小核酸的檢測的製作方法

2023-07-29 19:36:01

專利名稱：小核酸的檢測的製作方法
技術領域：
本發明涉及幹擾RNA(例如微小RNA(miRNA)和小幹擾RNA(siRNA))和其它短核酸分子的組合物及其檢測和表徵地方法。更加特別地，本發明涉及幹擾RNA表達的檢測和定量分析的改進的方法。本發明更進一步地提供了miRNA和siRNA的變異體和類型的檢測。
背景技術：
微小RNA(miRNA)是一種新類型的非編碼RNA，無脊椎動物和脊椎動物基因組中它們被編碼為短的反向重複序列(Ambros，(2001)細胞(Cell)107，823-826；Moss(2002)當代生物學(Curr Biol)12，R138-R140)。miRNA是靶mRNA翻譯和穩定性的調節子，儘管多數靶mRNA有待鑑定。miRNA通過結合於3′端非翻譯區域(UTRs)中反義互補位點序列特異性地控制靶mRNA的翻譯(Ambros，如前；Moss，如前；Lagos-Quintana等人，(2001)科學(Science)294，853-858；Lau等人，(2001)科學(Science)294，858-862；Lee等人，(2001)科學(Science)294，862-864)。
一些miRNA，例如let-7RNA、miR-1、miR-34、miR-60和miR-87，在無脊椎動物和脊椎動物之間是高度保守的，暗示它們可以識別推測保守功能的多重位點和/或多重靶(Lagos-Quintana等人，如前；Lau等人，如前；Lee等人，如前；Pasquinelli等人，(2000)自然(Nature)40886)。小暫時RNA(stRNA)lin-4和let-7代表了通過華麗新小杆線蟲(Caenorhabditis elegans)的基因分析鑑定出來的miRNA的一個亞型(subclass)，它們是受發育調節的並且它們自己控制發育程序，例如神經再接(neuronal rewiring)的時間選擇、Daucer幼蟲的形成、陰戶形成以及皮下細胞的終末分化。
miRNA一般是從60或70個核苷酸折返(foldback)RNA前體結構剪切來的，它們有時候在miRNA前體的表達開始時(Grishok等人，(2001)細胞(Cell)106，23-34；Hutvagner等人(2001)科學(Science)93，834-838；Ketting等人，(2001)基因發育(Genes Dev)15，2654-2659)或非常豐富的miRNA的表達過程中(Lagos-Quintana等人，如前；Lau等人，如前；Lee等人，如前)被檢測到。通常，只有髮夾前體分子的一條鏈被剪切並且蓄積，推測大概是因為它被相關蛋白質保護而免受RNA降解。這些推測的蛋白質可以介導翻譯的抑制。miRNA前體處理反應需要Dicer RNAsein和Argonaute家族成員(Grishok等人，如前；Hutvagner等人，如前；Ketting等人，如前)。
除了它們對基因表達的影響外，這些通常在21-22個核苷酸範圍內的小RNA，可以在治療和藥物發現領域內找到用途，例如作為藥物靶或作為藥劑。因而，在一些情形下，了解細胞中大約多少個每種miRNA存在是重要的。在一些情況下，更進一步地比較不同組織類型中或例如化學或物理幹預的刺激劑應用之前和之後miRNA的水平是重要的。因為有關的siRNA和miRNA在細胞中可以以很低的量存在，期望既敏感又特異的檢測方法。此外，對於某些應用，鑑定適合於高通量篩選的方法例如均相測定法、複合測定法或適合於高度平行自動化操作和有限制的溫度變化的那些方法是有利的。
儘管miRNA在基因表達的調節中有很重要的作用，一直缺乏miRNA表達的檢測和定量分析的有效技術。至今，用於miRNA定量分析的主要方法以凝膠電泳為基礎。所述miRNA通過Northern印跡或通過放射性抗RNase雙體(duplexes)的存在進行檢測。Northern印跡和晶片雜交法具有相對低的分析敏感性(Krichevsky等人2003)，所以需要微克質量的RNA用於檢測；此外，小RNA轉移到過濾器能夠引發定量分析重現性的問題，並且一般不可修正用於高通量。此外，基於RNase抗性的檢測方法需要高放射性的探針。更進一步地，只是基於探針雜交的方法不會提供序列密切相關的同型物之間的足夠的區別。替代的方法包括克隆所述miRNA，然後對所述插入體測序。雖然這個方法適合於分辨密切相關的miRNA種類之間單個鹼基的差別，但是它耗時且耗力。
象miRNA一樣，小幹擾RNA(siRNA)是經由稱為RNA幹擾(RNAi)(Cullen，B.R.，自然免疫學(Nature Immunology)，3597-599(2002))的反應參與細胞防禦的小RNA分子，例如抗病毒RNA。一類siRNA通過Dicer酶和RNA誘導的沉默複合物(RISC)蛋白質複合物的作用而產生，作為響應於細胞內雙鏈RNA存在的所述RNAi的一部分(Khvorova，A.等人，細胞(cell)115209-216(2003))。另一類siRNA是合成的，包含通常有特徵性的二核苷酸伸出端的21-23個核苷酸的短雙體，經由轉染或從引入載體的表達直接引入細胞(Elbashir，S.M.等人，歐洲分子生物學會雜誌(EMBO J.)206877-6888(2001))(Paul，C.P.等人，自然生物技術(NatureBiotechnology)20505-508(2002)，美國專利申請公開號2003/01481519A1，為了所有的目的此處整體引用作為參考)。在一些情況下，siRNA似乎一直是明確的序列，使得它們在功能和組成上與miRNA相似(Elbashir，S.M.等人，如前)。所需要的是檢測和定量分析miRNA和siRNA水平有效的並且精確的方法。
發明概述
本發明涉及小核酸(例如幹擾RNA和其它短核酸分子)的組合物及其檢測和表徵的方法。更加特別地，本發明涉及幹擾RNA表達的檢測和定量分析的改進的方法。
例如，本發明提供了一種方法，包括為了產生一個檢測結構，將至少一種核酸(例如含有不互補於幹擾RNA的序列的那個核酸)雜交於幹擾RNA靶，以及檢測所述檢測結構。在一些實施方案中，所述幹擾RNA靶是miRNA。在其它的實施方案中，所述幹擾RNA靶是siRNA。在一些實施方案中，所述siRNAs是雙鏈。
