含有腦膜炎奈瑟球菌b血清群外膜蛋白質的外膜囊(omv)疫苗的製作方法

2023-07-29 18:12:01 1

專利名稱：含有腦膜炎奈瑟球菌b血清群外膜蛋白質的外膜囊(omv)疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)B血清群(NmB)的疫苗。
背景技術：
腦膜炎奈瑟球菌是一種無運動性的革蘭氏陰性雙球菌人病原體。它群居於咽部，可引起腦膜炎，有時可在不出現腦膜炎的情況下發生敗血病。在美國，每年的發病率為0.6-1/100,000人，在戰爭期間發病率會更高〔參見Lieberman等人(1996)，JAMA，275(19)1499-1503；Schuchat等人(1997)，NEngl J Med，337(14)970-976〕。在發展中國家，地方性發病比例會更高，在疫疾流行期間，發病率可達每年500例/100,000人。死亡率極高，在美國是10-20％，在發展中國家更高。在引入抗流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)的聯合疫苗後，腦膜炎奈瑟球菌就成了引起美國所有年齡段的人的細菌性腦膜炎的主要原因〔Schuchat等人(1997)，同上〕。
根據該菌的莢膜多糖，已經鑑定出12種腦膜炎奈瑟球菌的血清群。目前使用的腦膜炎球菌疫苗是由血清群A、C、Y和W135組成的四價多糖疫苗。在針對流感嗜血菌疫苗的成功之後，已開發了針對血清群A和C的偶聯疫苗。
然而腦膜炎球菌B仍是一個問題。這種血清群導致約佔美國、歐洲和南美腦膜炎總數的50％。不能採用多糖方法，因為menB莢膜多糖是一種α(2-8)-相連的N-乙醯神經氨酸的聚合物，它也存在於哺乳動物組織中。這就導致了對抗原的耐免，事實上如果引發應答，該應答將會是防自身的，因此是不良的。為了避免引發自體免疫和引發保護性免疫應答，將莢膜多糖進行例如化學修飾，用N-丙醯基替代N-乙醯基，而不改變其特異性抗原性〔Romero Outschoom(1994)ClinMicrobiol Rev 7(4)559-575)。
已由挪威國家公共衛生委員會製備了抗B血清群的有效的外膜囊(OMV)疫苗〔如Bjune等人(1991)，Lancet，338(8775)1093-96〕。雖然這種疫苗是安全的，並可預防NmB發病，但是它的療效受到用於製備這種疫苗的菌株的限制。也已報導了以外膜製劑為基礎的其它疫苗。本發明的目的是將這些疫苗的藥效擴大至其它菌株。
發明的公開令人驚訝的是，已發現將已經確定的成分加到OMV疫苗中可明顯地擴大它們的藥效範圍。
因而，本發明提供一種組合物，它含有(a)NmB外膜製劑，和(b)下述免疫原性成分中的一種或多種·WO99/57280中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO99/36544中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO99/24578中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO00/66791中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·Tettelin等人〔Science(2000)，2871809-1815〕公開的蛋白質或其免疫原性片段；·Parkhill等人〔Nature(2000)，404502-506〕公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO97/28273中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO96/29412中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO95/03413中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO99/31132中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO99/58683中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO99/55873中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·腦膜炎奈瑟球菌PorA蛋白、TbpA蛋白、TbpB蛋白、PilC蛋白、OpA蛋白或Omp85蛋白。
如果所述組合物含有WO99/24578中公開的蛋白質，則所述蛋白質較佳含有選自該文中以下的胺基酸序列SEQ ID 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、1 80、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、和892〔或含有一種或多種這些SEQ ID的免疫原性片段的蛋白質，或含有與這些SEQ ID之一有序列相同性(宜高於50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)的序列的蛋白質〕；如果所述組合物含有WO99/36544中公開的蛋白質，則所述蛋白質較佳含有含有選自該文中以下胺基酸序列SEQ ID 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、和90〔或含有一種或多種這些SEQ ID的免疫原性片段的蛋白質，或含有與這些SEQ ID之一有序列相同性(宜高於50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)的序列的蛋白質〕；如果所述組合物含有Tettelin等人公開的蛋白質(即由該文公開的一種基因編碼的蛋白質)，則所述蛋白質較佳含有選自NMB0001到NMB2160的一條胺基酸序列〔或者含有這2160個基因中的一個或多個的免疫原性片段的蛋白質，或者含有與這2160個基因之一具有序列同一性(較佳大於50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白質〕。
如果所述組合物含有Parkhill等人公開的蛋白質，則所述蛋白質較佳含有選自該文中公開的2121個編碼序列的一個胺基酸序列〔或者含有這2121個序列的一個或多個的免疫原性片段的蛋白質，或者含有與這2121個序列中的一個具有序列同一性(較佳大於50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白質〕。
如果所述組合物含有WO99/57280中公開的蛋白質，則所述蛋白質較佳含有選自該文中的以下胺基酸序列SEQ ID 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、956、958、960、962、964、966、968、970、972、974、976、978、980、982、984、986、988、990、992、994、996、998、1000、1002、1004、1006、1008、1010、1012、1014、1016、1018、1020、1022、1024、1026、1028、1030、1032、1034、1036、1038、1040、1042、1044、1046、1048、1050、1052、1054、1056、1058、1060、1062、1064、1066、1068、1070、1072、1074、1076、1078、1080、1082、1084、1086、1088、1090、1092、1094、1096、1098、1100、1102、1104、1106、1108、1110、1112、1114、1116、1118、1120、1122、1124、1126、1128、1130、1132、1134、1136、1138、1140、1142、1144、1146、1148、1150、1152、1154、1156、1158、1160、1162、1164、1166、1168、1170、1172、1174、1176、1178、1180、1182、1184、1186、1188、1190、1192、1194、1196、1198、1200、1202、1204、1206、1208、1210、1212、1214、1216、1218、1220、1222、1224、1226、1228、1230、1232、1234、1236、1238、1240、1242、1244、1246、1248、1250、1252、1254、1256、1258、1260、1262、1264、1266、1268、1270、1272、1274、1276、1278、1280、1282、1284、1286、1288、1290、1292、1294、1296、1298、1300、1302、1304、1306、1308、1310、1312、1314、1316、1318、1320、1322、1324、1326、1328、1330、1332、1334、1336、1338、1340、1342、1344、1346、1348、1350、1352、1354、1356、1358、1360、1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374、1376、1378、1380、1382、1384、1386、1388、1390、1392、1394、1396、1398、1400、1402、1404、1406、1408、1410、1412、1414、1416、1418、1420、1422、1424、1426、1428、1430、1432、1434、1436、1438、1440、1442、1444、1446、1448、1450、1452、1454、1456、1458、1460、1462、1464、1466、1468、1470、1472、1474、1476、1478、1480、1482、1484、1486、1488、1490、1492、1494、1496、1498、1500、1502、1504、1506、1508、1510、1512、1514、1516、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1530、1532、1534、1536、1538、1540、1542、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564、1566、1568、1570、1572、1574、1576、1578、1580、1582、1584、1586、1588、1590、1592、1594、1596、1598、1600、1602、1604、1606、1608、1610、1612、1614、1616、1618、1620、1622、1624、1626、1628、1630、1632、1634、1636、1638、1640、1642、1644、1646、1648、1650、1652、1654、1656、1658、1660、1662、1664、1666、1668、1670、1672、1674、1676、1678、1680、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1706、1708、1710、1712、1714、1716、1718、1720、1722、1724、1726、1728、1730、1732、1734、1736、1738、1740、1742、1744、1746、1748、1750、1752、1754、1756、1758、1760、1762、1764、1766、1768、1770、1772、1774、1776、1778、1780、1782、1784、1786、1788、1790、1792、1794、1796、1798、1800、1802、1804、1806、1808、1810、1812、1814、1816、1818、1820、1822、1824、1826、1828、1830、1832、1834、1836、1838、1840、1842、1844、1846、1848、1850、1852、1854、1856、1858、1860、1862、1864、1866、1868、1870、1872、1874、1876、1878、1880、1882、1884、1886、1888、1890、1892、1894、1896、1898、1900、1902、1904、1906、1908、1910、1912、1914、1916、1918、1920、1922、1924、1926、1928、1930、1932、1934、1936、1938、1940、1942、1944、1946、1948、1950、1952、1954、1956、1958、1960、1962、1964、1966、1968、1970、1972、1974、1976、1978、1980、1982、1984、1986、1988、1990、1992、1994、1996、1998、2000、2002、2004、2006、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2020、2022、2024、2026、2028、2030、2032、2034、2036、2038、2040、2042、2044、2046、2048、2050、2052、2054、2056、2058、2060、2062、2064、2066、2068、2070、2072、2074、2076、2078、2080、2082、2084、2086、2088、2090、2092、2094、2096、2098、2100、2102、2104、2106、2108、2110、2112、2114、2116、2118、2120、2122、2124、2126、2128、2130、2132、2134、2136、2138、2140、2142、2144、2146、2148、2150、2152、2154、2156、2158、2160、2162、2164、2166、2168、2170、2172、2174、2176、2178、2180、2182、2184、2186、2188、2190、2192、2194、2196、2198、2200、2202、2204、2206、2208、2210、2212、2214、2216、2218、2220、2222、2224、2226、2228、2230、2232、2234、2236、2238、2240、2242、2244、2246、2248、2250、2252、2254、2256、2258、2260、2262、2264、2266、2268、2270、2272、2274、2276、2278、2280、2282、2284、2286、2288、2290、2292、2294、2296、2298、2300、2302、2304、2306、2308、2310、2312、2314、2316、2318、2320、2322、2324、2326、2328、2330、2332、2334、2336、2338、2340、2342、2344、2346、2348、2350、2352、2354、2356、2358、2360、2362、2364、2366、2368、2370、2372、2374、2376、2378、2380、2382、2384、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、2422、2424、2426、2428、2430、2432、2434、2436、2438、2440、2442、2444、2446、2448、2450、2452、2454、2456、2458、2460、2462、2464、2466、2468、2470、2472、2474、2476、2478、2480、2482、2484、2486、2488、2490、2492、2494、2496、2498、2500、2502、2504、2506、2508、2510、2512、2514、2516、2518、2520、2522、2524、2526、2528、2530、2532、2534、2536、2538、2540、2542、2544、2546、2548、2550、2552、2554、2556、2558、2560、2562、2564、2566、2568、2570、2572、2574、2576、2578、2580、2582、2584、2586、2588、2590、2592、2594、2596、2598、2600、2602、2604、2606、2608、2610、2612、2614、2616、2618、2620、2622、2624、2626、2628、2630、2632、2634、2636、2638、2640、2642、2644、2646、2648、2650、2652、2654、2656、2658、2660、2662、2664、2666、2668、2670、2672、2674、2676、2678、2680、2682、2684、2686、2688、2690、2692、2694、2696、2698、2700、2702、2704、2706、2708、2710、2712、2714、2716、2718、2720、2722、2724、2726、2728、2730、2732、2734、2736、2738、2740、2742、2744、2746、2748、2750、2752、2754、2756、2758、2760、2762、2764、2766、2768、2770、2772、2774、2776、2778、2780、2782、2784、2786、2788、2790、2792、2794、2796、2798、2800、2802、2804、2806、2808、2810、2812、2814、2816、2818、2820、2822、2824、2826、2828、2830、2832、2834、2836、2838、2840、2842、2844、2846、2848、2850、2852、2854、2856、2858、2860、2862、2864、2866、2868、2870、2872、2874、2876、2878、2880、2882、2884、2886、2888、2890、2892、2894、2896、2898、2900、2902、2904、2906、2908、2910、2912、2914、2916、2918、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964、2966、2968、2970、2972、2974、2976、2978、2980、2982、2984、2986、2988、2990、2992、2994、2996、2998、3000、3002、3004、3006、3008、3010、3012、3014、3016、3018和3020〔或含有一種或多種這些SEQ ID的免疫原性片段的蛋白質，或含有與這些SEQ ID之一有序列相同性(宜高於50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)的序列的蛋白質〕。
如果所述組合物含有WO99/28273公開的蛋白質，則所述蛋白質較佳是該文獻在圖4或

圖13中公開的蛋白質。
如果所述組合物含有WO96/29412公開的蛋白質，則所述蛋白質較佳含有選自該文獻公開的第1-8條序列中的一條胺基酸序列〔或者含有這些序列的一條或多條免疫原性片段的蛋白質，或者含有與這些序列中的一條具有序列同一性(較佳大於50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白質〕。
如果所述組合物含有WO95/03413公開的蛋白質，則所述蛋白質較佳含有選自該文獻公開的第1-23條序列中的一條胺基酸序列〔或者含有這些序列的一條或多條免疫原性片段的蛋白質，或者含有與這些序列中的一條具有序列同一性(較佳大於50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白質〕。
如果所述組合物含有WO99/31132公開的蛋白質，則所述蛋白質較佳含有選自該文獻公開的SEQ ID 2的胺基酸序列〔或者含有該序列的免疫原性片段的蛋白質，或者含有與該序列具有序列同一性(較佳大於5O％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白質〕。
如果所述組合物含有WO99/58683中公開的蛋白質，則所述蛋白質較佳含有選自該文獻公開的SEQ ID 2或SEQ ID 4的胺基酸序列〔或者含有SEQ ID 2或SEQID 4的免疫原性片段的蛋白質，或者含有與SEQ ID 2或SEQ ID 4具有序列同一性(較佳大於50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白質〕。
