALA後或空白對照劑的上清液測試中獲得的。
圖6是與HCMV細胞結合的DHPG抗性病毒滴定圖，它是由接種DHPG、PALA後或空白對照劑的經過超聲處理的細胞球獲得的。
圖7是在下文例5動物中發現的玻璃體炎嚴重程度的條形圖。
圖8是例6中單一和結合試劑治療組中的平均玻璃體炎嚴重程度的條形圖。
圖9是例7治療組中發現的平均玻璃體炎病嚴重程度的條形圖。
圖10是例7治療組中平均視神經疾病嚴重程度的條形圖。
圖11是PALA、PALA+三氮唑核苷和對照治療組的病毒滴定度條形圖。
圖12是PALA、利福平和PAL+利福平治療組的疫苗損害等級分的標繪圖。
圖13是治療組PALA、利福平和PALA+利福平的牛痘病毒滴定度對數的標繪圖。
本發明涉及治療人類和動物，包括鳥類廣譜抗病毒感染的方法，它包括向需要治療或防止病毒感染的人或動物體施用有效量的PALA或其藥物活性的類似物。本發明方法還包括組合治療法，其中PALA和至少一種別的治療藥劑作為混合物或按次序給藥。本發明還涉及藥物組合物，其活性成分包括化合物PALA或適當的類似物，並且任選地可與至少一種用於治療人、動物和鳥類病毒感染的選定的藥品以混合物形式使用。
本發明部分是基於這樣一個發現，即PALA是一種據報導在單獨使用時對治療癌症無效的藥品，但當作廣譜抗病毒使用時卻有效。當單獨使用或與別的藥品一塊使用時，都證明PALA作為抗病毒劑用於人和獸類中具有普及利用價值。
用PALA治療病毒感染病毒，按其定義屬於專性胞內寄生蟲，它取代寄主細胞組織機構並利用現存的胞內結構，如多核蛋白體、內質網、高爾基體和特定的寄主細胞大分子，即酶、tRNA等，來產生病毒mRNA的模板或轉錄體。利用特有的聚合酶可轉錄病毒核酸，而利用病毒mRNA可翻譯病毒蛋白(結構的和非結構的)。還可以進行轉譯後的修飾(通過蛋白酶裂解和糖基化作用)。病毒組合可以再次發生(裸病毒粒子)或採用可將重複表面突出物(粘蛋白)包埋在其中的脂質膜。在後一情況下，被膜包圍著病毒粒子。
適宜根據本發明用PALA處理的病毒包括所有的已知病毒的型和類，其中包括DNA和RNA病毒(陽性和陰性鏈狀病毒)。PALA能用於抗DNA和RNA病毒和病毒類型，它們包括但不限於下列腺病毒(Adenoviruses)痘病毒(Poxviruses)牛痘(Vaccinia)
軟疣接觸傳染病毒(molluscumcontagiosumvirus)牛痘病毒構建物(vacciniaviralcontructs)本雅病毒(Bunyaviruses)立夫特山谷熱病毒(Riftvalleyfevervirus)白蛉熱病毒(Sandlyfevervirus)登革熱病毒(Dengucviruses)疣特託羅(PuntaToro)黃熱病病毒(Flavivirus)黃熱病病毒(yellowfevervirus)流行性乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus)皰疹病毒(Herpesviruses)巨細胞病毒(cytomegalovirus(CMV))水痘(Varicella)人皰疹病毒-6(humanherpesvirus-6)Mare′x疾病病毒(獸類)馬貧血病毒(Equineanemiavirus)皰疹病毒1和2(herpesviruses12)愛潑斯坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-BarrVirus)副粘液病毒(Paramyxoviruses)呼吸合胞體病毒(respiratoryeymcytialvirus)麻疹病毒(measlesvirus)副流感病毒(parainflnenzaviruses)牛瘟病毒(rinderpestvirus(獸類))新城疫病毒(Nencastlediseasevirns(獸類))
腮腺炎病毒(mumps)流感病毒(ortlomyxoviruses)流感A(H2N2 H3N2流感B(某些菌株)流感C肝炎病毒(Hepadmaviruses)B型肝炎其它肝炎病毒(未完全分類)A型肝炎(HAV)C型肝炎(HCV)肝炎E(HEV)細小核糖核酸病毒(Picornaviruses)脊髓灰質炎病毒(Polioviruses)柯薩奇病毒(Coxsackieviruses)埃可病毒(ECHOviruses)口蹄疫(footmouthdisease(EMDV)(獸類)鼻病毒(rhinoviruses)棒狀病毒(Rhabdoviruses)狂犬病病毒(rabienvirus)外衣病毒(Togaviruses)委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒(Venezueleanequineencephalitisvirus)絲狀病毒(Filoviruses)歐鮑拉病毒(Ebolavirus)
馬堡病毒(Marburgvirus)乳多空病毒(Papovaviruses)人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus)風疹樣病毒風疹病毒(rubellavirus)斑狀病毒(orbiviruses)科羅拉多蜱熱病毒(Coloradotickvirus)胡寧和馬體波病毒(JuninMachupoviruses)Hantaan病毒Hantaan出血熱病毒(Hataanhenurrhagiofevervirus)剛果/克裡米亞出血熱病毒(congo/crimeanhemorrhagiofevervirus)反轉錄病毒和豆狀病毒(Lentiviruese)HTLV1和2HIV1和2當用於本文時，術語「病毒感染」說明一種病態，其中一種病毒侵入健康的細胞，利用該細胞的繁殖「機構」去重複或複製且最終溶解該細胞導致細胞死亡，釋放出病毒粒子以及使其它細胞受到所產生的子代病毒的感染。受某些病毒的潛伏感染也是產生病毒感染的一個可能後果。很清楚所屬技術領域的一般技術人員應當理解這些術語的涵義和與它有關的疾病和/或感染。
此外，當用於本文時，短語「治療或防止人、動物或鳥類病毒感染」意思是抑制特定病毒的複製或防止病毒本身構建於其寄主中以及改善或減輕由病毒感染引起的疾病症狀。
當用於抗這些病毒時，PALA及其藥物許可的類似物可單獨使用也可與另外的治療試劑一起使用。現已發現當治療皰疹病毒時，最好PALA與另外的治療試劑如抗病毒無環鳥苷或ganciclovir一塊使用。在組合治療皰疹病毒中使用PALA或藥物許可類似物，其效果將超過現在所能得到的治療;例如可以降低現時用於治療這些病毒感染的抗病毒的毒性。另外，PALA或其藥物許可類似物，對具有抗藥性的皰疹病毒菌株具有獨特的使用價值，如對於無環鳥苷或ganciclovir。此外，PALA或其藥物許可類似物在延期或阻斷抗性病毒菌株，如DHPG或無環鳥苷的發展方面也是有用的。
還發現PALA或其藥物許可類似物能單獨使用或與另外的藥物如抗病毒的利福平一塊使用，以用於治療或防止由牛痘病毒或用於製備疫苗的牛痘病毒構建物引起的感染。涉及使用牛痘構建物的職業危害性由此而降至最低。通常，使用PALA或其藥物許可類似物可使受到免疫損害的個體得以保護或治療。
還發現PALA或其藥物許可類似物，作為單一的體內治療呼吸合胞體病毒的試劑較三氮唑核苷更加有效。
五種主要的病毒性肝炎已被鑑定(Consolo和Freni，Nephron61252-254，1992)，它們代表不同的病毒(DNA和RNA)分子組。這些病毒性肝炎病毒是A型肝炎(HAV)、B型肝炎(HBV)、C型肝炎(非甲、非B型肝炎或HCV)、肝炎D(δ因子或HDV)以及肝炎E(HEV)。廣譜抗病毒是一種理想的抗這些病毒的試劑，這是因為它們在遺傳上和分子上存在著相異性。使用PALA或其藥物許可類似物(或單獨或與另外的治療藥劑，包括另外的抗病毒一塊使用)去治療或防止由A型肝炎、C型肝炎和B型肝炎引起的病毒感染屬於本發明的範圍之內。尤其是，PALA能單獨使用，也能與DHPG(ganciclovir)、膦醯基甲酸酯、3TC(BiochemPharmaGlaxo)、α-幹擾素(α-2bIF)或甾類化合物一塊使用，上述這些藥物都是通常用於阻斷肝炎發炎反應，治療或預防由B型肝炎引起的病毒感染的藥物。
為了說明其廣譜抗病毒活性，我們對PALA抗大量病毒，例如有軍用意義的病毒，如黃熱(flavi-)、本雅(buya-)和外衣病毒(togaviruses)的情況進行了檢測並且在內含牛痘病毒的篩子中對PALA進行了檢測。後者病毒的存在具有異乎尋常的意義，這是因為此時廣泛採用了質粒構造物，在該構造物中牛痘被用作為載體來產生活疫苗。隨後實驗由黃熱一、外衣-和本雅病毒向涉及美國大陸公共健康重要意義的病毒方面擴展，如粘液病毒、皰疹病毒(CMV，水痘)副粘病毒和正極性RNA病毒(細小核糖核酸病毒)以及反轉錄病毒。儘管不限於任何理論，但我們相信PALA是通過抑制副嘧啶生物合成，即ATCase的早期步驟，結果使核苷酸庫減少，或通過抑制病毒DNA聚合酶，結果產生如下表1-3中所示的活性而發揮其抗病毒作用。
此外，我們還對PALA對在初級鴨肝細胞培養基內的鴨B型肝炎;非洲綠猴體內的猴水痘病毒的感染;非洲綠猴體內牛痘病毒;以及在兔子體外和體內人類巨細胞病毒(HCMV)的抵抗情況進行了測試。由這些研究所得到的結果將描述在下文的各實例中。
PALA可與另外的治療試劑一塊使用，以便能提高所達到的抗病毒效果。例如，這些附加的抗病毒試劑包括但不限於在與病毒複製有關的不同靶分子上起作用的那些試劑;在同種分子不同位置上起作用的那些試劑;能抑制補救途徑(下文說明)從而防止或降低病毒抗性出現的試劑。
當PALA或PALA藥物許可類似物用於組合治療中時，最好將PALA與其它治療試劑分開但持續地給藥，另外，還可間歇地施用PALA。
雖然病毒有自己的DNA或RNA聚合酶，但比較複雜的病毒，即皰疹病毒和痘病毒，(僅少量舉例)還具有負責核苷酸生物合成的單個酶，例如轉磷酸核糖基酶或核苷酸磷酸化酶，這些酶也可以作為寄主細胞酶存在。這些酶可賦予嘧啶合成另一種路線或「補救途徑」，從而迴避了抗病毒試劑的抑制作用。因此，正如某些瘤的情況那樣，可能會出現對抗病毒化合物的病毒抗性，但這種可能性可以通過組合治療而避開，例如將核苷酸類似物與PALA及其它抗病毒試劑結合使用，所述的核苷酸包括但不限於腺嘌呤阿糖苷、腺嘌呤阿糖苷單磷酸、碘苷、三氟胸苷、無環鳥苷(acycloquanosine)、溴乙烯基脫氧尿苷、溴乙烯基脫氧阿拉伯尿苷(bromovinyldeoxyarauridine)(Bristol-Myers Squibb的BvaraV)、氟碘阿拉伯胞嘧啶(fluoroiodoaracytosine)、DHPA和三氮唑核苷(vizazole
)、糖基化抑制劑(如2-dGlc)、蛋白酶抑制劑、幹擾素、核苷酸運載抑制劑如雙嘧啶氨醇和硝基苄硫代肌苷，DNA從屬RNA聚合酶抑制劑，例如利福平(rifadin
)、鏈終止劑，例如ganciclovir(DHPG)、無環鳥苷(ACV)、AZT、ddc。
除了概述於下文表1-3的實驗以外，我們還進行了PALA與其它抗病毒化合物結合的實驗;例如，將PALA與抗白蛉溪谷熱病毒(Sandfly valley fever)的三氮唑核苷(virazole
)結合併且和2-脫氧-D-葡萄糖(2-dGlc)(一種已知的抗HSV)的抗病毒(人們已經用它在人身上進行了擴大臨床試驗，見Blough，H.A.和Giuntoli，R.G.(1979)J.Amer.Med.Assoc.2412798-2801)結合在一起。PALA還可任選地與利福平(rifadin
)結合用於牛痘;任意地與AZT、ddI、ddc及其混合物結合用於HIV-1和2;任意地與金剛胺(adamantidine-)結合用於流行性感冒;任意地與三氮唑核苷(virazole
)結合用於拉薩熱、Hantaan和CCHF病毒;和任意地與無環鳥苷ACV結合用於水痘-帶狀皰疹以及任意地與幹擾素-α或氟尿嘧啶結合用於人乳頭狀瘤病毒。
上述實驗結果證實PALA與其它的病毒抑制劑結合較任何一種單獨的化合物能達到更好的抑制效果。例如2-dGlc本身無抗黃熱病毒的效果，但用PALA與2-dGlc一起就能觀察到增強的抗SFS的效果。另外，與未處理的對比物和感染過HIV同時僅接受單一抗病毒(僅AZT或反PALA)處理的細胞相比，採用PALA和AZT的組合治療能使HIV-1的病毒複製大約再降低20%，(用放射免疫沉澱法或Western印痕法(用密度測定儀定量)根據P24的下降而測出)。此外，將PALA與另外的抗病毒試劑結合起來使用會使所用的一種或兩種活性試劑的劑量降低，以便使治療指數提高，而有毒的副作用降低。
因為PALA沒有顯現出改變體液的免疫應答-至少是在長瘤的動物中(Johnson，R.K，Swyryd，E.A.和Stark，G.R.(1978)CancerRes.38371-378)，根據本發明使用PALA可以使某些病毒獲得共同免疫(採用合適的疫苗，例如滅活的病毒或合成肽作免疫原)。如上面所指出的，所遇到的潛在問題是抗性菌株可能會通過突變或選擇或因某些病毒(或細胞)具有使用DNA合成的「補救」途徑的能力而發生進化;(這些補救途徑在感染HSV的細胞中似乎是有效的)，由此將失去效果。
另外，PALA能穿過腦血栓，因此在視網膜和腦內可達到較高的濃度;從而，PALA在治療由HIV誘導的腦病方面、和由CMV誘導以及由水痘誘導的視網膜炎方面是有用的。
PALA的預防和其它用途對於進入正流行某些「外來RNA病毒」，但至今還不能得到免疫(對那種病毒)或未取得效果的地理區域的個體來說，PALA還可作為預防藥品。另外，多價的、遺傳工程疫苗可使用牛痘構建物;這樣一來，在病人和或在實驗工作人員身上採用綜合牛痘的可能性將是現實的。由於可以採用像單一的PALA，或其與利福平(rifadin )結合起來的一種藥品，這就給治療的醫生一個特別的迴旋機會。許多帶有這種遺傳工程病毒的上述個體(偶然暴露)，可以作為門診病人而用PALA接受治療，預防性的、治療性的皆可。
PALA還可用於妊娠期以防止病毒向胎兒轉移，只要無畸胎作用就可以。PALA可用於移植外科手術中，例如做化學治療的腎臟和骨髓移植接受者以及因為器官或骨髓移植體經常受CMV治療的癌症病人。為了防止在供體組織內存在的病毒發生複製，受體和供體都要用單一的PALA或組合療法加以治療，例如在捐獻或接受組織或器官移植之前按照醫生的診斷進行治療。
PALA對於除了傳染人的副粘液病毒(包括麻疹)之外的呼吸合胞體(respiratorysyncytial)病毒(RSV)是有用的，因此PALA可通過靜脈向嬰兒施藥，無須使用三氮唑核苷(virazole )必須的昂貴的正壓力器械。另外，在黃熱(flavi)-、外衣(toga)和本雅病毒上(表1)使用PALA的結果為抗「外來」病毒提供了一種新的治療和化學治療方法，所述「外來」病毒在世界偏僻地域能夠遇到;PALA對歐鮑拉(Ebola)、馬堡(Marburg)和拉薩(Lassa)熱病毒是有功效的。此外，獸醫學上重要的病毒，例如口蹄疫(foot and mouth disease)(FMDV)、牛瘟(rinderpest)、新城疫病(New castle disease)、假性狂太病、馬貧血症和牛鼻氣管炎病毒，都可用PALA進行診治;因此PALA能預防或控制動物的流行病，防止或改善由於病毒性疫病而引起的嚴重經濟損失，所述動物包括但不限於家畜，鳥或馬，尤其是賽馬。
劑量在治療已感染病毒的動物，特別是人時，應施用治療上有效量的PALA，即以足夠抑制病毒複製的劑量給藥。例如，PALA作為一種浸劑用藥量每天大約1-100mg/公斤，持續約1周到1個月。優選的劑量為約25-50mg/kg;按表面積計PALA或其藥物許可類似物的日當量劑量，為約100-約600mg/m2。最佳劑量約5mg/kg-60mg/kg，持續約1周到1個月。PALA或其藥物許可類似物的劑量間隔為約1周到1個月，最好約7到約10天。優選的用藥劑量應使PALA或其藥物許可類似物達到約50-約100μM的峰值血漿濃度。這一點可通過例如靜脈注射無菌的含有約0.05%～10%用藥組分的溶液(在緩衝鹽水中)(對藥物化學領域的一般技術人員是已知的任何適當鹽水溶液都可使用)。根據用HPLC測得的血漿水平通過連續注入PALA而維持所需的血液濃度。通過降低各種藥品的劑量約25%-50%，可以實現用PALA或其藥物許可類似物進行組合療法。應該注意護理醫生應知道如何進行和什麼時候終止、中斷或將治療調節到較低劑量，這是考慮到毒性、或骨髓、肝或腎功能障礙。相反，護理醫生還應知道如果臨床反應未滿足要求(不包括毒性在內)時，則應將治療調節至較高的水平。與上述討論過的對應方案可用於獸類。