在一些實施方案中，所述檢測結構包含侵入性切割結構(invasivecleavage structure)。例如，在一些實施方案中，所述核酸包含為了形成聯合miRNA的侵入性切割結構而配置(configured)的第一和第二寡核苷酸。在一些實施方案中，所述核酸包含為了形成聯合所述miRNA的侵入性切割結構而配置的第一寡核苷酸。在一些實施方案中，所述第一寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述3′部分為了雜交於所述靶序列而配置，並且其中所述5′部分為了不雜交於所述靶序列而配置。在一些採用第二寡核苷酸的實施方案中，所述第二寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述5′部分為了雜交於所述靶序列而配置，並且其中所述3′部分為了不雜交於所述靶序列而配置。在一些實施方案中，所述檢測步驟包括INVADER試驗的使用。
在一些實施方案中，所述檢測結構包含雜交於所述小RNA的環狀寡核苷酸以產生環形檢測結構。在一些實施方案中，所述檢測步驟包含滾環複製試驗。
在一些實施方案中，所述檢測步驟包括檢測試驗的使用，包括但不限於測序試驗、聚合酶鏈式反應試驗、雜交試驗、採用互補於突變的探針的雜交試驗、微陣列試驗、珠子陣列試驗、引物延伸試驗、酶錯配切割試驗、分支雜交試驗、NASBA試驗、分子信標試驗、循環探針試驗、連接酶鏈式反應試驗、侵入性切割結構試驗、ARMS試驗以及夾心雜交試驗。在一些優選的實施方案中，所述檢測步驟在細胞裂解物中進行。
在一些實施方案中，本發明的方法包含檢測第二核酸靶。在一些優選的實施方案中，所述第二核酸靶是RNA。在一些特別優選的實施方案中，所述第二核酸靶是U6 RNA或GADPH mRNA。
在一些實施方案中，用於形成檢測結構的核酸包含具有充分互補於小RNA的一個或多個位點的模板，以便於允許所述RNA雜交於所述模板並且在延伸反應中被延伸。在一些實施方案中，所述延伸反應是聚合酶鏈式反應，其中一個或多個RNA被用作聚合酶鏈式反應中的引物。在一些這樣的實施方案中，為了提供聚合酶鏈式反應的引物，單一類型的RNA結合於模板上的兩個位置。在其它的實施方案中，兩個或兩個以上的RNA被用作引物。在這樣的實施方案中，擴增產物的檢測表示樣品中所述的兩個或多個RNA的存在(即miRNA複合試驗(miRNA multiplex assay))。相似的方法可被用於連接酶鏈式反應，這裡所述miRNA被用作連接的寡核苷酸。
在一些實施方案中，所述方法包含多種miRNA的檢測。在一些這樣的實施方案中，多種miRNA包含相同miRNA的多態性。在其它的實施方案中，多種miRNA包含不同的miRNA(例如Let-7、miR-1、miR-1d、miR-135、miR-15、miR-16、miR-124a或miR125b)。
本發明也提供了用於實施上面方法中任何一個的試劑盒。例如，在一些實施方案中，本發明提供了包含為了當雜交於RNA靶序列時形成檢測結構而配置的核酸的試劑盒。在一些實施方案中，所述試劑盒為了檢測miRNA而配置。在一些優選的實施方案中，所述試劑盒為了檢測Let-7、miR-1、miR-135、miR-15、miR-16、miR1b、miR-124a或miR125b的miRNA而配置。在一些優選的實施方案中，所述試劑盒為了共檢測第二RNA靶和miRNA靶而配置。


圖1顯示單個反應中檢測兩個不同等位基因(例如一個核苷酸的不同)的INVADER寡核苷酸、探針寡核苷酸和螢光共振能量轉移(FRET)盒的示意圖。
圖2顯示用於本發明一些實施方案中所用的示例性檢測結構。
圖3顯示用於本發明一些實施方案中所用的第二示例性檢測結構。
圖4顯示用於本發明一些實施方案中所用的第三示例性檢測結構。
圖5顯示用於本發明的示例性寡核苷酸。所述靶miRNA的鹼基為加下劃線的小寫。探針或INVADER寡核苷酸中的DNA殘基是正常字體的。小寫字體指出了2′-氧-甲基的殘基。
圖6顯示let-7的溫度最優化實驗的結果。
圖7顯示let-7的溫度最優化實驗的結果。
圖8顯示let-7的檢測限(LOD)實驗的結果。
圖9顯示使用let-7 miRNA的交叉反應性實驗的結果。
圖10顯示miR-1 LOD實驗的結果。
圖11顯示使用let-7 miRNA的CLEAVASE酶IX和XII比較的結果。
圖12顯示來自各種微生物的U6 RNA序列的部分序列比對。
圖13顯示mir-135的溫度最優化實驗的結果。
圖14顯示mir-135 LOD實驗的結果。
圖15含有細胞裂解物中let-7的檢測得到的平均計數的圖形表示。
圖16顯示經過或者未經過RNAse A處理的細胞裂解物中miRNA和mRNA的結果。
圖17顯示比較包括了全長的對於截短的捕集寡核苷酸的作用之侵入性切割試驗的結果。
圖18顯示使用圖16中描述的試驗設計的溫度最優化實驗的結果。
圖19顯示了使用10聚體探針和12聚體INVADER寡核苷酸設計的溫度最優化實驗的結果。
圖20顯示比較了兩個替代性寡核苷酸設計的LOD實驗的結果。
圖21顯示比較了將探針和INVADER寡核苷酸中一些或所有2′-氧-甲基殘基取代為2′-脫氧殘基的作用的結果。
圖22顯示檢測miR-124a的侵入性切割試驗的結果。
圖23顯示檢測分離自20個不同組織類型的總RNA中五種不同miRNA種類的實驗的結果。
圖24顯示測試改變的探針和寡核苷酸長度對miRNA檢測的作用的實驗結果。
圖25顯示為了siRNA檢測示例性侵入性切割寡核苷酸設計。小寫殘基表示2′-O-甲基。
定義
為了方便對本發明的理解，許多術語和短語定義如下
如此處使用地，術語「miRNA」指的是微小RNA。如此處使用的，術語「miRNA靶序列」指的是待檢測的miRNA(例如，在其它核酸的存在下)。在一些實施方案中，miRNA靶序列是miRNA的變異體。
如此處使用地，術語「RNA檢測結構」指的是通過核酸(例如，寡核苷酸)雜交於RNA靶，例如miRNA或siRNA，而形成的結構。在一些實施方案中，所述核酸是單核酸(例如，有一個小區域(或一些區域)同源於所述miRNA的較大的核酸)。在其它的實施方案中，所述核酸包含兩種核酸(例如，雜交於所述miRNA以形成髮夾(例如，單或雙髮夾)結構的核酸)。在優選的實施方案中，miRNA檢測結構是能夠使用已知的核酸檢測方法進行檢測的，包括但不限於此處公開的那些結構。
