調節t細胞抑制自身免疫的製作方法

2023-07-20 06:12:16 2

專利名稱：調節t細胞抑制自身免疫的製作方法
相關申請的交叉參考本申請要求申請日為2004年1月8日的美國專利申請系列號60/535,085的優先權。
政府資助的聲明本研究由NIH NCRR基金R37 AI46643資助。美國政府在基於本申請被授權的任何專利中可享有權利。
導言發明背景自身免疫疾病包含許多目前最具破壞性和難以處理的疾病，其中代表性的自身免疫疾病包括糖尿病、葡萄膜視網膜炎和多發性硬化等等。
調節性T細胞(Treg)主動調節自身免疫並誘導長期耐受性的潛力在誘導持續耐受性的策略中具有極大的潛在應用。對Treg的利用由於不能擴展並鑑定這個小T細胞亞類而複雜化了，而這個小T細胞亞類是在易於自身免疫的動物和患者中進一步更加減少的細胞群。例如，近來的研究提示使進行中的自身免疫性糖尿病逆轉是不可能的，因為自身反應性T細胞在該疾病的活動階段(active phase)變得對抑制有抗性。離體(ex vivo)擴增Treg的先前嘗試未達到臨床上足夠的擴增，也未表明在體內的效力(例如Fu et al.，2004，Am J Transplant.4，65-78)。CD4+CD25+調節T細胞(Treg)的低數目、其無變應性的表型以及不同的抗原特異性是利用這一強耐受原性(tolerogenic)群體治療自身免疫和移植排斥的最大挑戰。
許多美國專利文獻涉及T細胞擴增，包括Horwitz(例如美國專利No.6,803,036和6,797,267及相關的專利出版物)；美國專利No.6,534,055；US2003/124122A1；US2003/0082806A1；US2002/0058019A1；US2002/0119568A1；US2003/0119185A1和US2002/0019048A1。
發明概述本發明提供了產生富含自身抗原特異性調節T細胞的組合物的方法、所得組合物及其使用方法。在一個實施方案中，本發明提供了一種調節對象自身免疫應答的方法，所述方法包括(a)獲得對象可相容的細胞群；(b)從所述細胞群中產生富含自身抗原特異性調節T細胞的組合物；以及(c)將所述組合物導入所述對象，以調節所述對象中的所述自身免疫應答。
在特定的實施方案中，所述細胞群得自所述對象、得自與所述對象不同的供體、和/或從外周血中收穫。
在特定的實施方案中，所述產生步驟包括擴增所述抗原特異性調節T細胞和/或從所述獲得的細胞群中富集所述自身抗原特異性調節T細胞。
在特定的實施方案中，所述擴增通過將所述細胞群與一種自身抗原特異性調節T細胞刺激組合物接觸而實現。
在特定的實施方案中，所述調節T細胞在所述擴增步驟之前或者在所述擴增步驟之後從所述細胞群中富集。
在特定的實施方案中，所述刺激組合物包含II類MHC/自身抗原性肽複合物、一種共刺激劑或者第二種調節T細胞刺激劑。
在特定的實施方案中，所述共刺激劑是一種激動劑抗體，例如結合CD28的激動劑抗體。
在特定的實施方案中，所述第二種刺激劑是一種細胞因子，例如一種白細胞介素，如白細胞介素-2。
在特定的實施方案中，所述刺激組合物固定在基質上，例如固定在細胞或珠上。
在特定的實施方案中，所述產生步驟包括在特定的實施方案中，所述調節包括抑制。
本發明還提供了包含細胞群的組合物，其中所述組合物的所述細胞的至少50％是天然自身抗原特異性調節T細胞。
在特定的實施方案中，所述自身抗原特異性調節T細胞特異於表A所示MHC II類分子中呈遞的肽。
在特定的實施方案中，所述自身抗原特異性調節T細胞當被給予對象時有效調節自身免疫反應。
本發明還提供了產生自身抗原特異性調節T細胞的組合物的試劑盒，所述試劑盒包含(a)自身抗原特異性T細胞受體刺激劑；以及(b)一種共刺激劑。
在特定的實施方案中，所述刺激劑是II類MHC/自身抗原性肽複合物。
在特定的實施方案中，所述共刺激劑是一種激動劑抗體，例如結合CD28的抗體。
在特定的實施方案中，所述試劑盒進一步包含第二種調節T細胞刺激劑，例如一種細胞因子，如一種白細胞介素，如白細胞介素-2或者白細胞介素-15。
在特定的實施方案中，所述刺激劑和所述共刺激劑固定在基質上，如固定在細胞或珠上。
本發明提供了用於治療性調節T細胞離體擴增的方法和組合物，及所得組合物和使用方法。所述擴增方法一般包括如下步驟從混合的T細胞群中分離富含CD4+CD25+T細胞(Treg細胞)的亞群；通過將該亞群與有效量的(i)TCR/CD3激活物、(ii)TCR共刺激物激活物和(iii)IL-2接觸而擴增該亞群的Treg細胞，以獲得離體擴增的Treg細胞，其中擴增的Treg細胞表現免疫抑制，其中所述分離步驟典型地以從患有通過本發明所述治療方法可減輕的自身免疫疾病或處於所述疾病的恢復期的人或患者中提取細胞群而開始。
在特定的實施方案中，所述亞群包含＞98％的Treg細胞，優選＞98％的CD4+CD25+CD62L+Treg細胞；所述分離步驟包括陰性和陽性免疫選擇和細胞淘選(cell sorting)；所述擴增步驟可以使得所述亞群擴增至少100倍；所述TCR/CD3激活物是TCR/CD3的多價抗體或者配體；所述TCR共刺激物激活物是CD28、GITR、B7-1/2、CD5、ICOS、OX40或者CD40的多價抗體或配體；IL-2的有效量是200-2500 IU IL-2/ml；和/或所述Treg細胞抑制抗-CD3或同種異體抗原刺激的CD25-T細胞的體外增殖或者抑制包括體內移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease)在內的自身免疫。
在更特定的實施方案中將有效量的離體擴增的Treg細胞導入經診斷患有糖尿病並且具有選自空腹血糖(FPG)、餐後血糖(PPG)和葡萄糖耐量(GTT)的葡萄糖穩態的損傷指徵的患者體內，會使損傷的葡萄糖穩態得以改善，其中所述改善優選地選自FPG為110mg/dL或更低、2小時PPG為140mg/dL或更低、以及攝取75g葡萄糖2小時後GTT為140mg/dL或者更低；所述TCR/CD3激活物是一種抗-CD3抗體，所述TCR共刺激劑激活物是一種抗-CD28抗體，其中所述抗-CD3和抗-CD28抗體固定在Treg細胞珠的比率為1∶1至1∶2的順磁性珠上；TCR/CD3激活物和擴增的Treg細胞是抗原特異性的，優選地其中TCR/CD3激活物是MHC-肽多聚體(multimer)，其中所述肽是一種糖尿病相關的自身抗原肽，所述糖尿病相關的自身抗原選自穀氨酸脫羧酶(GAD)、胰島細胞自身抗原(ICA)和胰島素，所述TCR共刺激物激活物是抗-CD28抗體。
本發明還提供了用於過繼細胞免疫治療的方法和組合物，包括向需要治療的患者體內導入有效量的本發明的離體擴增的Treg細胞的步驟。這些方法通常包括如下步驟從人體提取混合的T細胞群；從所述細胞群中分離富含CD4+CD25+T細胞(Treg細胞)的亞群；通過將該亞群與有效量的(i)TCR/CD3激活物、(ii)TCR共刺激物激活物和(iii)IL-2接觸而擴增該亞群的Treg細胞，以獲得離體擴增的Treg細胞；向患者體內導入有效量的離體擴增的Treg細胞；以及檢測所得自身免疫的抑制。
在特定的實施方案中，所述人體和患者是經診斷患有糖尿病並且具有選自空腹血糖(FPG)、餐後血糖(PPG)和葡萄糖耐量(GTT)的葡萄糖穩態的損傷指徵的患者；所述亞群包含＞98％的Treg細胞；所述亞群包含＞98％的CD4+CD25+CD62L+Treg細胞；所述分離步驟包括陰性和陽性免疫選擇和細胞淘選；所述擴增步驟使得所述亞群擴增至少100倍；所述TCR/CD3激活物選自TCR/CD3的多價抗體或者配體；所述TCR共刺激物激活物是CD28、GITR、CD5、ICOS、OX40或者CD40L的多價抗體或配體；IL-2的有效量為200-2500 IU IL-2/ml；所述Treg細胞抑制抗-CD3或同種異體抗原刺激的CD25-T細胞的增殖，和/或所得自身免疫的抑制作為損傷的葡萄糖穩態的改善而被檢測到。
在更特定的實施方案中所述改善選自FPG為110mg/dL或更低、2小時PPG為140mg/dL或更低、以及攝取75-g葡萄糖2小時後GTT為140mg/dL或者更低；所述TCR/CD3激活物是一種抗-CD3抗體，所述TCR共刺激物激活物是一種抗-CD28抗體，其中所述抗-CD3和抗-CD28抗體固定在Treg細胞珠的比率為1∶1至1∶2的順磁性珠上；和/或所述TCR/CD3激活物是一種MHC-肽多聚體，其中所述肽是一種糖尿病相關的自身抗原肽，所述糖尿病相關的自身抗原選自穀氨酸脫羧酶(GAD)、胰島細胞自身抗原(ICA)和胰島素，所述TCR共刺激物激活物是一種抗-CD28抗體。
本發明的特定實施方案的詳細描述本發明提供了產生富含預定的自身抗原特異性調節T細胞的組合物的方法、所得組合物及其使用方法。在一個實施方案中，本發明提供了一種調節對象體內自身免疫反應的方法，所述方法包括(a)獲得對象相容的細胞群；(b)從所述細胞群中產生富含自身抗原特異性調節T細胞、優選預定的自身抗原特異性調節T細胞的組合物；以及(c)將所述組合物導入所述對象中以調節所述對象體內的所述自身免疫反應。
在特定的實施方案中，所述細胞群得自所述對象、得自與所述對象不同的供體、和/或從外周血中收穫。獲得的細胞群包含自身抗原特異性調節T細胞(Treg)，可以衍生自其中存在自身抗原特異性Treg細胞的任何來源，如外周血、胸腺、淋巴結、脾和骨髓。在某些實施方案中，Treg細胞來源於屍體組織。
所述細胞群可得自其中隨後導入了富含Treg的組合物的對象。所述對象可以是希望調節其自身免疫反應的任何哺乳動物。感興趣的哺乳動物包括但不限於嚙齒類動物，例如小鼠、大鼠；家畜，例如豬、馬、牛等等；寵物，例如狗、貓；及靈長類動物，例如人。在一個實施方案中，所述對象是自身免疫疾病的動物模型。有許多已建立的動物模型用於使用自身抗原的T細胞表位誘導耐受性，包括多發性硬化(EAE實驗性自身免疫腦脊髓炎)，重症肌無力(EMG實驗性重症肌無力)和神經炎(EAN實驗性自身免疫神經炎)。在另一個實施方案中，所述對象是患有自身免疫疾病或病症如表A所列出的任何疾病/病症的人。
在另一個實施方案中，所述細胞群得自與對象不同的供體。所述供體優選是同種同基因的(syngeneic)，但也可以是同種異基因的(allogeneic)，或者甚至是異種的，只要獲得的細胞與其可以導入的對象相容即可，任選地與免疫抑制治療聯合進行，而不產生廣泛的慢性移植物抗宿主疾病(GvHD)。同種異基因供體細胞優選是人白細胞抗原(HLA)相容的，並且典型地與免疫抑制治療聯合施與。為了使得與對象相容，可以將異種細胞進行γ射線輻射或者PEN110處理(Fast，LDet al，Transfusion.2004 Feb；44(2)282-5)。