在急性和慢性治療病毒感染中所用的PALA的預防或治療的劑量範圍隨所處理的病情的嚴重程度和用藥途徑而變化。再次聲明，應該注意的是門診醫師或醫生應知道由於毒性或骨髓、肝或腎功能障礙而在什麼時候中斷和/或調節治療劑量。劑量以及用藥頻率，將依年齡、體重和各個病人的反應而變化。通常，如上所討論的，對於本文所述大多數的病毒來說PALA或其藥物許可類似物的日總劑量範圍，約為1-100mg/kg病人。優選的日劑量範圍在約5-約75mg/kg之間，然而最佳的日劑量範圍應在約5-60mg/kg之間。另一個優選的範圍是每天約25-50mg/kg。在治療病人時，治療應從較低的劑量開始，例如約5mg/kg-約10mg/kg，然後提高到約25mg/kg或更高，這取決於各個病人的反應。進一步推薦的是對於嬰兒、兒童和超過65歲的病人，以及腎臟或肝功能有障礙的那些人，開始時接受低劑量，並且根據個體臨床反應和血濃度進行滴定。正如本技術領域的一般技術人員都清楚的那樣在某些情況下，必須使用超出這些範圍的劑量。各種術語「足夠減輕或防止病毒感染的量」、「足夠治療或防止病毒感染的量」或「有效抗病毒量」意思都是指上述用藥劑量和劑量頻率計劃。
如下面進一步討論的，為了向病人提供有效劑量的PALA，任何合適的用藥途徑都可使用。例如，口服、腸胃外的(皮下的、靜脈的和肌肉的);直腸的、經皮的、陰道等。劑型包括片劑、錠劑、分散劑、懸浮劑、栓劑、溶液、膠囊、乳劑、膏、微型泵(Alza公司)等。
藥物組合物本發明的藥物組合物含有作為活性成分的PALA或其藥物許可類似物，所述化合物在治療或防止人、動物和鳥類的病毒感染方面是有效的。這些藥物組合物還可含有治療劑，包括除了PALA或其藥物許可類似物之外的其它一些抗病毒試劑;這些新的組合物為治療病毒感染提供了組合療法。這種組合療法具有附加的和/或協同效果。
例如，含PALA的藥物組合物任意地可含有至少一種其它的治療試劑，如核苷酸類似物，包括核苷酸運送抑制劑;和鏈終止劑(例如二脫氧核苷酸)。適用於與PALA或其藥物活性類似物的組合療法中的一些化合物可以在Fields Virology，2nd Edition，Raven 1990;White，D.O.and Fenner，F.，Chepter T7「Chemotherapy of viral Diseades」in Medical Virology，3rd Edition，Academic Press，Inc.，Crlando，Fla，1986中找到，這些文獻公開的內容作為參考文獻編入本文。適用於本發明內的PALA組合療法的化合物包括但不限於2-脫氧-D-葡萄糖(2-dGlc)，脫氧野尻黴素、無環鳥苷(acycloguanosine)、三氮唑核苷(Virazole
)、利福平(rifadin
)、金剛胺(adamantidine)、利福丁炔(rifabutine)、ganciclovir、(DHPG)3′-疊氮基-3′-脫氧胸苷(AZT或Zidovudine
)、2′，3′-二脫氧肌苷(ddI)、2′，3′-二脫氧胞苷(ddc)、氟碘阿拉伯胞嘧啶(fluoroiodoaracytosine)、碘苷、三氟胸苷、阿糖腺苷(ara-A)、ara-AMP、溴乙烯基脫氧尿苷、溴乙烯基阿拉伯尿嘧啶(bromovinylarauracil)(BVaraV，來自Bristol-Meyers Squibb(1-β-D-阿糖-furanylo-E-5-[2-溴乙烯基]尿嘧啶))金剛(烷)乙胺、苯己庚二酮、二芳基脒、(S)-9-(2，3-二羥丙基)腺嘌呤(DHPA)、幹擾素-α、雙嘧啶氨醇、硝基苄基硫代肌苷、S-(P-硝基苄基-)6-硫代肌苷和膦醯基甲酸。屬於本發明的新型藥物組合物包括但不限於PALA，或其藥物許可類似物，和三氮唑核苷(virazole
);PALA和利福平(rifadin
);PALA和AZT;PALA和ddI;PALA和ddc;PALA和金剛胺;PALA和無環鳥苷(acycloguanosine);PALA和2-脫氧-D-葡萄糖;PALA和脫氧野尻黴素;PALA和幹擾素-α以及PALA和ganciclovir。本發明還包含藥物組合物，該組合物含PALA，或藥物許可的類似物，和任選一種以上的另外的治療化合物，以提供組合療法。
PALA的製備PALA及其大量的類似物的製備可按照下述方法進行，這些方法描述於US4，179，464、4，215，070、4，267，126、4，348，522、4，154，759、4，178，306和GB2008118和GB2051070，這些專利所公開的內容作為一個整體編入本文作參考。此外，PALA也可按照下列另外一些方法來製備，這些方法為Gloede，J.等人(1988)Pharmazie43(6)434;Henklein，P.等人(1989)DD272092A1Sept.27，1989;Kafarski，P.等人(1982)Synthesis3219-221;Montero，J.L.等人(1982)Eur.J.Med.Chem-chim.Ther.17(1)97-99;Stiebitz，B.等人(1991)，DD286589A5Jan.31，1991;Goodson，J.J.等人(1980)J.Chem.Soc.，PerkinTrans.1(12)2721-2727，這些文獻公開的內容作為整體編入本文作參考。
PALA類似物在本發明另一些特殊實施例中，大量的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸(PALA)類似物被用作為廣譜抗病毒試劑。正如所屬技術領域的一般技術人員都清楚的那樣，PALA含4個高酸性的氫(即兩個羧酸質子和兩個膦酸質子)和一個鹼性氮取代基。因此，在游離酸、酯、無機或有機鹽官能物之間可能存在許多種組合。這些可能性通過PALA通式的結構表達式可以更好地被理解，該通式中包含游離酸、鹽、酯或結合這些官能團的化合物，術語「PALA的類似物」用於本文的意思包括任意的鹽、酯或其它衍生物，這些物質是通過可得到的官能物由PALA製成的。術語「PALA」用於本文時其含義包括質子化的酸或N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸的藥物許可鹽。優選的一種鹽是二鈉鹽;另一種是下文的四鈉鹽。PALA的類似物在本發明的藥物組合物中具有特殊的使用價值，尤其是為口服用藥配製的那些。
N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸(PALA)核上述通式PALA核中的R基團獨立地代表氫、烴、矽烷、有機鹽或無機鹽基團，以及這些基團的所有可能的組合。當R是烴基時，所得到的類似物可稱為羧酸酯或膦酸酯。烴基可具有1-20個碳原子，最好1-8個，在性質上可以是環狀的，無環的，芳族的或脂族的，它還可任意地含有一些官能團，如羥基、醚基、氨基、硫醚基、鋶基、氟及其類似物。合適的烴取代基的特殊例子包括但不限於甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、環己基、苯基、苄基、對-硝基苄基及類似物。
當然，也可獲得相應的矽烷酯，其中的R是矽烷基，如三烷基甲矽烷基(例如三甲基甲矽烷基、三-叔-丁基甲矽烷基或甲基-二-叔-丁基甲矽烷基以及類似物)。
本發明還期待製備和使用作為抗病毒試劑的PALA類似物。在本發明一些特殊實施例中，通過本領域內一般技術人員所熟知的方法來製備PALA的銨，一、二、三和四元取代的銨鹽，這些方法包括但不限於PALA和胺之間的簡單的酸鹼反應或通過離子交換柱。正如一般技術人員所顯而易見的，各種胺都可以用來生成胺鹽，它包括伯、仲或叔胺。確實，甚至季銨基也能生成PALA鹽，只要PALA以鹽的形式存在即可。當然，PALA的胺鹽可以根據特定鹼或取代物的量、強度或而僅與在分子其它酸性部分處存在的磷酸鹽基團，一個或兩個羧酸基團，或按上述結構式所描繪的PALA核的全部酸性部分相結合。
儘管並未打算只限於公開於本文那些物質，但是為了讀者的利益現舉出下列胺。其它合適的無機鹽在本說明書的其它部分已經提到，而且應該理解到這些無機鹽能和烴或矽烷酯基團、以及用有機胺舉例說明的有機鹽一塊存在。因此，無機銨離子源的使用是有利的，例如除了氨本身以外的氫氧化銨、碘化銨、溴化銨、氯化銨以及類似物。
有機胺也是合適的，正如早已指出的那樣。例如，低級烷基(如C1-C4烴)胺基具有極大的使用價值。烷基醇胺(其中存在著氨基和羥基)是特別希望的。因此，甲醇胺、乙醇胺、丙醇胺、異丙醇胺、丁醇胺等都可製成具有吸引力的PALA胺鹽或類似物。同樣地，二烷基醇，三烷基醇或四烷基醇銨的基團也是希望的。含有多氨基的化合物也在預見之中，如乙二胺、二乙三胺或其N-烷基或其N-鏈烷醇-取代衍生物。另外，N-烴取代基的定義類似上述酯烴基的定義，即它們可以是環狀、無環、脂族或芳族並且可任意地含有除羥基以外的官能團，如醚基、氨基、硫代醚基、巰基、氟及類似物。
下列文獻中詳細地描述了製備PALA及其類似物的方法，這些文獻公開的全部內容作為參考而編入本文Stiebitz等人，DD286589A5(1991);Henklein等人，DD272092A1(1989);Gloede等人，Pharmazie43(6)434(1988);Mao等人，Antimicrob，AgentsChemother，27(2)197-202(1985);Kafarski等人，Synthesis3219-221(1982);Goodson等人，J.Chem.Soc.，PerkinTrans.1(12)2721-7(1980);Montero等人，Eur.J.Med.Chem-Chim.Ther.17(1)97-9(1982);Cole等人，Biochem.J.255(3)813-16(1988);Starks等人，DE2849396(1979);Bakunniak等人，J.Environ.Sci.Health.PartBB18(4-5)485-96(1983);Collins等人，J.Biol.Chem.246(21)6599-605(1971)。
藥物製劑本發明的藥物組合物包含作為活性成分的PALA，或其藥物許可類似物，並且還可含有一種藥物許可的載體以及任選的其它的治療成分。
如上所指出的，術語「藥物許可的類似物」包括鹽類、酯類和其它的PALA的衍生物。所述鹽類是由藥物許可的非毒性酸與鹼製備的(包括無機酸或鹼和有機酸或鹼)。這種鹽可包括鹼金屬鹽，例如鈉或鉀，以及鹼土金屬鹽或銨鹽。多種PALA的鹽都能在上面提過的Schultz等人和Parson等人的專利中找到。
此外，由於本發明的化合物是兩性的，所以鹽可以由藥物許可的非毒性鹼或酸(包括無機和有機鹼或酸)和金屬製成。適合本發明化合物的藥物許可的鹼加成鹽包括但不限於由鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉和鋅製成的金屬鹽，或由N，N′-二苄基乙二胺、氯代普魯卡因、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、甲基葡胺(n-甲基葡糖胺)和普魯卡因製成的有機鹽。優選的鹽是PALA的四鈉鹽，另一種優選的鹽是PALA的二鈉鹽。
在本發明一個特殊實施例中，公開了適於口服、直腸、經皮進入、局部的、陰道和非腸胃(包括皮下、肌肉和靜脈)用藥的製劑，儘管在任何指定的情況下，其最合適的途徑將取決於所治療的或防止的病毒性疾病的性質和嚴重程度。優選的一種用藥途徑是通過靜脈注射。本發明組合物可以較方便地以單位劑量的形式提供，並且可通過任何為藥物化學領域的一般技術人員知曉的方法製備。
在實際應用中，可以按常規藥物配料技術將PALA作為緊密混合物中的活性成分與一種藥物載體混合。所述載體可以有多種形式，這取決於用藥所要求的劑型，例如口服的或非腸胃的。在製備適於口服劑型的組合物時，任何常用的藥物介質都可以使用。常用的藥物介質包括例如水、甘醇、油、乙醇、調味劑、防腐劑、著色劑等(在口服液體製劑的情況下，例如，懸浮劑、溶液和酏劑);在氣霧劑的情況下，表面活性劑(用於輸送通過黏膜);或載體如澱粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、造粒劑、潤滑劑、粘著劑、分散劑等(在口服固體製劑的情況下，例如，粉劑、膠囊和片劑)。口服固體製劑比口服液體製劑優先。最優選的口服固體製劑是片劑或膠囊。當用直腸用製劑時，可在聚乙烯二醇組份中製備該製劑。
由於易於給藥，片劑和膠囊代表最有利的口服劑量單位類型，在這種情況下需使用固體藥物載體。如果需要的話，還可通過標準含水的或無水的工藝對片劑製作進一步塗覆。
除了上述普通的劑型外，本發明的所述化合物還可通過受控釋放裝置和/或輸送裝置用藥，該裝置包括Alzet
滲透泵，它可以由Alza公司獲得。合適的輸送裝置已描述於US3，845，770;3，916，899;3，536，809;3，598，123;3，944，064和4，008，719中。這些專利的公開內容全部編入本文供參考。
本發明適用於口服給藥的藥物組合物可按獨立單位提供(例如膠囊、藥包、或片劑、或氣霧劑)，每一種都含預定量的活性成分，該組分可以是粉末或顆粒、或作為在水溶液、非水溶液、水包油型乳狀液中的一種溶液或一種懸浮液、或油包水型液體乳狀液，或以適當的乳液用於局部或陰道內。這些組合物可通過藥物學中任何已知的方法來製備，但所有的方法都包含使活性成分與載體結合的步驟，該載體中一種或多種必要的成分組成。通常，製備所述組合物的過程都是將活性成分和液體載體或粉末狀固體載體或兩者均勻地且緊密地混合，然後，如果需要的話，將產品成型為所需的形式。
例如，可以經過壓制或模製而製備一種片劑，此時可任選地帶有一種或多種輔助成分。製備壓製片劑時可通過將自由流動的活性成分如粉末或顆粒在合適的機器中加壓加壓製成，此時該活性成分可任選地與一種粘著劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或分散劑混合，製造模製片劑時，可以在一適當的機器內，對用惰性液體稀釋劑潤溼過的所述粉狀化合物的混合物進行模製。按要求，每一片劑含約100-約500mg的活性成分，而每個藥包或膠囊含100mg-約500mg的活性成分，PALA。最好，片劑、藥包或膠囊含3分之一劑量，約100mg、約200mg、或約500mg的活性成分。
本發明所述的化合物特別適合用膠囊包起來(例如用脂質體)或與蛋白載體及類似物交聯。具有該性質的一些輸送系統描述於「BiologicalApproachestotheControlledDiliveryofDrugs，editorR.L.Juliano，Volume507，AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences(1987)，該文獻的公開內容編入本文供參考。
適用於靜脈、皮下或肌肉注射的配方列於下面。
配方數量ABC活性成分PALA,二鈉鹽125mg250mg500mg消毒的無熱原物的水,它具有PALA的EDTA(1.0mg/ml)適量到5ml25mg/ml50mg/ml100mg/ml合適的片劑或膠囊(含PALA)組合物說明如下片劑配方每片數量以mg計ABC活性成分,PALA,二鈉100200500用於評價組合療法的動物模型系統下列動物模型體系可用於評價各種治療方式的效果，所述處理方式使用PALA或其類似物並配合任何上述的化合物。
1.用於本雅(Bunya-)和黃熱病毒(Flavivirus)的小鼠模型系統龐特託羅病毒(PuntaToroVirus)用3周齡期小鼠C57BL/6(9.6-13.6g)在體內評價化合物抗由於皮下(S.C)接種龐特託羅(Punta Toro)(Adames)病毒(21天)而誘發的肝部感染的效果，其方式如前面對三氮唑核苷(Virazole
)(用作正對比物)和核脒(ribamidine)所述的。參見Sidwell等人，(1988)Antimicrob.Agents Chemother.，32331-336。
流行性乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus)將體重12-14g的10隻C57B1/6小鼠(VAF+，Charles River Lab S)分成一組，用磷酸鹽-緩衝鹽水(PBS)或藥品每日在腹腔內(i.p)處理兩次(b.i.d)，療程為5天，在病毒攻擊的前一天(1-天)進行第1次用藥。每組10隻動物中有5隻用JE病毒(Beijing菌株)100LD50進行感染(S.C.)，其劑量在第一次施用化合物(天0)後的6小時內應足以產生100%的死亡率(稀釋劑對比物)。對比物包括未治療、未感染的小鼠;未治療的但感染了病毒的小鼠;用稀釋劑處理的感染過病毒(和未感染過)的小鼠。用聚(ICLC)(一種三氮唑核苷)(ribarivin
)作為正面處理比物。病毒攻擊後6天(+6天)，採集感染過的鼠腦供病毒滴定。將腦懸浮液(10%W/V)通過在vero細胞培養基中用噬菌斑試驗進行滴定。在1-天到+6天記錄體重。測量重量變化，將其作為藥品毒性的測量值。
2.用於HCMV的兔模型系統本次研究總共使用20隻染色兔子。用狹縫燈和間接檢眼鏡評價動物，確定正常的視覺組織和原先不存在病狀。