在一些實施方案中，RNA檢測結構在雜交步驟之後被更進一步地修飾。例如，在一些實施方案中，雜交於所述RNA的所述核酸提供了用於通過核酸聚合酶延伸所述RNA的模板。所述RNA雜交於所述核酸並且然後使用所述聚合酶進行延伸。在其它的實施方案中，所述核酸起額外的核酸與所述RNA雜交和連接的模板作用。
術語「siRNA」指的是短幹擾RNA。在一些實施方案中，siRNA包含一個雙體或雙鏈區域，這裡所述雙鏈區域的每一個鏈大約18至25個核苷酸長；所述雙鏈區域能短至16個並長至29個鹼基對，這裡所述長度由所述反義鏈決定。通常siRNA在每一個鏈的3′末端含有大約兩個至四個非配對的核苷酸。siRNA似乎在非脊椎動物和在脊椎動物中起引發RNA幹擾以及在植物中在轉錄後基因沉默過程中起引發序列特異性RNA降解的關鍵中間物的作用。至少siRNA的雙體或雙鏈區域的一條鏈基本上同源於或基本上互補於靶RNA分子。互補於靶RNA分子的鏈是「反義」鏈；同源於靶RNA分子的鏈是「有義」鏈並且也互補於所述siRNA反義鏈。所述雙鏈區的一條鏈不需要是相對鏈的精確長度，因而，一條鏈可以具有比相對鏈至少少1個核苷酸，形成相對鏈中的「泡」或相對鏈至少一個未配對的鹼基。所述雙鏈區域的一個鏈不需要精確地互補於所述相對鏈；因而，所述鏈(優選地所述有義鏈)可具有至少一個錯配鹼基對。
siRNA也含有額外的序列；這樣的序列的非限制性實例包括連接序列或環，它們將所述雙體區域的兩個鏈連接起來。siRNA的這個形式可以指的是「si樣RNA」、「短髮夾siRNA」，(這裡所述的短指的是所述siRNA的雙體區域)或「髮夾siRNA」。siRNA中存在的額外序列的另外的非限制性實例包括莖和其它摺疊結構。所述額外序列可以有或可以沒有已知的功能；這樣的功能之非限制性實例包括siRNA分子增加的穩定性，或者提供細胞目的(destination)信號。
如此處使用地，術語「研究對象」和「患者」指的是任何生物體，包括植物、微生物和動物(例如哺乳動物例如狗、貓、家畜和人)。
如此處使用地，術語「INVADER試驗試劑」或「侵入性切割試驗試劑」指的是檢測靶序列的一個或多個試劑，所述試劑包含在靶序列存在下能夠形成侵入性切割結構的寡核苷酸。在一些實施方案中，所述INVADER試驗試劑更進一步地包含檢測侵入性切割結構(例如切割試劑)存在的試劑。在一些實施方案中，所述寡核苷酸包含第一和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含互補於靶核酸第一區域的5′部分，所述5′部分互補於位於第一部分下遊並且鄰近第一部分的靶核酸的第二區域。在一些實施方案中，第二寡核苷酸的所述3′部分包含不互補於靶核酸的3′末端核苷酸。在優選的實施方案中，所述第二寡核苷酸的3′部分由不互補於靶核酸的單核苷酸組成。在一些實施方案中，第一和第二寡核苷酸互相共價偶聯(例如通過連接子)。
在一些實施方案中，所述INVADER試驗試劑更進一步地包含固相支持物。例如，在一些實施方案中，所述試驗試劑的一個或多個寡核苷酸(例如第一和/或第二寡核苷酸，橋接的或非橋接的)附著於所述固相支持物。在一些實施方案中，所述INVADER試驗試劑更進一步地包含緩衝溶液。在一些優選的實施方案中，所述緩衝溶液包含二價陽離子的來源(例如Mn2+和/或Mg2+離子)。共同構成INVADER試驗試劑的單獨成分(例如寡核苷酸、酶、緩衝液、靶核酸)被稱為「INVADER試驗試劑組分」。
在一些實施方案中，所述INVADER試驗試劑更進一步地包含第三寡核苷酸，其互補於第一靶核酸第一部分上遊的靶核酸第三部分。然而在其它的實施方案中，所述INVADER試驗試劑更進一步地包含靶核酸。在一些實施方案中，所述INVADER試驗試劑更進一步地包含第二靶核酸。然而在其它的實施方案中，所述INVADER試驗試劑更進一步地包含第三寡核苷酸，其包含互補於第二靶核酸第一區域的5′部分。在一些具體實施方案中，第三寡核苷酸的3′部分共價聯接於第二靶核酸。在其它具體實施方案中，第二靶核酸更進一步地包含5′部分，其中第二靶核酸的所述5′部分是第三寡核苷酸。在其它的實施方案中，所述INVADER試驗試劑更進一步地包含ARRESTOR分子(例如ARRESTOR寡核苷酸)。
如Eis等人，自然生物工程(Nature Biotechnology)，19673-676(2001)中描述地，完全鹼基配對於每個探針的靶特異性區域並且部分配對於其5′flap區域的2′氧-甲基化的ARRESTOR寡核苷酸的包括，隔離了未切割的探針並且阻止了次級反應中X-結構的形成(此處整體引用作為參考)。
在一些優選的實施方案中，所述INVADER試驗試劑更進一步地包含檢測核酸切割產物的試劑。在一些實施方案中，所述INVADER試驗試劑中的一個或多個寡核苷酸包含標記物。在一些優選的實施方案中，所述第一寡核苷酸包含標記物。在其它優選的實施方案中，所述第三寡核苷酸包含標記物。在特別優選的實施方案中，所述試劑包含用產生螢光共振能量轉移(FRET)作用的基團標記的第一和/或第三寡核苷酸。
在一些實施方案中，一個或多個所述INVADER試驗試劑以分發前(predispensed)的形式(即，用在沒有重新測定或重新分發的程序中一個步驟的測定前的(premeasured))形式提供。在一些實施方案中，選擇的INVADER試驗試劑組分是「混合的」和「分發前的」在一起的。在優選的實施方案中，分發前的試驗試劑組分是分發前的，並且提供在一個反應容器裡(包括但不限於反應試管或例如微量滴定平板中的孔)。在特別優選的實施方案中，分發前的INVADER試驗試劑組分在反應容器中是經乾燥的(例如，脫水的或冷凍乾燥的)。
在一些實施方案中，所述INVADER試驗試劑可提供為試劑盒。如此處使用的，術語「試劑盒」指的是遞送物質的任何遞送系統。在反應試驗的上下文中，這樣的遞送系統包括允許反應試劑(例如，適當容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持物質(例如，緩衝液，執行試驗的書面說明書等等)從一個地點到另一個地點的儲存、運輸或遞送的系統。例如，所述試劑盒包括一個或多個含有相關反應試劑和/或支持物質的包封物(例如，盒子)。如此處使用的，術語「分開的(fragmented)試劑盒」指的是包含兩個或兩個以上分開的容器的遞送系統，其中每一個容器含有全部試劑盒組分的一個亞部分。所述容器被一起或分別遞送到預期的接受器。例如，第一容器可含有用於試驗的酶，而第二容器含有寡核苷酸。術語「分開的試劑盒」意在包括但不限於含有在聯邦食物、藥物和化妝品法案第520章節調控下的分析物特異性試劑(ASR’s)的試劑盒。當然，任何包含兩個或兩個以上分開的容器的遞送系統都包括在術語「分開的試劑盒」之中，其中每個所述容器含有全部試劑盒組分的一個亞部分。相反，「聯合的試劑盒」指的是在單個容器中含有一個反應試驗的所有組分的遞送系統(例如，容納了每一個期望的組分的單個盒)。術語「試劑盒」包括分開的和聯合的試劑盒。