所述產生步驟從所述細胞群中提供了一種富含預定的自身抗原特異性調節T細胞的組合物，優選地特異於與靶定的自身免疫反應相關的預定的自身抗原，優選地預定與靶定的自身免疫反應相關。在特定的實施方案中，所述產生步驟包括從所述獲得的細胞群中擴增所述抗原特異性調節T細胞，和/或富集所述自身抗原特異性調節T細胞。
富含自身抗原特異性調節T細胞(Treg)的組合物是這樣的組合物，其中自身抗原特異性Treg細胞的百分比高於在最初獲得的細胞群中的自身抗原特異性Treg細胞的百分比。在特定的實施方案中，所述組合物的所述細胞的至少75％、85％、90％、95％或者98％是自身抗原特異性調節T細胞。在特定的實施方案中，所述產生步驟包括從所述獲得的細胞群中擴增抗原特異性調節T細胞，和/或富集所述自身抗原特異性調節T細胞。
在特定的實施方案中，調節T細胞在所述擴增步驟之前或者在所述擴增步驟之後從所述細胞群中富集。Treg細胞可以通過選擇特異於免疫抑制性Treg的細胞表面標記並使用自動細胞淘選如螢光激活的細胞淘選(FACS)、固相磁珠等進行分離而富集，如實施例1和2所描述。為了增強富集，陽性選擇可以與針對包含特異於非Treg細胞類型的表面標記的細胞進行的陰性選擇(例如去除攜帶CD8、CD11b、CD16、CD19、CD36和CD56的細胞)組合，如下文所例證。
在特定的實施方案中，所述擴增通過將細胞群與自身抗原特異性調節T細胞刺激組合物接觸而實現。所述自身抗原特異性調節T細胞優選被擴增至少50倍，優選至少100、200、300、500和800倍。自身抗原特異性調節T細胞刺激組合物促進表達識別希望的自身抗原的T細胞受體的自身抗原特異性調節T細胞的存活、生長和/或擴增。
優選的刺激組合物通過抗原特異性結合併激活T細胞受體複合物而刺激T細胞。可以使用各種抗原特異性TCR結合試劑，包括交聯的肽結合的MHC分子、抗體和模擬物。在一個優選的實施方案中，所述組合物包含II類MHC/自身抗原性肽複合物，特別是這種MHC/肽複合物的聚集體。這些複合物至少包含MHC II類分子的胞外肽結合結構域，其中功能性結合了自身免疫原性肽。所述複合物可以在溶液或者懸浮液中，或者固定在基質上，如存在於細胞特別是APC表面上。本領域已知許多可用於產生功能性II類MHC/肽複合物的方法，如可以見於文獻中。
在一個實施方案中，所述自身抗原性肽是天然發生的自身抗原的肽，其能與MHC II類分子複合。表A列出了示例性的MHC II類分子/肽複合物。在另一個實施方案中，所述自身抗原性肽是能與MHCII類分子複合的模擬表位(mimotope)肽。
在另一個實施方案中，所述自身抗原性肽是能與MHC II類分子複合的模擬表位肽。模擬表位肽在下面的文獻及在實施例1中描述。使用自身抗原肽從其它常規T細胞中擴增Treg的方案包括使用自身抗原特異性MHC-肽四聚物、肽脈衝的DC(Yamazaki，et al，2003，JExp Med 198235-47)或者人工APC(Maus et al.Nat.Biotechnol.20143-8，2002)以不依賴於細胞表面表型的方式從患者中擴增Treg。另外，組合體外和體內方法可增強治療效力。例如，近來的研究示出給予自身抗原、改變的肽配體及甚至非特異性刺激如FcR未結合性抗-CD3 mAb可以促進抗原特異性Treg活性(Apostolou et al.J.Exp.Med.1991401-8，2003；Belghith et al.Nat.Med.91202-8，2003)。因此，將體內免疫誘導Treg與離體擴增組合是有益的，反之亦然。
在某些實施方案中，所述刺激組合物可進一步包括一或多種額外的物質，例如共刺激劑、第二種調節T細胞刺激劑，或者通常促進T細胞存活和/或生長的物質。
在某些實施方案中，所述共刺激劑是特異於TCR共刺激物如CD28或者GITR的抗體或配體，如下文所描述。在特定的實施方案中，所述共刺激劑是激動劑抗體，如結合CD28的激動劑抗體。
另外，所述刺激組合物包含第二種調節T細胞刺激劑。舉例性的刺激劑包括粒細胞集落刺激因子、白細胞介素如IL-2、IL-6、IL-7、IL-13和IL-15、及肝細胞生長因子(HGF)。在特定的實施方案中，所述第二種刺激劑是細胞因子，如白細胞介素，例如白細胞介素-2。
在特定的實施方案中，將刺激組合物的一或多種成分固定在基質上，如固定在細胞或珠上。適合用作基質的細胞包括人工抗原呈遞細胞(AAPC)(Kim，JV et al，Nat Biotechnol.2004 Apr；22(4)403-10；及Thomas，AK et al，Clin Immunol.2002 Dec；105(3)259-72)。珠可以是塑料珠、玻璃珠，或者任何其它合適材料的珠，直徑典型為1-20微米。優選順磁性珠。
刺激組合物的每種成分的最佳濃度、培養條件和持續時間可以使用常規實驗根據經驗加以確定。自身抗原特異性調節T細胞刺激組合物的一個實例在實施例2中描述。
將擴增的和/或增強的自身抗原特異性調節T細胞導入對象中以調節自身免疫反應。例如，所述對象可患有特徵在於具有進行性或復發性自身免疫反應的疾病或病症，如表A所列出的疾病/病症。在特定的實施方案中，所述調節包括抑制。Treg可作為「特洛伊木馬」將抑制性或者其它生物學因子例如IL-4(Yamamoto et al.J Immunol.1664973-80，2001)、幹細胞生長因子、血管發生調節物、遺傳缺陷等等輸送至炎症部位。例如，foxp3的過表達已經示出將其它病原性T細胞轉化為Treg(Jaeckel et al.Diabetes.2004 Dec 10；[Epub])，多克隆擴增的Treg可以用編碼抗原特異性TCR的基因加上foxp3轉導，以產生大量的和有效的強力抗原特異性Treg(Mekala，et al.，Blood.2004 Nov4；[Epub])。因此，這些抗原特異性方法在使Treg特異性和功能最佳的同時降低了對高細胞數的要求。
抗原特異性Treg應在這樣的感染性疾病中特別提及其中感染的病原性不是病原體的致細胞病變作用的結果，而是對感染因子的免疫炎症應答所致的組織損害的結果。在如C型肝炎或者HSV誘導的角膜炎症的疾病中，Treg治療提供了控制病毒誘導的免疫炎症疾病的一種獨特的機會(Suvas et al.J.Immunol.1724123-4132，2004)。病毒，如柯薩奇病毒，已知導致胰腺炎並且與I型糖尿病的產生相關。因此，靶定表達的病毒抗原的Treg可用於抑制感染所致的局部組織損害並減輕激發自身免疫疾病發生的炎症。
本發明還提供了包含一個細胞群的組合物，其中所述組合物的所述細胞的至少50％是天然的(未轉化的)，優選是擴增的自身抗原特異性調節T細胞，其中所述自身抗原特異性優選是預定的，優選預定為靶定自身免疫反應抗原。所述組合物通過本發明所述方法產生。組合物中自身抗原特異性調節T細胞的百分比可以使用實施例2所述的方法確定。在特定的實施方案中，組合物的所述細胞的至少75％、85％、90％、95％或者98％是自身抗原特異性調節T細胞。
在特定的實施方案中，所述自身抗原特異性調節T細胞特異於表A所列出的MHC II類分子/肽複合物。
在特定的實施方案中，所述自身抗原特異性調節T細胞當給予對象時有效調節自身免疫反應。使用擴增的和/或富集的自身抗原特異性調節細胞的有效和最佳劑量及治療方案通過現有T細胞輸注治療的大量臨床經驗獲知，並可根據經驗進一步確定。
本發明的方法被發現在治療其中希望調節宿主的異常免疫應答的各種不同病變中有作用。宿主中異常的免疫應答是指對象中以自身免疫應答為特徵的任何免疫反應(例如自身免疫疾病)。通常當對象的免疫系統將自身抗原識別為外源抗原時發生自身免疫應答，導致自身反應性效應免疫細胞產生。自身反應性效應免疫細胞包括來自各種譜系的細胞，包括但不限於細胞毒性T細胞、輔助T細胞和B細胞。雖然精確的機制不同，但患有自身免疫疾病的宿主中自身反應性效應免疫細胞的存在導致宿主的組織和細胞破壞，引起病理症狀。本領域技術人員已知確定宿主中存在這種細胞及因此存在自身免疫疾病(如宿主中抗原特異性自身免疫疾病)的各種測試，並易於應用於本發明的方法中。感興趣的方法包括但不限於Autoimmunity.2003 Sep-Nov；36(6-7)361-6；J Pediatr Hematol Oncol.2003 Dec；25 Suppl 1S57-61；Proteomics.2003 Nov；3(11)2077-84；Autoimmun Rev.2003 Jan；2(1)43-9中所描述的方法。
治療是指至少達到宿主中與異常免疫應答相關的症狀減輕，所述減輕以廣義使用，是指至少與被治療的病變相關的參數(例如症狀)的量級降低。這樣，治療也包括其中病理學病變或者至少與之相關的症狀完全被抑制的情況，例如阻止其發生或者停止例如終止，由此宿主不再患有該病變，或者至少不再具有該病變特徵性症狀。
根據本發明的方法可以治療各種各樣的宿主。在某些實施方案中，這些宿主是「哺乳動物」，該術語以廣義應用，以描述哺乳綱的生物，包括食肉目(例如狗和貓)、齧齒目(例如小鼠、豚鼠和大鼠)及靈長目(例如人、黑猩猩和猴)。在許多實施方案中，所述宿主是人。
在進一步的實施方案中，所述方法包括診斷自身免疫疾病存在的步驟。診斷是指對象的自身免疫應答通常被分類，例如糖尿病、SLE、MS等等。另外，所述異常免疫應答相關的至少一種自身抗原被鑑別。本領域已知許多診斷方法，目前也在不斷開發新的方法。這樣，本發明的方法不限於用於診斷宿主中自身免疫疾病及與之相關的抗原的特異性測試。
本發明還提供了實施一或多種上述方法的試劑和試劑盒。所述試劑和試劑盒可以有很大的變化。在某些實施方案中，所述試劑盒包括至少一種抗原特異性調節T細胞刺激組合物。在其它實施方案中，所述試劑盒包括另一種調節T細胞刺激劑，例如細胞因子，如白細胞介素，如白細胞介素-2或者白細胞介素-15。在某些實施方案中，所述試劑盒可進一步包括進行抗原特異性調節T細胞擴增步驟的試劑，包括培養皿或培養瓶、培養基，或者任何必需的緩衝液、因子等。在另一些實施方案中，所述試劑盒包括收穫含有調節T細胞的樣品的手段和進行調節T細胞富集/純化所必需的試劑。
除了上述成分之外，所述試劑盒進一步包括實施本發明的說明書。這些說明書可以各種形式存在於試劑盒中，試劑盒中可存在一或多個說明書。這些說明書的一種形式是在合適介質或襯底上印刷資料，例如印刷有資料的一或多張紙，在試劑盒的包裝上印刷資料，在插入的包裝中印刷資料等等。另一些方式是計算機可讀介質，例如已經記錄了這些資料的磁碟、CD等等。再一些方式是在遠離的站點通過網際網路訪問該信息的網站。試劑盒中可存在任何常規的手段。