如果所述組合物含有WO99/55873中公開的蛋白質，則所述蛋白質較佳含有選自該文獻公開的SEQ ID 2或SEQ ID 4的胺基酸序列〔或者含有SEQ ID 2或SEQID 4的免疫原性片段的蛋白質，或者含有與SEQ ID 2或SEQ ID 4具有序列同一性(較佳大於50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白質〕。
可在Wiertz等人〔Infect.Immun.(1996)，61298-304〕中找到Opa和PorA的詳細描述。PilC在Nassif等人〔PNAS USA(1994)，913769-73〕的文獻中公開。Omp85在Manning等人〔Microb.Pathog.(1998)，2511-21〕的文獻中公開。TbpA和TbpB在Ala＇Aldeen和Borriello(Vaccine(1996)，1449-53〕以及Legrain等人〔Protein Expr Purif(1995)，6570-578〕的文獻中公開。
用於組分(b)的較佳蛋白質是·蛋白質＇919＇，由WO99/57280的SEQ ID 3069-3074和SEQ ID 3027-3241代表(還可參見該文中的圖23和實施例15)；·蛋白質＇235＇，由WO99/57280的SEQ ID 869-874和3149-3178代表(還可參見該文中的圖20和實施例12)；·蛋白質＇519＇，由由WO99/57280的SEQ ID 3045-3056和3158-3206代表(還可參見該文中的圖22和實施例14)；·蛋白質＇225＇，由WO99/57280的SEQ ID 793-804和3115-3148代表(還可參見該文中的圖19和實施例11)；·蛋白質＇ORF40＇，由WO99/36544的實施例1(SEQ ID 1-6)代表(還可參見WO00/66741的圖1，還可參見WO99/31132和WP99/58683)；·蛋白質＇287＇，由WO99/57280的實施例9代表(還可參見該文中的SED ID1199-1204、3103-3108和3179-3184)；·蛋白質＇ORF1＇，由WO99/24578的實施例77(SEQ ID 647-654)代表(還可參見WO99/55873和登記號AJ242535)；·蛋白質＇ORF4＇，由WO99/24578的實施例26(SEQ ID 215-226)代表(還可參見WO00/66741的圖2)；·蛋白質＇ORF46＇，由WO99/24578的實施例55(SEQ ID 457-466)代表(還可參見WO00/66741的圖12)。
所述組合物的組分(b)較佳是NmB蛋白。較佳的是，組分(b)包含從獲得組分(a)的OMV的不同NmB菌株獲得的蛋白質，即所述組分(a)中的OMV較佳由從不同NmB菌株得到的免疫原性組分(b)補充。
可使一種或多種上述成分(或者全部)吸附到Al(OH)3上。
外膜製劑組分本發明的組合物包含作為組分(a)的NmB外膜製劑。這種製品較佳成外膜囊(OMV)的形式。
從NmB製備OMV在本領域中是周知的。獲得適當的製品的方法在如下文獻中公開Claassen等人〔Vaccine(1996)，141001-1008〕；Cartwright等人〔Vaccine(1999)，172612-2619)；Peeters等人〔Vaccine(1996)，141009-1015〕；Fu等人〔Biotechnology NY(1995)，12170-74〕；Davies等人〔J.Immunol.Meth.(1990)，134215-225〕；Saunders等人〔Infect.Immun.(1999)，67113-119〕；Draabick等人〔Vaccine(2000)，18160-172〕；Moreno等人〔Infect.Immun.(1985)，47527-533〕；Milagres等人〔Infect.Immun.(1994)，624419-4424〕；Naess等人〔Infect.Immun.(1998)，66959-965〕；Rosenqvist等人〔Dev.Biol.Stand.(1998)，92323-333〕；Haneberg等人〔Infect.Immun.(1998)，661334-41〕；Andersen等人〔Vaccine(1997)，151225-34〕；Bjune等人〔Lancer(1991)，3381093-96)等等。
OMV較佳是NmB的脫氧膽酸鹽抽提產物(即通過脫氧膽酸鹽抽提NmB獲得的產物)。Fredriksen等人〔MenB-疫苗「Folkehelsa」一種抗B型腦膜炎球菌疾病的外膜囊疫苗的製備、鑑定和控制(1991)，NIPH Ann.，14(2)67-80〕。
用於從中抽提OMV的較佳菌株是腦膜炎奈瑟球菌的44/76菌株(B15P1.7，16P5.5L3、7、9)。
關於OMV組分的更詳細描述可在以下文獻中查索如Bjune等人〔Lancet(1991)，338(8775)1093-96〕，或Fredriksen等人〔抗B型腦膜炎球菌疾病的外膜囊疫苗MenB-疫苗「Folkehelsa」中的高分子量組分的鑑定，Pathobiologyand immunobiology of Neisseriaceae的第818-824頁(Cinde-Glez等人編輯)，ISBN，968-6502-13-0〕。
所述OMV組分可被吸附到氫氧化鋁佐劑上。較佳的蛋白質佐劑比為1∶67(wt/wt)。
人用疫苗的標準劑型劑含有25μg蛋白質、2μg LPS和1.67mg Al(OH)3，可以0.5ml的體積注射到三角肌中。
可對所述OMV組分(如採用脫氧膽酸鹽抽提法獲得的)進行處理，以除去某些成分。例如，可除去熱原成分或毒性成分(如LPS)。
較佳的是，如Fredfiksen等人〔Pathobiology and immunobiology of Neisseriaceae的第818-824頁〕所述，所述OMV組分應保留80kDa的抗原成分。
更佳的是，所述OMV應保留含有一種或多種下述胺基酸序列的蛋白質SEQID 3、SEQ ID 5、SEQ ID 7、SEQ ID 9、SEQ ID 11、SEQ ID 13〔或者(i)與SEQ ID3、SEQ ID 5、SEQ ID 7、SEQ ID 9、SEQ ID 11、SEQ ID 13具有序列同一性的蛋白質——根據具體的序列，序列同一性的程度較佳大於50％(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)，該蛋白質包括突變體和等位基因變異體，或者(ii)含有SEQ ID 1、SEQ ID 3、SEQ ID 5、SEQ ID 7、SEQ ID 9、SEQ ID 11或SEQ ID13的免疫原性片段的蛋白質——該片段應含有對應序列上的至少n個連續的胺基酸，根據具體的序列，n是7或以上(如8、10、12、14、16、18、20或以上)〕。
將組分(a)和(b)混合通過使組分(a)與外膜製劑簡單地混合〔如通過使ORF4與挪威(Norwegian)OMV混合〕可混合組分(a)和(b)。
或者，以細菌在其外膜產生(較佳高產量)組分(a)的方式對細菌進行處理而將這兩種組分混合——從這種重組細菌獲得的外膜製劑將同時含有組分(a)和組分(b)。
在此方法中用於處理的合適細菌包括腦膜炎奈瑟球菌(任何血清群或菌株)、乳醯胺奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)或任何其它未定型的奈瑟球菌。也可使用其它革蘭氏陰性菌，如大腸埃希桿菌、沙門菌屬(Salmonella)、志賀菌屬(Shigella)、博代桿菌屬(Bordetella)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、螺桿菌屬(Helicobacter)等等。轉化方法在本領域中是周知的。
多價疫苗視需要，本發明的組合物還可含有一種或多種下述組分·抗腦膜炎奈瑟球菌A血清群的保護性抗原；·抗腦膜炎奈瑟球菌C血清群的保護性抗原；·抗腦膜炎奈瑟球菌Y血清群的保護性抗原；·抗腦膜炎奈瑟球菌W血清群的保護性抗原；·抗流感嗜血桿菌的保護性抗原；·抗肺炎球菌(pneumococcus)的保護性抗原；·抗白喉的保護性抗原；
·抗破傷風的保護性抗原；·抗百日咳的保護性抗原；·抗幽門螺桿菌的保護性抗原；·抗脊髓灰質炎的保護性抗原；和/或·抗B型肝炎病毒的保護性抗原。
這些任選的成分的較佳例子是·抗腦膜炎奈瑟球菌A血清群的多糖抗原；·抗腦膜炎奈瑟球菌C血清群的多糖抗原，如Costantino等人(1992) Vaccine，10691-698中所述；·抗腦膜炎奈瑟球菌Y血清群的多糖抗原；·抗腦膜炎奈瑟球菌W血清群的多糖抗原；·抗流感嗜血桿菌的多糖抗原；·抗肺炎球菌的多糖抗原；·抗白喉的保護性抗原，由白喉毒素組成，如CRM197突變體〔如Del Guidice等人(1998)，MolecularAspects of Medicine，191-70〕；·抗破傷風保護性抗原，由破傷風毒素組成〔如Wassilak和Orenstein，Vaccines(Plotkin和Mortimer編輯)的第4章，1988〕；·抗百日咳的保護性抗原，含有百日咳全毒素(PT)和絲狀血細胞凝集素(FHA)，視需要還可含有pertactin和/或凝集原2和凝集原3〔如Gustafsson等人(1996)，N.Engl.J.Med.，334349-355；Rappuoli等人(1991)，TIBTECH，9232-238〕；·抗幽門螺桿菌的保護性抗原，含有一種或多種CagA(如WO93/18150)、VacA(如WO93/18150)、NAP(如WO99/53310)、HopX(如WO98/04702)、HopY(如WO98/04702)、脲酶；·抗B型肝炎病毒的保護性抗原，由HBV表面抗原和/或HBV核心抗原組成。
當組合物含有抗白喉的抗原時，這種組合物宜含有抗破傷風和脊髓灰質炎的抗原。當組合物含有抗破傷風的抗原時，該組合物宜含有抗白喉和脊髓灰質炎的抗原。當組合物含有抗脊髓灰質炎的抗原時，該組合物宜含有抗白喉和破傷風的抗原。
百日咳毒素是毒素蛋白，當存在於組合物中時，宜將其去毒。去毒化可通過化學和/或遺傳方法進行。優選的去過毒的突變體是9K/129G雙突變體〔如，Rappuoli(1997)Nature Medicine 3374-376〕。
當組合物含有以不同新生和成熟形式存在的蛋白質時，宜選用該蛋白質的成熟形式。例如，當含有NspA時，(WO96/29412；還可參見Martin等人(1997)J.Exp.med1851173-1183)宜選用沒有信號肽的蛋白質成熟形式。
當組合物含有多糖抗原時，宜將多糖偶聯於載體蛋白。
治療、預防和診斷本發明的組合物較佳是一種疫苗。本發明的疫苗可以是預防性的(即預防感染)或治療性的(即感染後治療疾病)。
本發明還提供了用作藥劑(宜為疫苗)或作為診斷試劑的本發明的組合物。本發明還提供了本發明的組合物在生產下列物質中的應用(i)用於治療或預防奈瑟球菌屬細菌感染的藥劑；(ii)用於檢測奈瑟球菌屬細菌或檢測抗奈瑟球菌屬細菌抗體是否存在的診斷試劑；和/或(iii)用於產生抗奈瑟球菌屬細菌的抗體的試劑。所述奈瑟球菌屬細菌可以是任何物種或菌株(例如淋病奈瑟球菌，N.gonorrhoeae)，但優選腦膜炎奈瑟球菌，尤其是血清群B。
本發明還提供了一種治療患者的方法，該方法包括給予患者治療有效量的本發明的組合物。該方法宜為免疫法。
方法根據另一方面，本發明提供各種方法。
給出生產本發明組合物的一種方法，包括從腦膜炎奈瑟球菌抽提(如脫氧膽酸鹽抽提)出OMV。
序列表序列表中的序列如下


實施本發明的方式以下是為了實施本發明(如將公開的序列用於免疫接種或診斷)而可能使用到的標準技術和方法的歸納。這一歸納並不是對本發明進行限制，而是給出可能使用到而非必需的實施例。
綱要除非另有說明，否則本發明的實施將使用分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規技術，這些技術都是本領域熟練的技術人員所掌握的。這些技術在下述文獻中有充分的描述如Sambrook的Molecular Cloning；A LaboratoryManual，第二版(1989)；DNA Cloning，第I和II卷(D.N Glover編輯，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編輯，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯，1984)；Transcription and Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney編輯，1986)；ImmobilizedCells and Enzymes(IRL出版社，1986)；B.Perbal，A Practical Guide to MolecularCloning(1984)；the Methods in Enzymology series(Academic Press，Inc.)，尤其是第154和155卷；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos編輯，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Mayer和Walker編輯(1987)，Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press，London)；Scopes，(1987)Protein PurificationPrinciples and Practice，第二版(Springer-Verlag，N.Y.)和Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編輯，1986)。
在本說明書中使用核苷酸和胺基酸的標準縮寫。
可採用各種方法製備本發明使用的蛋白質(如重組表達、從細胞培養物中純化、化學合成等)，並將其製成各種形式(如天然的、融合的等)。較佳的是以基本純淨的形式製備(即基本上沒有其它奈瑟球菌或其它宿主細胞的蛋白質)。
可採用許多方法製備用於本發明的核酸(如化學合成、從基因組或cDNA庫獲得、從生物體自身獲得等)，並且所製得的核酸可以成各種形式(如單鏈、雙鏈、載體、探針等)。術語「核酸」包括DNA和RNA，還有它們的類似物(如那些含有修飾的骨架的核酸)，以及肽核酸(PNA)等。
定義當組合物中X+Y總重量的至少85％是X時，則稱含有X的組合物「基本無Y」。較佳地，X佔組合物中X+Y總重量的至少約90％，更佳地為至少約95％或者甚至99％(重量)。
術語「包含」指「含有」和「由......構成」，例如「包含」X的組合物可以完全由X構成，或者可以含有X之外的物質，例如X+Y。
術語「異源」指在自然界中發現不在一起的兩種生物學組分。這種組分可以是宿主細胞、基因、或調控區如啟動子。儘管異源組分在自然界中發現不在一起，但是它們能一起起作用，例如當與某基因異源的一種啟動子與該基因操作性相連時。另一個例子是奈瑟球菌序列與小鼠宿主細胞異源。另一例子是來自相同或不同蛋白質的兩個表位，它們已經以自然界沒有的排列方式組裝在一個蛋白質中。
「複製起點」是啟動和調節多核苷酸(例如表達載體)複製的一種多核苷酸序列。複製起點可作為細胞內多核苷酸複製的自主性單位，能在其自身的控制下進行複製。複製起點是載體在特定宿主細胞中複製所需要的。有了某一複製起點，表達載體就能在細胞中合適蛋白的存在下高拷貝數地複製。這些起點的例子是在酵母中有效的自主複製序列；以及在COS-7細胞中有效的病毒性T-抗原。
較佳採用在MPSRCH程序(Oxford Molecular)中執行的Smith-Waterman同一性檢索算法測定蛋白質間的同一性，使用參數缺口罰分(gap open penalty)＝12和缺口延伸罰分(gap extension penalty)＝1進行缺口仿射搜索(affine gap search)。通常，兩個蛋白質有50％以上的同一性即可認為它們在功能上相當。
核酸分子或提供核酸序列的區域的「等位基因變異體」在本文中指基本上在另一基因組或第二種分離物的基因組中的相同位置產生、並且由於天然變異(如突變或重組)而產生與所述基因組具有類似而非相同的核酸序列的核酸分子或區域。編碼區域的等位基因變異體一般編碼活性與由與它比較的基因編碼的蛋白質類似的蛋白質。等位基因變異體還可在基因的5＇或3＇不翻譯區域(如調節控制區域)有改變(如美國專利第5753/235號)。
表達系統奈瑟球菌屬細菌的核苷酸序列可在各種不同的表達系統中表達；例如那些使用哺乳動物細胞、杆狀病毒、植物、細菌和酵母的系統。
i.哺乳動物系統哺乳動物表達系統是本領域中已知的。哺乳動物啟動子是能結合哺乳動物RNA聚合酶並啟動編碼序列(如結構基因)的下遊(3＇)轉錄成mRNA的任何DNA序列。啟動子具有一個轉錄起始區，它通常鄰近編碼序列的5＇端，還具有一個TATA盒，這個框通常位於轉錄起始位點上遊25-30個鹼基對(bp)處。認為TATA盒指導RNA聚合酶II在正確位點開始RNA合成。哺乳動物啟動子還含有一個上遊啟動子元件，它通常位於TATA盒上遊100至200bp內。該上遊啟動子元件決定了轉錄啟動的速度，並可在兩個方向之一上起作用〔Sambrook等人(1989)「克隆基因在哺乳動物細胞中的表達」，Molecular CloningALaboratory Manual，第2版〕。
哺乳動物病毒基因通常是高表達的，具有廣泛的宿主範圍；因此，編碼哺乳動物病毒基因的序列提供了特別有用的啟動子序列。例子包括SV40早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒LTR啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)以及單純皰疹病毒啟動子。另外，從非病毒基因(如鼠金屬硫蛋白基因)衍生的序列也提供了有用的啟動子序列。表達可以是組成型的或受調控的(誘導型)，取決於啟動子能否在激素反應性細胞中用促糖皮質激素誘導。
增強元件(增強子)的存在，聯合上述啟動子元件時通常會提高表達水平。增強子是這樣一種調控性DNA序列，當它與同源或異源啟動子相連，合成在正常的RNA起始位點開始時，它能刺激轉錄提高1000倍。當增強子位於轉錄起始位點的上遊或下遊，處於正常或翻轉方向，或距離啟動子1000個核苷酸以上的距離時，它均具有活性〔Maniatis等人(1987)Science 2361237；Alberts等人(1989)《細胞分子生物學》，第2版〕。從病毒衍生的增強子元件可能是特別有用的，因為它們通常具有較寬的宿主範圍。例子包括SV40早期基因增強子〔Dijkema等人(1985)EMBO J.4761〕以及衍生自Rous肉瘤病毒的長末端重複序列(LTR)的增強子/啟動子〔Gorman等人(1982b)Proc.Natl.Acad.Sci.796777〕以及來自人巨細胞病毒的增強子/啟動子〔Boshart等人(1985)Cell 41521〕。另外，一些增強子僅僅在誘導物(例如激素或金屬離子)的存在下是具有活性〔Sassone-Corsi和Borelli(1986)Trends Genet.2215；Maniatis等人(1987)Science 2361237〕。
DNA分子可在哺乳動物細胞中胞內表達。啟動子序列可以和DNA分子直接相連，在這種情況下，重組蛋白N端的第一個胺基酸始終是甲硫氨酸，它由ATG起始密碼子編碼。如果需要，可通過和溴化氰體外培育來從蛋白上切下此N端。或者，外來蛋白也可從細胞中分泌到生長培養基中，方法是產生嵌合的DNA分子，該DNA分子編碼的融合蛋白包括一前導序列片段，該片段在哺乳動物細胞中提供了外源蛋白的分泌。較佳的是，在前導序列片段和外源基因之間可以有能在體內或體外斷裂的加工位點。前導序列片段通常編碼一種由疏水性胺基酸組成的信號肽，該信號肽指導蛋白質從細胞中分泌。腺病毒三聯前導序列是哺乳動物細胞中分泌外來蛋白的一個前導序列的例子。
通常，哺乳動物細胞識別的轉錄終止和聚腺苷酸化序列是位於翻譯終止密碼子3＇的調控區域，因此它和啟動子元件一起側接於編碼序列。成熟mRNA的3＇端由定點的轉錄後斷裂和聚腺苷酸化形成〔Bimstiel等人(1985)Cell 41349；Proudfoot和Whitelaw(1988)＂真核RNA的終端和3＇端加工＂，Transcription and splicing(B.D.Hames和D.M.Glover編)；Proudfoot(1989)Trends Biochem.Sci.14105〕。這些序列指導mRNA的轉錄，mRNA能被翻譯成該DNA編碼的多肽。轉錄終止子/聚腺苷酸化信號的例子包括從SV40衍生的那些〔Sambrook等人(1989)「克隆基因在培養的哺乳動物細胞中的表達」，Molecular CloningA Laboratory Manual〕。