在一些實施方案中，本發明提供了包含一個或多個實施本發明需要的組分的INVADER試驗試劑盒。例如，本發明提供了用於儲存或遞送實行INVADER試驗所需酶和/或反應組分的試劑盒。所述試劑盒可以包含試驗所需或期望的任何和全部組分，包括但不限於，所述試劑本身、緩衝液、對照試劑(例如，組織樣品、陽性和陰性對照靶寡核苷酸等等)、固態支持物、標記物、書面和/或圖示說明書和產品信息、抑制劑、標記的和/或檢測試劑、包裝環境控制物(例如，冰、乾燥劑等等)等等。在一些實施方案中，所述試劑盒提供了一亞套必需的組分，其中預期使用者將提供剩餘的組分。在一些實施方案中，所述試劑盒包含兩個或兩個以上獨立的容器，其中每個容器收藏了待遞送的一亞套所述組分。例如，第一容器(例如，盒子)可以含有酶(例如，合適的儲存緩衝液和容器中結構特異性切割酶)，而第二個盒子可以含有寡核苷酸(例如，INVADER寡核苷酸、探針寡核苷酸、對照靶寡核苷酸等等)。
如此處使用的術語「標記物」指的是能被用來提供可檢測(優選定量的)的作用並且能附著於核酸或蛋白質的任何原子或分子。所述標記物包括但不限於染料；放射標記物(例如32P)；結合基團(例如生物素)；半抗原例如digoxgenin；發光的、發磷光的或發螢光的基團；質量標籤以及螢光染料，單獨或與能通過螢光共振能量轉移(FRET)抑制或移動發射譜的基團聯合。所述標記物可以提供通過螢光、放射活性、比色法、重量測定、X射線衍射或吸收、磁力、酶活性、受質量影響的質量或行為的特徵(例如，MALDI時間飛行質譜；螢光偏振)等等可檢測的信號。標記物可以是帶電荷的基團(正或負電荷)或可以是電中性的。所述標記物可包括核酸或蛋白質序列或由其組成，只要包含所述標記物的序列是可檢測的。
如此處使用地，涉及信號的術語「截然不同的」指的是能互相區分的信號，例如通過質譜特性例如螢光發射波長、顏色、吸光度、質量、大小、螢光偏振特性、電荷等等，或者通過與另一個基團相互作用的能力，例如與化學試劑、酶、抗體等等。
如此處使用地，術語「互補的」或「互補」用於指因鹼基配對法則而相關的多核苷酸(即，例如寡核苷酸或靶核酸的核苷酸序列)。例如，對於序列″5′-A-G-T-3′″互補於序列″3′-T-C-A-5′″。互補可以是「部分」的，其中只有一些核酸的鹼基根據鹼基配對法則是配對的。或者，核酸之間可以有「完全的」或「全部的」互補。核酸鏈之間互補的程度對核酸鏈之間雜交的效率和強度有顯著的作用。這個在擴增反應以及依賴於核酸之間結合的檢測方法中特別重要。任一個術語也可用於涉及單獨的核苷酸，尤其是在多核苷酸的上下文中。例如，與餘下的所述寡核苷酸和所述核酸鏈之間的所述互補相對照或相比較，寡核苷酸中特別的核苷酸因其互補於或缺乏互補於另一個核酸鏈中的核苷酸而被注意。
術語「同源性」和「同源的」指的是相同的程度。可以有部分同源性或完全同源性。部分同源的序列是一個序列與另外一個序列少於100％的相同。
如此處使用地，術語「雜交」用於指互補的核酸的配對。雜交和雜交的強度(即，所述核酸之間聯合的強度)受例如所述核酸之間互補的程度、有關條件的嚴格性和形成之雜合體的Tm等因素的影響。「雜交」方法包括一個核酸與另一個互補核酸(即具有互補核苷酸序列)的核酸的退火。含有互補序列的核酸的兩個多聚體互相尋找並且通過鹼基配對相互作用退火的能力是廣泛驗證的現象。Marmur和Lane，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 46453(1960)和Doty等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 46461(1960)對「雜交」過程的最初觀察之後，該方法被精煉成現代生物學的基本工具。
如此處使用的核酸序列的互補物指的是一種寡核苷酸，當與核酸序列比對使一個序列的5′末端與另一個序列的3′末端配對時，所述寡核苷酸處於「反平行的結合」。天然核酸中平常找不到的某些鹼基可以包括在本發明的核酸之中，包括例如次黃嘌呤和7-去氮鳥嘌呤(deazaguanine)。互補不需要是完美的(perfect)；穩定的雙體可以含有誤配的鹼基對或未匹配的鹼基。核酸技術領域內的技術人員根據經驗考慮包括如下的許多變量就能夠確定雙體穩定性，例如寡核苷酸的長度、鹼基組成和寡核苷酸的序列、離子強度和誤配鹼基對的發生率。
如此處使用地，術語「Tm」用於指「熔化溫度」。所述熔化溫度是一群雙鏈核酸半數解離為單鏈的溫度。一些計算核酸Tm的方程在本領域是眾所周知的。如標準參考文獻指出地，當核酸在1M NaCl水溶液中時(見例如，Anderson和Young，核酸雜交中的定量過濾雜交(Quantitative Filter Hybridization，in Nucleic Acid Hybridization)(1985))，Tm值的簡單估計可以通過方程Tm＝81.5+0.41(％G+C)進行計算。其它的參考文獻(例如Allawi和SantaLucia，生物化學(Biochemistry)3610581-94(1997))包括更加複雜的計算，對於Tm的計算它考慮了結構和環境以及序列特徵。
術語「基因」指的是包含有非編碼功能的RNA(例如，核糖體或轉運RNA)、多肽或前體的產生必需的控制和編碼序列的DNA序列。所述RNA或多肽能由全長編碼序列或者由所述編碼序列的任何部分進行編碼，只要期望的活性或功能被保存。
術語「野生型」指的是從天然發生的來源分離時具有的基因或基因產物的特徵之基因或基因產物。野生型基因是最頻繁地在一個群體中觀察到，並且因而被主觀地指定為基因的「正常的」或「野生型」形式。相反，術語「修飾的」、「突變的」或「多態性的」指的是當與野生型基因或基因產物比較時，顯示了序列和/或功能特性的修飾(即改變的特性)的基因或基因產物。值得注意的是天然發生的突變體可以是分離的；這些突變體通過它們與野生型基因或基因產物比較時具有改變的特徵之事實而被鑑定。
