一種廣州管圓線蟲體外培養基和體外培養方法與流程
2023-07-13 22:09:26
本發明涉及蟲體培養技術領域，更具體地，涉及一種廣州管圓線蟲體外培養基和體外培養方法。
背景技術：
線蟲是地球上最為豐富的物種之一，廣泛分布於自然界中，其中寄生於人體並導致疾病的寄生線蟲有60餘種。寄生線蟲具有複雜的生活史，既可以引起各種複雜的疾病，也是研究病原體致病基因或病原體-宿主相互關係的理想模型，但是線蟲的寄生特性和複雜的生活史，使得相關的研究工作進展緩慢。
建立一種寄生線蟲體外培養的體系和方法，可以實現在體外條件下培養寄生線蟲，有助於運用現代的基因編輯技術進行寄生蟲的功能基因研究，探討其致病機制，為抗寄生蟲藥物的開發提供條件和基礎。
廣州管圓線蟲（Angiostrongylus cantonensis）是一種可引起嗜酸性粒細胞增多性腦脊髓膜炎的寄生線蟲。該疾病主要流行於東南亞地區、太平洋島嶼，我國主要在臺灣、廣東、浙江和黑龍江等地，若誤食感染廣州管圓線蟲的生或半生的螺類，感染期幼蟲（III期）經消化道侵入體內後，隨血液循環移行並侵入腦組織，從而引發該疾病。廣州管圓線蟲終宿主是大鼠，寄生在鼠肺動脈。成熟雌蟲產卵，卵在肺動脈內孵出幼蟲（I期幼蟲），I期幼蟲穿過肺泡並進入支氣管，最後入消化道，隨糞便排出體外。當鼠糞被淡水螺或陸生螺吞食後，I期幼蟲可在螺體內發育，經過2 次蛻皮，發育到III期幼蟲（感染期）；當大鼠吞食含有III期幼蟲的螺後，幼蟲在消化道內穿過腸壁、侵入鼠體。人不是廣州管圓線蟲的適宜宿主，侵入腦內的感染期幼蟲不能發育成熟，但可引起腦組織炎症反應。小鼠也是非適宜宿主，因此，小鼠是廣州管圓線蟲病研究的常用實驗動物。本專利申請人採用中間宿主藁杆雙臍螺和終宿主大鼠，在實驗室建立了廣州管圓線蟲的生活史，並在此基礎上建立了一種蟲卵和各期幼蟲體外培養方法，明確了蟲體培養的相關試劑和培養條件，從而實現了蟲體從蟲卵發育到I期幼蟲，以及各期幼蟲在體外的培養。本發明提供了一種簡單和高效的廣州管圓線蟲體外培養技術和方法，為寄生線蟲的新藥篩選、功能基因和致病機制研究提供了有效的研究基礎。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種廣州管圓線蟲體外培養基。
本發明的第二個目的是提供一種廣州管圓線蟲體外培養方法。
本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的：
一種廣州管圓線蟲體外培養基，所述培養基包括蟲卵培養基、I期幼蟲培養基、III期幼蟲培養基、IV期幼蟲培養基和V期幼蟲培養基，所述蟲卵培養基、I期幼蟲培養基、III期幼蟲培養基、IV期幼蟲培養基和V期幼蟲培養基中均含有兩性黴素B。
優選地，所述兩性黴素B分別在蟲卵培養基、I期幼蟲培養基、III期幼蟲培養基、IV期幼蟲培養基和V期幼蟲培養基中的終濃度為0.5μg/mL。
優選地，所述蟲卵培養基包含Ham’s F-12培養基和複合抗生素，所述複合抗生素含有青黴素G鉀、硫酸鏈黴素和兩性黴素B。
優選地，所述I期幼蟲培養基包含DMEM 基礎培養基、膽固醇乙醇溶液、胎牛血清、螺組織提取液和複合抗生素，所述複合抗生素含有青黴素G鉀、硫酸鏈黴素和兩性黴素B。
更優選地，所述I期幼蟲培養基包含DMEM 基礎培養基、0.1%的5 mg/ml膽固醇乙醇溶液、20%胎牛血清、1%螺組織提取液和0.1%複合抗生素，所述複合抗生素含有青黴素G鉀、硫酸鏈黴素和兩性黴素B。
優選地，所述III期幼蟲培養基、IV期幼蟲培養基、V期幼蟲培養基均包含Waymouth’s 培養基、胎牛血清、和複合抗生素，所述複合抗生素含有青黴素G鉀、硫酸鏈黴素和兩性黴素B。