通常，上述組件，包括啟動子、聚腺苷酸化信號以及轉錄終止序列被一起放入表達構建物中。如果需要，表達構建物中還包括增強子、具有功能性剪接供體和受體位點的內含子以及前導序列。構建物的表達通常以複製子形式維持，例如是能在宿主(如哺乳動物細胞或細菌)中穩定維持的染色體外元件(如質粒)。哺乳動物複製系統包括從動物病毒衍生的那些系統，其需要反式作用因子來進行複製。例如，含有乳多空病毒複製系統的質粒，如SV40〔Gluzman(1981)Cell，23175〕或多瘤病毒，在合適的病毒T抗原的存在下複製出極高的拷貝數。哺乳動物複製子的其它例子包括衍生自牛乳頭瘤病毒和EB病毒的複製子。另外，複製子可以有兩個複製系統，從而使其能維持在例如哺乳動物細胞中進行表達並能在原核宿主中克隆和擴增。這些哺乳動物細菌穿梭載體的例子包括pMT2〔Kaufman等人(1989)Mol.Cell.Biol.9946〕和pHEBO〔Shimizu等人(1986)Mol.Cell.Biol.61074〕。
所用的轉化步驟取決於待轉化的宿主。將異源多核苷酸導入哺乳動物細胞中的方法是本領域所知的，其包括葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣沉澱、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物)介導的轉染、原生質體融合、電穿孔、將多核苷酸包裹在脂質體中以及將DNA直接顯微注射到胞核中。
可作為宿主進行表達的哺乳動物細胞系是本領域中已知的，其包括許多從美國典型培養物保藏中心(ATCC)獲得的無限增殖的細胞系，包括但不局限於，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、海拉細胞、乳倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(如Hep G2)和其它許多細胞系。
ii.杆狀病毒系統也可將編碼蛋白質的多核苷酸插入合適的昆蟲表達載體中，並與該載體中的控制元件操作性相連。載體構建採用本領域已知的技術。通常，表達系統的組分包括一種轉移載體，通常是細菌質粒，它含有杆狀病毒基因組片段以及便於插入待表達異源基因的限制性位點；野生型杆狀病毒，它的序列與轉移載體中的杆狀病毒特異性片段同源(這使得異源基因能同源重組到杆狀病毒基因組中)；以及合適的昆蟲宿主細胞和生長培養基。
將編碼蛋白質的DNA序列插入轉移載體中後，將載體和野生型病毒基因組轉染到昆蟲宿主細胞中，使載體和病毒基因組重組。表達包裝的重組病毒，鑑定並純化重組噬斑。杆狀病毒/昆蟲細胞表達系統材料及其方法，除別的以外，可以試劑盒形式購自Invitrogen，San Diego CA(＂MaxBac＂試劑盒)。這些技術通常是本領域技術人員所知的，在Summers和Smith的Texas Agricultural Experiment StationBulletin No.1555(1987)(後稱「Summer和Smith的文章」)中有充分描述。
在將編碼蛋白質的DNA序列插入杆狀病毒基因組之前，通常將上述組件，包括啟動子、前導序列(如果需要)、感興趣的編碼序列以及轉錄終止序列裝配在中間置換型構建物(轉移載體)中。該構建物可含有單個基因以及操作性相連的調控元件；多個基因，每個基因有其自己的一套操作性相連調控元件；或是由同一組調控元件調控的多個基因。中間置換型構建物通常保持在一個複製子中，例如能在宿主(如細菌)內穩定保持的染色體外元件(如質粒)。複製子將具有一個複製系統，從而使其能保持在合適的宿主中進行克隆和擴增。
目前，用來將外源基因導入AcNPV的最常用的轉移載體是pAc373。還可設計本領域技術人員已知的其它許多載體。這些載體包括如pVL985(其將多角體蛋白的起始密碼子從ATG變為ATT，並在ATT下遊32個鹼基對處引入一個BamHI克隆位點；見Luckow和Summers，Virology(1989)，1731)。
質粒通常還含有多角體蛋白聚腺苷酸化信號(Miller等人(1988〕Ann.Rev.Microbiol.，42177)以及用來在大腸桿菌中選擇和繁殖的原核氨苄青黴素抗性(amp)基因和複製起點。
杆狀病毒轉移載體通常含有杆狀病毒啟動子。杆狀病毒啟動子是能結合杆狀病毒RNA聚合酶並啟動編碼序列(如結構基因)下遊(5＇到3＇)轉錄成mRNA的任何DNA序列。啟動子具有一個轉錄起始區，該區通常鄰近編碼序列的5＇端。該轉錄起始區通常包括一個RNA聚合酶結合位點以及一個轉錄起始位點。杆狀病毒轉移載體還可能具有稱為增強子的第二區，如果該區域存在，它通常遠離結構基因。表達可以是調控型或組成型的。
在病毒感染周期晚期大量轉錄的結構基因提供了特別有用的啟動子序列。例子包括從編碼病毒多角體蛋白的基因衍生獲得的序列，Friesen等人(1986)「杆狀病毒基因表達的調控」，The Molecular Biology of Baculoviruses(Walter Doerfler編輯)；EPO公開號127 839和155 476；以及編碼p10蛋白的基因，Vlak等人(1988)，J.Gen.Virol.，69765。
編碼合適的信號序列的DNA可以衍生自分泌的昆蟲或杆狀病毒蛋白的基因(如杆狀病毒多角體蛋白基因)(Carbonell等人，(1988)Gene，73409)。另外，由於哺乳動物細胞翻譯後修飾(如信號肽斷裂、蛋白水解斷裂和磷酸化)的信號看來可被昆蟲細胞識別，且分泌和胞核積累所需的信號看來在無脊椎動物細胞和脊椎動物細胞之間是保守的，因此也可用非昆蟲來源的前導序列來提供昆蟲中的分泌，這些前導序列例如是從編碼人α-幹擾素(Maeda等人(1985)，Nature 315592)、人胃泌素釋放的肽(Lebacq-Verheyden等人(l988)，Molec.Cell.Biol.83129)、人IL-2(Smith等人(1985)Proc.Nat』l.Acad Sci.USA，828404)、小鼠IL-3(Miyajima等人(1987)Gene 58273)和人葡糖腦苷脂酶(Martin等人(1988)DNA，799)的基因衍生獲得的。
重組多肽或聚蛋白可以在胞內表達，或如果它是用合適的調控序列表達的，就可被分泌。非融合的外源蛋白良好的胞內表達通常需要理想地具有短前導序列的異源基因在ATG起始信號前有合適的翻譯起始信號。如果需要，可通過和溴化氰體外培育，從成熟蛋白上切下N端甲硫氨酸。
另外，通過產生嵌合的DNA分子將非天然分泌的重組聚蛋白或蛋白從昆蟲細胞中分泌出來，該嵌合的DNA分子所編碼的融合蛋白包含一前導序列片段，該片段提供了從昆蟲中分泌外源蛋白的作用。該前導序列片段通常編碼一種信號肽，該信號肽包含的疏水性胺基酸引導蛋白質轉移到內質網中。
在插入了編碼該蛋白表達產物前體的DNA序列和/或基因後，用轉移載體的異源DNA和野生型杆狀病毒的基因組DNA共同轉化(通常是共轉染)昆蟲細胞宿主。此構建物的啟動子和轉錄終止序列通常包含杆狀病毒基因組2-5kb片段。將異源DNA引入杆狀病毒中所需位點內的方法是本領域所知的。(見Summers和Smith的文章，同上；Ju等人(1987)；Smith等人，Mol.Cell.Biol.(1983)32156；和Luckow和Summers(1989))。例如，插入可以是通過同源雙交換重組來插入一個基因如多角體蛋白基因中；插入還可以是插入構建的所需杆狀病毒基因內的限制性酶切位點中。Miller等人(1989)，Bioessays 491。當DNA序列被克隆在表達載體多角體蛋白基因位置中時，其5＇和3＇均側接了多角體蛋白特異性序列，並位於多角體蛋白啟動子的下遊。
隨後將新形成的杆狀病毒表達載體包裝到感染性重組杆狀病毒中。發生頻率很低(在約1％和5％之間)的同源重組；因此，共轉染後產生的大多數病毒仍是野生型病毒。因此，需要用一種方法來鑑別重組病毒。該表達系統的一個優點是肉眼篩選能區分重組病毒。在病毒感染後期，天然病毒產生的多角體蛋白在受其感染細胞的胞核中產生的水平非常高。累積的多角體蛋白形成的包涵體，其還含有包埋顆粒。這些大小至多為15微米的包涵體具有高度的折光性，從而使它們呈現明亮的發光外觀，在光學顯微鏡下很容易觀察。感染了重組病毒的細胞缺少包涵體。為了區分重組病毒和野生型病毒，用本領域已知的技術將轉染上清接種到單層昆蟲細胞上形成噬斑。即，在光學顯微鏡下篩選存在(表明是野生型病毒)或不存在(表明是重組病毒)包涵體的噬斑。「Current Protocols in Microbiology」，第2卷(Ausubel等人編輯)，16.8(增補10，1990)；Summers和Smith的文章，同上；Miller等人(1989)。
已經開發出感染進入幾種昆蟲細胞的重組杆狀病毒表達載體。例如，已經開發出用於感染以下昆蟲細胞的重組杆狀病毒埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿丫紋夜蛾(Autographa californica)、家蠶(Bombyx mori)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)(WO89/046699；Carbonell等人(1985)，J.Virol.56153；Wright(1986)Nature 321718；Smith等人(1983)Mol.Cell.Biol.32156；綜述見Fraser等人(1989)In Vitro Cell.Dev.Biol.25225)。
可以購得細胞和細胞培養基用於在杆狀病毒/表達系統中直接表達和融合表達異源多肽；細胞培養技術是本領域技術人員通常所知的。參見Summers和Smith的文章，同上。
然後，經修飾的昆蟲細胞可以生長在合適的營養培養基中，該培養基能穩定地保持該質粒於修飾的昆蟲宿主中。當表達產物的基因處於可誘導的控制下時，可以使宿主生長至高密度，並誘導表達。另外，當表達是組成型時，產物將被連續表達到培養基中，營養性培養基必需不斷循環，取出感興趣的產物同時補充消耗的營養物。產物可用以下這些技術來純化例如層析，如HPLC、親和層析、離子交換層析等；電泳；密度梯度離心；溶劑抽提等。產物可按需作進一步純化，以基本上除去所有也分泌到培養基中或由昆蟲細胞裂解而產生的昆蟲蛋白，以提供一種至少基本上不含宿主碎片如蛋白質、脂質和多糖的產物。
為了獲得蛋白質的表達，將從轉化子衍生獲得的重組宿主細胞培育在允許重組蛋白的編碼序列表達的條件下。這些條件將隨所選定的宿主細胞而變。然而，本領域技術人員容易根據本領域已知的知識來確定該條件。
iii.植物系統本領域已知有許多植物細胞培養系統和全植物遺傳表達系統。典型的植物細胞基因表達系統包括在以下專利中描述的那些，如US5,693,506；US5,659,122；和US5,608,143。Zenk，Phytochemistry 303861-3863(1991)中描述了在植物細胞培養物中遺傳表達的其它例子。除上述參考文獻外，關於植物蛋白信號肽的描述還可在下列文獻中找到Vaulcombe等人，Mol.Gen.Genet.20933-40(1987)；Chandler等人，Plant Molecular Biology 3407-418(1984)；Rogers，J.Biol.Chem.2603731-3738(1985)；Rothstein等人，Gene 55353-356(1987)；Whittier等人，NucleicAcids Research 152515-2535(1987)；Wirsel等人，Molecular Microbiology 33-14(1989)；Yu等人，Gene 122247-253(1992)。關於用植物激素、赤黴素酸和赤黴素酸誘導分泌的酶調節植物基因表達的描述可在R.L.Jones和J.MacMillin，Gibberellins，Advanced Plant Physiology，Malcolm B.Wilkins編輯，1984 PitmanPublishing Limited，London，21-52頁中找到。描述其它調節代謝的基因的參考文獻參見Sheen，Plant Cell，21027-1038(1990)；Maas等人，歐洲分子生物學協會雜誌(EMBO J.)93447-3452(1990)；Benkel和Hickey，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.).841337-1339(1987)。
通常，利用本領域已知的技術，將所需的多核苷酸序列插入一表達盒中，該表達盒含有為在植物中操作而設計的基因調控元件。將該表達盒插入所需的表達載體中，表達盒的上遊和下遊有適合在植物宿主中表達的伴隨序列。這些伴隨序列可來自質粒或病毒，並為載體提供所需的性能，以允許載體將DNA從起初的克隆宿主(如細菌)中移動到所需植物宿主中。基礎的細菌/植物載體構建物最好能提供寬的宿主範圍原核複製起點；原核可選擇的標記；以及，對於農桿菌轉化而言，宜提供T DNA序列用於農桿菌介導的轉移至植物染色體。當異源基因不易檢測時，該構建物最好還具有一個適用於確定植物細胞是否已經轉化的可選擇標記基因。關於合適標記(例如對於禾草類家族成員)的綜述可在Wilmink和Dons，1993，Plant Mol.Biol.Reptr，11(2)165-185中找到。
還建議採用適合將異源序列整合到植物基因組中的序列。這些序列可能包括用於同源重組的轉座子序列以及允許將異源表達盒隨機插入植物基因組中的Ti序列。合適的原核可選擇標記包括抗生素(如氨苄青黴素或四環素)抗性標記。編碼其它功能的其它DNA序列也可存在於載體中，這是本領域所知的。
本發明的核酸分子可包括在一個表達盒中來表達感興趣的蛋白質。通常只要一個表達盒，但是兩個或多個表達盒也是可行的。除了編碼異源蛋白的序列外，重組表達盒還含有下列元件啟動子區域、植物5＇非翻譯序列、起始密碼子(根據結構基因原來是否具有而定)、以及轉錄和翻譯終止序列。表達盒5＇和3＇端的獨特限制性酶位點能使表達盒方便地插入預先存在的載體中。
異源編碼序列可以用於任何與本發明有關的蛋白。編碼感興趣的蛋白的序列將編碼出一個信號肽，該信號肽能適當地加工和轉運蛋白質，並且通常缺少可能會導致本發明的所需蛋白與膜結合的序列。由於對於大部分來說，轉錄起始區將針對發芽期間表達和轉運的基因，採用提供轉運的信號肽，也可提供轉運感興趣的蛋白質。通過這種方式，感興趣的蛋白將從表達該蛋白的細胞中轉運出來，並能被有效地收穫。通常，種子中的分泌是通過糊粉或小盾體上皮層進入種子的胚乳。儘管不需要使蛋白從產生該蛋白的細胞中分泌出來，但是這種分泌有利於重組蛋白的分離和純化。
由於所需基因產物的最終表達將在真核細胞中進行，因此需要確定克隆的基因部分是否含有作為內含子被宿主剪接體機制加工的序列。如果是這樣，需要對「內含子」區進行定點誘變，以防止一部分遺傳信息作為錯誤的內含子密碼而喪失，Reed和Maniatis，Cell 4195-105，1985。
可用微量移液管以機械方式轉移重組DNA，將載體直接顯微注射到植物細胞中。Crossway，Mol.Gen.Genet，202179-185。還可用聚乙二醇將遺傳物質轉移到植物細胞中，Krens等人，Nature，296，72-74，1982。導入核酸片段的另一種方法是用小顆粒進行高速彈道貫穿，在這些小珠或顆粒的基質中或表面上帶有核酸，Klein等人，Nature，327，70-73，1987，Knudsen和Muller，1991，Planta，185330-336提出用顆粒轟擊大麥胚乳以產生轉基因大麥。還有一種導入方法是使原生質體和其它實體〔微細胞(minicell)、細胞、溶酶體或其它可融合的脂質表面體〕融合，Fraley等人，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，79，1859-1863，1982。
載體也可通過電穿孔導入植物細胞中。(Fromm等人，PNAS 825824，1958)。在該技術中，在含有基因構建物的質粒存在下電穿孔植物原生質體。高電場強度的電脈衝使生物膜可逆地被通透，從而允許導入質粒。電穿孔的植物原生質體重新形成細胞壁，分裂並形成植物愈傷組織。
能分離出原生質體並能培育成全再生植物的所有植物，都能用本發明進行轉化，從而回收得到含有轉基因的全植物。已經知道實際上可以從培育的細胞或組織再生所有的植物，其包括但不局限於，甘蔗、甜菜、棉花、果實和其它樹、豆科植物和蔬菜的所有主要種類。合適的植物包括如從草莓屬(Fragaria)、蓮屬(Lotus)、苜蓿屬(Medicago)、驢喜豆屬(Onobrychis)、三葉草屬(Trifolium)、胡蘆巴屬(Trigonella)、豇豆屬(Vigna)、柑橘屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、牻牛兒屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿蔔屬(Daucus)、擬南芥屬(Arabidopsis)、芸苔屬(Brassica)、蘿蔔屬(Raphanus)、芥屬(Sinapis)、顛茄屬(Atropa)、辣椒屬(Capsicum)、曼陀羅屬(Datura)、莨菪屬(Hyoscyamus)、番茄屬(Lycopersicon)、菸草屬(Nicotiana)、茄屬(Solanum)、矮牽牛屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、馬約喇納屬(Majorana)、菊苣屬(Cichorium)、向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhinum)、Hererocallis、龍面花屬(Nemesia)、天竺葵屬(Pelargonium)、黍屬(Panicum)、狼尾屬(Pennisetum)、毛莨屬(Ranunculus)、千裡光屬(Senecio)、蛾蝶屬(Salpiglossis)、黃瓜屬(Cucumis)、Browaalia、大豆屬(Glycine)、毒麥屬(Lolium)、玉米屬(Zea)、小麥屬(Triticum)、高粱屬(Sorghum)和曼陀羅屬(Datura)。
再生方式隨各種植物而有所不同，但是通常是首先提供含有異源基因拷貝的轉化的原生質體懸液。形成愈傷組織，從愈傷組織中誘生出枝條，隨後是根。另外，從原生質體懸液可以誘生形成胚。這些胚象天然的胚那樣發芽形成植物。培養基通常含有各種胺基酸和激素，如植物生長素和細胞分裂素。尤其是對於玉米和苜蓿屬來說，在培養基中加入穀氨酸和脯氨酸也是很有利的。枝條和根通常同時發育。有效的再生取決於培養基、基因型以及培養史。如果控制了這三個變量，那麼再生能完全再現和重複。
在一些植物細胞培養系統中，本發明所需的蛋白可能被分泌出來，或者蛋白可從全植物中提取出來。當本發明所需的蛋白被分泌到培養基中後，就可進行收集。或者，可以用機械方式破碎胚以及無胚-半種子或其它植物組織，以釋放出分泌到細胞和組織之間的蛋白。將該混合物懸於緩衝液中，以收回可溶性蛋白。然後用常規的蛋白分離和純化方法純化重組蛋白。用常規方法調節時間、溫度、pH、氧和體積等參數，以優化異源蛋白的表達和回收。
iv.細菌系統細菌表達技術是本領域已知的。細菌啟動子是能結合細菌RNA聚合酶並啟動下遊(3＇)編碼序列(如結構基因)轉錄成mRNA的DNA序列。啟動子具有一個轉錄起始區，其通常位於編碼序列的5＇端附近。該轉錄起始區通常包括RNA聚合酶結合位點以及一個轉錄起始位點。細菌啟動子可能還有第二個功能區域稱為操縱子，它可能與毗鄰的RNA合成開始的RNA聚合酶結合位點重疊。該操縱子允許負調節(可誘導)的轉錄，因為基因阻遏蛋白可能結合操縱子並因而抑制特定基因的轉錄。在負調節元件(如操縱子)不存在時，可能發生組成型表達。另外，正調節可通過基因激活蛋白結合序列來實現，如果有的話，該結合序列通常鄰近RNA聚合酶結合序列的(5＇)。基因激活蛋白的例子是分解代謝物激活劑蛋白(CAP)，它幫助啟動大腸桿菌(E.coli)中的lac操縱子的轉錄〔Raibaud等人(1984)Annu.Rev.Genet.18173〕。因此，表達的調控可能是正作用或負作用，從而增強或減弱轉錄。