如此處使用的術語「重組DNA載體」指的是含有期望的異源序列的DNA序列。例如，儘管所述術語不局限於表達的序列或編碼表達產物的序列的使用，在一些實施方案中，所述異源序列是一種編碼序列和宿主生物體中編碼序列的複製(或特別的宿主生物體中被有效地連接的編碼序列)的表達必需之適當的DNA序列。原核細胞中表達必需的DNA序列包括啟動子、任選地操縱子序列、核糖體結合位點以及可能的其它序列。真核細胞已知利用啟動子、多腺苷化信號和增強子。
如此處使用的術語「寡核苷酸」被定義為包含兩個或兩個以上脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，優選地至少5個核苷酸，更加優選地至少大約10-15個核苷酸，更加優選地至少大約15至30個核苷酸。確切的大小將依賴於很多因素，這些因素反過來依賴於所述寡核苷酸的最終的功能或使用。所述寡核苷酸可以以任何方式產生，包括化學合成、DNA複製、逆轉錄、PCR或它們的聯合。
因為單核苷酸以一個單核苷酸戊糖環的5′磷酸基在一個方向經由一個磷酸二酯連接附著於其相鄰3′氧這樣的方式進行反應，以製造寡核苷酸，如果寡核苷酸的5′磷酸基不聯接於單核苷酸戊糖環的3′氧，這個末端就被稱為「5′末端」，如果其3′氧不聯接於隨後的單核苷酸戊糖環的5′磷酸基，就被稱為「3′末端」。如此處使用地，即便在一個更大的寡核苷酸內部，核酸序列也可以說具有5′和3′末端。如果沿著核酸鏈以5′至3′方向移動，第一區域的3′末端在第二區域的5′末端之前，所述核酸鏈的第一區域就被說成是另一個區域的上遊。
當兩個不同的非重疊的寡核苷酸與相同線性互補的核酸序列的不同區域退火，並且一個寡核苷酸的3′末端指向另一個的5′末端時，前者可以被稱為「上遊」寡核苷酸，後者被稱為「下遊」寡核苷酸。相似地，當兩個重疊的寡核苷酸雜交於相同的線性互補核酸序列，在安置第一個寡核苷酸使得它的5′末端是第二個寡核苷酸的5′末端上遊，第一個寡核苷酸的3′末端是第二個寡核苷酸3′末端的上遊時，第一個寡核苷酸可被稱為「上遊」寡核苷酸，第二個核苷酸可被稱為「下遊」寡核苷酸。
術語「引物」指的是當置於可使引物延伸起始的條件下時，能夠起合成起始點的作用之寡核苷酸。寡核苷酸「引物」當在純化的限制性消化中時可以自然地產生，或者可以合成地生產。
選擇引物以「基本上」互補於所述模板特異性序列的鏈。為了發生引物的延長，引物必須充分互補以雜交於模板鏈。引物序列不需要反映所述模板的確切序列。例如，非互補的核苷酸片段可以附著於所述引物的5′末端，引物序列的剩餘部分基本上互補於所述鏈。非互補鹼基或更長的序列能散布在所述引物之內只要引物序列具有與要雜交的模板序列充分的互補並且因此形成模板引物複合物以合成延伸引物。
如此處使用的術語「切割結構」，指的是通過至少一個探針寡核苷酸和靶核酸的相互作用形成的結構，形成包含雙體的結構，所得結構通過包括但不限於酶的切割方式可被切割。與是通過例如磷酸二酯酶的試劑非特異性切割的底物之核酸分子相比，它不考慮二級結構而切割核酸分子(即，不需要雙體結構的形成)，所述切割結構是通過所述切割方式特異性切割的底物。
如此處使用的術語「切割方式」或「切割試劑」指的是能夠切割所述切割結構的任何方法，包括但不限於酶。「結構特異性核酸酶」或「結構特異性酶」是識別核酸分子中特異性二級結構並且切割這些結構的酶。本發明的切割方式響應切割結構的形成而切割核酸分子；所述切割方法於所述切割結構內任何特別位置切割所述切割結構不是必要的。
所述切割方式可以包括多種來源提供的核酸酶活性，包括CLEAVASE酶(第三波科技，Madison，WI)、FEN-1核酸內切酶(包括RAD2和XPG蛋白質)、Taq DNA聚合酶和大腸桿菌DNA聚合酶I。所述切割方式可以包括具有5′核酸酶活性的酶(例如Taq DNA聚合酶(DNAP)、大腸桿菌DNA聚合酶I)。所述切割方法也可以包括具有5′核酸酶活性但缺乏合成活性的修飾的DNA聚合酶。適合使用在本發明方法和試劑盒中使用的切割方式的實施例在美國專利號5,614,402、5,795,763、5,843,669、PCT申請號WO 98/23774、WO02/070755A2和WO0190337A2中有提供，它們的每一個此處整體引用作為參考。
當涉及例如5′核酸酶的酶而被使用時，術語「熱穩定的」指所述酶在升高的溫度下是功能性的或有活性的，即，在大約55℃或更高溫度下(例如，包括但不限於60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃)。
如此處使用的術語「切割產物」，指的切割方法與切割結構的反應(即，用切割方法對切割結構的處理)產生的產物。
術語「非靶切割產物」指的是不來源於所述靶核酸的切割反應的產物。如上面討論地，在本發明的一些方法中，所述切割結構的切割一般發生在探針寡核苷酸內。通過這個靶核酸依賴性切割產生的探針寡核苷酸的片段是「非靶切割產物」。
術語「探針寡核苷酸」在INVADER試驗反應的上下文中指的是與靶核酸相互作用而在有或無INVADER寡核苷酸的存在下形成切割結構的寡核苷酸。當與靶核酸退火時，所述探針寡核苷酸與靶形成切割結構，切割發生在所述探針寡核苷酸之內。
術語「INVADER寡核苷酸」指的是在探針和靶核酸之間的雜交區域附近的位置上雜交於靶核酸的寡核苷酸，其中所述INVADER寡核苷酸包含與所述探針和靶之間的雜交區域重疊的部分(例如，化學基團或核苷酸——無論互補於或不互補於那個靶)。在一些實施方案中，所述INVADER寡核苷酸在其3′末端含有基本上與位於探針寡核苷酸5′末端的序列相同的序列。
術語「ARRESTOR分子」指的是為了阻止一個或多個反應組分參加隨後的作用或反應而加入到或包括在侵入性切割反應的試劑。這個可以通過隔絕或失活一些反應組分(例如，通過與核酸組分結合或鹼基配對，或者通過與蛋白質組分結合)來進行。術語「ARRESTOR寡核苷酸」(也稱為捕集寡核苷酸)指的是為了阻止或捕獲任何反應的一個或多個方面(例如，第一反應和/或任何隨後的反應或作用；這不是旨在將所述ARRESTOR寡核苷酸限制於任何特別的反應或反應步驟)而包括在侵入性切割反應內的寡核苷酸。這個可以通過隔絕一些反應組分(例如，與另一個核酸鹼基配對或者與蛋白組分結合)來進行。然而，這不是旨在將所述術語如此局限於剛剛使得反應組分被隔離的情況。