在特定的實施方案中，所述刺激劑是II類MHC/自身抗原性肽複合物。表A中列出了示例性的MHC II類分子/肽複合物。
所述共刺激劑是特異於TCR共刺激物如CD28或GITR的抗體或配體，如下文所述。在特定的實施方案中，所述共刺激劑是一種激動劑抗體，如結合CD28的抗體。
在特定的實施方案中，所述刺激劑和所述共刺激劑固定在基質上，如固定在細胞或珠上。
本發明提供了用於離體擴增治療性調節T細胞(Treg細胞)的方法和組合物，及這種擴增的Treg細胞用於過繼細胞免疫治療以抑制自身免疫的應用。
所述擴增方法通常包括首先從人體或患者中提取混合的T細胞群，從該細胞群中分離富含Treg細胞的亞群。為了使效力最大化，將該亞群富集至至少90％、優選至少95％、更優選至少98％的Treg細胞，優選CD4+CD25+CD62L+Treg細胞。通常通過選擇特異於免疫抑制性Treg的細胞表面標記並使用自動細胞淘選如螢光激活的細胞淘選(FACS)、固相磁珠等方法分離而富集細胞。為了增強富集，可以將陽性選擇與針對包含特異於非Treg細胞類型的表面標記的細胞進行的陰性選擇(例如去除攜帶CD8、CD11b、CD16、CD19、CD36和CD56的細胞)組合，如下文所例證。
然後將富含Treg的亞群通過將細胞在存在有效量的TCR/CD3激活物、TCR共刺激物激活物和IL-2的條件下培養而離體擴增。TCR/CD3激活物選自TCR/CD3的多價抗體或配體，包括抗原非特異性激活物如抗-CD3抗體及抗原特異性激活物如MHC-肽多聚體(見例如Yee，et al.，Adoptive T cell therapy using antigen-specific CD8+T cellclones for the treatment of patients with metastatic melanomaIn vivopersistence，migration，and antitumor effect of transferred T cells.ProcNatl Acad Sci USA，Dec 10，2002；99(25)16168-16173；Butterfield，etal..T-Cell responses to HLA-A*0201 immunodominant peptides derivedfrom a-fetoprotein in patients with hepatocellular cancer，Clin.CancerRes.，Dec 1，2003；9(16)5902-5908；及Yee，et al.，Isolation of highavidity melanoma-reactive CTL from heterogeneous populations usingpeptide-MHC tetramers，J Immunol，1999，1622227-223)，其中所述肽典型是自身免疫疾病相關的肽，如糖尿病相關的自身抗原肽，其中合適的糖尿病相關的自身抗原包括穀氨酸脫羧酶(GAD)、胰島細胞自身抗原(ICA)和胰島素，也可以使用這些肽的組合。
共刺激物激活物是特異於TCR共刺激物、優選CD28或GITR的多價抗體或配體(Shimizu et al.，Stimulation of CD25(+)CD4(+)regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance，Nat Immunol.2002 Feb；3(2)135-42.Epub 2002 Jan 22；Tone et al.，Mouse glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand iscostimulatory for T cells，Proc Natl Acad SciU S A.2003 Dec 9；100(25)15059-64.Epub 2003 Nov 07)，但是也可以靶定另外的TCR共刺激物如CD5、ICOS、OX40和CD40L，其中也獲得合適的擴增，這可以根據經驗確定。為了促進激活和擴增，將TCR/CD3和TCR共刺激物激活物典型固定在三維固體表面上，如固定在宿主細胞上(例如Thomas et al，Dec 2002，Clin Immunol 105，259-72)或者珠上。在特定的實施方案中，所述激活物固定在Treg細胞珠的比率為2∶1至1∶5，優選1∶1至1∶3的順磁性珠上。最佳的珠大小根據經驗確定，直徑範圍典型為1-20微米。
IL-2典型地以重組形式存在，其中IL-2的有效量典型為200-2500 IU IL-2/ml。我們已經發現使用範圍在500-2500、優選1000-2000 IU IL-2/ml的非常規升高的IL-2濃度增加擴增。亞群的靶Treg細胞優選被擴增至少50倍、優選地至少100、200或300倍。根據經驗確定最大的擴增，並且根據細胞類型、溫育條件等而有所不同。在示例性的實施方案中，發現最大擴增為大約300、500和800倍。
擴增的Treg細胞的抑制功能可以在體外或在體內檢測。例如，在體外，擴增的Treg細胞可以示出對在存在攜帶Fc受體的細胞的條件下用抗CD3刺激的CD25-T細胞的增殖的抑制，或者對經放射處理的異源脾細胞刺激的CD25-T細胞的增殖的抑制。體內動物模型和人臨床免疫抑制方案的合適實例在下文進一步描述。
在特定的實施方案中，TCR/CD3激活物和擴增的Treg細胞是自身抗原特異性的。例如，在特定的這種實施方案中，向被診斷患有糖尿病(見例如Mayfield et al.，Diagnosis and classification of diabetesmellitusnew criteria，Am Fam Physician.1998 Oct15；58(6)1355-62，1369-70)並且具有葡萄糖穩態如空腹血糖(FPG)、餐後血糖(PPG)和葡萄糖耐量(GTT)損傷指徵的患者中導入有效量的離體擴增的Treg細胞，使得損傷的葡萄糖穩態得以改善，特別是其中所述改善選自FPG為110mg/dL或更低、2小時PPG為140mg/dL或更低、以及攝取75-g葡萄糖2小時後GTT為140mg/dL或者更低。因此，本發明提供了過繼細胞免疫治療的方法和組合物，所述方法包括向需要治療的患者中導入有效量的本發明的離體擴增的Treg細胞。
這些應用通常包括再次導入從相同患者中提取的擴增的Treg細胞，儘管所述方法也可以用於過繼細胞免疫治療以治療與移植相關的移植物抗宿主疾病，所述移植特別是使用衍生自供體組織的Treg進行的骨髓移植。
如在經論證的動物模型和人臨床實驗中所表明的，如本文所述擴增的Treg的過繼轉移有效抑制各種病原性自身免疫應答，包括糖尿病、GVHD、狼瘡、類風溼性關節炎、銀屑病、多發性硬化、退化性心臟病(例如Ziad Mallat，et al.Induction of a Regulatory T Cell Type 1Response Reduces the Development of Atherosclerosis in ApolipoproteinEBKnockout Mice，Circulation.2003 Sep 9；108(10)1232-7)、炎症性腸道疾病(克隆氏症(Crohn′s disease))等等，如在下文所示例。
在我們的過繼細胞轉移方案中，混合的T細胞群最初從靶供體中提取。根據應用，所述T細胞可以在疾病好轉期間或者在疾病活動期間提取。典型地通過抽取全血並通過白細胞去除術(leukopheresis)收穫粒細胞而提取。例如，大體積白細胞去除術(LVL)顯示出使血液白細胞產量最大化。使用連續流式去除設備(Spectra，COBE BCT)，收穫物達到20×106細胞/L。通過在白細胞去除期間持續輸入鈣而避免低血鈣症狀。在大約100-300分鐘的時間內收穫相應於大約4個總血液體積的15-45升液體。
收穫的淋巴細胞可以基於Treg特異性細胞標記如CD4、CD25和CD62通過流式細胞分選或者其它細胞分離技術而分離、如本文所述擴增、然後輸入患者，以進行免疫抑制，其中所述患者典型地為細胞供體(除了在供體和受體不同的GVHD情況中)。或者，細胞可以在擴增之前和/或之後冷凍，以用於貯存和/或運輸。對於抗原非特異性擴增，輸入大約109-1011個Treg；對於抗原特異性擴增，治療有效的輸入典型地需要大約107-109個Treg細胞。
移植物抗宿主疾病(GVHD)在對Taylor，et al.Blood 99，3493-9(2002)所述方案加以修改的實驗中，離體擴增的CD4+CD25+細胞抑制GVHD產生。將2×106個新鮮純化的B6 CD4+T細胞加上5×106個骨髓細胞輸入經輻射的BALB/c x B6(F1)受體中。一群小鼠接受單獨注射2×106個激活的CD4+CD25+細胞或者CD4+CD25-細胞，監測存活情況和體重。輸入離體擴增的CD4+CD25+細胞在80％的小鼠中使得平均存活時間由10天顯著增加至高於100天。接受補充的經擴增的CD4+CD25-細胞的小鼠的存活與僅接受新鮮CD4+T細胞的對照組小鼠無顯著不同，表明保護作用特異於擴增的CD4+CD25+群。在對Edinger，et al.Nat Med9，1144-50(2003)所述方案加以修改的實驗中，使用新鮮(未擴增的)供體衍生的CD4+CD25+Treg細胞在預防GVHD致死率方面獲得相似結果。接受與常規細胞之比為1∶1的離體擴增的Treg細胞的動物得以被保護免於急性致死性GVHD，並且＞80％的動物存活100天以上。
在共移植擴增的Treg細胞後，Tconv細胞的移植物抗腫瘤(GVT)活性也得以保持。通過臨床特徵和存活力、腫瘤生長和排斥情況評價GVHD。在BMT時間注射的20-luc/yfp細胞遷移至骨髓，導致具有肝臟和淋巴器官二級浸潤的白血病(Edinger，et al.Blood 101，640-648(2003)。移植了來自C57BL/6動物的TCD BM並共注射了1×104A20-luc/yfp白血病細胞的BALB/c小鼠在第36天之前死於白血病，這通過隨時間的生物發光成像(BLI)信號強度的增加而證明。BLI圖像示出在移植後5天腫瘤細胞浸潤肱骨、股骨和胸骨的骨髓，及在第15天之前浸潤其它器官，包括脾。接受TCD BM和Tconv細胞的動物死亡甚至早於GVHD，但是示出A20-luc/yfp白血病的最初移植(engraftment)，其腫瘤細胞分布與僅接受骨髓的對照組相似。相反，接受Tconv細胞和CD4+CD25+Treg細胞的大多數動物在60天的觀察期間存活。無一動物示出白血病進展，儘管所有動物在第5天均示出來自骨髓的初始腫瘤信號，表明T細胞移植不幹擾A20-luc/yfp細胞的移植，但是當動物通過供體CD4+CD25+Treg細胞保護而免於致死性GVHD時，實現了主動根除白血病細胞。這些數據表明擴增的CD4+CD25+Treg細胞對GVHD的抑制不消除過繼轉移的供體Tconv細胞的GVT活性。