處理兔子的方式如下(1)在0天時，所有兔子都通過玻璃體中(mid vitriol)注射接種106PFU HCMV菌株AD169。
(2)使動物保持在各個籠子裡並在接種後第2天監測脈絡膜視網膜HCMV病發展狀況。在接種後第2天時，將接種HCMV的具有同等脈絡膜視網膜病態的動物分成4個組，並按下文指不進行靜脈注射治療。
組＃1-五隻動物，在注射後第2、3、4、5和6天，分兩次給藥劑量每日靜脈注射藥品。藥品的濃度在體外測量時為ED90的1/2。
組＃2-五隻動物，在注射後第2、3、4、5和6天，分兩次給藥劑量每日靜脈注射藥品。藥品的濃度在體外測量時為ED90。
組＃3-五隻動物，在注射後第2、3、4、5和6天，分兩次給藥每日靜脈注射藥品。藥品的濃度在體外測量時為ED90的2倍。
組＃4-五隻動物，在注射後第2、3、4、5和6天，靜脈注射空白對照物。
(3)所有的動物每日都接受檢眼鏡的間接檢查，以評價臨床HCMV病的進展。間接檢眼鏡檢查由兩個偽裝的閱讀器獨立完成，以便使兔子接受治療。
(4)將所有的動物在注射後第8天殺死。取出脈絡膜視網膜和虹膜組織和玻璃體(在某些情況下還有肺組織)樣品並對樣品進行處理，通過在Hs68單細胞層上進行細胞聲處理檢驗法而回收HCMV。用組織化學法處理選出的組織樣品以評價治療和非治療組由HCMV誘導出的眼病狀態。
對臨床和組織分析結果與所有用藥品處理過的、靜脈治療的組的病毒回收結果一起進行評價，並且將它們彼此之間和與接受空白試劑治療的組聯繫起來。本次研究結果可以使我們選擇用於靜脈治療由CMV誘導的視網膜炎的最佳藥品濃度。
3.用於RSV的靈長目動物模型使用對RSV呈血清反應陰性的23隻年幼的非洲綠猴。所有的猴子都被逐個地放在籠子裡，置於靈長目動物中心(Primate Center)的一間房子中。保持它們的溫度在75°+/-3°F，相對溼度為50-60%。隨時供應Purina猴以食品和水且逐日監測動物的臨床病徵和食物的消耗情況。實驗結束時，所有的動物都用Beuthansia D Sqecial(安樂死溶液，Shering公司)在酮胺(Ketamine)麻醉的條件下殺死，再進行屍體剖檢。
使用兩種RSV菌株;一種是長型菌株(ATCC VR-26)而第二種是從澳大利亞人體RSV分離菌得到的，所述分離菌的提供者為Dr.Gail Wertz(School of Medicine，Vniversity of Alabama at Birmingham)。向非洲綠猴通入兩次病毒並製成BSC-40細胞(非洲綠猴腎)的儲備庫。病毒庫具有大約105TCID50/ml的滴定度並保存於-70℃下。
病毒接種物由稀釋10-1或10-2倍的儲備FSV組成，這是通過氣管導管(1.0ml)和鼻內滴注(1.0ml)給藥而實現的。逐日獲取咽喉拭子並將其放入1.0ml的組織培養基中(具有10%胎牛血清和抗菌素的小型基本培養基)。從拭子中壓榨出體液後在1.0ml培養基上進行滴定(表1)。通過製備各樣品10倍系列的稀釋液並將每份稀釋液接種到用BSC-40細胞接種的24孔培養板的複製孔內而完成的。通過用顯微鏡檢查培養基中由病毒誘導的細胞病徵而獲得滴定度，且將所述的滴定度表達為TCID50/ml。
在屍體剖檢時從每隻猴子中取下很小一部分肺，稱重並在玻璃組織磨中研磨成10%的勻漿(在pH7.2磷酸緩衝鹽水中)，取其中的0.1ml在血瓊脂培養基上培養以便作細菌學評價。將部分勻漿和肺灌洗液稀釋10倍以便滴定BSC-40細胞中的病毒。
記錄總的變化後，再將氣孔灌滿10%緩衝福馬林溶液。收集氣管、鼻腔中的組織樣品並將整個的肺結構浸於10%的緩衝福馬林溶液中。固定48小時後，將各肺葉製成切片，處理氣管和鼻甲(採用標準石蠟技術)，再以4-6μ進行切片並用蘇木精-曙紅(HE)進行染色;某些切片的染色採用PeriodicAcidShiff(PAS)和免疫過氧化酶(用一種在山羊抗猴中產生的(IgG，IgM，e3)(NordicImmunologicLaboratories，CapistranoBeach，CA)和Histomark免疫過氧化酶藥盒(KirkegaardandPerryLaboratories，Gaitherburg，MD)。
對總的和顯微鏡變化與病毒滴定度一塊進行評價。採用過氧化酶工藝來確定用RSV的A-2(Wertz)菌株顯著見到的基底膜變化。
參照下列描述本發明的實例對本發明作進一步的限定。對所屬技術領域的一般技術人員來說，很顯然，有許多改進(包括材料和方法)並不偏離本發明的範圍和精神。
實施例實施例11.1材料和方法得到的PALA呈晶狀粉末，以二鈉鹽的形式。將它放在光化玻璃器皿中，並溶解在消過毒的水或含1%牛血清蛋白的Eagle′s基本培養基中(作為一種10×或100×溶液)。使所有溶液通過微孔過濾器而消毒。使用下列細胞株Vero或CeM;Hep-2和人包皮細胞。採用3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯四唑鎓溴化物(MTT)、利用Pauwels等人(1988)在J.Virol.Methods中所述的方法20309-321(該說明書已列入本文參考文獻)觀察病毒抑制過程。
1.2體外抗病毒和細胞毒性試驗所有試驗均在Vero細胞中進行(除HIV-1試驗中用CEM細胞以外)。使用下列病毒(病毒菌株)對化合物的抗病毒效果進行評價a)流行性乙型腦炎病毒，JE，(Nakayama);b)黃熱病毒，YF，(Asibi);c)白蛉熱病毒，SF，(Sicilian);d)龐特託羅(PuntaToro)病毒，(PT)(Adames);e)委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒(VEE)，(Trinidad驢);f)牛痘病毒(VV)，(Lederle疫苗);g)登革型-4(Caribbean)病毒;h)人免疫缺乏病毒，類型1或2，HIV1或2。病毒(a-f)包括用於對藥物進行評價的標準組。該試驗化合物的體外抗病毒和細胞毒性作用的測量方法有a)通過用MTT-試驗(JE、YE、SF、PT、VEE、VV和HIV病毒)，(Pauwels等人(1988)J.Virol.Methods20309-321)來觀察對病毒細胞致病作用的抑制情況，或b)通過一種常用的噬菌斑減少試驗(所有其它病毒)。
在本發明中所用的基本測量值和定義包括(a)細胞毒性或濃度50%，TC50，其定義為在MTT試驗中與未傳染的在二倍試驗井中的對照細胞的存活力相比使細胞的數目和它們的代謝活性減少50%的藥物濃度(μg/ml);(b)病毒抑制濃度50%，IC50，其定義為在三倍試驗井中所觀察到的使病毒細胞致病作用(CPE)減少50%的藥物濃度(μg/ml)。治療(或抗病毒)指數，TI，它是一個與總的體外活性成比例的值。它以TC50/IC50的比率計算。它是在相同試樣和相同時間周期中某種化合物的相對抗細胞和抗病毒效果的單一藥物濃度的測量值。所有在體外MTT試驗中所給出的結果代表2-6個獨立試驗結果的平均值。
1.3結果如上所述試驗方法可對病毒複製和毒性水平進行測量。活細胞將MTT四唑鎓轉化成藍MTT甲脂(使用線粒體酶);死細胞沒有這種轉化能力。另一方面，也用標準細胞致病作用和毒性試驗(通過光顯微技術)來補充篩選。除了在進行病毒攻擊之前將細胞片用PALA預處理16小時之外，如前所述地對PALA的系列濃度進行測試。(參見，例如由Kumarasamy，R.和Blough，H.A.(1984)在Virology138156-161中所述的方法)。使用合適的抑制劑和病毒對照組，並評價其毒性。治療指數如上所述用常規方式進行計算，在表1中給出3對黃熱病毒、外衣病毒和本雅病毒(負和正鏈RNA病毒)的篩選結果;同樣對於這些病毒的證實數據在表2中給出。
注TI是治療指數，即TC/IC;a)50%抑制時的μg/ml;b)50%抑制時的μg/ml;c)50%抑制;d)95%抑制。
注TI是治療指數，即TC/IC;a)50%抑制時的μg/ml;b)50%抑制時的μg/ml;c)50%抑制;d)95%抑制。
僅在體外使用PALA的結果是明確的;PALA在濃度為約10至約25μg/ml時對所有這些RNA病毒(除了VEE)均具有廣譜抗病毒活性，並且在所有檢測系統中具有最小的毒性，這一點可以通過TC50值大於約320μg/ml而證實;因此，PALA對於大部分所檢測的病毒具有約20至30的治療指數。
當這些研究擴大到DNA病毒和其他RNA病毒(正和負鏈病毒以及反轉錄病毒)時證明四個含DNA病毒中有三個對PALA抑制作用是同樣敏感的。除了1型和2型皰疹病毒沒有觀察到抑制活性之外，PALA在約10μg/ml的濃度時對以上所有的病毒均具有活性。如表3中所示，一種RNA正鏈病毒，柯薩奇病毒B3(CoxsackieB3)對於50%抑制作用需要約33μg/ml;對於大部分這些病毒的治療指數為約32。
＊人包皮纖維細胞;a)50%抑制實例2使用鴨肝模型(DHBV)，用各種濃度的PALA(二鈉鹽)對初始的鴨肝細胞進行處理，並對細胞致病作用進行評價。另一方面，用狹縫點印跡法對病毒DNA的複製進行試驗。在濃度為40-50μM的條件下，在菌斑中觀察到50%的減少(IC50);在高濃度下，即，500μM，具有95%的抑制作用，此時只有很少或沒有毒性。將這些實驗進行三次以驗證其結果。
實例3下面各個部分描述了一些實驗，在這些實驗中用非洲綠猴進行猴水痘病毒傳染，並用PALA，無環鳥苷或它們的結合進行治療。其結果表明PALA與無環鳥式的結合減少了疹且最小限度地減輕了病毒血症，特別是在傳染期結束時。在高濃度條件下可以注意到一些與濃度有關的免疫抑制。此外，PALA表現出與BVaraU(Bristol-MyersSquibb)有極好的協同作用(未示出結果)。
1材料和方法將15隻非洲綠猴稱重並抽血以獲得臨床化學血液學原始數據。這些猴在此之前沒有表現出對猴水痘病毒Sf具有抗體。對15隻猴中的每一隻通過氣管內接種3.7×104菌斑形成單位(PFU)的猴水痘病毒來感染猴水痘病毒。將這些猴分成5組，每三隻猴為一組，並規定出治療組如在表4中所示的。該方案導致了下列治療組。對照猴，作為感染對照組，每日兩次靜脈注射磷酸鹽緩衝鹽溶液，施用量為0.1ml/kg(體重)。第二組的三隻猴接受PALA，用量為每日50mg/kg，通過靜脈團注射進入到隱靜脈中。第三組以同樣方式以每日20mg/kg的施用量施用較小劑量的PALA。無環鳥苷治療也通過靜脈團注射進入到隱靜脈中來施用每日10mg/kg的次有效劑量。第五組的三隻猴接受PALA，每日為20mg/kg和無環鳥苷為每日10mg/kg的組合治療。在每一次治療中其藥物注射到對向靜脈裡。
藥物溶液是在治療之前每日配製。在病毒接種之後24小時開始治療。PALA是以溶液來提供的，它置於含有5ml溶液的小玻璃瓶中，其含量為100mg/ml。合併三隻小玻璃瓶內的物質，且將7ml合併藥物稀釋到28ml以得到濃度為25mg/ml。將5ml這種溶液稀釋至50ml，從而得到10mg/ml。每日施用兩次藥物，使每日的總劑量為50或20mg/kg/日。
將從BurroughsWellcome作為禮物而獲得的無環鳥苷稱出200mg。將其用5mlPBS稀釋，且將pH用1NNaOH調至11.0成為有效溶液。隨後將該溶液稀釋到40ml，從而得到5mg/ml的溶液，且通過過濾來消毒。再一次，通過每日兩次靜脈注射，施用1ml/kg體重，其結果為每日10mg/kg的劑量。
在猴水痘感染的臨床過程之後在接種之後第2、5、7、9和11天採集肝素中的血2ml。將這2ml樣品中的淋巴細胞在ficol-3，5-二乙醯胺基-2，4，6-三碘苯甲酸鈉(hypaque)梯度上分離，在RPMI-1640介質中洗滌兩次，且在10ml這種介質中將其懸浮。將其10ml體積分開在兩個25cm2的組織培養燒瓶中，在此之前24小時已用Vero細胞接種該燒瓶。在5-7天培育期之後，將其培養液從該燒瓶中倒出，且用甲醇固定其細胞單層，並用甲烷藍基品紅著色。當乾燥時，計算在每個燒瓶中的菌斑的數量，並確定在這兩個燒瓶之間的菌斑平均數，將其表示為每ml血液的病毒血症的測量值。
使用一種主觀的從±至4+的嚴重程度的評分標準來對疹作每日評估。一個±評分表示在猴的皮膚上看到小於10個的小泡，而4+則表示很多小泡覆蓋了大部分身體表面。白天檢查總的臨床條件並通過計數每日食品餅乾的數量記錄厭食情況。將在實驗過程中死去的猴子進行屍體剖檢，且根據典型的病理學基礎將猴水痘確定為死因。基礎血液學和臨床化學試驗在病毒接種之前三天時進行，並在病毒接種之前0天立刻再做一次。隨後在3、7、9和11天時獲取猴的水痘病毒血液以供血液學和臨床化學試驗。
在病毒接種之後14和21天時，抽取血液，且為測定抗體而分離血清。使用一種噬菌斑減少試驗在血清中和試驗中獲得抗體的滴定度。所表示的抗體滴定度是菌斑數量比沒有加血清的對照培養物中所產生的數量減少80%時的血清稀釋量。
2結果表4表示了有關每日記錄的疹的數據。三隻對照猴的每一隻都出了疹，而其中一個猴在第11天疹子發展到最高程度4±。這隻猴在猴水痘靠近到它的肺和肝後的第二天就死了。其餘兩隻對照猴發展的最多出疹程度為2+和3+，並在每隻猴身上都持續了兩天。用50mg/kg/天PALA處理的三隻猴中有兩隻發展到最高出疹程度4+，第三隻猴在第9天僅表現出1+的疹，但是在第10天得了全身性猴水痘而死了。使用低劑量的PALA，結果在一隻猴身上有1+的出疹，而在第二隻猴身上有2+出疹。第三隻猴在第10天表現出3+的出疹，但在同一天的晚些時候就死了。以次有效量(每日10mg/kg)條件使用無環鳥苷的結果是在兩隻猴身上表現出中等嚴重程度的3+出疹，而在第三隻猴身上表現出輕度的1+出疹。以每天10mg為劑量進行組合處理的結果則可減輕出疹在多數日子裡僅看到±出疹，最嚴重的是有一隻猴有1+的記錄。
病毒血症在一隻對照猴身上較嚴重的(＞1000PFU/ml血)而在其它兩隻對照猴身上是中度的(為100～300PFU/ml血)(見表3)。當這些猴以每日50mg/kg的PALA進行治療時，一隻猴得了嚴重的病毒血症而死了，第二只得了較嚴重的病毒血症(300-800PFU/ml)，而第三隻則得了中度病毒血症。用每日20mg/kgPALA的劑量進行治療的猴身上可見到同樣結果。以每日10mg/kg的劑量施用無環鳥苷時發現對中度的病毒血症沒有作用。兩隻猴得了嚴重的病毒血症，而另一隻猴表現出較重度的病毒血症。用PALA和無環鳥苷進行組合治療可以看到稍微有點收益。一隻猴得了較重的病毒血症，一隻得了中度病毒血症，而第三隻得了最輕的病毒血症。
血液學試驗表明沒有持續的不規則數值。在用PALA以每日50mg/kg劑量治療的一隻猴(M636)身上和用無環鳥苷治療的兩隻猴(M642和M639)身上在第11天觀察到了血小極減少症。化學數值確實反映出由於猴水痘病毒而存在的肝炎後果。從按所用劑量施用該藥物來治療的結果來看沒有異常現象。
將血清中和抗體的滴定度與對照組中的猴子進行比較，並且與用PALA劑量或用無環鳥苷治療的猴子進行比較。用PALA和無環鳥苷組合治療的猴子在與其它猴子的滴定度進行比較時表現出對於猴水痘病毒具有低滴定度抗體。這很可能是由於組合治療而對病毒複製產生了抑制作用。
表4PALA和無環鳥苷組合治療對猴水痘病毒的治療效果疹疹子的程度-注射後的天數治療組猴子數量789101112131416對比M644--1+3+4+死亡PBSM634-±2+2+1+±---M547±1+2+3+3+1+±±±PALA:M646-±1+死亡50mg/kg/dM636-1+2+2+2+3+4+4+3+M635--2+2+2+3+4+4+3+PALA:M633-1+2+3+死亡d20mg/kg/dM637----1+2+2+2+-M638--±1+1+1+1+1+-無環鳥苷M642-±±1+1+±±±-10mg/kg/dM6391+1+1+2+3+3+3+2+1+M6431+2+2+3+2+2+1+1+±PALA:M640---±1+±---20mg/kg/dM645--±±±±±±-+無環鳥苷M641--±±±±---10mg/kg/d通過在接種病毒後24小時開始的分開劑量每天兩次靜脈內注射而治療表5PALA和無環鳥苷組合治療對猴水痘病毒的治療效果病毒血症平均PFU-注射後天數治療組猴子數量357911對比M644610510001000死亡PBSM634161385100M6471918123300PALA:M646113610001000死亡50mg/kg/dM6367254508892M6357248213100PALA:M633131951000100死亡20mg/kg/dM637913017340M63857930570無環鳥苷M64293421000322010mg/kg/dM63929010007060M643521050400PALA:M6400816113020mg/kg/dM64512113550110+無環鳥苷M641748300010mg/kg/通過在接種病毒後24小時開始的分開劑量每天兩次靜脈內注射而治療表6PALA和無環鳥苷治療對猴水痘病毒的血清中和抗體滴定度的影響SerumNeutral血清中和抗體滴定度Fiter-注射後天數治療組猴子數量14天天對比M644死亡死亡-M6341:6401:1280M6471:3201:1280PALA:M646死亡死亡50mg/kg/天M6361:801:1280M6351:320≥1:1280PALA:M633死亡死亡20mg/kg/天M6371:640≥1:1280M6381:1601:320無環鳥苷M6421:6401:64010mg/kg/天M6391:1601:1280M6431:1601:160PALA:M6401:801:64020mg/kg/天M6451:201:320+無環鳥苷M6411:801:64010mg/kg/天以導致病毒菌斑數比對比培養物的數降低80%或更多時的血清稀釋值作為滴定度實例4在Hs68細胞單層上在AD169傳染過程中體外用藥的效果。