編碼代謝途徑中的酶的序列提供了特別有用的啟動子序列。例子包括衍生自糖(如半乳糖、乳糖(lac)〔Chang等人(1977)Nature 1981056〕和麥芽糖)代謝酶的啟動子序列。其它例子包括衍生自生物合成酶(如色氨酸(trp))〔Goeddel等人(1980)Nuc.Acids Res.84057；Yelverton等人(1981)Nucl.Acids Res.9731；美國專利4,738,921；EP-A-0036776和EP-A-0121775〕的啟動子序列。β-內醯胺酶(bla)啟動子系統〔Weissmann(1981)＂幹擾素的克隆和其它錯誤＂《幹擾素3》(I.Gresser編輯)〕，λ噬菌體PL〔Shimatake等人(1981)Nature 292128〕和T5〔美國專利4,689,406〕啟動子系統也提供了有用的啟動子序列。
另外，非天然存在的合成的啟動子也可象細菌啟動子一樣起作用。例如，一種細菌或噬菌體啟動子的轉錄激活序列可以和另一種細菌或噬菌體啟動子的操縱子序列連接在一起，形成合成的雜交啟動子〔美國專利4,551,433〕。例如，tac啟動子是雜合的trp-lac啟動子，它由trp啟動子以及受lac阻遏蛋白調節的lac操縱子序列組成〔Amann等人(1983)Gene 25167；de Boer等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.8021〕。另外，細菌啟動子可包括非細菌來源但能結合細菌RNA聚合酶並啟動轉錄的天然存在的啟動子。天然存在的非細菌來源的啟動子還能和相容的RNA聚合酶偶聯在一起，從而在原核細胞中高水平地表達某些基因。噬菌體T7RNA聚合酶/啟動子系統就是一種偶聯的啟動子系統〔Studier等人(1986)J.Mol.Biol.189113；Tabor等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.821074〕。另外，雜合的啟動子還可由噬菌體啟動子以及大腸桿菌操縱子區域組成(EP-A-0267 851)。
除了有功能的啟動子序列外，有效的核糖體結合位點對於外來基因在原核細胞中的表達也是有用的。在大腸桿菌中，核糖體結合位點稱為Shine-Dalgarno(SD)序列，其包括起始密碼子(ATG)以及在起始密碼子上遊3-11個核苷酸處的長度為3-9個核苷酸的序列〔Shine等人(1975)Nature 25434〕。認為SD序列是通過SD序列和大腸桿菌16S rRNA的3＇端之間鹼基配對來促進mRNA與核糖體結合的〔Steitz等人(1979)，「信使RNA中的遺傳信號和核苷酸序列」，《生物學調節和發育基因表達》，R.F.Goldberger編輯〕。為了表達具有弱的核糖體結合位點的原核基因和真核基因〔Sambrook等人(1989)，「克隆基因在大腸桿菌中的表達」，《分子克隆實驗手冊》〕。
DNA分子可以在胞內表達。啟動子序列可以直接與DNA分子相連，在這種情況下，N端的第一個胺基酸始終是甲硫氨酸，其由ATG起始密碼子編碼。如果需要，可通過和溴化氰體外培育或通過和細菌甲硫氨酸N-端肽酶體內或體外培育，將N端的甲硫氨酸從蛋白質上切下(EP-A-0219237)。
融合蛋白為直接表達提供了另一種方法。通常，將編碼內源細菌蛋白或其它穩定的蛋白之N端部分的DNA序列與異源編碼序列的5＇端融合。在表達時，該構建物將提供這兩個胺基酸序列的融合物。例如，λ噬菌體細胞基因可以和外源基因的5＇端相連並在細菌中表達。所得融合蛋白宜保留一個酶(因子Xa)加工位點，以便將噬菌體蛋白與外源基因切開〔Nagai等人(1984)Nature 309810〕。融合蛋白也可用lacZ〔Jia等人(1987)Gene 60197〕，trpE〔Allen等人(1987)J.Biotechnol.593；Makoff等人(1989)，J.Gen.Microbiol.13511〕以及Chey〔EP-A-0324 647〕基因的序列組成。兩個胺基酸序列連接處的DNA序列可以編碼或不編碼一可切割的位點。另一個例子是遍在蛋白融合蛋白。這種融合蛋白由遍在蛋白區域組成，該區域宜保留一個酶(例如遍在蛋白特異性加工蛋白酶)加工位點，以便將外源蛋白和遍在蛋白切開。通過這種方法，可以分離獲得天然的外源蛋白〔Miller等人(1989)，Bio/Technology 7698〕。
另外，還可通過產生嵌合的DNA分子來將外源蛋白分泌出細胞，該嵌合的DNA分子編碼的融合蛋白含有一個信號肽序列片段，該序列片段能使細菌中的外源蛋白分泌出來〔美國專利4,336,336〕。信號序列片段通常編碼一個信號肽，該信號肽含有疏水性胺基酸，能指引蛋白分泌出細胞。蛋白質被分泌到生長培養基(革蘭陽性菌)中或細胞內膜和外膜之間的周質間隙內(革蘭陰性菌)。在編碼的信號肽片段和外源基因之間宜具有能在體內或體外切割的加工位點。
編碼合適信號序列的DNA可以從分泌性細菌蛋白的基因衍生獲得，這些基因例如是大腸桿菌外膜蛋白基因(ompA)〔Masui等人(1983)，《基因表達的實驗操作》；Ghrayeb等人(1984)EMBO J.32437〕以及大腸桿菌鹼性磷酸酶信號序列(phoA)〔Oka等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.827212〕。另一個例子是，可採用各種芽孢桿菌菌株的α澱粉酶基因的信號序列將異源蛋白分泌出枯草芽孢桿菌〔Palva等人(1982)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582；EP-A-0244042〕。
通常，細菌所識別的轉錄終止序列是位於翻譯終止密碼子3＇的調控區，它和啟動子一起側接在編碼序列的兩側。這些序列指導mRNA的轉錄，而mRNA能被翻譯成該DNA所編碼的多肽。轉錄終止序列通常包括約50個核苷酸的DNA序列，該序列能形成幫助終止轉錄的莖環結構。例子包括衍生自具有強啟動子的基因(如大腸桿菌中的trp基因以及其它生物合成的基因)的轉錄終止序列。
上述組件，包括啟動子、信號序列(如果需要)、感興趣的編碼序列以及轉錄終止序列通常一起被放在表達構建物中。表達構建物通常以複製子的形式維持，例如能在宿主(如細菌)中穩定維持的染色體外元件(如質粒)。複製子具有一個複製系統，從而允許其維持在原核宿主中或進行表達或進行克隆和擴增。另外，複製子可以是高拷貝數或低拷貝數的質粒。高拷貝數質粒的拷貝數大致在約5至200之間，通常在約10至150之間。含有高拷貝數質粒的宿主宜含有至少約10個質粒，更佳的含有至少約20個質粒。根據載體以及外源蛋白對宿主的影響，可以選擇高拷貝數或低拷貝數的載體。
另外，表達構建物可以和一個整合載體一起整合入細菌基因組中。整合載體通常含有至少一個序列與細菌染色體同源，從而允許該載體整合。整合看來是載體和細菌染色體中的同源DNA之間重組的結果。例如，用不同芽孢桿菌菌株的DNA構建的整合載體整合到芽孢桿菌染色體中(EP-A-0127328)。整合載體還可包含噬菌體或轉座子序列。
通常，染色體外構建物以及整合的表達構建物可含有可選擇的標記，以便選擇已經轉化的菌株。可選擇標記可在細菌宿主中表達，其包括賦予細菌對藥物(如氨苄青黴素、氯黴素、紅黴素、卡那黴素(新黴素)和四環素)抗性的基因〔Davies等人(1978)Annu.Rev.Microbiol.32469〕。可選擇標記還可包括生物合成性基因，如在組氨酸、色氨酸以及亮氨酸生物合成途徑中的那些基因。
另外，上述某些組件可以一起放在轉化載體中。轉化載體通常包含一個可選擇標記，如上所述，該載體以複製子形式維持或發展成一個整合載體。
已經開發出了用於轉化到許多細菌中的表達和轉化載體(無論是染色體外複製子還是整合載體)。例如，已經開發出了用於下列細菌的表達載體枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)〔Palva等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582；EP-A-0036259和063953；WO84/04541〕，大腸桿菌(Escherichia coli)〔Shimatake等人，(1981)Nature 292128；Amann等人，(1985)Gene 40183；Studier等人，(1986)J.Mol.Biol.189113；EP-A-0036776、136829和136907〕，乳脂鏈球菌(Streptococcus cremoris)〔Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655〕；淺青紫鏈球菌(Streptococcus lividans)〔Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655〕，淺青紫鏈黴菌(Streptomyces lividans)〔美國專利4,745,056〕。
將外源DNA導入細菌宿主的方法是本領域熟知的，通常包括用氯化鈣或其它試劑(如二價陽離子和二甲亞碸)處理對細菌進行轉化。DNA還可通過電穿孔方法導入細菌細胞。轉化程序通常因待轉化的細菌種類而不同。〔例如參見，例如使用桿菌Masson等人，(1989)FEMSMicrobiol.Lett.60273；Palva等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582；EP-A-0036259和063953；WO84/04541；使用彎曲桿菌Miller等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85856；和Wang等人，(1990)J.Bacteriol.172949；使用埃希氏大腸桿菌Cohen等人，(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.692110；Dower等人，(1988)NucleicAcids Res.166127；Kushner (1978)＂用ColE1-衍生質粒轉化大腸桿菌的改進方法＂Genetic EngineeringProceedings ofthe International Symposium on Genetic Engineering(H.W.Boyer和S.Nicosia編輯)；Mandel等人，(1970)J.Mol.Biol.53159；Taketo(1988)Biochim.Biophys.Acta949318；使用乳酸桿菌Chassy等人，(1987)FEMSMicrobiol.Lett.44173；使用假單胞菌Fiedler等人，(1988)Anal.Biochem17038；使用葡萄球菌Augustin等人，(1990)FEMS Microbiol.Lett.66203；使用鏈球菌Barany等人，(1980)J.Bacteriol.144698；Harlander(1987)＂用電穿孔轉化鏈球菌產乳酸微生物＂Streptococcal Genetics(J.Ferretti和R.Curtiss III編輯)；Perry等人，(1981)Infect.Immun.321295；Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655；Somkuti等人，(1987)Proc.4th Evr.Cong.Biotechnology 1412〕。
v酵母表達酵母表達系統也是本領域技術人員所知的。酵母啟動子是能結合酵母RNA聚合酶並啟動下遊(3＇)編碼序列(如結構基因)轉錄成mRNA的DNA序列。啟動子具有一個轉錄起始區，它通常位於編碼序列的5＇端附近。該轉錄起始區通常包括RNA聚合酶結合位點(＂TATA盒＂)以及一個轉錄起始位點。酵母啟動子可能還有第二個功能區域稱為上遊激活序列(UAS)，如果存在的話，它通常遠離結構基因。UAS允許調節(可誘導)的表達。在UAS不存在時，發生組成型表達。表達的調控可能是正作用或負作用的，從而增強或減弱轉錄。
酵母是一種發酵生物體，具有活潑的代謝途徑，因此編碼代謝途徑中的酶的序列提供了特別有用的啟動子序列。例子包括醇脫氫酶(ADH)(EP-A-0284044)、烯醇酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸變位酶、以及丙酮酸激酶(PyK)(EP-A-0329203)。編碼酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也提供了有用的啟動子序列〔Myanohara等人(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 801〕。
另外，非天然存在的合成的啟動子也可象酵母啟動子一樣起作用。例如，一種酵母啟動子的UAS序列可以和另一種酵母啟動子的轉錄激活區連接在一起，形成合成的雜合啟動子。這種雜合啟動子的例子包括與GAP轉錄激活區相連的ADH調控序列(美國專利No.4,876,197和4,880,734)。雜合啟動子的其它例子包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的調控序列組成的啟動子與糖酵解酶基因如GAP或PyK的轉錄激活區的組合(EP-A-0164556)。另外，酵母啟動子可包括非酵母來源但能結合酵母RNA聚合酶並啟動轉錄的天然存在的啟動子。這些啟動子的例子包括，尤其是，〔Cohen等人，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 771078；Henikoff等人，(1981)Nature 283835；Hollenberg等人，(1981)Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.96119；Hollenberg等人，(1979)＂細菌抗生素抗性基因在釀酒酵母中的表達＂，Plasmids of Medical，Environmental and Commercial Importance(K.N.Timmis和A.Puhler編輯)；Mercerau-Puigalon等人，(1980)Gene 11163；Panthier等人，(1980)Curr.Genet.2109〕。
DNA分子可以在酵母菌胞內表達。啟動子序列可以直接與DNA分子相連，在這種情況下，重組蛋白N端的第一個胺基酸始終是甲硫氨酸，其由ATG起始密碼子編碼。如果需要，可通過和溴化氰體外培育將N端的甲硫氨酸從蛋白質上切下。
象在哺乳動物、杆狀病毒以及細菌表達系統中一樣，融合蛋白為酵母表達系統提供了另一種方法。通常，將編碼內源酵母蛋白或其它穩定的蛋白之N端部分的DNA序列與異源編碼序列的5＇端融合。在表達時，該構建物將提供這兩個胺基酸序列的融合物。例如，酵母或人超氧化物歧化酶(SOD)基因可以和外源基因5＇端相連並在酵母中表達。兩個胺基酸序列連接處的DNA序列可以編碼或不編碼可切割的位點。例如參見EP-A-0196056。另一個例子是遍在蛋白融合蛋白。這種融合蛋白由遍在蛋白區域組成，該區域宜保留一個酶(例如遍在蛋白特異性加工蛋白酶)加工位點，以便將外源蛋白和遍在蛋白切開。因此，通過這種方法，可以分離獲得天然的外源蛋白(例如WO88/024066)。
另外，還可通過產生嵌合的DNA分子來將外源蛋白從細胞分泌到生長培養基中，該嵌合的DNA分子編碼的融合蛋白含有一個前導序列片段，該前導序列片段能使酵母中的外源蛋白分泌出來。較佳的是，在編碼的前導片段和外來基因之間宜具有能在體內或體外切割的加工位點。該前導序列片段通常編碼了含有疏水性胺基酸的信號肽，其引導蛋白從細胞分泌出來。
編碼合適信號序列的DNA可以從分泌性酵母蛋白的基因衍生獲得，這些基因例如有酵母轉化酶基因(EP-A-0012873；JPO 62096，086)以及A-因子基因(美國專利4,588,684)。另外，非酵母來源的前導序列(如幹擾素前導序列)的存在也能提供分泌出酵母的作用(EP-A-0060057)。
較佳的一類分泌前導序列採用了酵母α-因子基因的片段，其含有＂pre＂信號序列和＂pro＂區。可採用的α因子片段的類型包括全長pre-pro α因子前導序列(約83個胺基酸殘基)以及截短的α-因子前導序列(通常約25至50個胺基酸殘基)(美國專利4,546,083和4,870,008；EP-A-0324274)。採用α-因子前導片段提供分泌作用的其它前導序列包括雜合的α-因子前導序列，其由第一個酵母的pre序列以及第二個酵母α因子的pro區域組成(例如見WO89/02463)。
通常，酵母識別的轉錄終止序列是位於翻譯終止密碼子3＇的調控區，其和啟動子一起側接在編碼序列的兩側。這些序列指導mRNA的轉錄，而mRNA能被翻譯成該DNA所編碼的多肽。轉錄終止序列和其它酵母識別的終止序列的例子是編碼糖酵解酶的那些轉錄終止序列。
上述組件，包括啟動子、前導序列(如果需要時)、感興趣的編碼序列以及轉錄終止序列，通常被一起放在表達構建物中。表達構建物通常以複製子的形式保持，例如能在宿主(如酵母或細菌)中穩定保持的染色體外元件(如質粒)。複製子可能具有兩個複製系統，從而允許其能維持在例如酵母中進行表達，並能維持在原核宿主進行克隆和擴增。這些酵母-細菌穿梭載體的例子包括YEp24〔Botstein等人(1979)Gene 817-24〕，pCL/1〔Brake等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA814642-4646〕和YRp17〔Stinchcomb等人(1982)J.Mol.Biol.158157〕。另外，複製子可以是高拷貝數或低拷貝數的質粒。高拷貝數質粒的拷貝數大致在約5至200之間，通常在約10至150之間。含有高拷貝數質粒的宿主宜含有至少約10個質粒，更佳的含有至少約20個質粒。根據載體以及外源蛋白對宿主的影響，可以選擇高拷貝數或低拷貝數的載體。例如參見Brake等人，同上。
另外，表達構建物可以和一個整合載體一起整合入酵母基因組中。整合載體通常含有至少一個序列與酵母染色體同源，從而允許該載體整合，最好含有兩個同源序列側接該表達構建物。整合看來是載體和酵母染色體中同源DNA之間重組的結果〔Orr-Weaver等人(1983)，Methods in Enzymol.101228-245〕。通過選擇合適的同源序列插入載體中，可將整合載體導入酵母中某一特定的基因座。見Orr-Weaver等人，同上。可以整合入一個或多個表達構建物，這可能會影響重組蛋白產生的水平(Rine等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 806750〕。載體中的染色體序列可以載體中的單個片段形式存在(從而導致整個載體的整合)，或是與染色體中的相鄰片段同源的兩個片段，這兩個片段在載體中側接在表達構建物兩側，從而可導致僅表達構建物的穩定性整合。
通常，染色體外構建物以及整合的表達可建物均含有可選擇的標記，以便選擇已經轉化的酵母菌株。可選擇標記可包括能在酵母宿主中表達的生物合成基因(如ADE2、HIS4、LEU2、TRP1和ALG7以及G418抗性基因)，這些基因分別賦予酵母細胞對衣黴素以及G418的抗性。另外，合適的可選擇標記還可能為酵母在毒性化合物(如金屬)存在下提供生長能力。例如，CUP1的存在使酵母能在銅離子存在下生長〔Butt等人，(1987) Microbiol.Rev.51351〕。
另外，上述某些組件可以一起放在轉化載體中。轉化載體通常包含一個可選擇標記，如上所述，該載體以複製子形式維持或發展成一個整合載體。
已經開發出了用於轉化入許多酵母中的表達和轉化載體(無論是染色體外複製子還是整合載體)。例如，已經開發出用於下列酵母菌的表達載體白色念珠菌(Candida albicans)〔Kurtz，等人，(1986)Mol.Cell.Biol.6142〕，麥芽糖念珠菌(Candida maltosa)〔Kunze，等人，(1985)J.Basic Microbiol.25141〕，多形漢遜酵母(Hansenula polymorpa)〔Gleeson，等人，(1986)J.Gen.Microbiol.1323459；Roggenkamp等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202302〕，脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)〔Das，等人，(1984)J.Bacteriol.1581165〕，乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)〔De Louvencourt等人，(1983)J.Bacteriol.154737；Vanden Berg等人，(1990)Bio/Technology 8135〕，季也蒙畢赤酵母(Pichia guillerimondii)〔Kunze等人，(1985)J.BasicMicrobiol.25141〕，巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)〔Cregg，等人，(1985)Mol.Cell. Biol.53376；美國專利No.4,837,148和4,929,555〕，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)〔Hinnen等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA751929；Ito等人，(1983)J.Bacteriol.153163〕，慄酒裂植酵母(Schizosaccharomycespombe)〔Beach和Nurse(1981)Nature 300706〕，以及Yarrowia lipolytica〔Davidow，等人，(1985)Curr.Genet.10380471 Gaillardin，等人，(1985)Curr.Genet.1049〕。