多發性硬化(MS)許多研究提示Treg細胞的喪失是導致在MS患者中觀察到的免疫調節缺乏的因素(例如Putheti etal.，EurJNeurol.2003 Sep；10(5)529-35；Baecher-Allan et al.，J Immunol，1671245-53.2001；Baecher-Allan et al，J Immunol.2002.169(11)6210-7；Schmied，et al.，Clin Immunol.2003 Mar；106(3)163-74)，及提示過繼細胞治療可以減輕疾病(例如Muraro et al.Immunological questions on hematopoieticstem cell transplantation for multiple sclerosis，Bone Marrow Transplant.2003 Aug；32 Suppl 1S41-4；Blevins et al.Future immunotherapies inmultiple sclerosis，Semin Neurol.2003 Jun；23(2)147-58；Kohm，et al.，Cutting EdgeCD4+CD25+Regulatory T Cells SuppressAntigen-Specific Autoreactive Immune Responses and Central NervousSystem Inflammation During Active Experimental AutoimmuneEncephalomyelitis，J.Immunol.，Novl，2002；169(9)4712-4716.Eur JNeurol.2003 Sep；10(5)529-35所述)。
在我們對MS患者進行過繼免疫抑制治療的最初研究中，在疾病好轉期間收穫T細胞，Treg用抗-CD3和抗-CD28抗體擴增(如前)，並冷凍貯存。擴增的Treg在疾病復發時通過注射輸入，疾病進展使用釓增強的損害監測(例如Horsfield et al.，Guidelines for usingquantitative magnetization transfer magnetic resonance imaging formonitoring treatment of multiple sclerosis，J Magn Reson Imaging.2003Apr；17(4)389-97)。在隨後的研究中，抗原特異性擴增使用與髓鞘鹼性蛋白(MBP)、髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂質蛋白(PLP)的免疫原性肽結合的DR2 MHC實現。除了擴增使用MHC肽多聚體(如前)加抗-CD28抗體和IL-2進行之外，分離、擴增和冷凍貯存如上述進行。
類風溼性關節炎(RA)先前的研究提示Treg細胞的喪失是導致在RA患者中觀察到的免疫調節缺乏的因素，並且已經建立了用於治療幹預的動物模型。例如，一種特定的慢性炎症性關節炎卵清蛋白誘導的關節炎(OIA)的動物模型已經用於特異性分析確定的抗原特異性T細胞群的作用；見Hardung，Regulatory function of antigen-specific T helper cell subsets ina murine arthritis model，Proc 34th Ann Meet German Soc Immunol，Berlin，Sept 24-27，2003所述。在這個系統中，將激活的抗原特異性T輔助細胞(Ova-TCRtg/tg)被轉移進未進行過試驗的同類受體中足以在關節內注射該抗原後誘導關節炎症。在體外極化的Thl細胞的轉移導致急性和慢性關節炎症。另外，共轉移Ova-TCRtg/tgCD4+CD25+調節T細胞阻止了對疾病的誘導。
在我們對RA患者進行的過繼免疫抑制治療的最初研究中，T細胞是在疾病好轉時從PBMC或者關節滑液中收穫的(Cao et al.Isolation and functional characterization of regulatory CD25brightCD4+Tcells from peripheral blood or the target organ of patients withrheumatoid arthritis.Eur J Immunol.2003 Jan；33(1)215-23)，Treg用抗-CD3和抗-CD28抗體(如前)和IL-2擴增，並冷凍貯存。擴增的Treg在疾病復發時注射輸入，疾病的進展使用確定的臨床標準監測(Felson et al，The American College of Rheumatology preliminary coreset of disease activity measures for rheumatoid arthritis clinical trials.TheCommittee on Outcome Measures in Rheumatoid Arthritis Clinical Trials.Arthritis Rheum 1993 Jun；36(6)729-40；Felson et al.，AmericanCollege of Rheumatology.Preliminary definition of improvement inrheumatoid arthritis，ArthritisRheum 1995 Jun；38(6)727-35)。
在隨後的研究中，抗原特異性擴增使用與RA相關的自身抗原肽如熱休克蛋白(HSP)、MHC衍生的肽和關節特異性抗原如II型膠原偶聯的DR4 MHC實現(例如Kotzin，Use of soluble peptide-DR4tetramers to detect synovial T cells specific for cartilage antigens inpatients with rheumatoid arthritis，Proc Natl Acad Sci USA 2000 Jan 4；97(1)291-6)。除了擴增用MHC肽多聚體(如前)加上抗-CD28抗體和IL-2實現之外，如上述進行分離、擴增和冷凍貯存。
銀屑病先前的研究提示Treg細胞的喪失是導致在患有銀屑病的患者中觀察到的免疫調節缺乏的因素，已經建立了用於治療幹預的動物模型(見例如Elder et al.，Of genes and antigensthe inheritance of psoriasis.JInvest Dermatol.1994 Nov；103，5 Suppl，150S-153S)。
在我們對銀屑病患者進行過繼免疫抑制治療的最初研究中，T細胞在疾病好轉時從PBMC中收穫，或者在疾病活動期從皮膚中獲得，Treg用抗-CD3和抗-CD28(如前)抗體和IL-2擴增，並冷凍貯存。擴增的Treg在疾病復發時通過注射輸入，疾病的進展使用確定的臨床標準監測，其中主要臨床終點(primary clinical end point)是指比較基線和12周分值時PASI分值的平均百分比改變(見例如Ashcroft et al.，Clinical measures of disease severity and outcome in psoriasisa criticalappraisal oftheir quality.Br Dermatol.1999 Aug；141(2)185-91)。
在隨後的研究中，抗原特異性擴增使用與銀屑病相關的皮膚自身抗原肽偶聯的DR6 MHC實現，在銀屑病型關節炎中，抗原特異性擴增使用與關節自身抗原結合的DR6 MHC實現。除了擴增用MHC肽多聚體(如前)加抗-CD28抗體和IL-2實現之外，如上述進行分離、擴增和冷凍貯存。
炎症性腸道疾病(IBD)、克隆氏症、結腸炎先前的研究提示Treg細胞的喪失是導致在IBD患者中觀察到的免疫調節缺乏的因素，已經建立了用於治療幹預的動物模型(見例如Assessman et al.，Colitogenic Thl cells are present in theantigen-experienced T cell pool in normal micecontrol by CD4+regulatory T cells and IL-10.J Immunol.2003 Jul 15；171(2)971-8；Read，et al.，1998.CD38+CD45RBlowCD4+T cellsA T cell populationwith immune regulatory activities in vitro.Eur.J.Immunol.283435；Mason et al，1998.Control of Immune Pathology by regulatory T cells.Curr.Opin.in Immunol.10649；Asseman，et al.，1999.IL-10 is requiredfor the generation of a populationof T cells，which regulate inflammatoryresponses in the intestine.J.Exp.Med.190995)。
在我們對IBD患者進行過繼免疫抑制治療的最初研究中，T細胞在疾病好轉時從PBMC中收穫，或者在疾病活動期從受影響的腸道組織中收穫，Treg用抗-CD3和抗-CD28抗體(如前)和IL-2擴增，並冷凍貯存。擴增的Treg在疾病復發時通過注射輸入，疾病的進展使用確定的臨床標準監測，所述臨床標準與胃腸炎的組織學證據相關，包括中等至嚴重的炎症細胞浸潤、慢性間歇性長期腹瀉、體重減輕、嘔吐等等，其中臨床排除其它原因的腸道炎症。
在隨後的研究中，抗原特異性擴增使用與IBD超敏性相關的飲食和/或細菌抗原肽偶聯的HLA-CW6實現。除了擴增是用MHC肽多聚體(如前)加抗-CD28抗體和IL-2實現之外，如上述進行分離、擴增和冷凍貯存。
本發明提供了通過本發明所述方法產生的Treg細胞組合物，特別是適於輸入需要抑制自身免疫的患者體內的組合物。例如，這些組合物包括有效的可輸入單位劑量的本發明的擴增的Treg細胞，其中這些劑量可以預先包裝在如下述的試劑盒中。