這些實驗是用來證實在HCMV傳染過程中10μg/ml濃度的PALA的體外效果。在Hs68細胞學層上的體外感染和效果的評價是對以下HCMV病毒分離物進行的[1]AD169，一種標準的實驗室巨細胞病毒菌株;[2]一種DHPG抗性HCMV分離物(胸苷激酶抗性DHPG;ED50＝＞55μg)，和[3]一種最近獲得的HCMV臨床分離物。這一研究還可以對採用該實驗性藥物和採用DHPG在活性抑制過程中的HCMV滴定度減少的情況進行評價。
這些小部分證明所有三個菌株CMV實驗室菌株、人體HCMV分離物和DHPG抗性菌株對PALA是敏感的，病毒量減少了2～3log10。
1方法將特徵如上所述的[1]菌株AD169;[2]DHPG抗性HCMV;或[3]最近分離的臨床HCMV菌株的104PFU/mlHCMV接種到會合的Hs68細胞單層(35mm培養盤)上並在37℃下將其吸附於該單層上達1小時。將接種物吸出，且將含有實驗藥物或DHPG的培養基，或不含藥物的培養基加入到接種了HCMV的單層中。將含有適當的藥物添加到的培養每日變化。以24小時為間隔，從接種後第1天到第7天，將該接種HCMV且經藥物處理的單層按下列方式處理將含有無細胞病毒的上清液從該細胞中去除，而在該上清液中HCMV無細胞病毒的滴定度通過標準噬菌斑試驗來確定。將該單細胞層用HBSS洗滌，以去除剩餘的藥物，並通過刮削來收集細胞。將該細胞用聲波和離心作用來處理使其成為丸狀細胞碎片。測定從感染的單細胞層中釋放出的無細胞HCMV的滴定度。該藥物的效果用與無藥物處理的HCMV PFU/ml和DHPGHCMV抑制相比HCMVPFU/ml的減少量來表示。
2結果2.1用AD169感染的Hs68單細胞層在3μg/ml的濃度下使用PALA當與用空白對照物處理的對照組相比較時在減少HCNV滴定度方面它是有效的。當PALA與體外治療中的DHPG(19μg/ml;ED50對於AD169)相比較時，其HCMV滴度的降低與用DHPG處理的單層相類似，但其滴度卻比DHPG的滴度稍微高一些。用PALA治療之後的HCMV滴度的降低與該上清液(無細胞HCMC)和與其細胞丸(與細胞有關的HCMV滴度)是相類似的。HCMV滴度從細胞上清液和從細胞丸試驗中的回跳(目前未有解釋)在接種後第3天出現。該滴度與接種後第4和第5天的DHPG相比仍保持較高水平。在第5天之後由於單層中細胞的損失，沒有樣品被處理。到接種後第5天，在用藥物處理過的樣品中該單細胞層約有50%已經損失。HCMV滴度在表7a和圖1以及2中列出。
2.2臨床HCMV分離物從一個已證實的HCMV新生兒感染病例中獲得一種臨床分離物。該病毒通過中和作用證實為HCMV。PALA和DHPG可以有效地降低該HCMV臨床分離物的滴度。在這兩種治療之間和在它們降低HCMV滴度的作用上沒有不同。HCMV滴度在表7b和在圖3以及4中列出。
2.3DHPG抗性HCMV將一種DHPG抗性HCMV分離物(以前認為其特徵根據DHPG敏感性體外減少情況認為是一種DHPG抗性分離物;該病毒具有不同的胸苷激酶活性)用於這些體外試驗中。DHPG在與細胞有關的或無細胞試驗中對降低HCMV的滴度是沒有效的。在該用DHPG處理的組中DHPG抗性HCMV的滴度與用空白對照物處理的單細胞層相同或高一些(沒有統計意義)。PALA在降低DHPG抗性HCMV的滴度方面是有效的。到接種後第4-5天，用PALA處理的單細胞層比用DHPG處理的或用空白對照物處理的單細胞層明顯地降低了HCMV的滴度。HCMV滴度在表8和圖5以及6中列出。
表7a用DHPG、PALA和空白液接種後的無細胞(上清液)的HCMV滴定度DHPGPALA接種後的天數對比 AD 169 DHPGR臨床分離物 AD169 DHPGR臨床分離物0 1051051051051051051051 1021011031011011011022 1021011041011011011013 1031011051011031021024 1040 1051011021021015 1050 1040 101101101
表7b用DHPG、PALA和空白液接種後的與細胞有關(細胞丸處理)的HCMV滴定度DHPGPALA接種後的天數對比 AD 169 DHPGR臨床分離物 AD169 DHPGR0 1021021021021021021021 1041021031031031031032 1041011031021011011023 1031011051011011011014 1031011051011011011015 1040 1040 1010 06 1031011041011011011017 1010 1021010 101101實例5在HCMV脈絡膜視網膜的兔模型中對單一的和組合試劑PALA和DHPG的增加劑量以及頻率效果進行評價。
這些研究通過比較臨床的、病毒恢復和組織病理學上由HCMV誘導的疾病程度對在增加劑量濃度和頻率的研究中靜脈治療過程中的單一的和組合試劑PALA和DHPG的效果進行評價。對兩種實驗藥物濃度，20和50mg/kg，在2種不同施用頻率條件下的情況進行評價，每天以及從接種後第一天至第10天每隔一天進行評價。將該實驗藥物的體內效果與靜脈DHPG治療作比較。其結果表明用組合試劑劑量PALA加低劑量DHPG(組＃7)＞＞對照組(組＃8)＝單一試劑DHPG(組＃1和＃2)和低劑量(組＃3)PALA＞＞組合試劑高劑量PALA加低劑量DHPG(組＃5)＞＞組合試劑高劑量PALA加低劑量DHPG(組＃4)。
1方法在該研究中總共使用32隻有色兔。將這些動物通過狹縫燈和間接檢眼鏡確定正常的眼的形態以及原始病理缺陷，以對其進行評價。將這些動物按下述方式進行處理[1]在第0天，所有兔通過玻璃體中(mid-vitreal)注射105PFU HCMV菌株AD169(100μl)來接種。將動物們關在各自的籠子中，每日監測脈絡膜視網膜HCMV疾病的發展。在接種後第2天，將接種HCMV的動物分成8個組，每4隻為一組，每一隻具有類似的脈絡膜視網膜疾病記錄。將感染HCMV的兔子接受靜脈治療，方式如下組＃1;4隻動物，從接種後第2天至10天每日靜脈注射高劑量實驗藥物(50mg/kg)。共靜脈注射9次。
組＃34隻動物，從接種後第2天至10天每日靜脈注射低劑量實驗藥物(20mg/kg)。共靜脈注射9次。
組＃44隻動物，從接種後第2天至10天每日靜脈注射高劑量實驗藥物(50mg/kg)(共9次靜脈注射)，且從接種後第2天至10天每日2次注射高劑量DHPG10mg/kg/天(總共18次靜脈注射)。
組＃54隻動物，從接種後第2天至第10天每日靜脈注射高劑量實驗藥物(50mg/kg)(共9次靜脈注射)，且從接種後第2天至第10天每日兩次注射低劑量DHPG5mg/kg/天(共18次靜脈注射)。
組＃64隻動物，從接種後第2天至第10天每日靜脈注射低劑量實驗藥物(20mg/kg)(共9次靜脈注射)，且從接種後第2天至第10天將低劑量DHPG5mg/kg/天分兩次施用(共18次靜脈注射)。
組＃74隻動物，從接種後第2天至第10天每天分兩次靜脈注射的DHPG10mg/kg/天。共18次注射。
組＃84隻動物，從接種後第2天至第10天靜脈注射消毒鹽水。所有動物每日接受間接檢眼鏡的檢查，以評價臨床HCMV疾病的進展(從接種後第2天至第10天)。該間接檢眼鏡的檢查是通過兩臺讀出器獨立地進行的，該讀出器被偽裝進來，以方便正在接受治療的兔子。將所有動物在接種後第12天殺死，將脈絡膜視網膜和虹膜組織和玻璃體樣品取下來並作處理從而通過在Hs68單細胞層上進行細胞聲波試驗而收集HCMV。對所選擇的眼睛的和肺的組織樣品進行組織化學處理，以評價在治療組和未治療組中由HCMV誘發的眼睛的病狀。
將由所有經過藥物治療的靜脈治療組得到的有關臨床的、病毒收集以及組織病理效果的結果互相聯繫起來，且與空白對照治療組聯繫起來。
2結果單一試劑靜脈內治療組將在兔子身上由HCMV誘發的脈絡膜視網膜疾病過程中由單一試劑和組合試劑進行靜脈治療的效果的數據總結於圖5。以下是各個治療的概述。
組＃1從接種後第2天至第10天每日靜脈注射高劑量PALA(50mg/kg)進行單一試劑的治療。
每日用單一劑量靜脈施用濃度為50mg/kg的PALA。在接種HCMV的動物中對於降低疾病的發展僅勉強有效。在接種後3-4天內玻璃體炎發展到中等程度。玻璃體炎的進一步發展會妨礙在這些動物中對脈絡膜視網膜炎的全面評價，其結果，組織學的評價在確定脈絡膜視網膜疾病的範圍和單一PALA製劑的效果方面將變得更為重要。視神經乳頭水腫和發紅(在這種兔模型中HCMV感染的臨床症狀)在接種後第3至7天表現出來。該研究的結論為，在眼底部可見的動物中視神經乳頭的紅腫和發紅正在減輕。雖然眼底視覺和正在發展的HCMV脈絡膜視網膜疾病由於玻璃體炎而被遮蔽，但是在用高劑量PALA治療的那些動物中其臨床的感覺是該治療僅有極小的效果而且通過這種高劑量單一試劑的治療，由HCMV誘發的脈絡膜視網膜炎疾病的發展和進展沒有停止。
組織學初步評價表明中等面積的脈絡膜視網膜HCMV疾病限制在內視網膜上。偶然地，HCMV感染會深及傳播疾病中的脈絡膜視網膜的較大面積。脈絡膜的水腫和血管充血在中等水平條件下是突出的。在這些用PALA治療的眼睛中由HCMV產生的疾病的面積會集中在某一地區，這表明發生了中等脈絡膜視網膜感染。涉及免疫細胞的範圍由單細胞的和多形核細胞浸潤物組成。這些初步的組織學評價證實了該臨床疾病印象。宰殺時，其肺清晰且無充血。對樣品作常規的組織學處理，其結果有待給出。
在接種後第12天沒有從任何脈絡膜視網膜細胞聲波共同培養物中回收到HCMV。沒有回收到HCMV可能(且也許)直接與選定回收HCMV的時間有關，即與接種後第12天有關。為了對這些單一試劑治療的效果作更全面的評價，在整個治療過程有一段動物宰殺時間將是必須的。(在沒有治療的眼睛中，HCMV通常出現在接種後第8或9天。在接種後第9或10天之後的回收是不確定的)。
組＃2從接種第2天到第10天中用高劑量PALA(50mg/kg)每隔一天靜脈注射單一試劑進行治療以50mg/kg濃度每隔一天用單一劑量靜脈施用PALA對於在接種HCMV的動物中減輕疾病的發展是勉強有效的。用這種PALA濃度治療的動物中的疾病的發展與每日用50mg/kg靜脈治療組中HCMV疾病的進展情況相類似。玻璃體炎在接種後3-4天內發展到中等至嚴重水平。玻璃體炎的發展妨礙了對這些動物的脈絡膜視網膜疾病的全面評價，其結果，該組織學評價在確定脈絡膜視網膜疾病的範圍和該PALA製劑的單一試劑效果方面將變得更為重要。在接種後3-4天視神經乳頭水腫和發紅(在這一兔模型中HCMV感染的臨床特徵)較嚴重，且在第5至7天不能進行評價，這表明儘管進行了治療，但眼睛中的HCMV疾病仍在發展。雖然眼底視覺和發展的HCMV脈絡膜視網膜疾病由於在這些動物中玻璃體炎而被遮蔽，但是在這些用高劑量PALA每隔一天治療的動物中由HCMV誘發的疾病的臨床感覺是這種治療辦法對於減輕HCMV疾病的發展是沒有效力的。在這兩個高劑量PALA治療組中由HCMV誘發的疾病的發展相互之間沒有不同(圖7)。宰殺時其肺清晰且無充血。
在接種後第12天沒有從任何脈絡膜視網膜細胞聲波共同培養物中回收到HCMV。回收不到HCMV可能(且也許)直接與所選擇的HCMV回收時間有關。
組＃3從接種後第2天到第10天用低劑量PALA(20mg/kg)每日靜脈注射單一試劑進行治療以20mg/kg的濃度每隔一天用單一試劑靜脈注射施用PALA在已接種HCMV的動物中對於減輕疾病的發展來說與其它治療組和空白對照劑治療組相比是沒有效果的。該疾病的進展與組＃2的報告相類似。
初步的組織學結果表明發生了擴散性疾病並伴有中度到嚴重的脈絡膜視網膜疾病。
在接種後第12天沒有從任何脈絡膜視網膜細胞聲波共同培養物中回收到HCMV。回收不到HCMV可能是直接與所選擇的回收HCMV的時間有關。
組＃7從接種後第2天至第10天對已接種HCMV的動物靜脈注射DHPG(每日10mg/kg分兩次注射)在這一實驗中用DHPG作為對照治療。動物從接種後第2天開始接受DHPG治療，並持續到接種後第10天。每日10mg/kg分兩次施用DHPG進行治療確實可以減輕HCMV脈絡膜視網膜感染和疾病的發展。到接種後第6-7天在70%用DHPG治療的眼睛中，其平均HCMV脈絡膜視網膜疾病程度已穩定且該疾病在第8天已開始緩解。雖然眼底視力由於玻璃體炎的發展而部分被遮蔽，但是脈絡膜視網膜疾病仍保持明顯的病灶，同時其視神經乳頭仍存在中度炎症。該脈絡膜直到接種後第10天仍存在著充血。從接種後第4天至第10天這些動物的玻璃體炎仍處於中度水平。在這些被治療的眼睛中該疾病的臨床感覺是該DHPG單一試劑治療組是所有治療組中改進最大的組。在整個研究過程中，DHPG治療組與三個PALA單一試劑治療組相比，一直具有較輕的玻璃體炎(間接的脈絡膜視網膜疾病程度)。由於該治療組的中度病症發展成為嚴重的玻璃體炎，所以它與空白對照物治療組的統計學比較是不可能的(對照組和DHPG治療組具有類似程度的玻璃體炎)。宰殺時，其肺正常。對樣品作常規的組織學處理，結果待定。
在接種後第12天沒有從任何脈絡膜視網膜細胞聲波共同培養物中回收到HCMV。回收不到HCMV可能(且也許)直接與所選擇的回收HCMV的時間有關。
組＃8已接種HCMV的用空白對照物治療(空白對照物+EDTA)的動物對用空白對照物治療的動物從接種後第2天開始接收每日一次消毒鹽水+EDTA的注射，且持續到接種後第10天。用空白對照物治療的眼睛在接種後第2天形成了輕度脈絡膜視網膜和玻璃體疾病。該疾病包括視網膜浸潤的病灶區、視神經炎症和紅腫以及輕度的玻璃體炎。該玻璃體炎包括玻璃體帶和周邊細胞浸潤物以及渾濁。空白對照物治療沒有終止這些動物身上的脈絡膜視網膜疾病和玻璃體炎的發展。到接種後第4-5天，脈絡膜視網膜疾病加重且這些已感染HCMV的眼睛中正發展的玻璃體炎發展到嚴重水平，幹擾了對脈絡膜視網膜疾病的全面評價，在接種後第5天，其玻璃體炎遮蔽了對視網膜和脈絡膜疾病的全面評價。
對用空白對照物治療的眼睛的初步組織學評價表明HCMV感染已從內視網膜面發展到受光層。組織學結果證明了視網膜水腫面、混合細胞浸潤物和偶然的視網膜分離。視網膜HCMV疾病嚴重區域處於正常視網膜區的旁邊。組織學結果證實了脈絡膜和視網膜的中度和嚴重病狀。宰殺時，對肺的觀察表明在2隻兔中有輕度到中度的乳濁和出血。還存在輕度至中度的水腫(充血)。
在接種後第12天沒有從任何脈絡膜視網膜細胞聲波共同培養物中回收到HCMV。回收不到HCMV可能(且也許)直接與所選擇的回收HCMV的時間有關。
組合試劑PALA和DHPG靜脈注射治療組＃4從接種後第2天到第10天用高劑量PALA(50mg/kg)每日靜脈注射治療，同時靜脈注射高劑量DHPG(從接種後第2天到第10天每日10mg/kg分兩次施用)。
和組＃5從第2天到第10天用高劑量PALA(50mg/kg)每日靜脈注射治療，同時靜脈注射低劑量DHPG(從接種後第2天至第10天每日5mg/kg分兩次施用)。
用高劑量PALA(50mg/kg)和DHPG(10mg/kg)相結合每日靜脈注射治療[組＃4]或用高劑量PALA(50mg/kg)加上DHPG(5mg/kg，分兩次施用)每日靜脈注射治療(均從接種後第2天至第10天)對於減輕由HCMV誘發的脈絡膜視網膜疾病的發展是沒有效的。事實上，玻璃體炎(HCMV病的間接測量手段)在這些結合治療組中比在單一試劑治療組、組合試劑治療組或空白對照物治療組中的疾病更嚴重。由HCMV誘發的疾病程度的加重可能是由這兩種化合物的對抗作用而引起的，具體地說50mg/kgPALA和10或5mg/kg的DHPG的對抗作用。在玻璃體炎發展成能遮蔽眼底視覺之前，該視神經乳頭呈現出發紅且發炎變化特徵(由HCMV誘發的疾病)。在接種後第10天，該視神經乳頭的變化在那些其神經乳頭可見的動物身上已不再減少。根據在這些用高劑量PALA組合治療的眼睛中的由HCMV誘發的疾病的臨床感覺，組合治療的結果是其疾病比空白對照或在單一試劑治療組中的疾病更嚴重。雖然僅評價了8隻眼睛(高劑量PALA組合治療組)，但該結合組呈現出是對抗性的(即，在組合組中的疾病比用50mg/kgUSNUS08或10mg/kgDHPG單一試劑的治療組更嚴重)。宰殺時肺病症不明顯。對所選擇的樣品進行組織學處理。