將外源DNA導入酵母宿主的方法是本領域熟知的，通常包括用鹼陽離子處理轉化原生質球或完整酵母細胞。轉化程序通常因待轉化的酵母種類而不同。例如參見，〔Kurtz等人，(1986)Mol.Cell.Biol.6142；Kunze等人，(1985)J.BasicMicrobiol.25141；念珠菌〕；〔Gleeson等人，(1986)J.Gen.Microbiol.1323459；Roggenkamp等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202302；漢遜酵母〕；〔Das等人，(1984)J.Bacteriol.1581165；De Louvencourt等人，(1983)J.Bacteriol.1541165；Van denBerg等人，(1990)Bio/Technology8135；克魯維酵母〕；〔Cregg等人，(1985)Mol.Cell.Biol.53376；Kunze等人，(1985)J.Basic Microbiol.25141；美國專利No.4,837,148和4,929,555；畢赤酵母〕；〔Hinnen等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75；1929；Ito等人，(1983)J.Bacteriol.153163釀酒酵母〕；〔Beach和Nurse(1981)Nature 300706；裂殖酵母〕；〔Davidow等人，(1985)Curr.Genet.1039；Gaillardin等人，(1985)Curr.Genet.1049；Yarrowia〕。
抗體本文所用的術語「抗體」指由至少一個抗體結合位點組成的一個或一組多肽。「抗體結合位點」是一個三維結合空間，其內表面形狀和電荷分布與抗原表位的特徵互補，從而使抗體與抗原結合。「抗體」例如包括，脊椎動物抗體、雜合抗體、嵌合抗體、人源化抗體、經修飾的抗體、單價抗體、Fab蛋白以及單結構域抗體。
針對本發明蛋白的抗體可用於親和層析、免疫試驗以及區別/鑑定奈瑟球菌蛋白。
針對本發明蛋白的多克隆和單克隆抗體可用常規方法製得。通常，首先用蛋白來免疫合適的動物，較佳的是小鼠、大鼠、家兔或山羊。由於可獲得的血清體積多，能獲得標記的抗家兔和抗山羊抗體，因此對於製備多克隆抗血清來說，家兔和山羊是較佳的。免疫通常這樣進行將蛋白以鹽水(較佳的以佐劑如弗氏完全佐劑)混合或乳化，然後腸胃外(通常是皮下或肌內)注射該混合物或乳劑。每次注射50-200微克的劑量就足夠了。2-6周後用鹽水(較佳的是用弗氏不完全佐劑)配的蛋白質注射一次或多次以強化免疫。另外可以用本領域已知的方法進行體外免疫來產生抗體，從本發明的目的來看，認為其與體內免疫等效。將免疫後的動物血液抽取到玻璃或塑料容器中，25℃培育該血液1小時，然後4℃培育2-18小時，獲得多克隆抗血清。離心(例如1000g 10分鐘)回收血清。家兔每次取血可獲得約20-50毫升。
用Kohler和Milstein的標準方法〔Nature(1975)256495-96〕或其改進方法製得單克隆抗體。通常，如上所述對小鼠或大鼠免疫。然而，並非是對動物取血然後抽提血清，而是取出脾臟(以及任選地取出幾個大的淋巴結)，將其分散成單細胞。如果需要，可將細胞懸液(在除去非特異性粘附的細胞後)加入包被了蛋白質抗原的板或孔中，對脾細胞進行篩選。表達抗原特異性的膜結合免疫球蛋白的B細胞結合到板上，不象懸液其它物質那樣被洗去。然後對所得B細胞或所有解離的脾細胞進行誘導，使其與骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤，培養在選擇性培養基(如次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷培養基，「HAT」)中。通過有限稀釋接種所得雜交瘤，並測定特異性結合免疫抗原(且不結合無關抗原)的抗體的產生。然後，體外(例如在組織培養瓶或中空纖維反應器中)或體內(如小鼠腹水中)培養所選的分泌單克隆抗體的雜交瘤。
如果需要，抗體(無論是多克隆還是單克隆抗體)可用常規技術來標記。合適的標記包括螢光團、發色團、放射活性原子(尤其是32P和125I)、密電子試劑、酶、以及具有特異性結合配偶的配體。酶通常靠其活性來檢測。例如，辣根過氧化物酶通常是檢測其將3，3＇，5，5＇-四甲基聯苯胺(TMB)轉變成藍色的能力，可用分光光度計定量測定。「特異性結合配偶」指能以高特異性結合配體分子的蛋白質，例如抗原以及對其有特異性的單克隆抗體。其它特異性結合配偶包括生物素和親和素或鏈親和素，IgG和蛋白A，以及本領域已知的許多受體-配體對。應理解，上述內容並非要將各種標記分成不同的類，因為同一標記可在幾種不同的模型中起作用。例如，125I可作為放射活性標記，或作為密電子試劑。HRP可作為酶或單抗的抗原。另外，一種物質可以和各種標記組合以獲得所需的效果。例如，在實施本發明中，單抗和親和素也需要標記，因此，可以用生物素標記單抗，並用標記了125I的親和素檢測其存在，或用標記HRP的抗生物素單抗檢測其存在。其它替換和可能性對於本領域普通技術人員來說是顯而易見的，所以應認作屬於本發明範圍內的等價物。
藥物組合物藥物組合物可包含本發明的多肽、抗體或核酸。該藥物組合物將包含治療有效量的本發明的多肽、抗體或多核苷酸。
本文所用的術語「治療有效量」指治療劑治療、緩解或預防目標疾病或狀況的量，或是表現出可檢測的治療或預防效果的量。該效果例如可通過化學標記或抗原水平來檢測。治療效果也包括生理性症狀的減輕，例如導致體溫降低。對於某一對象的精確有效量取決於該對象的體型和健康狀況、病症的性質和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預先指定準確的有效量是沒用的。然而，對於某給定的症狀而言，可以用常規實驗來確定該有效量，臨床醫師是能夠判斷出來的。
為了本發明的目的，有效的劑量為給予個體約0.01毫克/千克至50毫克/千克或0.05毫克/千克至10毫克/千克的DNA構建物。
藥物組合物還可含有藥學上可接受的載體。術語「藥學上可接受的載體」指用於治療劑(例如抗體、多肽、基因或其它治療劑)給藥的載體。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身不誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體，且給藥後沒有過分的毒性。合適的載體可能是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸、胺基酸聚合物、胺基酸共聚物以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領域普通技術人員所熟知的。
本文可用的藥學上可接受的鹽例如有無機酸鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；以及有機酸鹽，如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。在Remington＇s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到關於藥學上可接受的賦形劑的充分討論。治療性組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如潤溼劑或乳化劑、pH緩衝物質等。通常，可將治療性組合物製成可注射劑，例如液體溶液或懸浮液；還可製成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。脂質體也包括在藥學上可接受的載體的定義中。
給藥方法一旦配成本發明的組合物，可將其直接給予對象。待治療的對象可以是動物；尤其可以治療人對象。
直接輸送該組合物通常可通過皮下、腹膜內、靜脈內或肌內注射或輸送至組織間隙來實現。組合物也可輸送至病灶區。其它給藥方式包括口服和肺給藥、栓劑和透皮或經皮膚施用(參見例如WO98/20734)、用針、基因槍或手持無針注射器(hypospray)。治療劑量方案可以是單劑份方案或多劑份方案。
疫苗疫苗包含免疫性抗原、免疫原、多肽、蛋白或核酸，通常與「藥學上可接受的載體」組合，這些載體包括本身不誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、胺基酸聚合物、胺基酸共聚物、脂質凝集物(如油滴或脂質體)以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領域普通技術人員所熟知的。另外，這些載體可起免疫刺激劑(「佐劑」)作用。另外，抗原或免疫原可以和細菌類毒素(如白喉、破傷風、霍亂、幽門螺桿菌等病原體的類毒素)偶聯。
增強組合物效果的較佳的佐劑包括但不局限於(1)鋁鹽(alum)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油型乳劑配方(有或沒有其它特異性的免疫刺激劑，如胞壁醯肽(見下文)或細菌細胞壁成分)，例如，(a)MF59TM(WO90/14837；第10章「疫苗設計亞基和佐劑方法」，Powell和Newman編，Plenum Press，1995)，其含有5％鯊烯、0.5％吐溫80和0.5％Span85(任選地含有不同量的MTP-PE(見下文)，雖然並不需要)，用微量流化器(如110Y型微量流化器(Microfluidics，Newton，MA))製成亞微米級顆粒；(b)SAF，其含有10％鯊烯、0.4％吐溫80、5％普盧蘭尼克(pluronic)嵌段聚合物L121以及thr-MDP(見下文)，微量流化成亞微米級乳劑或渦流振蕩產生粒徑較大的乳劑，和(c)RibiTM佐劑系統(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，其含有2％鯊烯、0.2％吐溫80以及選自單磷醯脂A(MPL)、二黴菌酸海藻糖酯(TDM)、和細胞壁骨架(CWS)的一種或多種細菌細胞壁組分，較佳的是MPL+CWS(DetoxTM)；(3)皂素佐劑，例如可採用StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或從其產生的顆粒，如ISCOM(免疫刺激性複合物)；(4)弗氏完全佐劑(CFA)和弗氏不完全佐劑(IFA)；(5)細胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、幹擾素(如γ幹擾素)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CFS)、腫瘤壞死因子(TNF)等；以及(6)作為免疫刺激劑來增強組合物效果的其它物質。Alum和MF59TM是較佳的。
如上所述，胞壁醯肽包括但不局限於，N-乙醯-胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異穀氨醯胺(thr-MDP)、N-乙醯-去甲基胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺(nor-MDP)、N-乙醯胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯氨醯基-L-丙氨酸-2-(1＇-2＇-二棕櫚醯-sn-甘油-3-羥基磷醯氧)-乙胺(MTP-PE)等。
免疫原性組合物(如用於免疫的抗原/免疫原/多肽/蛋白/核酸，藥學上可接受的載體以及佐劑)，通常含有稀釋劑，如水，鹽水，甘油，乙醇等。另外，輔助性物質，如潤溼劑或乳化劑、pH緩衝物質等可存在於這類運載體中。
通常，可將免疫原性組合物製成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可製成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該製劑還可乳化或包封在脂質體中，在上述藥學上可接受的載體下增強佐劑效果。
用作疫苗的免疫原性組合物，包含免疫學有效量的抗原性或免疫原性多肽以及上述其它所需的組分。「免疫學有效量」指以單劑或連續劑一部分給予個體的量對治療或預防是有效的。該用量根據所治療個體的健康狀況和生理狀況、所治療個體的類別(如非人靈長類、靈長類等)、個體免疫系統合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗的配製、治療醫師對醫療狀況的評估、及其它的相關因素而定。預計該用量將在相對較寬的範圍內，可通過常規實驗來確定。
常規方法是從腸胃外途徑通過注射給予免疫原性組合物，例如皮下、肌內或皮下/透皮給藥(例如WO98/20734)。適合其它給藥方式的其它配方包括口服和肺製劑、栓劑和透皮施藥。治療劑量可以是單劑份方案或多劑份方案。疫苗可以結合其它免疫調節劑一起給予。
作為以蛋白質為基礎的疫苗的一種替代方案是，可以採用DNA疫苗接種〔例如，Robinson和Torres(1997)Seminars in Immunology 9271-283；Donnelly等人(1997)Annu Rev.Immunol 15617-648；見下文〕。
基因傳送工具可局部或全身向哺乳動物給予用於傳送含有本發明治療劑的編碼序列的構建物的基因治療工具，以使其在該哺乳動物中表達。這些構建物可利用體內或體外形式的病毒或非病毒載體方法。可使用內源哺乳動物啟動子或異源啟動子誘導這種編碼序列的表達。該編碼序列的體內表達可以是組成型的或調節型的。
本發明包括能表達預期的核酸序列的基因傳送工具。該基因傳送工具較佳是病毒載體，更佳是逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、皰疹病毒或甲病毒載體。病毒載體還可以是星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、細小病毒、細小核糖核酸病毒、痘病毒或者披膜病毒載體。通常可參見Jolly(1994)，Cancer Gene Therapy，151-64；Kimura(1994)，Human Gene Therapy，5845-852；Connelly(1995)，Human Gene Therapy，6185-193；和Kaplitt1994)，Nature Genetics，6148-153。
逆轉錄病毒載體在本領域中是周知的，我們認為任何逆轉錄基因治療載體都可用在本發明中，包括B、C和D型逆轉錄病毒、異嗜性逆轉錄病毒〔例如，NZB-X1、NZB-X2和NZB9-1(參見O＇Neill(1985)，J.Viro1.，53160)〕、多嗜性逆轉錄病毒如MCF和MCF-MLV〔參見Kelly(1983)，J.Virol.，45291〕、泡沫病毒和慢病毒。參見RNA Tumor Viruses，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，1985。
可從不同的逆轉錄病毒獲得逆轉錄病毒基因治療載體的各個部分。例如，可從鼠肉瘤病毒獲得逆轉錄病毒載體的LTR、從勞氏肉瘤病毒獲得tRNA結合位點、從鼠白血病毒獲得包裝信號、從鳥類白血病毒得到第二條鏈的合成來源。
通過將這些重組的逆轉錄病毒載體導入適當的包裝細胞系中，可使它們產生轉導競爭性逆轉錄病毒載體粒子(參見美國專利第5,591,624號)。通過將嵌合型整合酶結合到該逆轉錄病毒粒子中，可構建可以位點特異性整合到宿主細胞DNA中的逆轉錄病毒載體(參見WO96/37626)。較佳的是，該重組病毒載體是複製缺陷性重組病毒。
適合用於上述逆轉錄病毒載體的包裝細胞系在本領域中是周知的，並且易於製備(參見WO95/30763和WO92/05266)，並且，這些細胞系可用於產生用於生產重組載體粒子的生產性細胞系(也稱為載體細胞系或「VCL」)。較佳的是，這些包裝細胞系由人的親本細胞(如HT1080細胞)或水貂的親本細胞系(在人血清中可恢復活性)製得。
用於構建逆轉錄病毒基因治療載體的較佳逆轉錄病毒包括鳥類白血病毒、牛白血病毒、鼠類白血病毒、水貂細胞病灶誘導性病毒、鼠類肉瘤病毒、網狀內皮組織增殖病毒和勞氏肉瘤病毒。特別優選的鼠類白血病毒包括4070A和1504A〔Hartley和Rowe(1976)，J Virol，1919-25〕、Abelson(ATCC第VR-999號)、Friend(ATCC第VR-245號)、Graffi、Gross(ATCC第VR-590號)、Kirsten、Harvey肉瘤病毒和Rauscher(ATCC第VR-998號)和莫洛尼鼠類白血病毒(ATCC第VR-190號)。可從收藏處或保藏所如在馬裡蘭Rockville的美國典型培養物保藏所(「ATCC」)獲得這些逆轉錄病毒，或者使用通常可獲得的技術從已知的來源中分離得到。
可用在本發明中的已知逆轉錄病毒基因治療載體的例子包括那些在下述專利申請中描述的載體GB2200651、EP0415731、EP0345242、EP0334301、WO89/02468、WO89/05349、WO89/0927l、WO90/02806、WO90/07936、WO94/03622、WO93/25698、WO93/25234、WO93/11230、WO93/10218、WO91/02805、WO91/02825、WO95/07994、US5,219,740、US4,405,712、US4,861,719、US4,980,289、US4,777,127、US5,591,624。還可參見Vile(1993)，CancerRes，533860-3864；Vile(1993)，CancerRes，53962-967；Ram(1993)，CancerRes 53(1993)，83-88；Takamiya(1992)，J Neurosci Res，33493-503；Baba(1993)，J Neurosurg，79729-735；Mann(1983)，Cell，33153；Cane(1984)，Proc Natl AcadSci，816349；和Miller(1990)，Human Gene Therapy 1。