更優選地，所述III期幼蟲培養基、IV期幼蟲培養基、V期幼蟲培養基均包含Waymouth’s 培養基、20%胎牛血清、和0.1%複合抗生素，所述複合抗生素含有青黴素G鉀、硫酸鏈黴素和兩性黴素B。
優選地，所述螺組織提取液的製備方法為：將螺清洗後，加入氯化鈉等滲溶液，經組織破碎、離心後取上清，過濾即得。
本發明還提供一種廣州管圓線蟲蟲卵的分離培養方法，是將已感染廣州管圓線蟲60d的大鼠進行解剖處理，挑出血管內的成蟲，將成蟲清洗後放入蟲卵培養基中孵育，孵育一段時間後，挑出成蟲，剩餘的蟲卵置於培養箱中培養7～10d即可。
現有技術中對於在體外培養廣州管圓線蟲蟲卵發育至I期幼蟲的過程中，一般會選擇40d左右的已感染廣州管圓線蟲的大鼠，但是發明人研究發現，選擇40d左右的已感染廣州管圓線蟲的大鼠的成蟲挑出的蟲卵孵育成I期幼蟲，孵化率很低，一般只有30%，但是選擇已感染廣州管圓線蟲60d的大鼠，在相同培養基中孵化，其蟲卵孵化為I期幼蟲的概率高很多。
本發明還提供一種廣州管圓線蟲的體外培養方法，包括以下步驟：
（1）蟲卵的分離培養：將已感染廣州管圓線蟲60d的大鼠進行解剖處理，挑出血管內的成蟲，將成蟲清洗後放入蟲卵培養基中孵育，孵育一段時間後，挑出成蟲，剩餘的蟲卵置於培養箱中培養7～10d即可；所述蟲卵培養基包含Ham’s F-12培養基和複合抗生素，所述複合抗生素含有青黴素G鉀、硫酸鏈黴素和兩性黴素B；
（2）I期幼蟲的分離培養：按常規方法分離出I期幼蟲，並置於I期幼蟲培養基中培養即可；所述I期幼蟲培養基包含DMEM 基礎培養基、膽固醇乙醇溶液、胎牛血清、螺組織提取液和複合抗生素，所述複合抗生素含有青黴素G鉀、硫酸鏈黴素和兩性黴素B；
（3）III期幼蟲的分離培養：按常規方法分離出III期幼蟲，並置於III期幼蟲培養基中培養即可；所述III期幼蟲培養基包含Waymouth’s 培養基、胎牛血清、和複合抗生素，所述複合抗生素含有青黴素G鉀、硫酸鏈黴素和兩性黴素B；
（4）IV期幼蟲的分離培養：按常規方法分離出IV期幼蟲，並置於IV期幼蟲培養基中培養即可；所述IV期幼蟲培養基包含Waymouth’s 培養基、胎牛血清、和複合抗生素，所述複合抗生素含有青黴素G鉀、硫酸鏈黴素和兩性黴素B；
（5）V期幼蟲的分離培養：按常規方法分離出V期幼蟲，並置於V期幼蟲培養基中培養即可；所述V期幼蟲培養基包含Waymouth’s 培養基、胎牛血清、和複合抗生素，所述複合抗生素含有青黴素G鉀、硫酸鏈黴素和兩性黴素B。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
本發明提供一種廣州管圓線蟲體外培養基，所述培養基包括蟲卵培養基、I期幼蟲培養基、III期幼蟲培養基、IV期幼蟲培養基和V期幼蟲培養基，所述蟲卵培養基、I期幼蟲培養基、III期幼蟲培養基、IV期幼蟲培養基和V期幼蟲培養基中均含有兩性黴素B；通過在廣州管圓線蟲培養中加入兩性黴素，可防止體外培養廣州管圓線蟲的汙染，通過將已感染廣州管圓線蟲60d的大鼠進行解剖處理，挑出血管內的成蟲，將成蟲清洗後放入蟲卵培養基中孵育，孵育一段時間後，挑出成蟲，剩餘的蟲卵置於培養箱中培養7～10d，80%的蟲卵可成功發育為I期幼蟲，且體外培育的I期幼蟲，III期幼蟲，IV期幼蟲，V期幼蟲均可在體外長期存活，本發明的研究為廣州管圓線蟲的體外研究和應用提供了堅實的基礎。
附圖說明
圖1為體外培養廣州管圓線蟲從蟲卵發育到I期幼蟲。
圖2為 I期和III期幼蟲培養不同天數後分別感染藁杆雙臍螺和大鼠的感染率。
具體實施方式