在接種後第12天沒有從任何脈絡膜視網膜細胞聲波共同培養物中回收到HCMV。回收不到HCMV可能(且也許)直接與所選擇的回收HCMV的時間有關。
組＃6從第2天至第10天每日用低劑量PALA(20mg/kg)進行靜脈注射治療，加上在接種後第2天至第10天以每日5mg/kg分兩次低劑量靜脈注射DHPG。
用每日低劑量PALA(20mg/kg)和每日低劑量DHPG(5mg/kg)的組合靜脈治療(組＃6)是最有效的組合試劑治療。這種組合在減輕玻璃體炎和視神經乳頭變化方面比任何其它所評價的單一試劑或組合試劑的治療方式更為有效。這種組合試劑治療在整個治療過程中(接種後第2天至第10天)均超過所有其它的治療。事實上，在這種組合治療組中的玻璃體炎(間接的HCMV疾病的測試手段)並不比任何其它單一試劑治療組、組合試劑治療組或空白對照物治療組輕多少。在由HCMV誘發的疾病程度上的減輕可以解釋為兩種化合物的加和性(在這一結論能由統計學分析結果支持之前需要對其它的樣品進行評價)。在玻璃體炎發展到遮蔽眼底視覺之前，其視神經乳頭呈現出中度紅腫和炎症變化特徵(由HCMV誘發的疾病)。在接種後第10天，視神經乳頭的變化在那些神經頭可看見的動物中已減輕。根據在這些低劑量PALA組合治療的眼睛中中的對由HCMV誘發的疾病的臨床感覺，這種組合治療導致的疾病比在空白對照物治療組中的病症或在單一試劑治療組中的病症的嚴重程度低不了多少。宰殺時，肺部沒有明顯症狀。對所選擇的樣品進行組織學處理。
在接種後第12天，沒有從任何脈絡膜視網膜細胞聲波共同培養物中回收到HCMV。回收不到HCMV可能(且也許)直接與所選擇的回收HCMV的時間有關。
3結論[1]在兔身上由HCMV誘發感染的過程中，當PALA作為單一試劑時，其高劑量或低劑量的治療在減輕眼疾病的發展和進程中是沒有效的(根據玻璃體炎和視神經乳頭由HCMV誘發的變化)。用DHPG作單一試劑治療時，對於在兔身上減輕由HCMV誘發的脈絡膜視網膜疾病的嚴重程度是有效的。高劑量PALA組合試劑的治療對於減緩眼睛由HCMV誘發的疾病的進程是沒有效的。事實上，這些高劑量組合治療證明了一種對抗性抗病毒作用，它所造成的由HCMV誘發的眼疾病的嚴重程度比在其它單一的和組合試劑治療組中所觀察到的疾病更嚴重。用靜脈低劑量PALA和低劑量DHPG進行組合試劑治療對於在這一模式中減輕由HCMV誘發的疾病的發展和嚴重程度是有效的。這種組合試劑的治療方式證明了一種附加的或協同的抗HCMV效果。
實例6在兔身上進行PALA效果評價在治療後第3、4、5、和6天對其脈絡膜視網膜中HCMV滴度的降低情況作精確分析來驗證臨床單一和組合試劑的效果。
進行這些實驗是在兔模型中在感染HCMV之後通過比較臨床的、和組織病理學的由HCMV誘發的疾病的嚴重程度來證實PALA靜脈治療的效果。PALA靜脈治療結果通過治療過程中HCMV的回收情況評價。將從脈絡膜視網膜聲波共同培養物中獲得的HCMV的滴度與DHPG和定向對照物回收滴度相比較。對高劑量PALA治療的單一試劑治療和與DHPG結合中的組合試劑治療結果進行評價的。
1方法總共有41隻著色的兔子用於這一研究。通過狹縫燈和間接檢眼鏡來評價這些動物，以測定正常眼睛的形態和沒有原始病狀。對動物進行如下處理[1]在第0天，所有動物通過檢眼鏡進行評價，以確保所有的後段(posteriorsegment)是正常的。在眼底檢查之後，動物接受局部滴眼藥以擴張瞳孔。局部滴眼藥治療每天都進行，一直貫穿整個研究過程。在第0天，所有兔通過玻璃體內(mid-vitreal)注射105PFU HCMV菌株AD169(100μl)來進行接種。其它兔用非感染的Hs68單細胞層上清液進行假接種。這些假接種的動物用作靜脈治療組的對照物。這些動物養在各自的籠子中，且對脈絡膜視網膜HCMV疾病的發展進行每日監測。在接種後第2天，將接種HCMV的動物分成組，每組有4-6隻接種HCMV的兔子和一隻假接種的兔子。已感染HCMV和假接種的兔如下所示接受靜脈治療每日單一試劑PALA靜脈治療組＃14隻接種HCMV的動物和1隻假接種的動物，在接種後2至10天靜脈注射高劑量PALA(50mg/kg)。共9次靜脈注射。
將這組動物在進行研究的這段時間中在接種後第3、4、5和6天宰殺，以評價HCMV回收量和滴度的降低情況。將眼睛摘除，並作處理以對細胞聲波物進行HCMV回收。將假接種的動物在接種後第12天宰殺，並用於對在靜脈治療之後PALA對視網膜和脈絡膜的毒性作用進行評價。
組合試劑PALA和DHPG的靜脈治療滴度測定和臨床效果的證實。
組＃27隻接種HCMV的動物和1隻假接種的動物，在接種後第2天至10天靜脈注射高劑量PALA(50mg/kg)(共9次靜脈注射)加上從接種後第2至10天每天注射高劑量DHPG10mg/kg，分兩次用藥(總共18次靜脈注射)。
在這一治療組中，在接種後第3、4、5、和6天每天各宰殺一隻動物。摘出眼睛，並作處理從而通過細胞聲波處理物回收進行HCMV回收，以測定HCMV的存在量和在脈絡膜視網膜中的病毒的滴度。其餘2隻已感染HCMV的兔子和1隻假接種的兔子到接種後第12天一直進行評價。這些剩餘的動物用於證實PALA組合效果的臨床感覺，其證實方式如前面實例5中所述的那樣。
組＃36隻接種HCMV的動物和1隻假接種的動物，在接種後第2天至10天靜脈注射中等劑量PALA(25mg/kg)(共9次靜脈注射)加上從接種後第2至10天每日注射中等劑量的DHPG7.5mg/kg，分兩次用藥(共18次靜脈注射)。
在這一治療組中，在接種後第3、4、5和6天每天宰殺一隻動物。摘出眼睛，並作處理以通過細胞聲波處理回收HCMV，以測定HCMV的存在量和在脈絡膜視網膜中的病毒的滴度。其餘2隻接種HCMV和1隻假接種的兔子到接種後第12天一直用來進行評價。這些剩餘的動物用於證實PALA組合效果的臨床感覺，其證實方式如前面實例5中所述的那樣，這些剩餘的兔子還用於對最終狀態的效果進行評價。
組＃46隻接種HCMV的動物和1隻假接種的動物，在接種後第2至10天靜脈注射低劑量PALA(10mg/kg)(共9次靜脈注射)加上從接種後第2至10天每日注射低劑量DHPG5mg/kg，分兩次用藥(共18次靜脈注射)。
在這一治療組中，從接種後第3、4、5、和6天每天宰殺一隻動物。摘出眼睛，並作處理以通過細胞聲波處理物回收HCMV，以測定HCMV的存在量和在脈絡膜視網膜中的病毒的滴度。其餘2隻接種HCMV和1隻假接種的兔子到接種後第12天一直用於進行評價。這些剩餘的動物用於證實PALA組合效果的臨床感覺，其證實方式如前面實例5中所述的那樣。
單一試劑正負對照組＃56隻接種HCMV的動物，從接種後第2至10天每天靜脈注射DHPG10mg/kg，分兩次施藥。共18次靜脈注射。
在一段時間的研究過程中將這組動物在接種後第3、4、5、和6天宰殺，以評價HCMV回收量和滴度的降低情況。將其摘除眼睛，並作處理以從視網膜的細胞聲波處理物中回收HCMV。將其餘2隻動物在接種後第12天宰殺，以用於在靜脈治療後對PALA對視網膜和脈絡膜的臨床作用過程進行評價。
組＃66隻接種HCMV的動物，從接種後第2至10天靜脈注射消毒鹽水。
在一段時間的研究中將這組動物在接種後第3、4、5、和6天宰殺，以評價HCMV的回收量和在視網膜的滴度的降低情況。摘除眼睛，並作處理以從細胞聲波處理物中回收HCMV。將其餘2隻動物在接種後第12天宰殺，並用於在靜脈施藥後對PALA對視網膜和脈絡膜的臨床作用過程進行評價。所有動物每日接受間接檢眼鏡檢查或用一個手持90屈光度透鏡進行狹縫檢查，以評價臨床HCMV疾病的進展(從接種後第2至10天)。通過兩個遮蔽(以便兔子接受治療)的讀出器進行獨立的眼底檢查。將所有動物在這段時間研究過程中宰殺以評價PALA單一的和組合試劑對HCMV滴度的降低作用，或在接種後第12天將其宰殺，以證實臨床過程PALA的治療效果。
對於所有經過藥物處理的靜脈治療組，將其臨床的、病毒回收和組織效果結果在各組之間以及與空白對照物治療組之間相聯繫起來。在整個效果評價過程中各個動物的總結。
第1天所有動物通過狹縫燈生物顯微鏡進行初始評價以及眼底檢查。動物編號從1到36;和S1-S5。將兔子立刻隨機地編進各動物組，以接受如下所述的靜脈治療組＃1兔＃1、2、3、4和假接種的兔S1-50mg/kgPALA。
組＃2兔＃5、6、7、8、9、10、11和1隻假接種動物＃S2-每日靜脈注射高劑量PALA(50mg/kg)和高劑量DHPG(10mg/kg/天)。
組＃3兔＃12、13、14、15、16、17和1隻假接種動物＃S3-每日靜脈注射中劑量PALA(25mg/kg)加上中劑量DHPG(7.5mg/kg/天)。
組＃4兔＃18、19、20、21、22、23和1隻假接種動物＃S4-每日靜脈注射低劑量PALA(10mg/kg)加上低劑量DHPG(5mg/kg/天)。
組＃5兔＃24、25、26、27、28、29和1隻假接種動物＃S5-每日靜脈注射高劑量DHPG(10mg/kg/天)。
組＃6兔＃30、31、32、33、34、35、和36-每日接受空白對照物靜脈治療(注射消毒鹽水)。
接種HCMV的並用單一和組合試劑治療的動物的宰殺接種後第3天宰殺，並將得到的脈絡膜視網膜的細胞聲波處理物培養物進行HCMV回收-組＃1兔＃1組＃2兔＃11組＃3兔＃16組＃4兔＃23組＃5兔＃28
組＃6兔＃34接種後第4天宰殺，並將得到的脈絡膜視網膜的細胞聲波處理物培養物進行HCMV回收-組＃1兔＃2組＃2兔＃7組＃3兔＃12組＃4兔＃18組＃5兔＃24組＃6兔＃30接種後第5天宰殺，並將得到的脈絡膜視網膜的細胞聲波處理物培養物進行HCMV回收-組＃1兔＃3組＃2兔＃8組＃3兔＃13組＃4兔＃19組＃5兔＃26組＃6兔＃31接種後第6天宰殺，並將得到的脈絡膜視網膜的細胞聲波處理物培養物進行HCMV回收-組＃1兔＃4組＃2兔＃6組＃3兔＃14組＃4兔＃21組＃5兔＃27
組＃6兔＃33接種後第12天宰殺，並進行組織處理以便進行組織學評價或從脈絡膜視網膜聲波處理物培養物中進行培養物HCMV回收。通過間接檢眼鏡對在效果評價結束時宰殺的動物每日進行觀察。將這些動物中的HCMV疾病的臨床感覺用於構建在本申請中圖示所表明的玻璃體炎和脈絡膜視網膜疾病的曲線圖。在評價結束時所宰殺的動物包括組＃1沒有感染HCMV的兔子，S1組＃2兔＃9、10、S2組＃3兔＃15、17、S3組＃4兔＃20、22、S4組＃5兔＃25、29、S5組＃6兔＃32、35、36臨床疾病感覺玻璃體炎和脈絡膜視網膜疾病的發展圖6和圖7對在靜脈組合試劑和單一試劑治療組中的脈絡膜視網膜炎的發展和玻璃體炎的發展的數據進行了總結。脈絡膜視網膜疾病的發展由於玻璃體炎的發展在接種後第5-8天被部分地遮蔽了，這在前面效果評價中已證明了。對於接種後這些天的平均記錄是以臨床感覺和前幾天眼底檢查的評價結果為根據的。
表8、9、10、和11總結了臨床玻璃體炎、脈絡膜視網膜炎和視神經乳頭評分以及從治療組在接種後第3、4、5和6天所得到的2隻眼睛中的HCMV的回收量。
2結果單一試劑PALA靜脈治療組＃1PALA單一試劑治療50mg/kg/天在這一治療組中所有兔子在研究HCMV回收的時間過程中被宰殺。在這一單一試劑治療組中沒有動物連續地經過整個靜脈治療過程而被評價。經過假接種PALA50mg/kg/天治療的動物，＃S1，在研究的過程中沒有得任何玻璃體炎也沒有脈絡膜視網膜疾病。
在這一單一試劑治療組中通過細胞聲波處理試驗的HCMV回收結果證明在接種後第3、4、5和6天在脈絡膜視網膜中存在病毒，HCMV在培養物樣品中的滴度在接種後第3天達到最高，從其樣品中平均回收到104pfuHCMV。HCMV是從在該時間段的評價中所宰殺的動物的兩眼中回收的。HCMV滴度在整個恢復過程中是降低的，因此在接種後第6天在培養物中僅檢測到平均101pfoHCMV。HCMV在這一單一試劑治療組中的回收情況比在空白對照物處理組中的要好，但是在這個組中HCMV的滴度比其它組合試劑或單一試劑DHPG治療組更高。
組＃2組合試劑PALA(50mg/kg/天)加上DHPG(10mg/kg/天)臨床疾病(玻璃體炎和脈絡膜視網膜疾病)在這一高劑量PALA加上高劑量DHPG治療組中最輕。玻璃體炎(對脈絡膜視網膜HCMV病狀的間接測量手段)在除了接種後第5天外的所有天中都與單一試劑DHPG的治療相當。在這一高劑量治療組合組中的脈絡膜視網膜疾病當與單一試劑DHPG治療組相比較時可能具有一種附加的作用效果。這一高劑量組合組比其它PALA加DHPG治療組顯著地更好，且比空白對照物治療明顯地更好。在這個組中視神經炎在接種後的所有天中都是輕的。在這一組中的平均神經炎評分比所有其他組合試劑和單一試劑治療組更好。這個觀察結果是重要的且證明這一治療方式與其它結合和單一試劑的治療相比具有優選。在這一HCMV感染模型中的視神經乳頭變化是對脈絡膜視網膜疾病的發展和由HCMV誘發的病下的一種可靠的測定和評價手段。
在這一高劑量組合試劑治療組中通過細胞聲波處理試驗的HCMV回收結果表明僅在接種後第3和4天在脈絡膜視網膜中存在病毒。雖然在每個時間點上在每個組中僅處理2個樣品，但在第5和6天沒有病毒被回收到的事實是有意義的。在培養物樣品中HCMV滴度在接種後第3天達到最高，此時從樣品中平均回收到103.5pfuHCMV。從在該段評價時間中在接種後第3天殺的動物(接種並經藥物治療的動物)的雙眼中回收HCMV。在接種後第4天，2隻眼睛中僅有一隻通過培養物表明其中存在HCMV。在這個脈絡膜視網膜的樣品中的HCMV滴度是101pfuHCMV。這種從接種後第3至4天HCMV滴度的戲劇性降低表明這種組合試劑治療方式可能存在附加的反應。在接種後第4天之後在這一組合試劑治療組中從脈絡膜視網膜樣品裡沒有回收到HCMV。在這一高劑量組合試劑治療組中HCMV回收比在用空白對照物治療的眼睛中的回收更好，且比在早期用PALA加DHPG組合治療組中的HCMV的回收要好(頻率和HCMV滴度)。在這一組中HCMV滴度的降低比其它組合試劑治療組更好，且顯示出與在單一試劑DHPG治療組中所觀察的HCMV滴度的降低一樣好。
組＃3組合試劑PALA(25mg/kg/天)加上DHPG(7.5mg/kg/天)[中等劑量組合治療]和組＃4組合試劑PALA(25mg/kg/天)加上DHPG(5mg/kg/天)[低劑量組合治療]。
臨床疾病(玻璃體炎和脈絡膜視網膜疾病)在中等劑量和低劑量PALA加中劑量DHPG治療組中是中度的。在這些組合試劑治療組中的玻璃體炎的評分與高劑量組合或單一試劑DHPG治療組相比沒有改進。玻璃體炎在中等劑量組合治療組中在第10天還較嚴重。脈絡膜視網膜疾病的分析結果表明在接種後第10天在這兩個組合治療組中該疾病處於中度水平，而且視網膜病狀清晰可見。在這些組合治療組中平均脈絡膜視網膜和玻璃體疾病比在高劑量組合劑治療組中更嚴重。在中等劑量治療組中疾病的進展與在低劑量組合治療組中的疾病狀態沒有不同。玻璃體炎和脈絡膜視網膜疾病在這兩個組合組中呈現出中度水平。在中等劑量和低劑量組合治療組中，玻璃體炎和脈絡膜視網膜疾病比在高劑量組合和DHPG單一試劑治療組中更嚴重。視神經炎和視神經乳頭變化在這兩個中等劑量和低劑量治療組中存在於整個研究過程中。兩個組合治療組均表明中度的視神經乳頭神經炎和病症。在這些組中視神經乳頭變化與單一試劑DHPG治療組或空白對照物治療組沒有不同。在這些組中視神經乳頭變化與高劑量組合試劑治療組相比更差。
在這些組合治療組中從脈絡膜視網膜細胞聲波處理培養物中的HCMV回收介於空白對照物HCMV回收和單一試劑DHPGHCMV回收之間。在中等劑量回收組中，在接種後第3、4、和6天從聲波處理培養物中回收HCMV。滴度從接種後第3天的平均104降低到第6天的平均101。HCMV的回收量比在空白對照物治療組中的回收量更少。HCMV回收在中等劑量組中沒有象在高劑量組合治療組或單一劑DHPG治療組中降低得那樣快。
在低劑量組合試劑組中從脈絡膜視網膜細胞聲波處理培養物中的HCMV的回收量與中等劑量治療組相當。與在空白對照物組中或單一試劑PALA治療組中相比，在這一低劑量結合治療組中在第4、5、6天只有幾個脈絡膜視網膜樣品是陽性的。在這一低劑量治療組中HCMV的滴度和回收頻率與中等劑量組合HCMV治療組的回收頻率和HCMV滴度相類似。
在中劑量和低劑量結合治療組上進行組織解剖。該組織解剖總結如下。
中等劑量PALA加DHPG治療。在這一中等劑量組合治療組中該組織學結果表明在視網膜和靠近該視網膜的玻璃體中混合的細胞浸潤物發生輕度到中度的聚積。視網膜的破壞呈局部病灶具有水腫、壞死以及整個視網膜厚度消失明。脈絡膜視網膜中度充血和水腫，視神經乳頭變化包括該神經發生病灶浸潤和在玻璃體內界面處聚積混合細胞浸潤物。該病症在這一樣品中是值得注意的。若與實例5中所表明的病症相比較，該病症比在高劑量PALA加DHPG治療組和在單一劑治療組中所看見的病症更為嚴重。在這一中等劑量組合治療組中的病症與在經過空白對照物治療的脈絡膜視網膜樣品(實例5)中所看到的嚴重程度是不一樣的。