人的腺病毒基因治療載體在本領域中也是已知的，並可用在本發明中。例如可參見Berkner(1988)，Biotechniques，6616和Rosenfeld(1991)，Science，252431；和WO93/07283、WO93/06223和WO 93/07282。可用在本發明的已知的腺病毒基因治療載體的例子包括上述文獻所述的載體以及下述文獻中描述的載體WO94/12649、WO93/03769、WO93/19191、WO94/28938、WO95/11984、WO95/00655、WO95/27071、WO95/29993、WO95/34671、WO96/05320、WO94/08026、WO94/11506、WO93/06223、WO94/24299、WO95/14102、WO95/24297、WO95/02697、WO94/28152、WO94/24299、WO95/09241、WO95/25807、WO95/05835、WO94/18922和WO95/09654。或者，可使用Curiel(1992)，Hum.Gene Ther.，3147-154所述給予連接於被殺死的腺病毒的DNA。本發明的基因傳送工具還可包括腺伴隨病毒(AAV)載體。用於本發明的這些載體的主要和較佳的例子是Srivastava的WO93/09239中公開的以AAV-2為基礎的載體。大多數較佳的AAV載體含有這兩個AAV反向末端重複單元，在該單元中，天然的D-序列經核苷酸的取代而被修飾，這樣至少5個天然核苷酸到18個天然核苷酸、較佳至少10個到18個、最佳10個天然核苷酸被保留，該D-序列的其餘核苷酸則被刪除或被非天然核苷酸取代。這些AAV反向末端重複單元的天然D-序列是在各AAV反向末端重複單元(即每端各有一條序列)有20個連續的核苷酸的序列，這些序列不參與HP的形成。非天然取代核苷酸可以是除了在天然D-序列的相同位置上發現的核苷酸以外的任何核苷酸。其它可使用的AAV載體的例子是pWP-19、pWN-1，這兩個載體已在Nahreini(1993)，Gene，124257-262中公開。這種AAV載體的另一例子是psub201〔參見Samulski(1987)，J.Virol.，613096〕。AAV載體的另一例子是Double-D ITR載體。Double-D ITR載體的構建已在美國專利第5,478,745中公開。還有其它的例子在Carter的美國專利第4,797,368號和Muzyczka的美國專利第5,139,941號、Chartejee的美國專利第5,474,935號和Kotin的WO94/288157中公開。可用在本發明中的AAV載體又一例子是SSV9AFABTKneo，它含有AFP增強子和清蛋白啟動子，它主要在肝中指導表達。它的結構和構造在Su(1996)，Human Gene Therapy，7463-470中公開。另外一些AAV基因治療載體已在US5,354,678、US5,173,414、US5,139,941和US5,252,479中公開。
本發明的基因治療載體還包括皰疹載體。主要的和較佳的例子是含有編碼胸苷激酶多肽的序列的單純皰疹病毒載體，如US5,288,641和EP0176170(Roizman)中公開的那些載體。單純皰疹病毒載體的另外的例子包括WO95/04139(WistarInstitute)中公開的HFEM/ICP6-LacZ、Geller(1998，Science，2411667-1669)和WO99/0944 1以及WO92/07945中描述的pHSVlac、Fink(1992，Human GeneTherapy，311-19)描述的HSVpgC-lacZ和EP0453242(Breakefield)中所述的HSV7134、2 RH 105和GAL4，以及那些保藏在ATCC中登記號為ATCC VR-977和ATCC VR-260的載體。
還考慮的是甲病毒基因治療載體，這種載體也可用在本發明中。較佳的甲病毒載體是新培斯病毒載體。披膜病毒、Semliki Forest病毒(ATCC VR-67、ATCCVR-1247)、Middleberg病毒(ATCC VR-370)、Rose River病毒(ATCC VR-373、ATCCVR-1246)、委內瑞拉馬腦炎病毒(ATCC VR923；ATCC VR-1250、ATCC VR-1249、ATCC VR-532)和在美國專利第5,091,309號、第5,217,879號和WO92/10578中描述的那些載體。更具體而言，在美國系列號08/405627(1995年3月15日提交)、WO94/21792、WO92/10578、WO95/07994、US5,091,309和US5,217,879中所述的那些甲病毒載體也可在本發明中使用。可從如馬裡蘭Rockville的ATCC中獲得這類甲病毒，或者使用常規可獲得的技術從已知的來源中分離獲得。較佳是使用減弱的細胞毒性的甲病毒載體(參見USSN08/679640)。
還將DNA載體系統(如真核生物分層表達系統)用於本發明的核酸的表達。參見WO95/07994，該文有關於真核生物分層表達系統的詳細描述。較佳的是，本發明的真核生物分層表達系統從甲病毒載體中獲得，最佳是從新培斯病毒載體獲得。
適合用於本發明的其它病毒載體包括，從脊髓灰質炎病毒獲得的那些載體(例如ATCC VR-58)；和Evans〔Nature，339(1989)，385〕和Sabin(1973，J.Biol.Standardization，1115)描述的那些載體；鼻病毒，如ATCC VR-1110和Amold(1990，J Cell Biochem，L401)描述的那些；痘病毒，如金絲雀痘病毒或牛痘病毒，例如ATCC VR-111和ATCC VR-2010和Fisher-Hoch(1989，Proc Natl Acad Sci，86317)、Flexner(1989，Ann NY Acad Sci，56986)、Flexner(1990，Vaccine，817)、US4,603,112和US4,769,330以及WO89/01973中所述的那些載體；SV40病毒，例如，ATCC VR-305和那些在Mulligan(1979，Nature，277108)和Madzak(1992，J Gen Virol，731533)所述的載體；流感病毒，例如ATCC VR-797和使用如US5,166,057和Enami(1990，Proc Natl Acad Sci，873802-3805)、Enami和Palese(1991，J Virol，652711-2713)和Luytjes〔1989，Cell，59110，還可參見McMichael(1983)，NEJ Med，30913和Yap(1978)，Nature，273238和Nature(1979)，277108〕中所述的反向遺傳學技術製得的重組流感病毒；EP-0386882和Buchschacher(1992，J.Vrol.，662731)中所述的人免疫缺陷病毒；麻疹病毒，如ATCC VR-67和VR-1247和EP-0440219中所述；Aura病毒，例如ATCC VR-368；Bebaru病毒，例如，ATCC VR-600和ATCC VR-1240；Cabassou病毒，例如ATCCVR-922；Chikungunya病毒，例如ATCC VR-64和ATCC VR-1241；Fort Morgan病毒，例如ATCC VR-924；Getah病毒，例如ATCC VR-369和ATCC VR-1243；Kyzylagach病毒，例如ATCC VR-927；Mayaro病毒，例如ATCC VR-66；Mucambo病毒，例如ATCC VR-580和ATCC VR-1244；Ndumu病毒，例如ATCC VR-371；Pixuna病毒，例如ATCC VR-372和ATCC VR-1245；Tonate病毒，例如ATCCVR-925；Triniti病毒，例如ATCC VR-469；Una病毒，例如ATCC VR-374；Whataroa病毒，例如ATCC VR-926；Y-62-33病毒，例如ATCC VR-375；O＇Nyong病毒、東部腦炎病毒，例如ATCC VR-65和ATCC VR-1242；西部腦炎病毒，例如ATCCVR-70、ATCC VR-1251、ATCC VR-622和ATCC VR-1252；和冠狀病毒，例如ATCC VR-740和Hamre(1966，Proc Soc Exp Biol Med，121190)中所述。
並不限於使用上述載體將本發明的組合物傳送到細胞中。可使用其它的傳送方法和介質，如核酸表達載體、僅連接或未連接被殺死的腺病毒的多陽離子濃縮的DNA〔例如參見美國系列號08/366,787(1994年12月30日提交)和Curiel(1992)，Hum Gene Ther，3147-154〕、配體連接的DNA〔例如參見Wu(1989)，J Biol Chem，26416985-16987〕、原核生物細胞傳送工具細胞〔如參見美國系列號08/240,030(1994年5月8日提交)和美國系列號08/404,796〕、如美國專利第5,149,655號所述的使光聚合的水凝膠物質沉積和手控基因轉移粒子槍、如US5,206,152和WO92/11033中所述的電離輻射、核電荷中和或與細胞膜的融合。其它的方法在Philip(1994)，Mol CellBiol，142411-2418和Woffendin(1994)，Proc NatlAcad Sci，911581-1585中有所描述。
可使用粒子介導的基因轉移，如可參見美國系列號60/023,867。簡言之，可將該序列插入含有用於高水平表達的常規控制序列的常規載體中，然後使其與合成的基因轉移分子(如聚合的DNA結合陽離子，如聚賴氨酸、魚精蛋白和清蛋白)，使其連接於細胞靶向配體，如Wu和Wu(1987，J.Biol.Chem.，2624429-4432)所述的脫唾液酸血清類粘蛋白、Hucked(1990，Biochem Pharmacol，40253-263)所述的胰島素、Plank(1992，Bioconjugate Chem，3533-539)所述的半乳糖、乳糖或運鐵蛋白。
也可使用裸DNA。導入裸DNA的方法的例子在WO90/11092和US5,580,859中有所描述。使用生物可降解的膠乳珠可改進攝取的效率。包塗在膠乳珠上的DNA在這些珠啟動的胞吞作用後可有效地被輸送到細胞中。通過對這些珠進行處理，使它們的疏水性增加，從而促進內涵體的破壞並將DNA釋放到細胞質中，這樣可進一步改進此方法。
在US5,422,120、WO95/13796、WO94/23697、WO91/14445和EP-524,968中描述了可用作基因傳送工具的脂質體。如USSN60/023,867中所述，對於非病毒傳送，可將編碼多肽的核酸序列插入含有用於高水平表達的常規控制序列的常規載體中，然後使其與合成的基因轉移分子培育，如聚合的DNA結合陽離子(如聚賴氨酸、魚精蛋白和清蛋白)，使其連接於細胞靶向配體，如脫唾液酸血清類粘蛋白、胰島素、半乳糖、乳糖或運鐵蛋白。其它的傳送系統包括使用脂質體包被含有在各種組織特異性或普遍存在的活躍的啟動子控制之下的基因的DNA。適合使用的非病毒傳送系統還包括機械傳送系統，如Woffendin等人〔1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91(24)11581-11585〕所述的方法。此外，可通過光聚合水凝膠物質的沉積作用傳送該編碼序列或其表達產物。可用於傳送編碼序列的基因傳送的其它常規方法包括，如使用手控基因轉移粒子槍(如US5149,655所述)、使用電離輻射以激活轉移的基因(如US5,206,152和WO/9211033所述)。
示範性的脂質體和多陽離子基因傳送工具是下述文獻中描述的那些US5,422,120和4,762,915，WO95/13796，WO94/23697和WO91/14445，EP-0524968，Stryer〔Biochemistry，第236-240頁(1975)〕，W.H.Freeman，洛杉磯；Szoka〔(1980)，Biochem Biophys Acta，6001〕，Bayer〔(1979)，Biochem Biophys Acta，550464；Rivnay〔(1987)，Meth Enzymol，149119〕；Wang〔(1987)，Proc Natl Acad Sci，847851〕；Plant〔(1989)，AnalBiochem，176420〕。
多核苷酸組合物可含有治療有效量(定義如上)的基因治療工具。對於本發明的目的，有效的劑量是每個給藥個體約0.01mg/kg到50mg/kg或者約0.05mg/kg到約10mg/kg的DNA構建物。
傳送方法一旦配製成藥劑，本發明的多核苷酸組合物就可以下述方式給予(1)直接給予；(2)離體傳送給從受試對象獲得的細胞；或者(3)體外用於重組蛋白質的表達。要治療的對象可以是哺乳動物或鳥類。也可治療人。
通常通過皮下、腹膜內、靜脈或肌肉內注射或者傳送到組織間隙中，以實現這些組合物的傳送。也可將這些組合物施加到病灶中。給藥的其它模式包括口服和肺部給藥、栓劑和經皮或皮下使用(如參見WO98/20734)、使用針頭和基因槍或無針注射器給藥。劑量治療可以是單劑份方案或多劑份方案。
離體傳送然後將轉化的細胞再移植到受試對象體中的方法在本領域中是已知的，在如WO93/14778中有所描述。用於離體用途的細胞的例子包括，例如幹細胞，尤其是造血幹細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞或者腫瘤細胞。
通常，通過下述方法可實現用於離體和體外用途的核酸的傳送，例如，葡聚糖介導的轉染作用、磷酸鈣沉澱作用、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物介導的轉染作用、原生質體融合作用、電穿孔作用、將多核苷酸包被在脂質體中和將DNA直接顯微注射到細胞核中，這些方法在本領域中都是已知的。
多核苷酸和多肽藥物組合物除了上述的藥學上可接受的載體和鹽外，多核苷酸和多肽組合物中還可採用下列附加試劑。
A.多肽一個例子是多肽，其包括但不局限於脫唾液酸血清類粘蛋白(ASOR)；運鐵蛋白；脫唾液酸糖蛋白；抗體；抗體片段；鐵蛋白；白介素；幹擾素；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、幹細胞因子和促紅細胞生成素。還可使用病毒抗原，如包膜蛋白。另外，可用來自其它侵襲性生物的蛋白，例如瘧原蟲惡性瘧疾的環孢子蛋白的17個胺基酸的肽(稱為RII)。
B.激素，維生素等其它可包括的種類例如是激素、類固醇、雄激素、雌激素、甲狀腺激素或維生素、葉酸。
C.聚亞烷基、多糖等另外，聚(亞烷基)二醇可以和所需的多核苷酸或多肽組合在一起。在一個較佳的實施方案中，聚(亞烷基)二醇是聚乙二醇。另外，可以加入單糖、二糖或多糖。在此方面的一個較佳實施方案中，多糖是葡聚糖或DEAE-葡聚糖。另外有脫乙醯殼多糖和聚(丙交酯-共-乙交酯)。
D.脂質和脂質體所需的多核苷酸或多肽還可在輸送給對象或對象衍生的細胞之前包裹在脂質中或包裹在脂質體中。
脂質包裹通常用能穩定結合或捕獲並保留核酸的脂質體來實現。濃縮的多核苷酸與脂質製劑之比可以不同，但是通常在約1∶1(毫克DNA∶微摩爾脂質)之間，或脂質更多。關於脂質體作為輸送核酸的載體的綜述參見Hug和Sleight(1991)Biochim.Biophys.Acta.10971-17；Straubinger(1983)Meth.Enzymol.101512-527。
用於本發明的脂質體製劑包括陽離子(帶正電荷)、陰離子(帶負電荷)和中性製劑。陽離子脂質體已經顯示出能以有功能的形式介導質粒DNA的胞內輸送(Felgner(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413-7416)；mRNA(Malone(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA866077-6081)；和純化的轉錄因子的胞內輸送(Debs(1990)J.Biol.Chem.26510189-10192)。
陽離子脂質體很容易購得。例如，N〔1-2，3-二油烯基氧)丙基〕-N，N，N-三乙銨(DOTMA)脂質體可以以Lipofectin的商標從GIBCO BRL，Grand Island，NY購得。(另見Felgner，同上)。其它商品脂質體包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。其它陽離子脂質體可用本領域熟知的方法從易購得的材料製得。例如參見，Szoka(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 754194-4198；WO90/11092關於DOTAP(1，2-二(油醯基氧)-3-(三甲基銨溶)丙烷〕脂質體合成的描述。
同樣，陰離子和中性脂質體也是容易獲得的，例如購自Avanti PolarLipids(birmingham，AL)，或容易用易購得的材料製得。這種材料包括磷脂醯膽鹼、膽固醇、磷脂醯乙醇胺、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)。這些材料還能以合適比例與DOTMA和DOTAP原料混合。用這些材料製備脂質體的方法是本領域熟知的。
脂質體可包含多層脂質體(MLV)，小的單層脂質體(SUV)、或大的單層脂質體(LUV)。各種脂質體-核酸複合物可用本領域已知的方法製得。例如參見Straubinger(1983)Meth.Immunol.101512-527；Szoka(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 754194-4198；Papahadjopoulos(1975)Biochim.Biophys.Acta 394483；Wilson(1979)Cell 1777)；Deamer和Bangham(1976)Biochim.Biophys.Acta 443629；Ostro(1977)Biochem.Biophys.Res.Commun.76836；Fraley(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 763348)；Enoch和Strittmatter(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76145；Fraley(1980)J.Biol.Chem.(1980)25510431；Szoka和Papahadjopoulos(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75145；以及Schaefer-Ridder(1982)Science 215166。
E.脂蛋白另外，脂蛋白也可加入待輸送的多核苷酸或多肽中。採用的脂蛋白的例子包括乳糜微粒、HDL、IDL、LDL和VLDL。還可採用這些蛋白的突變體、片段或融合蛋白。另外，可採用天然存在的脂蛋白的修飾物，例如乙醯化的LDL。這些脂蛋白能使多核苷酸的輸送指向表達脂蛋白受體的細胞。較佳的是，如果待輸送的多核苷酸中加入了脂蛋白，則組合物中不加入其它尋靶的配體。
天然存在的脂蛋白包含脂質和蛋白部分。蛋白部分稱為脫輔基蛋白。目前，已經分離並鑑定出了脫輔基蛋白A、B、C、D和E。其中至少有兩個含有幾種蛋白，用羅馬數字AI、AII、AIV；CI、CII、CIII命名。
脂蛋白可包含多個脫輔基蛋白。例如，天然存在的乳糜微粒包含A、B、C和E，隨著時間的推移，這些脂蛋白失去A，得到C和E脫輔基蛋白。VLDL包含A、B、C、和E脫輔基蛋白，LDL包含脫輔基蛋白B；HDL包含脫輔基蛋白A、C和E。
這些脫輔基蛋白的胺基酸是已知的，並且在下列文獻中有所描述Breslow(1985)Annu Rev.Biochem 54699；Law(1986)Adv.Exp Med.Biol.151162；Chen(1986)J Biol Chem 26112918；Kane(1980)Proc Natl Acad Sci USA 772465；andUtermann(1984)Hum Genet 65232。
脂蛋白含有各種脂質，包括甘油三酯、膽固醇(游離的和酯型)以及磷脂。天然存在的脂蛋白中脂質的組成是不同的。例如，乳糜微粒主要含甘油三酯。關於天然存在的脂蛋白的脂質含量更詳細的描述可在例如Meth.Enzymol.128(1986)中找到。選擇脂質的組成，以使脫輔基蛋白的構型有利於受體結合活性。還可選擇脂質的組成，以促進與多核苷酸結合分子中的疏水性相互作用和結合。
天然存在的脂蛋白可以用諸如超離心方法從血清中分離出來。這些方法在Meth.Enzymol.(同上)；Pitas(1980)J.BioChem.2555454-5460以及Mahey(1979)JClin.Invest 64743-750中有所描述。脂蛋白還可在體外產生，或通過在所需宿主細胞中表達脫輔基蛋白基因的重組方法產生。例如參見Atkinson(1986)Annu RevBiophys Chem 15403和Radding(1958)Biochim Biophys Acta 30443。脂蛋白也可購自商業供應商，如Biomedical Techniologies，Inc.，Stoughton，Massachusetts，USA。關於脂蛋白的進一步描述可在Zuckermann等人的WO98/06437中找到。
F.聚陽離子試劑聚陽離子試劑可以與或不與脂蛋白一起包括在含所需待輸送多核苷酸/多肽的組合物中。
聚陽離子試劑通常在生理性相關的pH下表現出淨的正電荷，並能中和核酸的電荷，而有助於輸送至所需位置。這些試劑具有體外、活體外和體內的用途。聚陽離子試劑可用來將核酸通過肌內或皮下等輸送至活的對象。