下面將結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟、條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若無特別說明，實施例中所用的實驗方法均為本領域技術人員所熟知的常規方法和技術，試劑或材料均為通過商業途徑得到，具體實施方式中所設計到的百分數均為體積百分數。
實施例1
一、試劑及溶液的配製
複合抗生素：青黴素G鉀，硫酸鏈黴素，兩性黴素B，分別用無菌水配製，0.2μm濾膜過濾除菌，配製複合抗生素溶液，複合抗生素溶液中青黴素G鉀的終濃度為100,000 units/ml，硫酸鏈黴素的終濃度為50mg/ml，兩性黴素的終濃度為0.5mg/ml。
蟲卵培養基：按照1：1000的體積比將製備得到的複合抗生素溶液加入到Ham』F-12（GBICO）培養液中。
等滲氯化鈉溶液：2.8 mg/ml NaCl，0.043 mg/ml Na2HPO4·12H2O，0.097 mg/ml KCl，0.42 mg/ml CaCl2，0.325 mg/ml MgCl2·6H2O，配置500mL，0.22μm濾膜過濾除菌。
螺組織提取液：150隻螺體的頭足部在等滲氯化鈉溶液中清洗，組織中加入4ml等滲氯化鈉溶液，用組織破碎儀破碎，再700×g 離心 5 分鐘，上清通過0.22μm 濾膜除菌，等滲氯化鈉溶液補足到10ml（測定濃度）。
膽固醇乙醇溶液：膽固醇粉末溶於100%乙醇中，配置成5mg/ml膽固醇溶液。
CBSS緩衝液：2.8g NaCl，0.15g KCl，0.07g Na2HPO4，0.45g MgSO4·7H2O，0.53g CaCl2·2H2O，0.05g NaHCO3，上述成分溶解於滅菌水，調pH值至7.4， 0.22μm濾膜過濾除菌，定容至1L。
I期幼蟲培養基：DMEM/F12（GIBCO）+20%胎牛血清+1%螺組織提取液+0.1%的5mg/ml膽固醇乙醇溶液，再按照1：1000的體積比加入製備得到的複合抗生素溶液。
III期幼蟲培養基：Waymouth’s（GIBCO）+10%胎牛血清，再按照1：1000的體積比加入製備得到的複合抗生素溶液。
二、廣州管圓線蟲蟲卵分離純化培養
將已感染廣州管圓線蟲2個月的陽性大鼠，用10%的水合氯醛麻醉，待其眼球無反應後，摘其眼球放血，之後置於超淨臺內剖開腹部，將肺部連同心臟取出，放於乾淨的培養皿中，用鑷子小心的撕開肺部血管，沿著血管挑出成蟲，成蟲主要集中於血管內。
將挑出的20條雌性成蟲在含有抗生素的HBSS緩衝液中，清洗3次，清洗後的成蟲放入步驟一製備得到的蟲卵培養基中，37 ℃下孵育3小時。
3小時後將成蟲從皿中挑走，剩下的液體（含有蟲卵）全部均勻的轉移至96孔細胞培養板中，每孔加入100μl，在顯微鏡下觀察，20條雌性成蟲約產出200顆蟲卵；之後將培養板置於培養箱中，在37℃，8% CO2下培養，至幼蟲孵出期間不需更換培養基；7天後開始有I期幼蟲孵出，10天後80%的蟲卵全部發育為I期幼蟲。
三、廣州管圓線蟲I期幼蟲分離純化培養
收集已感染廣州管圓線蟲80天的陽性大鼠的糞便20粒，200目篩網置於沉澱杯上，加入過濾水至液面略高於篩網，篩網上放置雙層擦鏡紙，取大鼠糞便平鋪於擦鏡紙上，室溫放置3h，棄去大部分上清，收集杯底的I期幼蟲於15ml離心管中，管口加上雙層篩網，倒扣於含有CBSS緩衝液（含複合抗生素）的培養皿中，室溫放置半小時，1000 rpm，5分鐘 離心，吸取沉澱，在體視顯微鏡下計數，約有10000條I期幼蟲，再加入10ml含複合抗生素的CBSS緩衝液。
按體積比1000：1.3加入13μl的次氯酸鈉，消毒10分鐘，1000 rpm，5分鐘離心，將沉澱用巴氏吸管吸出，加入到2ml的I期幼蟲培養基，均勻的轉移至24孔細胞培養板中，每孔加入1ml，平均每孔有500條I期幼蟲，在28℃，5% CO2下培養，每隔兩天更換一次培養基。