如此處使用的術語「盒子(cassette)」指的是在INVADER試驗中為響應探針寡核苷酸切割而產生可檢測的信號所配置的寡核苷酸或寡核苷酸的聯合。在優選的實施方案中，所述盒子雜交於自所述探針寡核苷酸的切割得到的非靶切割產物，以形成第二侵入性切割結構，由此使所述盒子然後能夠被切割。
本發明一些優選的實施方案中的次級切割反應包括FRET盒子的使用。這樣的分子提供了次級靶(次級反應靶(或SRT))和FRET標記的可切割序列，允許連續侵入性切割反應的均相檢測(即，所述反應之後沒有產物的分離或其它操作)。其它優選的實施方案使用了次級反應系統，其中所述FRET探針和合成靶被提供為分開的寡核苷酸。來自初級反應的被切割的5′冗餘鏈(flap)在次級反應中起入侵寡核苷酸的作用，其中它們結合於適當的次級反應靶(SRT)。
在一些實施方案中，所述盒子是包含髮夾部分(即，一個區域，其中盒子寡核苷酸的一個部分在反應條件下雜交於相同寡核苷酸的第二個部分，以形成雙體)的單個寡核苷酸。在其它的實施方案中，盒子包含至少兩個包含有在反應條件下能形成雙體的互補部分的寡核苷酸。在優選的實施方案中，所述盒子包含標記物。在特別優選的實施方案中，所述盒子包含產生螢光共振能量轉移(FRET)作用的標記的基團。
當涉及核酸底物而被使用時，術語「基本上單鏈的」意味著與以通過鏈內鹼基配對相互作用保持在一起的雙鏈核酸形式存在的雙鏈底物相對比，所述底物分子主要以單鏈核酸存在。
如此處使用地，短語「未被擴增的寡核苷酸檢測試驗」指的是這樣構建的檢測試驗，其中為了檢測有或無並未被擴增的(例如，通過PCR)特別的靶序列(例如，miRNA、SNP、重複序列等等)的存在，而無需產生所述靶序列的複製體。「非擴增的寡核苷酸檢測試驗」可以，例如，擴增用於指示靶序列之中有或無特別靶序列或多肽性存在的信號，只要所述靶序列未被複製。
如此處使用地，短語「非擴增性的寡核苷酸檢測試驗」指的是這樣構建的檢測試驗，其中為了檢測有或無靶序列(例如miRNA、SNP、重複序列等等)存在，而無需產生所述靶序列的複製體。「非擴增性的寡核苷酸檢測試驗」可以，例如，擴增用於指示靶序列中有或無特別靶序列或多肽性存在的信號，只要靶序列未複製。
如此處使用的術語「序列變異」指的是兩個核酸之間核酸序列的差異。例如，野生型結構基因和這個野生型結構基因的突變形式可以由於一個鹼基的替代和/或缺失，或一個或多個核苷酸的插入的存在，而在序列上不同。所述結構基因的這兩個形式據說在序列上互不相同。所述結構基因的第二個突變形式可以存在。這個第二突變形式據說在序列上與野生型基因和所述基因第一個突變形式都不同。
如此處使用的術語「釋放」指的是核酸片段通過例如5′核酸酶的作用從例如寡核苷酸的更大的核酸片段的釋放，以至於釋放的片段不再共價附著於剩餘的寡核苷酸上。
如此處使用的術語「Km」指的是酶的Michaelis-Menten常數，被定義為特定的酶在酶催化的反應中產生其最大速率一半的特定底物的濃度。
如此處使用的「核苷酸類似物」指的是修飾的或非天然發生的核苷酸，包括但不限於具有改變的堆積相互作用的類似物例如7-脫氮嘌呤(即，7-脫氮-dATP和7-脫氮-dGTP)；有替代的氫鍵合構型的鹼基類似物(例如Iso-C和Iso-G以及S.Benner的美國專利號6,001,983中描述的並且此處引用作為參考的其它非標準的鹼基對)；非氫鍵合類似物(例如，非極性、芳香性核苷類似物，例如B.A.Schweitzer和E.T.Kool，有機化學雜誌(J.Org.Chem.)，1994，59，7238-7242，B.A.Schweitzer和E.T.Kool，美國化學協會雜誌(J.Am.Chem.Soc.)，1995,117，1863-1872描述的2，4-二氟甲苯；它們的每一個此處引用作為參考)；「通用」鹼基例如5-基吲哚和3-硝基吡咯；以及通用嘌呤和嘧啶(例如分別是「K」和「P」核苷酸；P.Kong，等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，1989，17，10373-10383，P.Kong等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，1992，20，5149-5152)。核苷酸類似物包括在糖基團上具有修飾的核苷酸，例如二脫氧核苷酸和2′-氧-甲基核苷酸。核苷酸類似物包括脫氧核糖核苷酸以及核糖核苷酸的修飾形式。
術語「多態性基因座」是群體中存在的在一個群體成員之間顯示了變異的基因座(例如，最普通的等位基因具有少於0.95的頻率)。相對比，「單態性基因座」是所述群體成員之間很少或沒有變異被觀察到的遺傳基因座(一般認為是所述人群的基因池中最普通的等位基因超過0.95的頻率的基因座)。
如此處使用的術語「微生物」是指一個生物體太小以至於肉眼觀察不到，包括但不限於細菌、病毒、原生動物、真菌和纖毛蟲。
術語「微生物基因序列」指的是來源於微生物的基因序列。
術語「細菌」指的是包括真細菌和古細菌類的任何細菌種類。
術語「病毒」指的是不能自主複製的(即，複製需要宿主細胞機制的使用)專性的、超顯微鏡的、細胞內寄生物。
本說明書和權利要求中的術語「樣品」以其最廣泛的意義而被使用。一方面它意在包括樣本或培養物(例如，微生物培養物)。另一方面，它意在包括生物學的和環境的樣品。樣品可以包括合成來源的樣本。
生物樣品可以是動物，包括人類、流體、固體(例如，糞便)或者組織，以及液體和固體食物以及飼料產品和成分例如奶製品、植物、肉和肉的副產品以及垃圾。生物樣品可以從所有各科的家畜，以及野獸或野生動物獲得，包括但不限於例如有蹄類動物、熊、魚、兔類、鼠等等的動物。
環境樣品包括環境物質，例如表面物質、土壤、水和工業樣品，以及得自食物和奶製品加工工具、設備、儀器、器具、一次性和非一次性項目。這些實例不被解釋為限制可應用於本發明的樣品類型。
術語「靶核酸的來源」指的是任何含有核酸(RNA(例如，miRNA)或DNA)的樣品。靶核酸特別優選的來源是生物樣品，包括但不限於血液、唾液、腦脊液、腹膜液、奶、淋巴、痰和精液。
如果一個寡核苷酸以比另一個寡核苷酸(或靶核酸序列)更高的摩爾濃度存在，就說那個寡核苷酸相對於另一個寡核苷酸(或靶核酸序列)而「過量」存在。當例如探針寡核苷酸的寡核苷酸在切割反應中相對於互補的靶核酸序列的濃度過量存在時，所述反應可被用於指出所述靶核酸存在的量。一般地，當過量存在時，所述探針寡核苷酸將以至少100倍摩爾過量存在；當所述靶核酸序列以大約10fmole或更少的量存在時，一般地至少1pmol的每個探針寡核苷酸會被使用。