低劑量PALA加DHPG治療。玻璃體炎在這一樣品中為中度嚴重。脈絡膜視網膜病症僅限於由正常視網膜和脈絡膜分開的免疫細胞浸潤作用的孤立區域。在涉及HCMV反應的區域內，該視網膜表現出水腫、免疫性細胞浸潤作用、壞死以及正常細胞結構的缺損。在脈絡管和常見的脈絡膜炎區域明顯充血腫脹的同時該脈絡膜嚴重地充血。在這一低劑量組合治療組中的病症與在中等劑量治療組中的病症相類似。該病症比在高劑量PALA加DHPG組合治療組和在DHPG單一試劑治療組中的病症更嚴重且分布面更廣。
組＃5單一試劑DHPG(10mg/kg/天)。
在這一單一試劑治療組中的動物在接種後第2天開始接受DHPG治療，並一直持續到接種後第10天。每天10mg/kg的DHPG治療分成兩次施用。如在實例5中所證明的那樣，DHPG治療確實可減輕HCMV脈絡膜視網膜感染和疾病以及玻璃體炎的發展。脈絡膜視網膜疾病仍保持病灶，其視神經乳頭中度發炎並有中度免疫細胞浸潤。該脈絡膜存在中度充血。在這些經過治療的眼睛中疾病的臨床感覺與高劑量PALA加DHPG組合治療組相類似。在這一單一試劑組中的HCMV疾病比中劑量和低劑量組合治療組中更好，且比空白對照物治療組更好。在該單一試劑DHPG治療組中的臨床疾病與高劑量PALA組合治療組相類似。事實上，該高劑量組合治療方式可能比該單一試劑DHPG的治療稍微更好一些，因此顯示出這兩個靜脈治療組的一個附加效果。
從細胞聲波處理培養物中的HCMV回收結果表明HCMV回收率和從該樣品中回收的HCMV的滴度出現了快速下降。在接種後第3天，在這一治療組中從這兩個脈絡膜視網膜中均回收到了HCMV。HCMV的滴度測定為103pfu。在接種後第4天，HCMV回收值已降低至101滴度，且僅在2個脈絡膜視網膜樣品中的1個中較明顯。在接種後第5天沒有回收到HCMV，然而在接種後第6天從一個脈絡膜視網膜樣品中回收到一個較低的滴度(為101)。該HCMV回收頻率和HCMV滴度的降低比中等劑量和低劑量組合治療組和單一劑量試劑PALA組以及空白對照物治療組要好。HCMV回收的方式與高劑量組合治療組沒有不同。
組＃6空白對照物治療。
接受空白對照物治療的動物在接種後第2天開始接受消毒鹽水+EDTA，每天注射一次，並持續到接種後第10天。經過空白對照物治療的眼睛產生了輕度到中度的玻璃體炎。在該空白對照物治療組中的玻璃體炎與在其它單一試劑和組合試劑治療組中的嚴重程度不一樣。在這些經過空白對照物治療的眼睛中的脈絡膜視網膜疾病比其它治療組明顯地要差。病灶性視網膜靜脈出血和內視網膜出血是常見的。HCMV疾病的病灶面很大且導致了平均評分為1.5至2+的脈絡膜視網膜疾病。該疾病包括局部區域的視網膜浸潤病灶、視神經炎症和紅腫以及輕度玻璃體炎。玻璃體炎包括具有周邊細胞浸潤物的玻璃體條、細胞凝塊和混濁。空白對照劑治療不能終止脈絡膜視網膜的發展。在用空白對照物治療的眼睛中視神經炎和炎症的平均水平與其它治療組相當。
從空白對照物治療組中HCMV回收結果表明在接種後第3-6天的HCMV回收量在該評價過程中其滴度從104降至102。空白對照物治療組與其它治療組比較具有最高的滴度回收值。
3結論[1]使用高劑量PALA加DHPG的組合試劑治療要優於所有其它組合試劑治療。事實上，這一高劑量治療與單獨的DHPG治療相比具有一種附加的抗病毒作用效果。從所有治療組中在分析過程中均回收到HCMV。回收頻率(如，呈陽性HCMV的病毒回收樣品的數量)的差異隨著治療後時間的增加而減少。很明顯從脈絡膜視網膜的聲波處理樣品中所回收的病毒的滴度也隨著接種後時間的增加而降低。HCMV回收值和HCMV滴度的降低與兔子所接受的治療有關。組合試劑高劑量PALA加DHPG(治療組＃2)對於減輕臨床疾病和降低在脈絡膜視網膜培養物中的HCMV回收值是最有效的組合試劑治療。這種組合治療與單一試劑DHPG的治療一樣好。這種組合試劑治療與單一試劑DHPG治療相比具有一種附加的抗病毒作用。在降低HCMV回收值方面，組合試劑和單一試劑治療組的效果排列為高劑量組合劑PALA加DHPG(組＃2)≈單一試劑DHPGDHPG(組＃5)＞＞中等劑量組合試劑PALA加DHPG(組＃3)＞低劑量組合試劑PALA加DHPG(組＃4)＞單一試劑PALA(組＃1)＞空白對照物(組＃6)。高劑量PALA加DHPG的組合治療對於保持視網膜結構是最有效的(opthalmologically)且通過最終的組織病理學可證實(結果未示出)。
表9對用單一和組合試劑靜脈內治療的動物的視神經炎評分視神經炎評分10/1910/2010/2110/2210/2310/263456710組號動物ONHONHONHONHONHONH29NR2220.52 10 2*2 4 4 5 1.52S22000000315NRNR4433317NR24NR623S30000004202NR22NR3422NRNR22624S4000000525NRNR43335292NR51635S5000000635015633636NR44NRNR4ONH-視神經乳頭;NR-未讀出;＊評分代表每隻兔子的兩隻眼中的視神經乳頭變化(視神經炎)之和。
表10在接種後第3-6天由脈絡膜視網膜細胞聲處理培養物中回收的HCMV宰殺的天數動物數量回收的HCMVHCMV滴度ODOSODOS3 1 + + 1041043 11 + + 1031033 19 + - 104---3 23 + + 1021043 28 + + 1031033 34 + - 104-105---4 2 + + 1031024 7 - + --- 1014 12 + - 102---4 18 - + --- 1034 24 + - 101---4 30 + + 1031035 3 + + 10110258--------513--------519--------526--------5 31 - - --- 1026 4 + + 10110166--------6 14 - + --- 1016 21 + - 101---6 27 + - 101---6 33 - + --- 102培養物代表在靜脈內治療期間的HCMV細胞聲處理培養物，將培養物放在12井中，將所有的陰性培養物在黑暗中傳代培養4次，共28天，在確定培養物中存在HCMV(陰性)之後利用標準噬菌斑試驗確定陽性培養物中的HCMV滴度表11由單一和組合試劑治療組回收的HCMV由脈絡膜視網膜培養物回收的HCMV的平均滴度接種後天數治療組3456組 #1 2/2*; 2/2; 2/2; 2/2; 104**102.5101.5101組 #2 2/2; 103.51/2; 0/2 0/2[50mg/kg/天PALA 加 10110mg/kg/天DHPG]Gro組 #3 1/2; 1041/2; 0/2 1/2;組 #4 2/2; 1031/2; 0/2 1/2;組 #5 2/2; 1031/2; 0/2 1/2; 101101組 #6 2/2; 104.52/2; 1/2; 1/2; 103102102例7兔體內PALA上升劑量效能的評價，在評價過程中的臨床和HCMV回收情況。
通過對比臨床HCMV疾病、由細胞聲處理培養中回收的HCMV、和由HCMV誘導的組織病理學上疾病嚴重程度採用這些實驗來評價在兔模型中感染HCMV後，上升劑量靜脈治療研究中PALA的效能。將由脈絡膜視網膜聲處理共同培養物得到的HCMV滴度與用DHPG和空白對照物治療的動物中回收的HCMV滴度作對比。
方法用於本研究的總共有60隻染色的兔子，用狹縫燈和間接檢眼鏡評價動物，以確定正常眼的形態和預先沒有病狀。
動物的處理方式如下[1]0天時，所有的動物都經間接檢眼鏡評價，確保後段是正常的。在眼底檢查之後使動物接受局部眼藥水使瞳孔放大。每日進行局部眼藥水療法自接種後持續10天。0天時，所有的兔子都通過玻璃體(vitreal)注射100μl的105PFU HCMV菌株AD169進行接種。將動物保存在各個籠子內並每日監測發展的脈絡膜視網膜HCMV病。接種後第2天，將接種HCMV的動物按每10隻接種HCMV的兔子加1隻假接種的兔子分為1組。感染HCMV的和假接種的兔子接受如下所述的靜脈治療單一試劑PALA上升劑量靜脈治療組＃110隻接種HCMV的兔子，在接種後第2-10天靜脈注射PALA(50mg/kg)。每隻兔子總共靜脈內注射9次。
將這組兔子在研究過程中，於接種後第3、4、5和6天殺死，以評價HCMV回收和滴度的降低。取出兩隻兔子(4隻眼睛)並作處理從而在接種後各個時間點從細胞聲處理物中回收HCMV。剩餘的2隻動物接著進行為期9天的療程。
組＃210隻接種HCMV的兔子，在接種後第2-10天靜脈注射PALA(75mg/kg)。每隻兔子Ⅳ注射9次。
將這組兔子在研究過程中，接種後第3、4、5和6天處死，以評價HCMV回收和滴度的降低。取出兩隻動物(4隻眼睛)並作處理從而從聲處理細胞中在接種後每個時間點回收HCMV。剩餘的2隻動物接著進行為期9天的療程。
組＃310隻接種過HCMV的兔子，在接種後第2-10天靜脈注射PALA(100mg/kg)。每隻兔子靜脈內注射9次。
將這組動物在研究過程中在接種後3、4、5和6天處死，以評價HCMV的回收和滴度。取出兩隻兔子(4隻眼睛)並處理從而從聲處理細胞中在接種後每個時間點回收HCMV。剩餘的2隻兔子接著做為期9天的療程。
組合試劑PALA加地塞米松結膜下治療組＃410隻兔子在HCMV接種前1小時，接受4mg的結膜下depo地塞米松。兔子接受靜脈注射PALA(接種後2-10天75mg/kg/天)。
將這組動物在研究過程中在接種後第3、4、5和6天處死，以評價HCMV回收和滴度的降低。取出兩隻動物(4隻眼睛)並處理從而從聲處理細胞中在接種後每個時間點回收HCMV。剩餘2隻兔子隨後進行為期9天的療程。
正和負對比物治療組組＃510隻接種HCMV的動物，在接種後第2-10天按10mg/kg/天的劑量分兩次靜脈注射。
將這一組的動物在研究過程中，在接種後第3、4、5和6天處死，以評價HCMV的回收和滴度降低情況。取出兩隻動物(4隻眼)並作處理從而從聲處理細胞中、在接種後每個時間點回收HCMV。剩餘2隻動物接著進行為期9天的療程。
組＃610隻接種HCMV的動物，在接種後第2-10天靜脈注射消毒鹽水。
將這組在研究過程中，在接種後第3、4、5和6天處死，以評價從視網膜中的回收HCMV和滴度降低。取出兩隻動物(4隻眼睛)並作處理從而從聲處理細胞中在接種後每個時間點回收HCMV。剩餘的2隻動物接著作為期9天的療程。所有的動物每天接受間接檢眼鏡的檢查或用手持+90屈光度稜鏡的狹縫燈檢查，以評價臨床HCMV病的進展(接種後第2-10天)。由兩個偽裝起來的讀數器獨立完成眼底檢查，使兔子接受治療。所有兔子或在研究過程中在接種後第3、4、5和6天處死，以評價PALA單一試劑對HCMV滴度降低的影響，或者在接種後第2天從組織學上證實臨床過程PALA的療效。
將由所有經過藥物處理的靜脈治療組得到的臨床、病毒回收和組織效能結果彼此之間和空白對照物治療組之間相互聯繫進來。
概括說明在整個上升劑量效果評價過程中的各個兔子。
第0天，所有的兔子通過狹縫燈生物顯微鏡和眼底檢查作預評價。動物編號1-60;和S1-S3。在預檢查之後，立即對動物進行HCMV玻璃體內(intrvitresl)注射接種。在按將兔子隨機分成幾個組第1天，動物按下列指示接受靜脈治療(從1天-10天)組＃1兔子＃1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和假接種兔S1-50mg/kgPALA。
組＃2兔子＃11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和1隻假接種動物＃S2-每日接受靜脈注射75mg/kgPALA。
組＃3兔子＃21、22、23、24、25、26、27、28、29、30和1隻假接種動物＃S3-每日接受靜脈注射100mg/kgPALA。
組＃4兔子＃31、32、33、34、35、36、37、38、39、和40在接種單一結膜下注射4mg醋酸6-甲強的松龍(depomedrol)(甾族化合物)後立即接種HCMV。然後使這些動物每日接受75mg/kgPALA的靜脈治療。
組＃5兔子＃41、42、43、44、45、46、47、48、49和50每日接受DHPG(10mg/kg/天)的靜脈治療。
組＃6兔子＃51、52、53、54、55、56、57、58、59和60每日接受空白對照物的靜脈治療(消毒鹽水加EDTA注射液)。
接種HCMV且經過單一試劑處理的動物的宰殺接種後第3天為回收HCMV而將下列動物殺死並進行脈絡膜視網膜細胞聲處理培養組＃1兔子＃1和2組＃2兔子＃11和12組＃3兔子＃21和22組＃4兔子＃31和32組＃5兔子＃41和42組＃6兔子＃51和52接種後第4天為回收HCMV而將下列動物殺死並進行脈絡膜視網膜細胞聲處理培養組＃1兔子＃3和4組＃2兔子＃13和14
組＃3兔子＃23和24組＃4兔子＃33和34組＃5兔子＃43和44組＃6兔子＃53和54接種後第5天為回收HCMV而將下列動物殺死並進行脈絡膜視網膜細胞聲處理培養組＃1兔子＃5和6組＃2兔子＃15和16組＃3兔子＃25和26組＃4兔子＃35和36組＃5兔子＃45和46組＃6兔子＃55和56接種後第6天為回收HCMV而將下列動物殺死並進行脈絡膜視網膜細胞聲處理培養組＃1兔子＃7和8組＃2兔子＃17和18組＃3兔子＃27和28組＃4兔子＃37和38組＃5兔子＃47和48組＃6兔子＃57和58接種後第12天為了進行組織學評價或為了從脈絡膜視網膜細胞聲處理培養物中回收培養的HCMV，將動物處死並處理其組織。在效果評價結束時處死的動物每天用間接檢眼鏡進行觀察。將這些動物HCMV病的臨床印象用於構建玻璃體-視網膜病曲線(在本文中圖示證明的)，評價結束時處死的動物包括臨床疾病印象玻璃體炎和脈絡膜視網膜病的發展圖9和10概述了在靜脈單一試劑組中有關玻璃體視網膜疾病的發展數據。脈絡膜視網膜病的發展由於40%的眼睛在接種後4-5天內的玻璃體炎的發展而部分變得模糊不清。條形圖表明了在上升劑量PALA治療的和對比物治療的動物中玻璃體-視網膜病程的趨勢。
表12、13、14和15概述了在接種後第3、4、5和6天從4隻眼睛/治療組得到的有關玻璃體炎和視神經乳頭疾病嚴重程度和回收HCMV的原始數據。
結果單一試劑PALA靜脈治療組＃1PALA單一試劑治療，50mg/kg/天將本治療組中的兔子＃1-8在HCMV回收研究過程中處死。隨後對50mg/kg/天單一試劑治療組中的動物＃9和10在整個靜脈治療過程中進行評價。到接種後第6天，臨床疾病表明玻璃體炎增強了。接種後第7天，玻璃體炎(炎症反應)降至低水平。這種觀測與先前對單一試劑50mg/kg/天PALA治療中玻璃體炎病情發展的觀測結果相類似。視神經乳頭病的嚴重程度也與以前報導的50mg/kg/天治療眼睛的相類似。在本項研究中，視神經乳頭病狀在接種後第4天達到峰值，在研究的其餘過程中降至低水平。
通過單一試劑治療組的細胞聲處理試驗回收的HCMV結果表明在接種後第3、4、5和6天脈絡膜視網膜中存在著病毒。培養樣品中的HCMV滴度最高是在接種後第3天，當時由4種脈絡膜視網膜細胞聲處理樣品回收的HCMV平均值為103.5pfu。接種後第4和5天，由處理過的眼睛回收HCMV的頻率下降。當從4/4脈絡膜視網膜細胞聲處理樣品回收HCMV時，可以看到在接種後第6天，病毒回收量(HCMV回收頻率)回縮。當可以看到HCMV滴度輕微回縮至102pfu/ml時，除接種後第6天以外，整個回收過程中的HCMV滴度都在下降。在該單一試劑治療組中的HCMV回收，較從經空白對照物處理的眼睛中的回收要好，而且與經DHPG處理過的眼睛相當。(用DHPG處理過的眼睛具有稍低的HCMV滴度而且在回收研究中，幾乎沒有陽性的脈絡膜視網膜樣品)。
假接種的且經過PALA50mg/kg/天處理的動物，＃S1，在研究的過程中出現了輕微的玻璃體炎。接種後第7天，50mg/kg/天假接種動物的玻璃體炎水平為0.5-0.75。
組＃2PALA單一試劑治療，75mg/kg/天將該治療組中的兔子＃11-18，在HCMV回收研究過程中處死。隨後對75mg/kg/天單一試劑治療組中的動物＃19和20在整個靜脈治療過程中進行評價。到接種後第6天，臨床疾病表明為玻璃體炎增強了。在接種後第7天，玻璃體炎(炎症反應)仍然在增加。視神經乳頭疾病的嚴重程度與以前報導的50mg/kg/天治療眼睛的相類似。視神經乳頭病狀在接種後第4天達到峰值而後迅速下降。在接種後第7天，根據臨床評價，沒有明顯的視神經乳頭變化。假接種的且經過PALA50mg/kg/天處理的動物，＃S1，在研究的過程中沒有發生任何的玻璃體炎，也沒有發生脈絡膜視網膜疾病。