本發明提供了包含本發明方法中使用的試劑和/或材料、以及任選地包含描述本發明方法的指導性媒介的試劑盒。本發明還提供了特別調整的適於本發明方法或試劑盒的商業方法、和/或摻入了本發明方法或試劑盒的商業方法、或參考了本發明方法或試劑盒的商業方法。
額外實施例實施例1體外擴增的抗原特異性Treg細胞抑制自身免疫糖尿病在此我們描述了一種從有自身免疫傾向的非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠中擴增抗原特異性Treg的強有力的方法。在少於2周的時間內體外擴增直至200倍的Treg表達一種經典的Treg表型，該表型保留這個亞類所有典型特徵，包括表達CD25、CD62L、FoxP3和GITR，及在體外和體內均具有抑制效應T細胞功能的作用。當與多克隆Treg相對比時，使用自身抗原特異性T細胞顯著增強擴增的NOD Treg在體內抑制前糖尿病和糖尿病小鼠的糖尿病的能力。抗原特異性Treg有效抑制Treg-缺陷的CD28-/-小鼠中糖尿病的發展，在慢性糖尿病動物中阻斷同種同基因胰島移植排斥，與先前的報導相反，首次示出在新發作疾病的小鼠中Treg逆轉糖尿病。因此，這是首次表明少量抗原特異性Treg在疾病發作後可逆轉糖尿病，提供了對於自身免疫的一種新的細胞免疫治療的方法。
調節T細胞從自身抗原特異性TCR轉基因NOD小鼠中擴增。先前的研究示出在16-24周齡的NOD小鼠中，隨著時間的過去Treg的數目和功能與臨床疾病相關地減少。然而，治療性使用這些細胞的能力通過少數細胞殘留在血液循環和淋巴器官中而顯示治療不當(＜5％的CD4+T細胞在NOD小鼠中，＜2％的CD4+T細胞在T1D人體中)。另外，由於基於抗原特異性難以選擇細胞，因此需要大量的細胞。因此，基於觀察到在TCR轉基因(Tg)小鼠中存在的這些細胞可以用共同固定的抗CD3和抗CD28抗體加上外源IL-2驅動進細胞周期，我們開發了一種用於快速和有效地擴增自身抗原特異性Treg的技術。用抗-CD3/抗-CD28包被的珠在存在IL-2的條件下培養的FACS純化的NOD Treg在11天中擴增150-225倍。通常地，CD4+CD25-T細胞擴增更強(在多個實驗中擴增範圍是300-800倍)。因此，純度＞98％的CD4+CD25+CD62+T細胞被優選用於成功擴增Treg，因為CD25-CD4+或者CD8+T細胞的少量汙染影響擴增Treg的能力。
先前的研究報導了分離自年輕的NOD小鼠的CD4+CD25+Treg抑制來自糖尿病NOD小鼠的Teff細胞將疾病轉移至免疫缺陷的NOD小鼠的能力。然而，所述方法效率低，在這種背景下Treg的抑制作用需要0.5∶1或者1∶1比率的Treg∶Teff，這可能是由於抗原特異性Treg的低前體頻率所致。因此，我們檢驗了來自兩種不同的抗原特異性TCR Tg小鼠的Treg是否可以在體外使用與多克隆NOD Treg相同的方法擴增。BDC2.5 TCR Tg小鼠表達特異於在β細胞顆粒中表達的胰島抗原的TCR，而GAD286 TCR Tg識別衍生自胰島抗原穀氨酸脫羧酶(GAD)的肽。從BDC2.5和GAD286小鼠中純化Treg並使用抗-CD3/抗-CD28加上IL-2混合物擴增。基於先前示出與TCRαβ反應的MHC-肽四聚體的有效染色，BDC2.5細胞表達轉基因的TCRαβ，擴增的GAD286 Treg表達Tg TCRβ鏈。來自BDC2.5 TCR Tg小鼠的CD4+CD62L+CD25-和Treg可以使用固定的MHC-肽二聚體以相似效率擴增。這些結果表明在野生型小鼠和TCR Tg小鼠中均存在可以使用這個方案擴增的CD4+CD25+CD62L+群。
我們接下來通過流式細胞計量術、Western印跡和實時PCR檢驗擴增的Treg的表型。擴增的Treg與擴增的CD25-T細胞相比保持高水平的CD25表達，而CD62L的表達在這兩種細胞類型中均保持較高。另外，定量PCR示出所有Treg與相似擴增的CD25-T細胞相比均表達高水平的SOCS2、PD-1和CTLA-4。另外，最近鑑別的標記神經氈蛋白(neuropilin)和TRAIL在擴增的Treg中也高水平表達。在擴增的Treg上觀察到高水平的細胞表面GITR表達，然而這個先前鑑別的Treg標記在擴增的CD25-T細胞上也被誘導。應注意定量PCR研究是對5個單獨擴增的Treg群(既包括多克隆也包括BDC2.5 TCRTg Treg)進行的，相關表達是高度可再現的。最後，我們檢驗了最近鑑別的Treg譜系標記-FoxP3。通過RT-PCR和Western印跡分析示出，擴增的Treg表達的FoxP3水平與在新鮮Treg中觀察到的結果相似，顯著高於在新鮮的或擴增的CD25-T細胞中觀察到的結果。RNA表達(10倍)和蛋白質的量(20倍)與先前對新鮮Treg的研究一致，儘管在CD25-Teff細胞中FoxP3顯然有一些增加，這表明培養條件在CD25-亞類中可誘導一些調節T細胞。
我們還檢驗了擴增的Treg分泌細胞因子的能力。與激活的CD25-T細胞不同，Treg不產生IL-2或者IFNγ，但是表達免疫抑制性細胞因子IL-10和TGFβ。因此，Treg的廣泛激活和增殖不改變Treg的表型，其保持與CD25-T細胞亞類不同。
體外擴增的Treg的功能活性先前的研究已經示出Treg可有效地抑制抗-CD3和脾APC刺激的CD25-T細胞的增殖性應答。擴增的NOD Treg有效抑制增殖性應答和包括IL-2和IFNγ在內的細胞因子產生。事實上，在多個實驗中，擴增的Treg與新鮮的NOD Treg相比抑制作用明顯更好。所述抑制通常在Treg∶Teff比率＜1∶10時觀察到。使用來自TCR Tg小鼠的擴增的Treg觀察到相似結果，擴增的BDC2.5 Treg有效抑制BDC2.5以及多克隆NOD T細胞的增殖性應答。對Treg抑制作用機制的檢測證實了其它研究，表明需要細胞與細胞之間的接觸。儘管擴增的Treg表達明顯水平的IL-10和TGFβ，但是通過向體外培養物中加入抗-IL-10、抗-TGFβ或者這兩種抗體的組合不影響抑制活性。這些結果與許多Treg抑制模型一致，其中細胞與細胞的接觸是在體外背景下免疫抑制的主要方式。
為了進一步評價擴增的Treg的抗原特異性並確定擴增的Treg是否是組成型抑制的，檢測來自正常BALB/c小鼠的擴增的Treg抑制來自OVA特異性DO11.10 TCR Tg小鼠的T細胞的能力。將Treg和DO11.10 Tg Teff細胞在存在OVA抗原(僅激活Teff細胞)或者抗-CD3(既激活Teff也激活Treg)的條件下共培養。擴增的BALB/c Treg不抑制OVA肽刺激的DO11.10 T細胞的增殖性應答。然而，在低Treg∶Teff比率下，抗-CD3應答完全被抑制，支持了擴增的Treg缺乏組成型抑制活性及需要抗原特異性激活Treg以進行有效免疫抑制。這個結果也排除了這種很小的可能性，即細胞通過表達高水平CD25消耗可利用的IL-2而抑制培養物。
擴增的Treg的體內存活和激活Treg在體內有效抑制免疫應答需要細胞遷移至合適位置、對抗原產生應答及長時間存活。我們最近已經觀察到CD28/B7途徑的封閉導致Treg在體內迅速喪失，並隨後喪失關鍵的免疫調節。因此，我們檢驗了擴增的Treg在體內存活和增殖的能力。將來自NOD、BDC2.5和GAD286小鼠的擴增的Treg用CSFE標記並轉移至正常的非淋巴細胞減少(non-lymphopenic)的NOD小鼠中。在轉移後7天，處死小鼠並檢測CSFE+細胞的數目作為存活和增殖的讀數。從用來自不同品系小鼠的擴增的Treg轉移的小鼠中回收大量的CSFE+細胞。事實上，在轉移至少50天後觀察到CFSE+Treg以及Thy1.1標記的Treg，其數目與以同樣方式轉移新鮮Treg觀察到的結果相等。
接下來，我們分析了過繼轉移的Treg應答抗原及在體內增殖的能力。為了消除淋巴細胞減少症引起的增殖的潛力，將Treg移至正常小鼠中。基於CSFE稀釋，Treg少量但明顯地增殖。然而，在胰腺淋巴結(pancLN)中沒有NOD Treg的選擇性增殖表明在NOD Treg集合(repertoire)中沒有明顯數量的胰島自身抗原特異性細胞。事實上，與在其它LN細胞中觀察到的結果相比，在NOD pancLN細胞中擴增的Treg的量更小，這提示了NOD中缺失胰島特異性Treg的可能性。與NOD Treg相反，來自BDC2.5 Tg小鼠的Treg在pancLN中廣泛地和選擇性地增殖和擴增，在7天的時間中分裂至少3-4次。令人感興趣地，增殖的Treg減量調節CD62L表達。這是令人驚奇的，因為所述細胞在轉移之前已經在體外經歷多次增殖循環，並且保持高水平CD62L表達。與BDC2.5 Treg相反，GAD286 Treg在體內不增殖。先前的研究提示這兩種TCR Tg小鼠在胸腺發育方面顯著不同。BDC2.5Tg小鼠在胸腺中不對胰島特異性進行陰性選擇，但是產生少量但可再現的Treg，這些Treg被表明通過這些動物中殘留的潛在效應細胞而阻斷疾病。對比之下，GAD286 TCR Tg T細胞在胸腺中進行陰性選擇，由此逃脫的細胞利用另外的TCRα鏈。儘管外周GAD286 TCRTg細胞在體外應答GAD肽，但是反應性較弱，並且與BDC2.5相反，這些細胞不能基於過繼轉移而誘導糖尿病，這表明「不存在」自身反應性部分。因此，使用擴增的Treg的這些結果提示BCD2.5 TCR Tg小鼠而非GAD286 TCR Tg小鼠具有循環的自身反應性Treg，其在體內留駐並存活，並且接受另外的信號以進一步激活和擴增抗原特異性亞類。
體外擴增的Treg抑制體內糖尿病的過繼轉移接下來，我們檢測了與激活的BDC2.5 T細胞體內共轉移至NOD.RAG小鼠之後，擴增的BDC2.5 Treg抑制糖尿病的能力。Treg有效阻斷糖尿病的轉移，在低如1∶9的Treg∶Teff比率即可發揮作用，而GAD286 Treg甚至在Treg∶Teff為1∶1比率時也不發揮保護作用。事實上，擴增的BDC2.5 Treg抑制多克隆T細胞介導的疾病。少如2×106個擴增的BDC2.5 Treg阻斷25×106個致糖尿病的NOD脾細胞轉移疾病的能力。來自BDC2.5小鼠的擴增的抗原特異性Treg與擴增的多克隆NOD Treg相比在防止糖尿病發生方面有效得多，這與上述獨特的增殖差異一致。與使用四分之一數目的抗原特異性BDC2.5Treg對疾病轉移的總體阻斷相比，多如8×106個擴增的NOD Treg僅在25％的致糖尿病細胞轉移的RAG受體中預防糖尿病。這個結果與先前的結論一致，提示在這種背景下需要多克隆Treg∶Teff細胞的高比率，以有效抑制疾病轉移。重要的是這些數據表明Treg的體外反應性不能預測其在體內對這種疾病的功能。