「懷疑含有」第一和第二靶核酸的樣品可以含有這兩個靶核酸分子的任何一個，或者兩個都含有或都不含有。
術語「反應物」此處以其最廣泛的意義而被使用。所述反應物能包含，例如，酶反應物、化學反應物或光(例如，紫外光，特別是短波長紫外光已知破壞寡核苷酸鏈)。任何能與寡核苷酸反應縮短(例如，切割)或延長所述寡核苷酸的試劑都包括在術語「反應物」之中。
如此處使用地，術語「純化的」或「要純化」指的是汙染物從樣品中的去除。例如，在一些實施方案中，重組CLEAVASE核酸酶表達於細菌宿主細胞內，並且所述核酸酶通過宿主細胞蛋白質的去除進行純化；這些重組核酸酶的百分比因此在樣品中是增加的。
如此處使用的術語「部分」當涉及蛋白質時(例如「給定蛋白質的部分」中)指的是那個蛋白質的片段。所述片段大小範圍可以從4個胺基酸殘基到完整的胺基酸序列減去一個胺基酸(例如，4，5，6，...，n-1)。
如此處使用的術語「核酸序列」指的是寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸以及它們的片段或部分，以及基因組或合成來源的DNA或RNA，它們可以是單或雙鏈的，並且代表有義或反義鏈。相似地，如此處使用的「胺基酸序列」指的是肽或蛋白質序列。
如此處使用地，術語「純化的」或「基本上純化的」指的是核酸(或胺基酸)序列的分子，所述分子從它們的天然環境被移出、被分離或被分開，並且是至少60％游離、優選地75％游離以及最優選地90％游離於與它們天然相關的其它組分。「分離的多核苷酸」或「分離的寡核苷酸」所以是基本上純化的多核苷酸。
如此處使用的術語「核酸的連續鏈」意味著具有連續的、共價連接的骨架結構而沒有缺口或其它中斷之核酸的鏈。每個核苷酸鹼基部分的傾向，無論鹼基配對的、單鏈的或誤配的，都不是連續鏈的定義的要素。所述連續鏈的骨架不局限於天然發生的未修飾的核酸中找到的核糖-磷酸酯或脫氧核糖-磷酸酯組分。本發明的核酸可以包含所述骨架結構的修飾，包括但不限於硫代磷酸酯殘基、膦酸酯殘基、2′取代的核糖殘基(例如，2′-氧-甲基核糖)以及含有可選的糖(例如，阿拉伯糖)的殘基。
如此處使用的術語「連續的雙體」指的是雙鏈核酸的一個區域，其中在所述雙體內鹼基對的行進過程中沒有中斷(即，沿著所述雙體的所述鹼基對沒有被扭曲以在連續雙體區域的約束內容納一個間隙、凸出或誤配)。如此處使用的所述術語僅僅指的是所述雙體內所述鹼基對的排列，而沒有所述核酸鏈骨架部分連續性的暗示。有未打斷的鹼基配對但是在一條或兩條鏈中有缺口的雙體核酸在連續雙體的定義之內。
術語「雙體」指的是核酸的狀態，其中一條鏈上核苷酸的鹼基部分通過氫鍵合結合於排列於第二鏈上的它們的互補鹼基。處於雙體形式的條件反映了核酸的所述鹼基的狀態。依靠鹼基配對，所述核酸鏈一般也假設了雙螺旋的三級結構，具有大和小溝。所述螺旋形式的假設在變成雙體的行為中暗示。
術語「模板」指的是核酸的一條鏈，在所述鏈上互補的複製體通過模板依賴性的核酸聚合酶的活性由核苷三磷酸進行構造。雙體之內所述模板鏈，根據慣例，被描寫並且描述為「底」鏈。相似地，所述非模板鏈經常被描寫和描述為「頂」鏈。
發明詳述
本發明涉及微小RNA(miRNA)或其它短核酸分子，例如，siRNA，的組合物及其檢測和特徵分析的方法。本發明提供了檢測、特徵分析和定量分析miRNA表達的改進的方法。在一些實施方案中，本發明提供了包括將核酸加入到miRNA以幫助檢測的檢測miRNA表達的方法。所得「miRNA檢測結構」然後使用任何合適的方法進行檢測，包括但不限於此處公開的那些方法。雖然下面的描述集中在miRNA的檢測和定量分析，應當理解本發明也找到了用其它短核酸分子(例如，長度少於例如50、40、30或20個核苷酸的DNA和RNA)的用途。
1.miRNA檢測結構的形成
在一些實施方案中，本發明提供了產生miRNA檢測結構以幫助miRNA檢測的方法。miRNA是很小的(大約21個核苷酸)，因而使用標準化的雜交方法進行檢測是困難的。在一些實施方案中，本發明的方法包含將核酸分子加入到miRNA(例如，經由雜交、延伸或連接)以產生檢測結構。這樣的檢測結構然後能使用任何合適的方法進行檢測。
在一個特別的實施方案中，為了miRNA的檢測產生了圖2中描述的檢測結構。在這個實施方案中，兩個寡核苷酸與所述miRNA退火以形成一個雙環或「啞鈴」樣結構。所述啞鈴結構通過延伸有寡核苷酸雙鏈區域的所述miRNA末端而產生了一個更大區域的雙鏈核酸。在一些實施方案中，所述miRNA的每個末端被延伸了2至5個之間的核苷酸。在一些實施方案中，所述寡核苷酸的末端包含不雜交於所述miRNA的額外的核酸序列。在一些實施方案中，這些額外的序列形成了侵入性切割結構(例如，INVADER試驗侵入性切割結構)。在一些實施方案中，侵入性切割結構通過INVADER試驗進行檢測(見例如，下面的描述)。
在其它的實施方案中，為了miRNA的檢測產生了圖3中描述的檢測結構。在這個實施方案中，寡核苷酸與所述miRNA退火以產生弓形結構。所述miRNA將寡核苷酸的末端集合在一起，帶來比沒有所述miRNA存在更大的效率。在一些實施方案中，所述寡核苷酸的末端包含了延伸到超出miRNA且不雜交於所述mRNA的額外的序列。在一些實施方案中，這些額外的序列形成了侵入性切割結構(例如，INVADER試驗侵入性切割結構)。在一些實施方案中，侵入性切割結構通過所述INVADER試驗進行檢測(見例如，下面的描述)。在其它的實施方案中，在INVADER試驗侵入性切割結構的切割之後，得到的末端被連接以形成環形結構。在其它的實施方案中，寡核苷酸雜交於miRNA，使得所述寡核苷酸的末端被帶到近處(例如，雜交於所述miRNA鄰近的核苷酸)並且然後被連接。
在更進一步的實施方案中，產生了圖16和17中描述的檢測結構。在這個實施方案中，探針或INVADER寡核苷酸被延伸以產生單個髮夾環或「半啞鈴」結構。在一些實施方案中，所述寡核苷酸的末端包含不雜交於所述miRNA的額外的核酸序列。在一些實施方案中，這些額外序列形成侵入性切割結構(例如，INVADER試驗侵入性切割結構)。在一些實施方案中，侵入性切割結構通過所述INVADER試驗進行檢測(見例如，下面的描述)。
在其它的實施方案中，這些額外的序列互補於加入到反應混合物以穩定切割結構的額外的寡核苷酸，例如INVADER試驗侵入性切割結構(圖4)。