下面是用作聚陽離子試劑的多肽例子聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸和魚精蛋白。其它例子包括組蛋白、魚精蛋白、人血清白蛋白、DNA結合蛋白、非組蛋白染色體蛋白、DNA病毒的外殼蛋白，如(X174，轉錄因子還含有結合DNA的結構域，因此可用作核酸凝聚劑。簡言之，轉錄因子如C/CEBP、c-jun、c-fos、AP-1、AP-2、AP-3、CPF、Prot-1、Sp-1、Oct-1、Oct-2、CREP、和TFIID含有結合DNA序列的基本結構域。聚陽離子有機試劑包括精胺、亞精胺和腐胺。
從上面的清單可以推出聚陽離子試劑的尺寸和物理性能，以構建其它多肽聚陽離子試劑或產生合成的聚陽離子試劑。有用的合成聚陽離子試劑例如包括，DEAE-葡聚糖、Polybrene。LipofectinTM和lipofectAMINETM是與多核苷酸/多肽組合時形成聚陽離子複合物的單體。
免疫診斷檢測本發明的奈瑟球菌抗原可用在免疫測定中，以檢測抗體水平(或者相反地，可使用抗奈瑟球菌抗體檢測抗原的水平)。可發展以明確的重組抗原為基礎的免疫測定，以替換侵入性診斷方法。可檢測針對生物樣品(包括血液和血清樣品)中奈瑟球菌蛋白質的抗體。免疫測定的設計變化極大，其中多數是本領域已知的。免疫測定的方案可以如競爭性試驗、或直接反應或者夾心式試驗為基礎。這些方案也可使用如固相支持物，或者通過免疫沉澱進行。大多數的測定涉及使用標記的抗體或多肽；這些標記物可以是如螢光素、化學發光物質、放射性物質或染料分子。由探針放大信號的試驗也是已知的；這類試驗的例子是使用生物素和抗生物素蛋白的測定以及酶標記和介導的免疫測定(如ELISA)。
通過使適當的材料(包括本發明的組合物)與進行試驗所需的剩餘的試劑以及材料(如適當的緩衝液、鹽溶液等)包裝在合適的容器中，構建適合用於免疫診斷並含有適當的標記試劑的試劑盒，同時提供適當的測定說明。
核酸雜交「雜交」指兩個核酸序列相互之間通過氫鍵而結合。通常，一個序列固定於固體載體，另一個將游離於溶液內。然後，在有利於形成氫鍵的條件下使兩個序列相互接觸。影響這種結合的因素包括溶劑的類型和體積；反應溫度；雜交時間；攪拌；封閉液相序列與固體載體非特異性結合的試劑(Denhardt＇s試劑或BLOTTO)；各序列的濃度；是否使用化合物來增加序列結合的速度(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；以及雜交後洗滌條件的嚴謹程度。見Sambrook等人〔同上〕第2卷，第9章，9.47至9.57頁。
「嚴謹性」指有利於非常相似的序列結合而不利於不同序列結合的雜交反應條件。例如，應選擇溫度和鹽濃度的組合，使溫度比所研究的雜交的Tm計算值低大約120至200℃。溫度和鹽濃度常可通過初步實驗中憑經驗來確定，在初步實驗中，固定在濾膜上的基因組DNA樣品與感興趣的序列雜交，然後在不同的嚴謹度條件下洗滌。見Sambrook等人第9.50頁。
在進行例如Southern印跡時，要考慮的參數是(1)待印跡的DNA的複雜性以及(2)探針與受檢測序列之間的同源性。對於高度複雜的真核基因組中的單拷貝基因，待研究片段的總量可以在10的一個數量級範圍內變化，質粒為0.1至1微克，或將噬菌體消化至10-9至10-8克。對於複雜性較低的多核苷酸，可以採用實際上更短的印跡、雜交以及接觸時間，更少量的起始多核苷酸，以及比活更低的探針。例如，從1微克酵母DNA開始，用僅僅1小時的接觸時間，印跡2小時，然後和108cpm/μg的探針雜交4-8小時，就可以檢測單拷貝酵母基因。對於單拷貝哺乳動物基因而言，一種保守的方法是從10微克DNA開始，印跡過夜，在10％硫酸葡聚糖存在下用108cpm/μg以上的探針雜交過夜，導致接觸時間約為24小時。
有幾個因素可能會影響探針與感興趣片段之間的DNA-DNA雜交物的解鏈溫度(Tm)，因而影響雜交和洗滌的合適條件。在許多情況下，探針並非與待測片段100％同源。其它常常遇到的變量包括雜交序列的長度和G+C總含量，以及雜交緩衝液的離子強度和甲醯胺含量。所有這些因素的作用可近似表示成一個方程式Tm＝81+16.6(log10Ci)+0.4〔％(G+C)〕-0.6(％甲醯胺)-600/n-1.5(％錯配)式中Ci是鹽濃度(單價離子)，n是雜交物鹼基對的長度(對Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138267-284的方法稍作了修改)。
在設計雜交實驗時，影響核酸雜交的一些因素可以方便地予以改變。雜交和洗滌時的溫度以及洗滌時的鹽濃度的調節最為簡單。隨著雜交溫度(即嚴謹度)的升高，不同源的鏈之間發生雜交的可能性變得更少，結果背景值降低。如果放射性標記的探針並非與固定的片段完全同源(這在基因家族和種間雜交實驗中是常見的)，則必須降低雜交溫度，而背景值將會增加。洗滌溫度以類似的方式影響雜交帶的強度和背景值的程度。洗滌的嚴謹性也隨鹽濃度的降低而升高。
通常，在50％甲醯胺存在下的方便的雜交溫度是對於靶片段同源性達95％至100％的探針而言，是42℃；對於同源性為90％至95％的探針，為37℃；對於同源性為85％和90％的探針，為32℃。對於較低的同源性，應用上述方程式應相應地降低甲醯胺含量和調節溫度。如果探針和靶片段之間的同源性是未知的，則最簡單的方法是從非嚴謹的雜交和洗滌條件開始。如果在放射自顯影后發現了非特異性的條帶或高背景值，則可在高嚴謹性下洗滌濾膜，並重新曝光。如果曝光所需時間使得該方法不切實際，則應平行測試幾種雜交和/或洗滌嚴謹性。
腦膜炎球菌80-85kDa蛋白質的鑑定已發現從腦膜炎奈瑟球菌血清群B製備的多種外膜小泡製劑含有約80-85kDa的成分。用SDS-PAGE凝膠純化該蛋白質並進行N-端測序(SEQ ID 1)。
製備的抗SDS-PAGE純化蛋白的抗體與50種以上的不同血清群和血清型的腦膜炎奈瑟球菌菌株中的當量蛋白質相互反應。還觀察到與淋病奈瑟球菌、多糖奈瑟球菌(N.polysaccharia)和乳糖奈瑟球菌(N.lactamica)的交叉反應。接受過疫苗的患者的血清也與該蛋白質反應。
從血清群B腦膜炎奈瑟球菌克隆了完整的基因(SEQ ID 2)，並推斷其編碼的蛋白質(SEQ ID 3)。通過與上述N-端測序相比較，推斷出信號肽(SEQ ID 4)和成熟序列(SEQ ID 5)。
腦膜炎奈瑟球菌血清群A和淋病奈瑟球菌中相應基因的鑑定在血清群B腦膜炎奈瑟球菌序列的基礎上，克隆和測序了腦膜炎奈瑟球菌血清群A和淋病奈瑟球菌的相應序列(稱為『ORF21』)。
SEQ ID 6列出了血清群A腦膜炎奈瑟球菌的完整基因，SEQ ID 7列出了其所編碼的蛋白質。SEQ ID 8和9是信號肽和成熟序列。
SEQ ID 10列出了淋病奈瑟球菌的完整序列，SEQ ID 11列出了其編碼的蛋白質。SEQ ID 12和13為信號肽和成熟序列。
序列的比較將這些蛋白質序列進行比較，發現它們是高度同源的。
腦膜炎奈瑟球菌血清群B序列和淋病奈瑟球菌序列顯示在797aa重疊的片段中有95.4％相同。
10 2030405060orf21.pepMKLKQIASALMMLGISPLALADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFNYLPVKVGDTYNDTHGSA|||||||||||||||||||:||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep MKLKQIASALMMLGISPLAFADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFNYLPVKVGDTYNDTHGSA10 203040506070 8090 100 110 120orf21.pepIIKSLYATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSLNITGAKMLQNDAIKKNLESFGLAQ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep IIKSLYATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSLNITGAKMLQNDAIKKNLESFGLAQ70 8090 100 110 120130 140 150 160 170 180orf21.pepSQYFNQATLNQAVAGLKEEYLGRGKLNIQITPKVTKLARNRVDIDITIDEGKSAKITDIE||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep SQYFNQATLNQAVAGLKEEYLGRGKLNIQITPKVTKLARNRVDIDITIDEGKSAKITDIE130 140 150 160 170 180190 200 210 220 230 240orf21.pepFEGNQVYSDRKLMRQMSLTEGGIWTWLTRSNQFNEQKFAQDMEKVTDFYQNNGYFDFRIL||||||||||||||||||||||||||||||::|::|||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep FEGNQVYSDRKLMRQMSLTEGGIWTWLTRSDRFDRQKFAQDMEKVTDFYQNNGYFDFRIL190 200 210 220 230 240250 260 270 280 290 300orf21.pepDTDIQTNEDKTKQTIKITVHEGGRFRWGKVSIEGDTNEVPKAELEKLLTMKPGKWYERQQ|||||||||||:||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep DTDIQTNEDKTRQTIKITVHEGGRFRWGKVSIEGDTNEVPKAELEKLLTMKPGKWYERQQ250 260 270 280 290 300310 320 330 340 350 360orf21.pepMTAVLGEIQNRMGSAGYAYSEISVQPLPNAETKTVDFVLHIEPGRKIYVNEIHITGNNKT|||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep MTAVLGEIQNRMGSAGYAYSEISVQPLPNAGTKTVDFVLHIEPGRKIYVNEIHITGNNKT310 320 330 340 350 360370 380 390 400 410 420orf21.pepRDEVVRRELRQMESAPYDTSKLQRSKERVELLGYFDNVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTE||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep RDEVVRRELRQMESAPYDTSKLQRSKERVELLGYFDNVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTE370 380 390 400 410 420430 440 450 460 470 480orf21.pepRSTGSLDLSAGWVQDTGLVMSAGVSQDNLFGTGKSAALRASRSKTTLNGSLSFTDPYFTA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep RSTGSLDLSAGWVQDTGLVMSAGVSQDNLFGTGKSAALRASRSKTTLNGSLSFTDPYFTA430 440 450 460 470 480490 500 510 520 530 540orf21.pepDGVSLGYDVYGKAFDPRKASTSIKQYKTTTAGAGIRMSVPVTEYDRVNFGLVAEHLTVNT||||||||:|||||||||||||:|||||||||:|:||::||||||||||||:||||||||orf21ng.pep DGVSLGYDIYGKAFDPRKASTSVKQYKTTTAGGGVRMGIPVTEYDRVNFGLAAEHLTVNT490 500 510 520 530 540550 560 570 580 590 600orf21.pepYNKAPKHYADFIKKYGKTDGTDGSFKGWLYKGTVGWGRNKTDSALWPTRGYLTGVNAEIA||||||:|||||:|||||||:|||||| |||||||||||||||| |||||||||||||||orf21ng.pep YNKAPKRYADFIRKYGKTDGADGSFKGLLYKGTVGWGRNKTDSASWPTRGYLTGVNAEIA550 560 570 580 590 600610 620 630 640 650 660orf21.pepLPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTFTLMLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVR||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep LPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTFTLMLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVR610 620 630 640 650 660670 680 690 700 710 720orf21.pepGYESGTLGPKVYDEYGEKISYGGNKKANVSAELLFPMPGAKDARTVRLSLFADAGSVWDG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep GYESGTLGPKVYDEYGEKISYGGNKKANVSAELLFPMPGAKDARTVRLSLFADAGSVWDG670 680 690 700 710 720730 740 750 760 770 780orf21.pepKTYDDNSSSATGGRVQNIYGAGNTHKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGPMKFSYAYPLKK:||::| :| :::|: |:||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep RTY----TAAENGNNKSVYSE-NAHKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGPMKFSYAYPLKK730740 750 760 770790orf21.pepKPEDEIQRFQFQLGTTF|||||||||||||||||orf21nG.pep KPEDEIQRFQFQLGTTFX780 790腦膜炎奈瑟球菌A血清群和B血清群在797個胺基酸重疊序列中顯示出99.9％的同一性102030405060orf21.pepMKLKQIASALMMLGISPLALADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFNYLPVKVGDTYNDTHGSA|||||||||||:||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep MKLKQIASALMVLGISPLALADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFNYLPVKVGDTYNDTHGSA102030405060708090 100 110 120orf21.pepIIKSLYATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSLNITGAKMLQNDAIKKNLESFGLAQ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep IIKSLYATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSLNITGAKMLQNDAIKKNLESFGLAQ708090 100 110 120130 140 150 160 170 180orf21.pepSQYFNQATLNQAVAGLKEEYLGRGKLNIQITPKVTKLARNRVDIDITIDEGKSAKITDIE||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep SQYFNQATLNQAVAGLKEEYLGRGKLNIQITPKVTKLARNRVDIDITIDEGKSAKITDIE130 140 150 160 170 180190 200 210 220 230 240orf21.pepFEGNQVYSDRKLMRQMSLTEGGIWTWLTRSNQFNEQKFAQDMEKVTDFYQNNGYFDFRIL||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21apepFEGNQVYSDRKLMRQMSLTEGGIWTWLTRSNQFNEQKFAQDMEKVTDFYQNNGYFDFRIL190 200 210 220 230 240250 260 270 280 290 300irf21.pepDTDIQTNEDKTKQTIKITVHEGGRFRWGKVSIEGDTNEVPKAELEKLLTMKPGKWYERQQ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep DTDIQTNEDKTKQTIKITVHEGGRFRWGKVSIEGDTNEVPKAELEKLLTMKPGKWYERQQ250 260 270 280 290 300310 320 330 340 350 360irf21pep MTAVLGEIQNRMGSAGYAYSEISVQPLPNAETKTVDFVLHIEPGRKIYVNEIHITGNNKT||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep MTAVLGEIQNRMGSAGYAYSEISVQPLPNAETKTVDFVLHIEPGRKIYVNEIHITGNNKT310 320 330 340 350 360370 380 390 400 410 420orf21.pepRDEVVRRELRQMESAPYDTSKLQRSKERVELLGYFDNVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTE||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep RDEVVRRELRQMESAPYDTSkLQRSKERVELLGYFDNVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTE370 380 390 400 410 420