在非淋巴細胞減少症背景下，擴增的Treg在體內預防糖尿病。儘管有多個模型表明Treg的免疫調節活性，但許多系統基於利用淋巴細胞減少的小鼠增強Treg增殖的過繼轉移模型8，21-24。因此，我們檢測了擴增的Treg在非淋巴細胞減少的動物模型中預防糖尿病的能力。先前的研究已經示出CD28-/-NOD小鼠具有正常數目的T細胞和Th1應答。事實上，這些小鼠由於Th2和極其依賴CD28的Treg中的缺陷而產生惡化的自身免疫。因此，我們檢測了野生型擴增的BDC2.5 Treg是否能被轉移進CD28-/-NOD小鼠中並且延緩或預防疾病的發生。將5×105個Treg轉移進5周齡的CD28-/-NOD小鼠中並監測糖尿病情況。擴增的BDC2.5 Treg的轉移在所有檢測的小鼠中在長達轉移後20周的時間內預防了糖尿病的發生。相反，轉移擴增的NOD Treg對疾病發生無作用。這些結果表明抗原特異性擴增的Treg在體內針對完全功能性病原性T細胞應答起作用。
擴增的Treg在體內逆轉糖尿病Treg治療的最終應用依賴於能治療正處於疾病狀態中的個體。因此，我們檢測了這些擴增的Treg在糖尿病的明顯(frank)模型中的調節作用。首先，我們檢測了擴增的BDC2.5 Treg阻斷同種同基因NOD胰島移植物的排斥反應的能力。使用胰島素沉澱至少2周使糖尿病NOD小鼠保持血糖量正常。此時為小鼠只移植500個同種同基因胰島細胞或者再聯合移植擴增的Treg。共轉移2×106個BDC2.5而非5×106NOD，擴增的Treg阻斷對同種同基因胰島的排斥，這與抑制細胞阻斷這種背景下的進行中的自身免疫的能力一致。更重要地，擴增的BDC2.5 Treg的過繼轉移在明顯具有糖尿病的NOD小鼠中逆轉糖尿病。在這種背景下，將1×107個Treg轉移進基於血液葡萄糖水平升高(＞300mg/dL)而診斷新近發生疾病的NOD小鼠中。轉移的Treg在60％的檢測小鼠中逆轉糖尿病。因此，擴增的Treg在進行中的自身免疫背景下極其有效地阻斷和逆轉糖尿病。
我們觀察到Treg能逆轉糖尿病，這表明我們的方法在臨床自身免疫治療中的可應用性，其中Treg分離自疾病好轉中的(例如SLE或MS)或者發病後不久(例如T1D)的患者。然後將細胞擴增並在疾病活性最大時重新導入以緩和炎症應答。我們發現這種治療可以與Rapamycin、抗-CD3或者導致病原性細胞消除而不影響Treg的其它藥物組合應用。這些治療方法一起既降低了短期病原性應答，同時又恢復了用於長期耐受誘導的穩態平衡。
實施例2功能性內源抗原特異性CD4+CD25+調節T細胞從NOD小鼠中的擴增抗原特異性CD4+CD25+調節T細胞控制自身免疫糖尿病CD4+CD25+Foxp3+調節T細胞(Treg)對於控制自身免疫是關鍵的。有證據提示Treg的產生和功能依賴於抗原特異性。儘管如此，有關抗原特異性Treg在天然背景下的產生的知識還是很少。在這個實施例中，我們鑑別和鑑定了識別胰島肽模擬物及在非肥胖糖尿病小鼠中天然產生的Treg。抗原特異性Treg表達原型表面標記和細胞因子。儘管以抗原特異性方式激活，但是擴增的Treg在體外和體內均能進行旁觀者抑制(bystander suppression)。重要的是，胰島肽模擬物特異性Treg與多克隆Treg相比在抑制自身免疫糖尿病方面更有效。我們的描述論證了Treg可用作器官特異性自身免疫的治療劑。
自身免疫I型糖尿病(T1D)是由於保持自身抗原耐受性的機制被破壞，導致T細胞介導的胰腺產生胰島素的胰島細胞被破壞所致。潛在病原性自身反應性T細胞存在於正常的外周T細胞集合(repertoire)中，但是在健康個體中部分受到抑制細胞或者調節T細胞(Treg)的控制(1，2)。在Treg類別中，CD4+CD25+Treg是對於控制自身免疫重要的獨特細胞亞類(3，4)。在CD4+CD25+Treg或者Foxp3(控制CD4+CD25+Treg的產生和抑制功能的轉錄因子)中有缺陷的小鼠和人患有多器官自身免疫疾病(5-11)。降低或者削弱的CD4+CD25+Treg的抑制功能與T1D、多發性硬化、類風溼性關節炎及其它自身免疫疾病相關(12-16)。對比之下，多克隆CD4+CD25+調節T細胞的轉移在許多系統、包括非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠(一種T1D小鼠模型)的自身免疫糖尿病中防止自身免疫(17，18)。然而，所述方法效率低並且需要轉移大量的Treg。我們最近描述了一種使用IL-2與用抗-CD3和抗-CD28mAb包被的珠的組合在體外擴增胰島抗原特異性CD4+CD25+BDC2.5 T細胞受體轉基因(TCR Tg+)Treg的方法(19)。與多克隆NOD Treg相比，使用明顯較少數目的Treg，擴增的胰島特異性Treg在NOD小鼠中有效阻斷和逆轉糖尿病，表明Treg的抗原特異性對於治療效力是重要的。因此，有效的臨床治療依賴於從多克隆細胞群中鑑別和擴增相關的抗原特異性Treg的能力(20)。
關於在天然條件下CD4+CD25+Treg的抗原特異性了解的相對較少。在本發明的研究中，我們假想由於BDC2.5 TCR Tg+小鼠具有高百分比的胰島抗原特異性Treg，因此這種特異性可能在常規的NOD小鼠中也存在(19，21，22)。因此，我們調整了在BDC2.5 Treg研究中使用的擴增方案，用呈遞BDC2.5 TCR模擬表位肽1040-31(p31)的重組II類MHC I-Ag7取代抗-CD3 mAb(23)。使用模擬表位肽是因為內源BDC2.5抗原還未鑑別(24)。為了確定p31-I-Ag7珠是否可以從多克隆細胞群中擴增低頻率抗原特異性細胞，將BDC2.5 TCRTg+Treg接種進來自NOD小鼠的多克隆CD4+CD25+Treg細胞中。p31-I-Ag7和抗-CD28包被的珠在存在外源IL-2的條件下極為有效地擴增CD4+CD25+BDC2.5 TCRTg+Treg。最初以0.1％BDC2.5 TCR Tg+Treg接種的培養物擴增大約4倍，而以0.01％和0.001％BDC2.5 TCR Tg+Treg接種的培養物不明顯擴增。然而，使用p31-I-Ag7多聚體檢測抗原特異性細胞的流式細胞計量分析表明BDC2.5 TCR Tg+Treg在所有培養物中均擴增。在最低接種密度情況中，BDC2.5 TCR Tg+Treg從佔細胞群的0.001％生長至34.3％。這反映了在培養期間高於12次的細胞分裂，導致在10天培養期間抗原特異性細胞擴增接近5000倍。為了保證CD4+CD25+Treg在用肽-1-Ag7包被的珠擴增後保持調節活性，使用新鮮分離的CD4+CD25-BDC2.5 Tg+應答細胞組合擴增的CD4+CD25+BDC2.5 Tg+Treg的滴定進行抑制分析。在用BDC2.5模擬表位肽1040-31刺激的培養物中，擴增的CD4+CD25+BDC2.5 Treg以劑量依賴性方式有效抑制CD4+CD25-T細胞應答。另外，抑制活性在多次體外刺激後不喪失。最初以0.001％接種的及在用肽-I-Ag7珠刺激兩次後擴增為50％的CD4+CD25+BDC2.5 Tg+細胞抑制p31肽刺激的CD4+CD25-BDC2.5 Tg+細胞。因此，即使當抗原特異性BDC2.5TCR Tg+Treg細胞代表極少百分比的總多克隆Treg群時，所述方法仍可以大量擴增保留抑制功能的抗原特異性Treg。
我們接下來應用這種方法從常規NOD小鼠中擴增抗原特異性CD4+CD25+Treg。將來自NOD小鼠的CD4+CD25+CD62L+細胞用p31-I-Ag7珠如材料及方法(Material and Methods)部分所述進行培養(25)。在7-14天期間，與最初輸入的細胞相比總細胞群典型擴增7-10倍。流式細胞計量分析表明在用p31-I-Ag7珠擴增後，多至10％的CD4+CD25+細胞對於p31-I-Ag7多聚體染色陽性，而用抗-CD3包被的珠擴增的CD4+CD25+細胞對於p31-I-Ag7不呈現高於背景水平的染色陽性。在相同培養條件下，CD4+CD25-CD62L+T效應細胞(Teff)典型地擴增10倍，40-50％對於p31-I-Ag7多聚體染色陽性。然而，基於體外增殖分析，多聚體染色顯然低估了p31-I-Ag7-反應性Treg細胞。將擴增的Treg細胞用羧基螢光素琥珀醯亞氨酯(CFSE)標記，並在存在抗原呈遞細胞(APC)和抗-CD28條件下與p31肽或者對照卵清蛋白(OVA)肽一起培養。CFSE稀釋分析結果示出50％以上的p31-I-Ag7培養的Treg進入細胞周期，相比之下在卵清蛋白刺激的培養物中背景增殖為14％。用OVA肽見到的高度的背景增殖可以反映出由於培養物中珠的持續存在導致所述培養物不是100％靜止的。在刺激之前，當通過流式細胞計量分析p31-I-Ag7多聚體結合時，這個細胞群僅具有6.4％p31-反應性細胞。這些結果提示低親合力的T細胞很難通過多聚體染色檢測到，並且可以反映出TCR特異於與BDC2.5特異性的p31模擬表位不完全相同的內源抗原的事實。為了探究這種解釋的正確性，我們檢測了p31-I-Ag7-擴增的T細胞的Vβ集合(repertoire)。BDC2.5 T細胞受體表達衍生自Vβ4家族的TCRβ(26)。然而，當p31-I-Ag7擴增的Treg和Teff細胞用p31-I-Ag7多聚體和不同的TCRVβ試劑共染色時，這兩個細胞群均不是單克隆的。相反，這兩個細胞群示出具有一些Vβ群的廣泛集合(repertoire)。令人感興趣地，儘管在Treg培養物中有大量Vβ4+p31-I-Ag7多聚體+T細胞，但是在這個代表性培養物中也有許多其它TCR Vβ，例如分別佔p31-I-Ag7多聚體+Treg的10.2％和13.7％的Vβ2和Vβ12。TCR Vβ4+T細胞通常存在於p31-I-Ag7多聚體+T效應細胞群中，但是百分比較低。這些結果一起表明針對胰島肽模擬物反應的Treg和Teff細胞的廣泛集合(repertoire)留駐在常規NOD小鼠中。結果還表明胰島肽模擬物反應性Treg集合(repertoire)與胰島肽模擬物反應性Teff集合(repertoire)不同。