通過該單一試劑治療組的細胞聲處理試驗回收的HCMV結果證明接種後第3、4、5和6天，在脈絡膜視網膜中有病毒存在。接種後第3天和4天，培養樣品的HCMV滴度達到最高，當時在每個時間點從脈絡膜視網膜細胞聲處理樣品中回收的HCMV平均為104.5103.75pfu。接種後第5天，HCMV滴度降至低水平。在接種後第4和5天，由處理過的眼睛回收HCMV的頻率下降。然而，從中回收病毒的樣品數量在接種後第6天增加，這說明在50mg/kg/天治療組中出現了回縮。在75mg/kg/天治療組中在接種後第6天，有3/4的樣品對通過細胞聲處理回收的HCMV呈陽性。在該單一試劑PALA處理組HCMV回收頻率的增加是可重複的。在該單一試劑治療組中的HCMV回收與空白對照物治療組相當。該單一試劑治療組在降低HCMV滴度和降低HCMV回收頻率方面的效果不如DHPG，所述HCMV是從脈絡膜視網膜組織回收的。
組＃3PALA單一試劑治療組，100mg/kg/天將這一治療組中的兔子＃21-28，在HCMV回收研究過程中處死。隨後對100mg/kg/天單藥劑治療組的兔子＃29和30，在整個靜脈療法過程中進行評價。在整個研究過程中，臨床疾病證明玻璃體炎增強了。在接種後第7天，玻璃體炎(發炎反應)仍保持增強，並且與75mg/kg/天組所觀測到的玻璃體炎相當。視神經乳頭病狀在接種後第4天達到峰值。到接種後第7天，根據臨床評價，視神經乳頭變化呈中等程度到高等程度，症狀很明顯。玻璃體炎和視神經乳頭疾病的嚴重程度與其它單一試劑PALA、DHPG和空白對照物治療相比增加了。100mg/kg/天的劑量可能是該化合物的毒性界限或稍微高予該毒性極限。但值得注意的事實是經100mg/kg/天處理的HCMV病沒有取得改進。有關上升劑量允許值的這些結果證明PALA在這樣高的濃度是不能忍受的。事實上，100mg/kg/day劑量對動物是有毒的。
假接種的且經過PALA/kg/天處理的動物，＃3，在接種後第5-7天，發生中等的玻璃體炎和暫時性的視神經乳頭變化。這些結果證明100mg/kg/天療法是在毒性範圍內的。
在該單一試劑治療組中通過細胞聲處理試驗回收的HCMV結果證明在接種後第3、4、5和6天脈絡膜視網膜內存在著病毒。培養樣品中的HCMV滴度在接種後第3天是最高的，當時由脈絡膜視網膜細胞聲處理樣品中回收的HCMV平均為104pfu。在接種後第5天，HCMV滴度降至很低的回收水平(102pfu/ml)。最重要的是，由處理過的眼睛回收HCMV的頻率在接種後第4和5天出現下降。然而，在接種後第6天，由脈絡膜視網膜細胞聲處理培養回收的HCMV滴度出現上升同時陽性培養物的數量(例如，由細胞聲處理樣品的HCMV回收頻率)也在增加。在接種後第6天，在100mg/kg/天治療組中，對於由細胞聲處理回收的HCMV有3/4的樣品呈陽性。HCMV滴度增加到與接種後第3天HCMV回收滴度相同的水平。在這種單一試劑治療組中HCMV回收顯著高於經空白對照物處理的動物的HCMV回收。該單一試劑治療組在降低臨床疾病進展或從細胞聲處理培養物的HCMV回收方面都是無效的。
組＃4PALA單一試劑治療(100mg/kg/天)加4mg結膜下的甾族化合物注射將該治療組的兔子＃31-38，在HCMV回收研究過程中處死。隨後對在該75mg/kg/天單一試劑治療加4mg結膜下的甾族化合物治療組中的兔子＃39和40，在整個靜脈治療過程中進行評價。在整個評價期的過程中，臨床疾病證實玻璃體炎是輕微的。視神經乳頭病的嚴重程度的降低與所有其它治療組相當。該臨床疾病的嚴重程度的下降是結膜下的甾族化合物注射的直接反應，所述注射可使眼睛鎮靜並可降低寄主對HCMV接種的免疫應答。
在這種單一試劑治療組中，從細胞聲處理試驗回收的HCMV，結果證明接種後第3、4、5和6天時脈絡膜視網膜中有病毒存在。在整個研究過程中，培養樣品中的HCMV滴度仍保持增長。在接種後第3-6天回收的HCMV的平均滴度為103pfu。除了在甾族化合物治療組中回收到較高的HCMV滴度之外，HCMV回收頻率(陽性樣品數量)與50mg/kg/天和75mg/kg/天治療組相似(例如，HCMV回收頻率的逐漸降低，緊接著在接種後第6天HCMV回收出現回縮)。儘管玻璃體炎的發展和視神經乳頭的變化在所述甾族化合物治療組內有所下降，但是病毒的滴度還是有提高的，這說明甾族化合物增強了HCMV的複製(或檢測)，75mg/kg/天PALA治療對於抑制疾病的發展、HCMV複製和由脈絡膜視網膜組織的回收是無效的。
組＃5單一試劑DHPG(10mg/kg/天)。
將該治療組中的兔子＃41-48在HCMV回收研究的過程中處死。隨後對在10mg/kg/天單一試劑DHPG治療組中的兔子＃49和50，在整個靜脈治療過程中進行評價。單一試劑治療組的動物從接種後第2天開始持續到接種後第10天一直接受DHPG治療。10mg/kg/天DHPG劑量分成2次給藥。正如已前研究中所證明過的，DHPG治療能降低由HCMV誘導的視神經疾病嚴重程度的發展。玻璃體炎的發展只在一定程度上受DHPG治療的影響。
從細胞聲處理培養物回收的HCMV結果證明HCMV的回收速率和由樣品回收的HCMV滴度迅速下降。在接種後第3天，測量的HCMV滴度是103pfu。在接種後第4天，HCMV回收已降至滴度101.25，HCMV回收頻率和滴度連續降到接種第6天。HCMV滴度或陽性HCMV組織數量在DHPG治療組中沒有出現回宿。HCMV回收和滴度降低圖與以前在其它的單一試劑DHPG治療組所證實的沒有差別。
組＃6空白對照物治療。
在HCMV回收研究過程中，將該治療組中的兔子＃51-58處死。隨後在靜脈治療過程中，對經空白對照物處理的治療組中的兔子＃59和60進行評價。經空白對照物處理的動物，從接種後第2天開始直到第10天每天接受消毒鹽水+EDTA的單一注射。經空白對照物處理的眼睛發生輕微到中等程度的玻璃體炎。空白對照物處理組的玻璃體炎在整個研究過程中一直在加劇。玻璃體炎包含玻璃體條，它具有周邊細胞侵潤、細胞聚集和混濁。在空白對照物處理過的眼睛中，視神經炎和炎症的平均水平與其它治療組相當。
由空白對照物處理組回收的HCMV結果證實在評價過程中在接種後第3-6天回收的HCMV其滴度由104.5降至102。空白對照物處理組與其它治療組相比具有較高滴度回收。正如在PALA單一試劑治療組所證明的那樣，在第6天的HCMV回收或滴度中不存在回縮。
結論[1]用PALA50，75和100mg/kg/天的上升劑量治療兔子，在效果方面沒有提高。事實上，100mg/kg/天組對動物是有毒的。眼病仍保持在高水平上。當與50mg/kg/天PALA劑量或10mg/kg/天DHPG劑量比較時，75mg/kg/天劑量沒有改善。從所有治療組的分析過程中均回收到HCMV，回收頻率(例如HCMV陽性病毒回收樣品的數量)方面的差異伴隨著治療後時間的延伸而減少。很明顯由脈絡膜視網膜聲處理樣品回收的病毒滴度也伴隨接種後時間的延伸而減小。感興趣的結果是在所有的PALA單一試劑治療組中，在接種後第6天的HCMV檢測和HCMV滴度中均存在回縮。這種滴度和頻率的觀察結果在較高的PALA治療濃度時更加明顯。結膜下甾族化合物注射組的結果證明甾族化合物治療確實抑制了玻璃體炎和視神經乳頭病症。對甾族化合物處理組的病程的評價是容易的，75mg/kg/天治療，如同在非甾族化合物處理的75mg/kg/天治療中一樣，和DHPG治療一樣無效。使用甾族化合物的一個潛在問題是接種後第3-6天HCMV的滴度持續增長。除了滴度提高之外，HCMV回收頻率與單一試劑75mg/kg/天PALA處理眼睛對所觀察到的類似。在該上升劑量治療評價中，在減少HCMV回收方面單一試劑治療組的效果排列是DHPG治療(組＃5)＞PALA單一試劑50mg/kg/天(組＃1)＞＞PALA單一試劑75mg/kg/天(組＃2)＞或等於空白對照物治療(組＃6)＞＞單一試劑PALA100mg/kg/天(組＃3)＞單一試劑PALA75mg/kg/天加4mg結膜下甾族化合物注射(組＃4)。
根據本研究和以前研究的結果，單一試劑PALA治療在降低視網膜中HCMV疾病的發展和減少HCMV病毒回收方面(從脈絡膜視網膜樣品中回收的HCMV的滴度和HCMV回收頻率)與DHPG治療一樣無效。因此，正如例6所證實的一樣，在治療HCMV病毒感染時，最好使用PALA組合治療。
表12用單一試劑靜脈注射治療處理的動物的脈絡膜視網膜和玻璃體炎的評分玻璃體-視網膜評分組動物1/111/121/131/141/15345671 9 1.0*0.75 0.65 0.75 0.41101.52.51.250.60.42192.252.751.752.0無2201.53.53.55.5評分5.03291.04.53.54.03.253300.753.753.04.04.254391.00.750.751.51.04401.01.51.01.752.255494.753.754.02.53.255505.05.755.05.255.56 59 1.0 2.25 3.0 3.0 1.75**61.252.752.753.03.0-＊評分代表兩隻眼睛/兔子的總和。
＊＊只有一種可以評價。
＊＊＊只有白色反射表13用單一試劑靜脈治療法處理的動物的視神經炎評分視神經炎評分Group#Animai1/111/121/131/141/1534567ONHONHONHONHONH192.02.01.01.01.01102.03.01.00.502192.04.03.02.002202.05.05.0NRNR3292.06.05.04.02.53303.05.04.04.04.0439001.00044001.01.00.50.55495.06.04.02.02.05504.05.05.02.0 6503.03.05.04.05.06 60 2.0 4.0 2.0*4.0 ONH-視神經乳頭;NR-未讀出;＊評分代表兩隻眼睛/兔子的視神經乳頭變化(神經炎)的總和。？眼底觀測模糊;＊＊只一面評價。
表14接種後3-6天從脈絡膜視網膜細胞培養物回收的HCMV回收的HCMVHCMV滴度組殺死天數動物序號ODOSODOS1 3 1 + + 1031041 3 2 + + 104103143------1 4 4 + - 104--1 5 5 - + -- 1021 5 6 + - 102--1 6 7 + + 1021031 6 8 + + 1021021129------11210------2 3 11 + + 1051042 3 12 + + 1041042 4 13 + + 1041032 4 14 + - 104--2515------2 5 16 - + -- 1022 6 17 + + 1031042618------21219------21220------3321無數據/動物在培養前死去3 3 22 + + 1041033 4 23 + + 1051033 4 24 + + 1031043 5 25 - + -- 1023526------3 6 27 + - 102--3 6 28 + + 10210331229------31230------
表14(續)回收的HCMVHCMV滴度組殺死天數動物序號ODOSODOS4 3 31 + - 104--4 3 32 - + -- 1044 4 33 + + 1031044434------4535------4 5 36 - + -- 1034 6 37 + + 1041044 6 38 + - 103--41239------41240------5 3 41 + - 104--5 3 42 + + 1041035 4 43 + - 102--5 4 44 + - 103--5 5 45 - + -- 1025 5 46 + - 102--5647------5 6 48 - + -- 10251249------51250------6 3 51 + + 1041056 3 52 + + 1041046 4 53 + + 1021046 4 54 + + 1041036 5 55 + - 102--6 5 56 + + 1021026 6 57 + + 1031026 6 58 - + -- 10161259------61260------
大補元氣類膨酥飲片人參、黃芪、山茱萸;
大補氣血雙虧類膨酥飲片人參、當歸、黃芪、桂圓、何首烏;
防治高血壓類膨酥飲片杜仲、三七、枸杞子、決明子;
防治腦心血管疾病類膨酥飲片人參、丹參、三七、何首烏、枸杞子;
大補肺虛止咳祛痰類膨酥飲片桂圓、桔梗、杏仁、百合、山藥、五味子;
補心益智、寧心安神類膨酥飲片人參、百合、山藥、桂圓、茯苓、枸杞子;
補脾胃虛虧食慾不佳體弱無力類膨酥飲片白朮、茯苓、芡實、熟地、天冬、仙靈脾、薏苡仁、何首烏、枸杞子、菟絲子、山藥;
補腎壯陽添精益髓類膨酥飲片肉蓯蓉、山株萸、枸杞子、菟絲子、五味子、蛇床子、芡實;
補腎培元強筋狀骨延年益壽類膨酥飲片何首烏、枸杞子、菟絲子、五味子、覆盆子、肉蓯蓉、人參、杜仲、熟地、山藥、小茴香、
。
抗癌類膨酥飲片白朮、百合、山藥、桂圓、茯苓、薏苡仁、無花果。
系列中藥膨酥飲片包括單味中藥和多味中藥膨酥飲片，供中老年人補品用。10類大補膨酥飲片不是方劑，只是歸類組合，使用時，遵照醫囑，臨症配方服用。
傳統的中藥成方經過上述七道工藝程序混合劑加工成各種成方膨酥飲片，一改現在中藥的成方劑型，變成飲片劑型，可以延長中成藥的保存期限，提高藥性、便於服用、利於人體健康。
1材料和方法在實驗中使用15隻成年非洲綠猴，以評價單獨的指定的PALA化合物和PALA與利福平的組合在抑制牛痘病毒感染方面的能力。在開始研究之前，對15隻猴子的每一隻中提取的血清在1∶10稀釋條件下進行血清反應陰性(對牛痘病毒)測試。所採用的試驗採用100TCID50病毒進行血清中和試驗。
牛痘病毒感染是一種皮膚感染，它是通過皮內注射0.1ml經1∶100稀釋的貯存病毒而產生的，該注射在剃光的每個猴的背部八個位點的每一個上進行。該病毒接種物的滴定表明每個注射位點接受了106TCID50病毒。
在病毒注射之後，將這些猴分成5組，每組3隻猴，分組結果列於表1。在接種病毒前，對每個猴稱重，提取5ml血漿作為原始血漿和淋巴細胞樣品。
在病毒接種後24小時開始用PALA和/或利福平進行治療。兩種藥劑在治療當天重新製備。PALA是在含有5ml溶液100mg/ml的小玻璃瓶中提供的。在pH7.2PBS中製備1∶4稀釋液，其結果藥物濃度為25mg/ml。在第1組和第3組中的猴接受PALA50mg/kg/天治療，通過靜脈注射給藥，分為每日早8點和晚8點鐘分開給藥。25mg/ml的PALA溶液進入隱靜脈中，每公斤體重施用1ml。
將利福平按300mg等分稱出，將其溶解在10mlDMSO中且加到60ml體積。這一稀釋的結果是其濃度為5mg/ml。第2、3組接受靜脈注射，每公斤體重注射1ml或5mg/kg。每日在早8點鐘和晚8點鐘進行兩次治療，結果每日劑量為10mg/kg。
第5組的猴子在感染後第1天和第7天接受PALA，以125mg/kg進行一次靜脈注射。第4組是一個感染對照組，通過每日早8點和晚8點的靜脈注射施用PBS。所有的治療持續到第10天。
感染通過每日檢查損害位點而評價，且對於增加的嚴重程度以±到4+的等級對它們進行評分。每隻猴的總評分通過將各個損害值加在一起而確定，並通過用該總值除以注射位點數而確定平均值。因此對每隻猴提供每日的平均損害值。
另一方面，在感染後第3、7、和10，對每隻猴的一個損害位點進行活體解剖，此時開一個8mm皮膚切口。通過縫合關閉該活體解剖位點。將每一塊活體解剖的皮膚轉移到一個玻璃組織研磨器中，且該組織在2ml組織培養基中均化(最小基本培養基，含有2%胎牛血清和抗生素)。該組織勻漿通過製備系列十倍稀釋物對牛痘病毒進行滴定，該稀釋物是在含有Vero細胞的24小井培養板中複製培養的。在接種4天之後，將培養物在甲醇中固定，用亞甲藍基品紅染色，且進行噬菌斑計數。
在感染後第0、3、6、8和10天，在肝素中收集5ml血液，將血漿和細胞分離。將該血漿冷凍在-200℃下，且用PBS1∶1稀釋該細胞，並層放在ficoll-hypaque梯度上。隨後以1400rpm的轉速離心作用30分鐘，收集淋巴細胞帶，並有含有15%胎牛血清的RPMI-1640培養基中將其洗滌兩次。在第二次洗滌之後去除培養基，將沉澱的細胞懸浮在一種1mM二硫蘇糖醇、1mMEDTA和10mM乙酸鎂的溶液中，並冷凍在-70℃條件下。
將這些猴在第10、14、和21天稱重，並在第14和21天抽血以測定對牛痘病毒的抗體滴度。抗體滴度通過血清中和試驗來測定。
2結果每隻猴的平均損害值示於表16中。在第3、6、7、8、9、10和13天對每個猴背上的所有位點進行損害評分，並計算其平均值。每天對每一組的猴的平均值進行測定，且以黑體字的型式看到。該數據表明50mg/kg/天的PALA和50mg/kg/天的PALA與10mg/kg/天的利福平的組合對於減輕損害發展和減小尺寸是有效的。兩隻感染對照猴具有可看見的損害，而另一隻對照猴具有中度損害。用利福平治療的猴也可看見具有可見的皮膚損害，又有兩隻猴表現出比第三隻猴子更嚴重的感染。在感染後第1-7天接受125mg/kgPALA施藥的組中，一隻猴在用藥後4小時死去。總的病理學結果包括肝部的深紅色變色作用，這說明可能發生了急性休克或中毒。組織病理學結果在以後將會報告。在損害表現方面，接受高劑量PALA的一隻猴表現出一般嚴重的損害，而另一隻具有更為中等程度的損害。在感染後第1天和第7天用高劑量PALA治療的猴中，損害的嚴重程度要比用較低劑量PALA每日治療的猴所看見的損害更大。