430 440 450 450 470 480orf21.pepRSTGSLDLSAGWVQDTGLVMSAGVSQDNLFGTGKSAALRASRSKTTLNGSLSFTDPYFTA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep RSTGSLDLSAGWVQDTGLVMSAGVSQDNLFGTGKSAALRASRSKTTLNGSLSFTDPYFTA430 440 450 460 470 480490 500 510 520 530 540orf21.pepDGVSLGYDVYGKAFDPRKASTSIKQYKTTTAGAGIRMSVPVTEYDRVNFGLVAEHLTVNT||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep DGVSLGYDVYGKAFDPRKASTSIKQYKTTTAGAGIRMSVPVTEYDRVNFGLVAEHLTVNT490 500 510 520 530 540550 560 570 580 590 600orf21.pepYNKAPKHYADFIKKYGKTDGTDGSFKGWLYKGTVGWGRNKTDSALWPTRGYLTGVNAEIA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep YNKAPKHYADFIKKYGKTDGTDGSFKGWLYKGTVGWGRNKTDSALWPTRGYLTGVNAEIA550 560 570 580 590 600610 620 630 640 650 660orf21.pepLPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTFTLMLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVR||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep LPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTFTLMLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVR610 620 630 640 650 660670 680 690 700 710 720orf21.pepGYESGTLGPKVYDEYGEKISYGGNKKANVSAELLFPMPGAKDARTVRLSLFADAGSVWDG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep GYESGTLGPKVYDEYGEKISYGGNKKANVSAELLFPMPGAKDARTVRLSLFADAGSVWDG670 680 690 700 710 720730 740 750 760 770 780orf21.pepKTYDDNSSSATGGRVQNIYGAGNTHKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGPMKFSYAYPLKK||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep KTYDDNSSSATGGRVQNIYGAGNTHKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGPMKFSYAYPLKK730 740 750 760 770 780790orf21.pepKPEDEIQRFQFQLGTTF|||||||||||||||||orf21a.pep KPEDEIQRFQFQLGTTFX790高度的保守說明，單一的蛋白質可能會針對各種奈瑟球菌種類誘導免疫應答。
疫苗使上述鑑別的三種蛋白質表達，然後將它們用於免疫接種。觀察到針對這些蛋白質的良好的免疫應答。
組合疫苗此外，使這些蛋白質各自與針對其它病原生物體(如針對腦膜炎C血清群的Chiron多糖疫苗)的抗原混合，並用於免疫接種。觀察到良好的免疫應答。
另外的NmB組分雖然這種挪威OMV疫苗是有效的，但是它產生的保護作用受到製備它的菌株的限制。使用這種疫苗對青少年進行的臨床試驗的結果顯示，在29個月後僅獲得57.2％的有效率，雖然觀察到幾乎100％的患者有IgG應答〔如Rosenqvist等人(1995)，Infect.Immun.，634642-4652〕。
令人意外的是，已發現將另外確定的組分加到該挪威OMV疫苗中的做法明顯擴大了該疫苗的有效率。
挪威疫苗並沒有產生針對NmB 2996菌株的保護作用。將從2996菌株獲得的確定的蛋白質加到該挪威疫苗中，結果顯示該疫苗的藥學以令人驚訝的程度增加。而且，加入NmC多糖連接抗原〔如Costantino等人(1992)，Vaccine，10691-698〕獲得優異的結果。
下表給出這些組合物的殺菌活性

*使用3種不同的NmB抗原#1ORF1——如WO99/24578(還可參見WO99/55873)的實施例77#2＇287＇蛋白——如WO99/57280的圖21(還可參見SEQ ID 3103-3108)#3#1、#2和＇919＇蛋白在Al(OH)3中的混合物(本文的SEQ ID 14，還可參見WO99/57280的圖23和該文獻中的SEQ ID 3069-3074)可易於看出，通過加入從2996菌株獲得的確定的抗原，可克服該挪威OMV疫苗抗2996菌株的無效問題(組1)。使用NmB蛋白＇287＇的結果特別好。由此可改善該挪威疫苗，而不需由各種不同菌株製備OMV。
這種疫苗還提供了針對異源MenB菌株的保護作用。測試使用2996菌株蛋白質製得的相同的疫苗抗5種其它菌株的情況。滴度如下

*對照2996菌株、BZ133株和1000株＝由同源菌株製得的OMV；BZ232株＝由2996菌株製得的OMV；MC56和NGH38＝SEAM3。
另一研究使用從NmB2996菌株獲得的蛋白質添加到「挪威」OMV中——919蛋白，在大腸桿菌中表達，沒有任何融合配偶體——ORF1，在大腸桿菌中表達為His標記的融合蛋白——287蛋白，在大腸桿菌中表達為GST融合蛋白——這3種蛋白質的混合物，任選含有NmC偶聯物使用Al(OH)3作為這些製品的佐劑，進行殺菌測試，測試它們抗同源菌株的能力。結果如下

*該抗體抑菌而非殺菌。
使用抗原287進行的進一步的工作進一步研究挪威OMV與抗原287的組合物。將20μg的287抗原和挪威OMP疫苗(15μg OMP+Al(OH)3〕混合，用所得混合物對小鼠進行免疫。在殺菌測試中測試抗體，結果發現它能有效抗所有測試的菌株。結果如下

因此，幾乎在大多數例子中，OMV+287蛋白的組合令人驚訝地產生比單獨的OMV要好的結果。
重組的OMV轉化大腸桿菌，使其表達ORF1、ORF40和ORF46。由重組的大腸桿菌製得的OMV能誘導針對腦膜炎奈瑟球菌的殺菌性抗體。
ORF1、ORF40和ORF46(2996菌株)在大腸桿菌中表達為His標記的融合蛋白質，並以純蛋白質的形式或者OMV的形式製得它們。使用2996菌株作為攻擊源測試針對這兩種製品的殺菌滴度

還測量了使用異源攻擊菌株的殺菌滴度。純化的ORF46抗MC58株的滴度是4096，其OMV形式抗MC58的滴度升高到32000。純化的ORF1抗NmA F6124株的滴度是128，其OMV形式抗此菌株的滴度升高到512。純化的ORF40抗MC58株的滴度是512，其OMV形式是這個滴度的兩倍。
這些數據顯示，當在大腸桿菌中將NmB抗原製成OMV形式時，它們保留了免疫原性，而且該免疫原性實際上被提高。
可以理解，本申請僅通過實施例的方式描述本發明，在不偏離本發明的範圍和精神的情況下可對本發明進行修改。
序列表序列表110啟龍股份公司(CHIRON SpA)120含有腦膜炎奈瑟球菌B血清群外膜蛋白質的外膜囊(OMV)疫苗130P023785WO1412001-01-17150GB-0001067.81512000-01-17150GB-0005699.41512000-03-0916014170SeqWin99，version1.02210121115212PRT213腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)4001Asp Phe Thr Ile Gln Asp Ile Arg Val Glu Gly Leu Gln Arg Thr1 5 10 1521022112394212DNA213腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)4002atgaaactga aacagattgc ttccgcactg atgatgttgg gcatatcgcc tttggcactt 60gccgacttca ccatccaaga catccgcgtc gaaggcttgc agcgtaccga gccgagtacc 120gtattcaact acctgcccgt caaagtcggc gacacctaca acgacacaca cggcagtgcc 180atcatcaaaa gcctgtacgc caccggtttc tttgacgacg tacgcgtcga aactgcggac 240gggcagctcc tgctgaccgt tatcgaacgc cccaccatcg gctcgctcaa catcaccggc 300gcaaaaatgc tgcaaaacga cgccattaag aaaaacctcg aatcgttcgg gctggcgcag 360tcgcaatact ttaatcaggc gacactcaat caggcagtcg ccggcctgaa agaagaatac 420ctcgggcgcg gcaaactcaa tatccaaatc acgcccaaag taaccaaact cgcccgcaac 480cgcgtcgaca tcgacatcac gattgacgag ggcaaatccg ccaaaatcac cgacatcgaa 540tttgaaggca accaagtcta ttccgaccgc aaactgatgc ggcaaatgtc cctgaccgaa 600ggcggcattt ggacatggct gacacgaagc aaccaattca acgagcagaa atttgcccaa 660gatatggaaa aagtaaccga cttctaccaa aataacggct acttcgattt ccgtatcctc 720gataccgaca tccaaaccaa cgaagacaaa accaagcaga ccatcaaaat caccgtccac 780gaaggcggac gtttccgttg gggcaaagtc tccatcgaag gcgacaccaa cgaagtcccc 840aaagccgaac tggaaaaact gctgaccatg aagcccggca aatggtacga acgccagcag 900atgaccgccg ttttgggtga gattcagaac cgcatgggct cggcaggcta cgcatacagc 960gaaatcagcg tacagccgct gccgaacgct gaaaccaaaa ccgtcgattt cgtcctgcac 1020atcgaaccgg gccggaaaat ctacgtcaac gaaatacaca tcaccggcaa caacaaaacc 1080cgcgacgaag tcgtccgccg tgaattacgc caaatggaat ccgcacctta cgacacctcc 1140aagctgcaac gttccaaaga gcgcgtcgag cttttgggct acttcgacaa tgtccagttt 1200gatgctgtcc cgcttgccgg cacgcccgac aaagtcgatt tgaacatgag tctgaccgaa 1260cgttccaccg gttccctgga tttgagcgcg ggttgggttc aagataccgg gttggtcatg 1320tccgcaggcg tttcccaaga caacctgttc ggtacgggca agtcggccgc actgcgcgcc 1380tccaggagca aaaccacgct taacggctcg ctgtcgttta ctgacccgta 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2280gttacctggc tctcgccttt aggcccgatg aaattcagct acgcctaccc gctgaagaaa 2340aaaccggaag acgaaatcca acgcttccaa ttccaactcg gcacgacgtt ctaa 23942103211797212PRT213腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)4003Met Lys Leu Lys Gln Ile Ala Ser Ala Leu Met Met Leu Gly Ile Ser1 5 10 15Pro Leu Ala Leu Ala Asp Phe Thr Ile Gln Asp Ile Arg Val Glu Gly20 25 30Leu Gln Arg Thr Glu Pro Ser Thr Val Phe Asn Tyr Leu Pro Val Lys35 40 45Val Gly Asp Thr Tyr Asn Asp Thr His Gly Ser Ala Ile Ile Lys Ser50 55 60Leu Tyr Ala Thr Gly Phe Phe Asp Asp Val Arg Val Glu Thr Ala Asp65 70 75 80Gly Gln Leu Leu Leu Thr Val Ile Glu Arg Pro Thr Ile Gly Ser Leu85 90 95Asn Ile Thr Gly Ala Lys Met Leu Gln Asn Asp Ala Ile Lys Lys Asn100 105 110Leu Glu Ser Phe Gly Leu Ala Gln Ser Gln Tyr Phe Asn Gln Ala Thr115 120 125Leu Asn Gln Ala Val Ala Gly Leu Lys Glu Glu Tyr Leu Gly Arg Gly130 135 140Lys Leu Asn Ile Gln Ile Thr Pro Lys Val Thr Lys Leu Ala Arg Asn145 150 155 160Arg Val Asp Ile Asp Ile Thr Ile Asp Glu Gly Lys Ser Ala Lys Ile165 170 175Thr 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權利要求
1.一種組合物，它含有(a)腦膜炎奈瑟球菌B血清群的外膜製劑，和(b)一種或多種下列免疫原性成分·WO99/57280中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO99/36544中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO99/24578中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO99/66791中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·Tettelin等人〔Science(2000)，2871809-1815〕公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO97/28273中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO96/29412中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO95/03413中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO99/31132中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO99/58683中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO99/55873中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·腦膜炎奈瑟球菌PorA蛋白、TbpA蛋白、TbpB蛋白、PilC蛋白、OpA蛋白、Omp85蛋白。
2.如權利要求1所述的組合物，其特徵在於，所述成分(b)是NmB蛋白質。
3.如權利要求2所述的組合物，其特徵在於，所述NmB蛋白質是919蛋白、235蛋白、519蛋白、225蛋白、ORF40蛋白、287蛋白、ORF1、ORF4或ORF46。
4.如前述權利要求中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述成分(b)包括從獲得所述成分(a)的不同的NmB菌株獲得的蛋白質。
5.如前述權利要求中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述組合物的一種或多種成分被吸附在Al(OH)3上。
6.如前述權利要求中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述成分(a)含有OMV。
7.如權利要求6所述的組合物，其特徵在於，所述OMV是NmB的脫氧膽酸鹽抽提物。
8.如前述權利要求中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述成分(a)被吸附在Al(OH)3上。
9.如前述權利要求中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述組合物還含有一種或多種下述成分·抗腦膜炎奈瑟球菌A血清群的保護性抗原；·抗腦膜炎奈瑟球菌C血清群的保護性抗原；·抗腦膜炎奈瑟球菌Y血清群的保護性抗原；·抗腦膜炎奈瑟球菌W血清群的保護性抗原；·抗流感嗜血桿菌的保護性抗原；·抗肺炎球菌的保護性抗原；·抗白喉的保護性抗原；·抗破傷風的保護性抗原；·抗百日咳的保護性抗原；·抗幽門螺桿菌的保護性抗原；·抗脊髓灰質炎的保護性抗原；和/或·抗B型肝炎病毒的保護性抗原。
10.如前述權利要求中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述組合物是疫苗。
11.如前述權利要求中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述組合物可用作藥劑。
12.前述權利要求中任一項所述的組合物在製備下列藥劑中的應用(i)治療或預防奈瑟球菌感染的藥劑；(ii)檢測奈瑟球菌或抗奈瑟球菌的抗體的診斷用試劑；(iii)可產生針對奈瑟球菌的抗體的試劑。
13.一種治療患者的方法，它包括向該患者給予治療有效量的權利要求1-10中任一項所述的組合物。
14.一種細菌外膜製劑，它含有下述一種或多種免疫原性成分·WO99/57280中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO99/36544中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO99/24578中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO99/66791中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·Tettelin等人〔Science(2000)，2871809-1815〕公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO97/28273中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO96/29412中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO95/03413中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO99/31132中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO99/58683中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·WO99/55873中公開的蛋白質或其免疫原性片段；·腦膜炎奈瑟球菌PorA蛋白、TbpA蛋白、TbpB蛋白、PilC蛋白、OpA蛋白、Omp85蛋白。
全文摘要
含有(a)腦膜炎奈瑟球菌B血清群(Neisseria meningitidis serogroup B，NmB)外膜囊(OMV)和(b)選自其它奈瑟球菌蛋白質的免疫原性成分或其免疫原性片段的組合物。成分(b)較佳包括獲得成分(a)的OMV的不同NmB菌株的蛋白質。較佳通過脫氧膽酸鹽抽提法獲得所述OMV。任選地，該組合物還可含有抗其它病原體的保護性抗原。
文檔編號A61K39/116GK1416352SQ01805920
公開日2003年5月7日 申請日期2001年1月17日 優先權日2000年1月17日
發明者M·皮扎, R·拉普奧利, M·朱利亞尼 申請人:啟龍股份公司