如先前對於抗CD3擴增的培養物所觀察到的結果，肽-I-Ag7-擴增的Treg在整個培養期間保留CD4+CD25+CD62L+表型，而以相似方式培養的CD4+CD25-CD62L+則相反。CD4+CD25-CD62L+細胞在激活後呈CD25high，但是在初始激活之後與p31-I-Ag7反應性Treg細胞相比輕微地減量調節CD25。大多數p31-I-Ag7-反應性T效應細胞在培養期間減量調節CD62L。我們還使用定量實時PCR檢測了擴增的Treg和Teff細胞表達Treg譜系標記Foxp3的情況。為了保證p31-I-Ag7反應性細胞被分析，在分析之前通過螢光激活的細胞淘選(FACS)將p31-I-Ag7擴增的Treg分選為p31-I-Ag7-多聚體陽性和陰性群。在代表性實驗中，擴增的p31-I-Ag7-多聚體+Treg與擴增的p31-I-Ag7-多聚體陽性T效應細胞相比表達大約多3000倍的Foxp3。當通過流式細胞計量術分析時，擴增的p31-1-Ag7Treg也表達最典型的Treg表面標記CTLA-4、ICOS和GITR。我們接下來檢測p31-I-Ag7擴增的Treg在用抗原攻擊後細胞因子的分泌情況。與先前對於Treg報導的數據一致，p31-I-Ag7擴增的Treg表達低水平的促炎細胞因子IL-2、IL-4和IFNγ，及表達高水平的抗炎細胞因子IL-10。
先前的研究示出CD4+CD25+Treg可以抑制CD4+效應細胞體外增殖，並且所述抑制作用依賴於CD4+CD25+Treg通過其TCR的刺激。因此，檢測擴增的p31-I-Ag7Treg細胞在體外的抑制活性和特異性。當培養物用多克隆激活物抗CD3刺激時，擴增的p31-I-Ag7以劑量特異性方式有效抑制新鮮分離的多克隆CD4+T細胞和抗原特異性CD4+BDC2.5 TCR Tg+小鼠的增殖。更重要的是當用1040-31肽刺激培養物時，p31-I-Ag7Treg抑制BDC2.5 TCRTg+CD4+T細胞的增殖，表明培養物中1040-31肽反應性細胞的特異性抑制。相反，擴增的CD4+CD25-p31-I-Ag7Teff不能抑制新鮮分離的BDC2.5 CD4+T細胞，並且導致增殖的增加。令人感興趣地，p31-I-Ag7擴增的Treg而不是Teff細胞在沒有CD28共刺激的情況下對刺激無反應性(對p31肽和抗-CD3均無反應性)，這與對於新鮮分離的Treg的報導一致。為了進一步鑑定擴增的Treg的抗原特異性，評估擴增的多克隆Treg和p31-I-Ag7擴增的Treg通過抗CD3的多克隆T細胞激活或者抗原特異性T細胞激活而抑制BDC2.5 TCR Tg+或者穀氨酸脫羧酶肽286-特異性(GAD286)TCR Tg+CD4+細胞的能力(27)。當用抗CD3刺激時，多克隆Treg和p31-I-Ag7擴增的Treg均抑制BDC2.5 TCR Tg+應答細胞，而只有p31-I-Ag7擴增的Treg抑制用BDC2.5 1040-31肽刺激的培養物。相似地，當用抗CD3刺激時，多克隆Treg和p31-I-Ag7擴增的Treg均抑制GAD286 TCR Tg+CD4+T細胞的應答。然而，當用GAD(286-300)肽刺激時，多克隆Treg群和p31-I-Ag7擴增的Treg群均不抑制GAD286 TCR Tg+應答細胞。最重要地，當用GAD(286-300)和1040-31肽一起刺激培養物時，p31-1-Ag7擴增的Treg能抑制GAD286 TCR Tg+應答細胞。綜合起來，這些數據表明肽-I-Ag7-擴增的Treg的抑制活性依賴於通過TCR的抗原特異性刺激，儘管一旦用同源抗原刺激則p31-I-Ag7擴增的Treg能發揮旁觀者抑制作用。
然後我們測試了小數目p31-I-Ag7-擴增的Treg在CD28-/-NOD小鼠中抑制多克隆T細胞介導的糖尿病的能力。CD28-/-NOD小鼠具有正常數目的效應T細胞和Th1應答，並且由於依賴於CD28在外周血中處於穩態的Treg缺陷而經歷加速形式的自身免疫糖尿病(17，28)。先前的研究示出轉移大量(8-20×106)的多克隆Treg可以延緩或者預防糖尿病的發生(17)。因此，我們檢測了轉移進CD28-/-小鼠中的p31-I-Ag7-擴增的Treg是否能預防糖尿病。將少如1.8-2×106個p31-I-Ag7擴增的Treg轉移進5-7周齡小鼠中，在55％的小鼠中在長至15周的時間內預防糖尿病發生。基於流式細胞計量術，轉移的細胞群典型含有～10％p31-I-Ag7多聚體+細胞，儘管基於CFSE增殖分析的絕對頻率毫無疑問地更高。因此，我們估計轉移的細胞群含有106或者更少的抗原特異性Treg細胞，這基本上低於用多克隆NODTreg進行的相似研究。因此，抗原特異性p31-I-Ag7擴增的細胞高度有效地預防完全功能性多克隆T細胞應答誘導的糖尿病發生。另外，p31-I-Ag7擴增的Treg對自身免疫的抑制是器官特異性的，因為接受p31-I-Ag7擴增的Treg並且得以保護在15和16周齡免於糖尿病發生的動物與具有糖尿病並在8-10周齡檢測的未處理的和多克隆Treg處理的小鼠相比，表現出在唾液腺和甲狀腺中較高程度的淋巴細胞浸潤。
在這個實施例中，我們論證了具有與胰島肽模擬物反應性的抗原特異性CD4+CD25+Foxp3+Treg留駐在糖尿病易感性NOD小鼠的外周血中。另外，我們論證了抗原特異性細胞可以在體外從多克隆細胞群中選擇性擴增，並且這些擴增的Treg保留新鮮分離的CD4+CD25+Foxp3+Treg的表型和功能特徵。我們示出擴增的抗原特異性Treg在體內高度有效地控制器官特異性自身免疫。這些結果支持了CD4+CD25+Treg的免疫調節作用依賴於Treg的抗原特異性的先前研究結果，並且與提示Treg以抗原非特異性方式通過競爭T細胞生態位(niche)而起作用的報導不一致(19，22，29)。
我們的結果提供了基於Treg進行臨床治療的方法，所述方法需要從外周血中擴增器官特異性Treg。即使擴增了具有有限集合(repertoire)的少數自身抗原特異性Treg，這些細胞也可以是臨床有效的，因為其具有通過旁觀者細胞因子產生和/或內源調節細胞募集而抑制多克隆T細胞應答的能力。已經鑑別了許多器官特異性抗原是造成自身免疫疾病如T1D和多發性硬化的因素，並且目前可利用的人MHC多聚體試劑可以用於擴增人器官特異性Treg以用於治療自身免疫疾病(2)。
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實施例3在擴增的Treg細胞過繼轉移後狼瘡性腎炎的臨床好轉研究規格對象總數20；部位總數2研究時間12-24個月目標群體具有狼瘡性腎炎的患者研究原因調節T淋巴細胞(Treg)在控制自身免疫中的重要性目前在各種實驗動物模型中已充分確定(McHughet al.，The role ofsuppressor T cells in regulation of immune responses.J Allergy ClinImmunol 10693-702，2002)。另外，許多研究提示Treg不足是導致人自身免疫疾病的深層原因。最重要的是發現CD4+CD25+調節T細胞作為免疫穩態的必要成分提供了對於主動免疫調節和長期耐受性誘導的一個潛在的治療機會。然而，Treg僅代表少數(＜2％)的人CD4+T細胞、在自身免疫人體中數目和功能降低、並且通常被認為對增殖無反應性。我們開發了一種強有力的方法從人體中擴增Treg細胞。在不到3周的時間擴增直至200倍的細胞表達傳統的Treg表型(CD4+，CD25+，CD62Lhi，GITR+和FoxP3+)，並且發揮抑制T細胞效應細胞增殖和細胞因子產生的功能。
本研究設計為測試從狼瘡性腎炎患者中擴增的CD4+CD25+細胞的安全性和效力。初步的結果提示系統性紅斑狼瘡(SLE)患者根據疾病的狀態而具有不同的Treg活性，在好轉期間具有Treg高活性，而在復發其間活性降低(Crispin et al.，Quantification of regulatory T cellsin patients with systemic lupus erythematosus.J Autoimmun 21273-276，2003)。我們試圖確定是否可以從好轉期的患者中鑑別、選擇並擴增Treg，通過低溫冷藏貯存這些細胞，並在疾病復發時再導入這些細胞。設計這項研究以測試這種自體Treg療法的安全性，並確定這種治療對於疾病進程和免疫學參數的影響。
研究設計/治療方案這項研究又兩個階段組成。在第一階段，我們從5名活動期狼瘡性腎炎患者和5名狼瘡性腎炎處於好轉期的患者(停止免疫抑制治療)中擴增Treg。這個階段表明從疾病活動期和非活動期患者中擴增Treg的相對可行性，並論證了擴增的細胞具有的功能。
第二階段是使用兩種不同的設計方案在活動期狼瘡性腎炎患者中輸入Treg的公開標記實驗(open-label trial)。在第一種方案中，從疾病活動期患者中擴增功能性Treg，然後讓這些患者立即接受其自身擴增的細胞。進入標準除了活動期狼瘡性腎炎之外，還包括存在抗-dsDNA抗體和補體低下。進入標準還包括對腎炎的合適的基本治療(例如強的松、黴酚酸嗎啉乙酯、硫唑嘌呤等等)。然而，環磷醯胺(CTX)治療排除在外，因為CTX很可能干擾Treg的效力。主要終點是自體移植的安全性，通過監測一般臨床參數和疾病活動性評估。次要終點(疾病活動性、血清學和機械研究)在治療後第30、60、90、180和365天測定。
第二種方案在從活動期狼瘡性腎炎患者中不能收集到足夠的Treg的情況下應用。在此，在疾病好轉期從患者收穫細胞，離體擴增，然後冷凍製備以在疾病復發時輸入。除了較大的患者群和較長的時間之外，這個實驗設計與上述設計相同。
方法和材料與下述在糖尿病患者中過繼細胞轉移研究的第一階段描述的方法和材料相同。我們選擇的FDA-許可的抗-CD3/抗-CD28包被的珠和特定的單克隆抗體分別得自Xcyte Therapies和BectonDickinson。我們調整了淘選和擴增程序以擴增並低溫保存來自各個患者的大約109Treg。
初級結果安全性二級結果1)腎功能，通過肌酸酐、蛋白尿和尿沉渣評價；2)狼瘡血清學，通過抗-dsDNA抗體和補體評價；3)疾病活動指數，通過SLEDAI和/或BILAG及對患者整體評估評價；4)機理學研究。
機理學研究1)抗-dsDNA和補體的測定；2)產生自身抗體的B細胞的頻數評價；3)循環淋巴細胞的表型分析以檢測Treg表型；4)評價Treg活性；5)對Th1和Treg細胞因子的ELISPOT。
解釋這個研究論證了衍生自狼瘡性腎炎患者的Treg細胞對患者的健康或疾病進展無不利作用，過繼轉移治療方法改善了這些患者的腎功能。
實施例4擴增的Treg細胞過繼轉移後糖尿病的臨床好轉這個實驗論證了在擴增的Treg細胞過繼轉移後糖尿病的臨床好轉。我們的研究淋巴細胞收集和輸注方案是從Rapoport，et al.Molecular remissionof CML after autotransplantation followed byadoptive transfer of costimulated autologous T cells.Bone MarrowTransplant(Epub ahead of print，Oct 27，2004)的方法加以調整而成。患者合格性和參與我們根據Institutional Review Board指導方針要求從所有患者獲得事先的書面知情同意書。需要患者患有基於臨床特徵和實驗室特徵的糖尿病。需要足夠的腎、心、肺和肝功能，患者不可以具有活動期感染或者HIV血清學陽性。