I期幼蟲在體外培養過程中可存活1個多月以上的時間，通過顯微鏡的觀察，蟲體在體外培養的時間內都有很好的活力，但蟲體感染螺體的能力會隨培養時間的延長而減弱。
四、廣州管圓線蟲III期幼蟲分離純化培養
將已感染廣州管圓線蟲21天的5隻藁杆雙臍螺碾碎，每隻螺放入含有1ml消化液（1.5mg胃蛋白酶溶於含有7μl濃鹽酸的1ml水）的EP管中，37℃下消化1小時。
1小時後，將消化液（含III期幼蟲）倒於培養皿中，加入2ml的生理鹽水，終止消化液的消化作用，在體視顯微鏡下對蟲子進行計數，每隻螺約有500條III期幼蟲，共有2500條III期幼蟲，將蟲子轉移到10ml含有抗生素的CBSS緩衝液中。
按體積比1000：1.3加入13μl的次氯酸鈉，消毒10分鐘，1000 rpm，5分鐘 離心，加入5ml的III期幼蟲培養基，轉移至6孔細胞培養板中，每孔1ml，平均每孔500條III期幼蟲，在28℃，5% CO2下培養，每隔兩天換一次培養基。
體外培養的III期幼蟲可在體外存活1月多以上的時間，並可以保持很好的活力，而且感染老鼠的能力不會有所減弱。
五、廣州管圓線蟲IV期幼蟲分離純化培養
將已感染廣州管圓線蟲14 d的陽性大鼠，用10%的水合氯醛麻醉，待其眼球無反應後，摘其眼球放血，之後置於超淨臺內取出大鼠腦部，放於含有HBSS（含複合抗生素）的乾淨培養皿中，用鑷子小心的撕開腦組織，肉眼挑出IV期幼蟲，每隻大鼠感染50條廣州管圓線蟲，共收集35條IV期幼蟲。
將挑出的35條IV期幼蟲在含有抗生素的HBSS緩衝液中，清洗3次，清洗後的幼蟲放入IV期幼蟲培養基中，轉移至6孔細胞培養板，每孔加入1ml培養基，平均每孔5條IV期幼蟲，在28℃，5% CO2下培養，每隔兩天換一次培養基。在體外培養的條件下，蟲體可以存活1個月左右時間，期間可保持較好的活力。
六、廣州管圓線蟲V期幼蟲分離純化培養
將已感染廣州管圓線蟲28 d的陽性大鼠，用10%的水合氯醛麻醉，待其眼球無反應後，摘其眼球放血，之後置於超淨臺內取出大鼠腦部，放於含有HBSS（含複合抗生素）的乾淨培養皿中，用鑷子小心的撕開腦組織，肉眼挑出V期幼蟲，每隻大鼠感染50條廣州管圓線蟲，共收集34條V期幼蟲。
將挑出的34條V期幼蟲在含有抗生素的HBSS緩衝液中，清洗3次，清洗後的幼蟲放入V期幼蟲培養基中，轉移至6孔細胞培養板，每孔加入1ml培養基，平均每孔5條V期幼蟲，在28℃，5% CO2下培養，每隔兩天換一次培養基。V期幼蟲可在體外存活1個月左右時間，期間可保持較好的活力。
對比例1
實驗方法同實施例1中步驟二的廣州管圓線蟲蟲卵分離純化培養，唯一不同的是：將已感染廣州管圓線蟲40d的陽性大鼠用於成蟲蟲卵的收集。
結果顯示：從40 d的陽性大鼠中獲取的成蟲，有較弱的體外排卵能力，卵的質量較差，不容易在體外發育成I期幼蟲，且會有畸形卵的排出，相對而言，60 d的陽性大鼠中的成蟲有很好的排卵能力，且排卵數量相對較多，蟲卵質量也很好，可保證80%的蟲卵發育。
對比例2
實驗方法同實施例1中廣州管圓線蟲各個時期的分離純化培養，唯一不同的是，蟲卵培養基為 Ham』F-12（GBICO）培養液；I期幼蟲培養基為DMEM/F12（GIBCO）+20%胎牛血清+1%螺組織提取液+0.1%的5mg/ml膽固醇乙醇溶液；III期幼蟲培養基為Waymouth’s（GIBCO）+10%胎牛血清；IV期幼蟲培養基為Waymouth’s（GIBCO）+20%胎牛血清；V期幼蟲培養基為Waymouth’s（GIBCO）+20%胎牛血清。
結果顯示：無兩性黴素B的培養基容易發生汙染，會影響到蟲卵的發育，菌類的生長使蟲卵的發育空間受限，攝取的營養也會減少，降低了蟲卵的發育能力。