從每個猴身上皮膚活體解剖中的病毒滴定在每個治療組內以及在對照組中猴子和猴子之間各不相同(表3)。牛痘病毒的較高滴度在感染對照組、利福平組以及高劑量PALA組中表現出來。病毒的較低滴度在接受50mg/kg/天PALA的猴中和在接受PALA和利福平組合組中表現出來。
沒有明顯的跡象表明毒性存在於任何用PALA或用利福平治療的猴中(除了那只在施用PALA125mg/kg之後就死了的猴子之外)。兩隻存活的接受這種劑量的猴子，在感染後第7天接受第2次125mg/kg的注射，沒有任何不良症狀。
表16由感染牛痘病毒的非洲綠猴背上的接種點得到的牛痘損害評分
＊按+到4+的等級(相應於增加的程度)進行評分，每個評分代表每隻猴子的7(＊＊)，6(＊＊＊)或5(＊＊＊＊)位點的平均值表17在來自非洲綠猴的皮膚損害活體解剖的勻漿中的牛痘病毒的滴度
＊在2.0ml組織培養介質中將8mm活體解剖物均化，並在接種Vero細胞的24井板中的複製井中進行滴定表18對用牛痘病毒感染的並用PALA和/或利福平治療的猴中的牛痘病毒的中和抗體滴度
表19用牛痘病毒感染的且用PALA和/或利福平治療的非洲綠猴的體重
實例9通過棉鼠研究PALA抗呼吸合胞體病毒(RSV)的情況。
以下部分描述了一些實驗，其中用呼吸合胞體病毒先感染棉鼠，並用PALA、三氮唑核苷(ribavirin)、或它們的組合治療三天。其結果表明10mg/kg/天的PALA是最有效的;用PALA(10mg/kg/天)，組織病症明顯減輕，且病毒滴度下降一個log10。
1材料棉鼠(遠親繁殖的有短硬毛的棉田鼠(sigmodenhispidus))，任何性別，50至100克。攻擊病毒RSVA1，約100棉鼠中感染劑量(CRID50;100μl，鼻內(i.n)給藥)。PALA(30mg/kg/天)、三氮唑核苷(30mg/kg/天)、以及它們的結合治療，兩個化合物均內腹膜給藥(i.p.)。動物在(+)4天處死，將肺均化，且對RSV進行滴定。
總動物數24。
實驗記錄在棉鼠初步體內篩中的呼吸合胞體病毒(RSV)(採用16隻動物)。
＊(天0＝病毒接種日，所用的各種藥物的劑量及方案均隨實驗1的結果而變化)
呼吸合胞體病毒肺滴度(LOC10)PALA對三氮唑核苷實驗(對RSV)
兩個平均值之間的統計評價差異具有單程Anova(對T試驗可變)的T試驗空白對照物對PALA10mg/kg/d(t＝3.1650;df＝15;雙尾形p＝0.0064)。
2測試PALA抗棉鼠中RSV的抗病毒活性的實驗結果的總結2.1程序1.對50至100g任何性別的棉鼠在第0天用RSA2(庫8-28-92)進行接種(i.n.)2.在第+1天如下所述向動物供給空白對照物或PALA組1空白對照物(水)腹膜內(i.p.)第+1天-第+3天組2PALA3mg/kg/天腹膜內第+1天-第+3天組3PALA10mg/kg/天腹膜內第+1天-第+3天組4三氮唑核苷40mg/kg/天腹膜內第+1天-第+3天組5三氮唑核苷40mg/kg/天+第+1天-第+3天PALAmg/kg/天腹膜內3.將所有動物於第+4天處死，且將它們的肺用於RSV水平試驗
劃線的表示在用Kruskal-Wallis非參數ANOVA試驗和Newman-Reuls試驗作多重比較時明顯不同於空白對照物的平均值(p＜0.05)，採用具有單程ANOVA的t-試驗則更明顯。
＊多重比較方法＊＊所採用的治療以mg/kg/天計(腹膜內)3結論結果表明PALA作為單一藥物在抗呼吸合胞體病毒方面具有統計學上有意義的效果。從統計學上看PALA比三氮唑核苷更好。在PALA和三氮唑核苷之間沒有呈現出附加的和/或協同的作用。
很明顯，對於本領域技術人員來說在上述公開的範圍內對本發明作出修改和變化是可能的。應當知道，這些修改是包括在本發明的精神和範圍內的，這將通過權利要求書來限定。
權利要求
1.一種用於治療或防止人或獸類病毒感染的抗病毒組合物，包含有效抗病毒量的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸及其藥物許可的類似物和至少一種另外的抗病毒試劑。
2.權利要求1所述抗病毒組合物，其中所述另外的抗病毒試劑選自利福平、ganciclovir、無環鳥苷、金剛胺(adamantidine)、三氮唑核苷及其混合物。
3.一種用於治療或防止人或獸類病毒感染的抗病毒組合物，含有效抗病毒量的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸及其藥物許可類似物和和至少一種另外的糖基化抑制劑，該抑制劑選自2-脫氧-D-葡萄糖或脫氧野尻黴素。
4.一種用於治療或防止由人乳頭瘤病毒引起的疾病的抗病毒組合物，含有有效抗病毒量的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸及其藥物許可類似物和一種有效量的治療試劑，該試劑選自幹擾素-α和氟尿嘧啶及其一種混合物。
5.一種適用於治療或防止人或獸類病毒感染的藥物組合物，含有N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸及其藥物許可類似物，至少一種另外的抗病毒試劑和藥物許可載體。
6.一種治療或防止人或獸類病毒感染的方法，包括向需要進行抗病毒治療的人或動物施以有效抗病毒量的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物。
7.一種治療或防止人或獸類病毒感染的方法，包含向需要進行抗病毒治療的人或動物施以有效抗病毒量的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物以及至少一種有效量的另外的治療試劑。
8.權利要求7所述的方法，其中所述另外的治療試劑是一種抗病毒。
9.權利要求8所述的方法，其中所述的抗病毒是一種核苷酸類似物，一種核苷酸運載抑制劑，一種DNA或RNA鏈終止劑，一種糖基化抑制劑，或其一種混合物。
10.權利要求6或7所述的方法，其中所述的用藥是通過胃腸外或口服的。
11.權利要求6或7所述的方法，其中所述用藥是在局部、陰道或直腸上。
12.按權利要求6或7所述的方法，其中將約1mg/Kg/天-100mg/Kg/天的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對象上。
13.按權利要求12所述的方法，其中將約25mg/Kg/天-60mg/Kg/天的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對象上。
14.按權利要求12所述的方法，其中將約5-約60mg/Kg/天的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或藥物許可類似物施用到所述對象上。
15.按權利要求6或7所述的方法，其中所述病毒感染是由RNA病毒引起的。
16.權利要求15所述的方法，其中所述RNA病毒選自黃熱病毒、本雅病毒、Hantaan病毒和絲狀病毒。
17.按權利要求15所述的方法，其中所述RNA病毒選自黃熱病、白蛉熱、立夫特山谷熱、登革病毒1-4、何薩奇病毒、麻疹、呼吸合胞體、副流感和流感A(H2N2和H3N2)病毒。
18.按權利要求6或7所述的方法，其中所述病毒感染是由DNA病毒引起的。
19.按權利要求6所述的方法，其中所述病毒感染是由選自水痘、巨細胞和人皰疹病毒-6的DNA病毒引起的。
20.按權利要求9所述的方法，其中所述核苷酸類似物選自阿糖腺苷、阿糠腺苷單磷酸、碘苷、三氟胸苷、溴乙烯基脫氧尿苷、ganciclovir、無環鳥苷、溴乙烯阿拉伯尿嘧啶和(S)-9-(2，3-二羥丙基)腺嘌呤或其混合物。
21.按權利要求9所述的方法，其中所述抗病毒選自利福平、無環鳥苷、三氮唑核苷和金剛胺或其混合物。
22.按權利要求9所述的方法，其中所述DNA或RNA鏈終止劑選自2′，3′-二脫氧胞嘧啶、2′，3′-二脫氧肌苷、3′-疊氮基-3′-脫氧胸苷或其混合物。
23.權利要求9所述的方法，其中所述糖基化抑制劑選自2-脫氧-D-葡萄糖或脫氧野尻黴素。
24.權利要求7所述的方法，其中所述另外的治療試劑是與所述PALA或其藥物許可類似物一塊用藥的。
25.按權利要求7所述的方法，其中所述另外的治療試劑是在所述的PALA或其藥物許可類似物之前用藥的。
26.按權利要求7所述的方法，其中所述另外的治療劑在所述的PALA或其藥物許可類似物之後用藥的。
27.一種治療或防止由人乳頭瘤病毒引起的疾病的方法，包括向需要抗病毒治療的人施用有效抗病毒量的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物，以及有效量的選自幹擾素-α和氟尿嘧啶或其混合物的一種化合物。
28.一種治療或防止由C型肝炎引起的疾病的方法，包括向需要這種治療的人施用有效抗病毒量的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物。
29.一種治療或防止由C型肝炎引起的疾病的方法，包括向需要這種治療的人施用有效抗病毒時的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物，至少一種有效治療時的另外的治療試劑。
30.按權利要求27的所述的方法，其中將約1mg/Kg/天-約100mg/Kg/天的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述人體上。
31.按權利要求30的所述的方法，其中將約5-約60mg/Kg/天的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸及其藥物許可類似物施用到所述對象上。
32.按權利要求30的所述的方法，其中所述治療試劑選自抗病毒和甾族化合物或其混合物。
33.按權利要求32所述的方法，其中所述的抗病毒選自一種核苷酸類似物、一種核苷酸運載抑制劑、一種RNA或DNA鏈終止劑和一種糖基化抑制劑。
34.按權利要求33所述的方法，其中所述抗病毒選自ganciclovir和膦醯基甲酸或其混合物。
35.按權利要求30所述的方法，其中所述治療劑是3TC或α-幹擾素。
36.一種治療或防止由B型肝炎病毒引起的疾病的方法，包括向需這種治療的人施用有效抗病毒量的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物。
37.一種治療或防止由B型肝炎病毒引起的疾病的方法，包括向需要這種治療的人施用有效抗病毒量的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物，以及至少一種有效量的另外的治療試劑。
38.按權利要求34所述的方法，其中將約1mg/Kg/天-約100mg/Kg/天的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施加到所述對象上。
39.按權利要求38所述的方法，其中將約5-約60mg/Kg/天的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對象上。
40.按權利要求38所述的方法，其中所述治療試劑是一種抗病毒或一種甾族化合物。
41.按權利要求40所述的方法，其中所述抗病毒選自一種核苷酸類似物，一種核苷酸運載抑制劑、一種DNA或RNA鏈終止劑和一種糖基化抑制劑。
42.一種治療或防止由水痘病毒引起的疾病的方法，包括向需要這種治療的人或動物施用有效抗病毒量的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物以及有效量的無環鳥苷。
43.按權利要求42所述的方法，其中所述用藥是通過胃腸外。
44.按權利要求42所述的方法，其中所述用藥是口服。
45.按權利要求39所述的方法，其中將約1mg/Kg/天-約100mg/Kg/天的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對象上。
46.按權利要求45所述的方法，其中將約5-約60mg/Kg/天的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對象上。
47.按權利要求45所述的方法，其中將約20mg/Kg/天-約50mg/Kg/天的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對象上。
48.權利要求42所述的方法，其中將約10mg/Kg/天-約25mg/Kg/天的無環鳥苷施用到所述對象上。
49.一種治療或防止由牛痘病毒或牛痘病毒構建物引起的疾病的方法，包括向需要進行這種治療的人或動物施用有效抗病毒量的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物以及有效量的利福平。
50.按權利要求49所述的方法，其中將約1mg/Kg/天-約100mg/Kg/天的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對象上。
51.按權利要求50所述的方法，其中將約5-約60mg/Kg/天的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對象上。
52.按權利要求49所述的方法，其中將約20mg/Kg/天-約50mg/Kg/天的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對象上。
53.按權利要求49所述的方法，其中將約10mg/Kg/天-約20mg/Kg/天的利福平施用到所述對象上。
54.一種治療或防止由巨細胞病毒引起疾病的方法，其中包括向需要這種治療的人施用有效抗病毒量的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物以及有效量的ganciclovir。
55.按權利要求54所述的方法，其中將約5mg/Kg/天-約60mg/Kg/天的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對象上。
56.按權利要求55所述的方法，其中將約20mg/Kg/天-約50mg/Kg/天的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對象上。
57.按權利要求54所述的方法，其中將約5mg/Kg/天-約10mg/Kg/天的ganciclovir施用到所述人上。
58.按權利要求49或54所述的方法，其中所述用藥是通過胃腸外。
59.按權利要求49或54所述的方法，其中所述用藥是通過口服。
60.一種治療或防止免疫缺乏對象中的人或獸類病毒感染的方法，包括向缺乏免疫的人或動物對象施用有效抗病毒量的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物。
61.一種治療或防止免疫缺乏對象中的人或獸類病毒感染的方法，包括向缺乏免疫的人或動物對象施用有效抗病毒量的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物和至少一種有效量的另外的治療試劑。
62.按權利要求61所述的方法，其中將約1mg/Kg/天-約100mg/Kg/天的PALA或其藥物許可類似物施用到所述對象上。
63.按權利要求62所述的方法，其中將約5-約60mg/Kg/天的N-(膦醯基乙醯基)-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對象上。
64.按權利要求60或61所述的方法，其中所述病毒感染是由DNA或RNA病毒引起的。
65.按權利要求60或61所述的方法，其中所述的病毒感染是一種機會性病毒(opportunisticviral)感染，它是由HIV-1或HIV-2，化學療法或其它免疫抑制因素次生的，它選自觸染性軟疣病毒、巨細胞病毒、水痘-帶狀皰疹病毒。
全文摘要
本申請公開了利用PALA的廣譜抗病毒活性的組合物和方法。該方化合物及其藥物許可類似物具有有效的活性，同時顯示出最小的毒性，因此其特徵在於治療指數較高。還公開了任意地含有另外的治療試劑，例如另外的抗病毒試劑的組合物，並且還發現它具有協同的和/或附加的抗病毒活性。
文檔編號A61KGK1080853SQ9310459
公開日1994年1月19日 申請日期1993年3月18日 優先權日1992年3月18日
發明者H·A·布勞 申請人:美國生物科學有限公司