穩態淋巴細胞收集首先使用自動細胞分離儀(Cobe Spectra細胞收集儀或者相等功能設備)對患者進行穩態白細胞去除。大約20-30升的血液通過大內徑導管加工，獲得大約1.5×108單核細胞/kg體重。冷凍保存這些細胞以隨後在抗-CD3/抗-CD28培養系統中進行擴增。
T淋巴細胞的離體共刺激和擴增將T細胞根據FDA批准的研究性新藥應用中規定的方法培養。在自體移植階段第0天左右，解凍冷藏的單核細胞並用含有1％的人血清白蛋白的PBS洗滌三次。如果在最初冷藏時不進行，則使用磁性珠在密閉系統中去除單核細胞。然後將細胞接種進含有X-VIVO並補加了5％收集的AB血清的透氣培養瓶(Baxter Oncology，Deeriield，IL，USA)中。加入具有固定的抗-CD3(OKT3)和抗-CD28(9.3)單克隆抗體順磁性珠(比率為2∶1的珠CD3+細胞)，IL-2(1000 IU/ml)補充的培養物保持多至14天，之後進行收穫並製備以進行輸入(如前)。每日計數細胞，加入補加了1000IU/ml IL-2的新鮮培養基以保持細胞密度為0.75-2×106/ml。在完成細胞培養後，使用Baxter FenwalMaxsep磁性細胞分離設備除去磁珠。在除去磁珠後，洗滌細胞，濃縮並再懸浮於含有1％人血清白蛋白的100-250ml Plasmalyte A中，使用Baxter Fenwal收穫系統進行。
離體擴增的T細胞的再輸入在釋放之前，所有收穫的產物均需要符合細胞存活(70％)、無菌(細菌和真菌培養陰性，內毒素分析陰性)和珠汙染(＜100珠/3×106細胞)的標準。將收穫的細胞通過信使從細胞生產機構轉運至患者，並在當天輸入。細胞在20-60分鐘內輸入而無白細胞過濾。患者可以常規提前服用對乙醯氨基酚和苯海拉明。
實施例5擴增的Treg細胞過繼轉移後糖尿病的臨床好轉這個實驗論證了在擴增的Treg細胞過繼轉移後糖尿病臨床好轉。我們的研究淋巴細胞收集和輸入方案是從Rapoport，et al.Molecularremissionof CML after autotransplantation followed by adoptive transferof costimulated autologous T cells.Bone Marrow Transplant(Epub aheadofprint，Oct 27，2004)的方法加以調整而成。
患者合格性和參與我們根據Institutional Review Board指導方針要求從所有患者獲得事先的書面知情同意書。需要患者患有基於臨床特徵和實驗室特徵的糖尿病。需要足夠的腎、心、肺和肝功能，患者不可以具有活動期感染或者HIV血清學陽性。
穩態淋巴細胞收集首先使用自動細胞分離儀(Cobe Spectra細胞收集儀或者相等功能設備)對患者進行穩態白細胞去除。大約20-30升的血液通過大內徑導管加工，獲得大約1.5×108單核細胞/kg體重。冷凍保存這些細胞以隨後在MHC II類分子/肽複合物共刺激劑培養系統中進行擴增。
T淋巴細胞的離體的共刺激和擴增將T細胞根據FDA批准的研究性新藥物應用中規定的方法培養。在自體移植階段第0天左右，解凍冷藏的單核細胞並用具有1％的人血清白蛋白的PBS洗滌三次。如果在最初冷藏時不進行，則使用磁性珠在密閉系統中去除單核細胞。然後將細胞接種進含有X-VIVO並補加了5％收集的AB血清的透氣培養瓶(Baxter Oncology，Deeriield，IL，USA)中。加入具有固定的MHC複合物II型DQ0602/胰島素B肽(胺基酸5-15)和抗-CD28(9.3)單克隆抗體順磁性珠(比率為2∶1的珠CD3+細胞)，及IL-2(1000IU/ml)補充的培養物保持多至14天，之後進行收穫並製備以進行輸入(如前)。每日計數細胞，加入補加了1000IU/ml IL-2的新鮮培養基以保持細胞密度為0.75-2×106/ml。在完成細胞培養後，使用Baxter Fenwal Maxsep磁性細胞分離設備除去磁珠。在除去磁珠後，洗滌細胞，濃縮並再懸浮於含有1％人血清白蛋白的100-250ml Plasmalyte A中，使用Baxter Fenwal收穫系統進行。
離體擴增的T細胞的再輸入在釋放之前，所有收穫的產物均需要符合細胞存活(70％)、無菌(細菌和真菌培養陰性，內毒素分析陰性)和珠汙染(＜100珠/3×106細胞)的標準。將收穫的細胞通過信使從細胞生產機構運輸至患者，並在當天輸入。細胞在20-60分鐘內輸入而無白細胞過濾。患者可以常規提前服用對乙醯氨基酚和苯海拉明。
前面關於特定實施方案和實施例的描述只是例證了本發明，而無任何限制之意。除非有相反提示或另外說明，在這些描述和整個本說明書中，術語「一個」是指一或多個，術語「或者」意味著和/或。本說明書中引用的所有出版物和專利申請及那些文獻中引用的所有出版物均通過引用併入本文，等同於每一篇文獻都被獨立地通過引用併入本文。儘管對本發明通過例證和實施例進行了一定的詳細描述，但是本領域技術人員根據本發明的教導明白在不偏離本發明的精神和所附權利要求書的範圍的基礎上，可以對本發明進行一定的改變和修改。
表A
權利要求
1.一種調節對象自身免疫應答的方法，所述方法包括獲得對象可相容的細胞群；從所述細胞群中產生富含預定的自身抗原特異性調節T細胞的組合物；以及將所述組合物導入所述對象，以調節所述對象中的所述自身免疫應答。
2.權利要求1的方法，其中所述細胞群得自所述對象。
3.權利要求1的方法，其中所述細胞群得自與所述對象不同的供體。
4.權利要求1的方法，其中所述細胞群從外周血中收穫。
5.權利要求1的方法，其中所述產生步驟包括擴增所述抗原特異性調節T細胞。
6.權利要求5的方法，其中所述擴增通過將所述細胞群與自身抗原特異性調節T細胞刺激組合物接觸而實現。
7.權利要求5的方法，其中調節T細胞在進行所述擴增步驟之前從所述細胞群中富集。
8.權利要求5的方法，其中調節T細胞在進行所述擴增步驟之後從所述細胞群中富集。
9.權利要求6的方法，其中所述刺激組合物包含II類MHC/自身抗原性肽複合物。
10.權利要求6的方法，其中所述刺激組合物包含一種共刺激劑。
11.權利要求10的方法，其中所述共刺激劑是一種激動劑抗體。
12.權利要求11的方法，其中所述激動劑抗體結合CD28。
13.權利要求6的方法，其中所述刺激組合物包含第二種調節T細胞刺激劑。
14.權利要求13的方法，其中所述第二種刺激劑是一種細胞因子。
15.權利要求14的方法，其中所述細胞因子是一種白細胞介素。
16.權利要求15的方法，其中所述白細胞介素是白細胞介素-2。
17.權利要求6的方法，其中所述刺激組合物被固定在基質上。
18.權利要求17的方法，其中所述基質是細胞。
19.權利要求17的方法，其中所述基質是珠。
20.權利要求1的方法，其中所述產生步驟包括從所述獲得的細胞群中富集所述自身抗原特異性調節T細胞。
21.權利要求1的方法，其中所述調節包括抑制。
22.一種組合物，其包含一個天然細胞群，其中所述組合物的所述細胞的至少50％是自身抗原特異性調節T細胞。
23.權利要求22的組合物，其中所述自身抗原特異性調節T細胞特異於表A中MHC II類分子中呈遞的自身抗原性肽。
24.權利要求22的組合物，其中所述自身抗原特異性調節T細胞當被給予對象時有效調節自身免疫應答。
25.一種產生權利要求22的自身抗原特異性調節T細胞的組合物的試劑盒，所述試劑盒包含一種自身抗原特異性T細胞受體刺激劑；及一種共刺激劑。
26.權利要求25的試劑盒，其中所述刺激劑是II類MHC/自身抗原性肽複合物。
27.權利要求25的試劑盒，其中所述共刺激劑是一種激動劑抗體。
28.權利要求27的試劑盒，其中所述抗體結合CD28。
29.權利要求25的試劑盒，其中所述試劑盒進一步包含第二種調節T細胞刺激劑。
30.權利要求29的試劑盒，其中所述第二種刺激劑是一種細胞因子。
31.權利要求30的試劑盒，其中所述細胞因子是一種白細胞介素。
32.權利要求31的試劑盒，其中所述白細胞介素是白細胞介素-2。
33.權利要求31的試劑盒，其中所述白細胞介素是白細胞介素-15 。
34.權利要求25的試劑盒，其中所述刺激劑和所述共刺激劑被固定在基質上。
35.權利要求34的試劑盒，其中所述基質是細胞。
36.權利要求34的試劑盒，其中所述基質是珠。
37.一種過繼細胞免疫治療的方法，所述方法包括如下步驟從經診斷患有糖尿病並且具有選自空腹血糖(FPG)、餐後血糖(PPG)和葡萄糖耐量(GTT)的葡萄糖穩態的損傷指徵的患者中提取混合的T細胞群；通過陰性和陽性免疫選擇和細胞淘選從所述細胞群中分離包含＞98％CD4+CD25+T細胞(Treg細胞)的亞群；通過將所述亞群與有效量的(i)選自TCR/CD3的多價抗體和配體的TCR/CD3激活物；(ii)選自CD28的多價抗體和配體的TCR共刺激物激活物；和(iii)IL-2接觸而將所述亞群的Treg細胞擴增至少100倍，以獲得離體擴增的Treg細胞，其中有效量的IL-2是200-2500 IU IL-2/ml；將107-1011個離體擴增的Treg細胞導入患者；以及檢測損傷的葡萄糖穩態的改善。
38.權利要求37的方法，其中所述改善選自FPG為110mg/dL或更低、2小時PPG為140mg/dL或更低、以及攝取75-g葡萄糖2小時後GTT為140mg/dL或者更低。
39.權利要求37的方法，其中所述TCR/CD3激活物是一種抗-CD3抗體，TCR共刺激物激活物是抗CD28抗體，其中抗CD3和抗CD28抗體固定在Treg細胞∶珠的比率為1∶1至1∶2的順磁性珠上。
40.權利要求37的方法，其中所述TCR/CD3激活物是一種MHC-肽多聚體，其中所述肽是一種與糖尿病相關的自身抗原肽，所述糖尿病相關的自身抗原選自穀氨酸脫羧酶(GAD)、胰島細胞自身抗原(ICA)和胰島素，TCR共刺激物激活物是抗-CD28抗體，導入步驟是將107-109離體擴增的Treg細胞導入患者中。
全文摘要
本發明提供了產生富含自身抗原特異性調節T細胞的組合物的方法、所得組合物及其使用方法。
文檔編號A61K39/395GK1953767SQ200580007325
公開日2007年4月25日 申請日期2005年1月8日 優先權日2004年1月8日
發明者傑弗裡·A.·布魯斯通, 唐奇志, 埃瑪·馬斯特列爾 申請人:加利福尼亞大學董事會