在一些實施方案中，如上述產生的環形結構使用滾環複製試驗(見例如，滾環複製的下面的描述)進行檢測。
在更進一步的實施方案中，檢測結構從與miRNA有一個或多個短區域同源性的長寡核苷酸(例如，大於50、100、1000或更多個核苷酸)產生。一個或多個miRNA雜交於所述寡核苷酸以產生所述檢測結構。在一些實施方案中，這些檢測結構通過miRNA的延伸(例如，經由連接或聚合反應例如RT-PCR)進行檢測。在一些實施方案中，這些檢測結構通過與偶聯於(例如微球、或其它表面或結構的)固相支持物的寡核苷酸之雜交進一步地進行檢測。
在一些實施方案中，用於形成檢測結構的寡核苷酸包含一個或多個核苷酸類似物。例如，在一些實施方案中，2′-氧-甲基核苷酸被利用。本發明不局限於特別的機制。當然，對所述機制的理解在實行本發明不是必需的。然而，可以預期2′-氧-甲基鹼基的存在增加了所述雜交的檢測結構的穩定性，並且幫助了進一步的檢測方法。
2.幹擾RNA的檢測
在一些實施方案中，本發明提供了檢測miRNA的方法。本發明不局限於特定的檢測試驗。任何合適的方法可以被利用，包括但不限於此處公開那些方法。
在本發明一些優選的實施方案中，miRNA檢測方法是定量的。本發明不局限於特別的機制。當然，對所述機制的理解在實行本發明不是必需的。然而，可以期望體內特別的miRNA的水平與來自它們同類基因的基因表達水平是相關的。本發明因而提供了與特定基因(例如，參與疾病狀態或代謝的基因)的基因表達相互關聯的miRNA的方法。例如，在一些實施方案中，本發明的方法被用來測定特定miRNA的異常(例如，高或低)水平的存在，或測定一種幹預(例如，藥物)對miRNA表達的作用。在其它的實施方案中，對異源性miRNA(例如，來自表達載體、轉基因構建體、轉染等等)進行檢測以表徵miRNA表達系統的效率。
在一些實施方案中，本發明提供了檢測特定miRNA(例如，miRNA諸如mir-1或mir-135)的方法。在其它的實施方案中，本發明的方法被用來區別特定miRNA中的變異體(例如，多態性或突變)。在更進一步的實施方案中，本發明提供了裂解細胞以檢測miRNA存在的方法。
A.INVADER試驗
在一些實施方案中，所述INVADER試驗被用於miRNA的檢測。在一些實施方案中，所述INVADER試驗包含形成依賴於靶核酸存在的核酸切割結構，以及切割所述核酸切割結構以釋放獨特的切割產物。例如，5′核酸酶的活性被用於切割所述靶依賴性切割結構，所得切割產物或所述切割結構的切割是樣品中特異性靶核酸序列存在的指示。當核酸的一個或兩個(或兩個以上)鏈，或者寡核苷酸，都雜交於靶核酸鏈以使它們形成重疊的侵入性切割結構時，如下面描述地，侵入性切割能夠發生。通過切割試劑(例如，5′核酶)和上遊寡核苷酸的相互作用，可製造所述切割試劑，以獨特的片段被產生的方式在內部位點處切割下遊寡核苷酸。這樣的實施方案被稱為INVADER試驗(第三波科技)並且在美國專利號5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567、6,090,543、6,348,314和6,458,535，WO 97/27214、WO98/42873，Lyamichev等人，自然生物技術(Nat.Biotech.)，17292(1999)、Hall等人，PNAS，USA，978272(2000)中有描述，為了所有的目的它們的每一個此處引用作為參考)。
所述INVADER試驗通過結構特異性酶對特異性結構的酶切割，檢測探針與靶的雜交(見，INVADER試驗，第三波科技；見例如，美國專利號5,846,717、6,090,543、6,001,567、5,985,557、5,994,069、6,090,543、6,348,314、6,458,535,美國專利申請號20030186238(序列號10/084839)、20030104378A1(序列號09/864636)，Lyamichev等人，自然生物科技(Nat.Biotech.)，17292(1999)、Hall等人，PNAS，USA，978272(2000)，WO97/27214以及WO98/42873，為了所有的目的它們的每一個此處引用作為參考)。
所述INVADER試驗通過使用結構特異性酶(例如FEN核酸內切酶)切割由重疊寡核苷酸探針的雜交形成的複合物，檢測特異性的DNA和RNA序列(見，例如圖1)。升高的溫度和一個所述探針的過量能使待切割的針對每一靶的多重探針存在而無溫度循環。在一些實施方案中，這些切割的探針然後指導第二標記探針的切割。所述次級探針寡核苷酸能用被內部染料淬滅的螢光素進行5′末端標記。一經切割，所述去淬滅的螢光素標記的產物可以使用標準螢光平板閱讀儀進行檢測。
所述INVADER試驗檢測了未擴增的以及擴增的RNA和DNA中的特異性序列、突變和SNP，包括基因組DNA。在圖1中圖表顯示的實施方案中，所述INVADER試驗使用兩個都產生並且然後擴增所述靶特異性信號的級聯步驟(初級和次級反應)。為了方便，下面的討論中所述等位基因被描述為野生型(WT)和突變型(MT)，即使這個術語並不適用於所有的基因變異。在所述初級反應中(圖1，A表)，所述野生型初級探針和所述INVADER寡核苷酸一前一後雜交於所述靶核酸以形成重疊結構。未配對的「flap」被包括在所述WT初級探針的5′末端。結構特異性酶(例如CLEAVASE酶，第三波科技)識別所述重疊，切割掉所述未配對的flap，將它釋放為靶特異性產物。在所述次級反應中，這個切割的產物起WT螢光共振能量轉移(WT-FRET)探針上INVADER寡核苷酸的作用，以再次產生結構特異性酶識別的所述結構(A表)。當單個FRET探針上的所述兩個染料通過切割被分開時(通過圖1中的箭頭指出)，產生在背景螢光之上的可檢測的螢光信號。因此，這個二級結構的切割導致螢光的增加，指示WT等位基因(或者突變等位基因，如果所述試驗為了突變型等位基因產生可檢測的信號而配置)的存在。在一些實施方案中，針對每個等位基因或基因座的檢測，提供具有不同標記物的FRET探針(例如，通過發射或激發波長的不同可分辨的，或者通過時間分辨螢光檢測可分辨的)，以使單個反應中可檢測不同的等位基因或基因座。在這樣的實施方案中，所述初級探針組合(set)和所述不同的FRET探針在單個試驗中可以聯合起來，允許來自相同樣品中每個等位基因或基因座的所述信號的比較。
如果初級探針寡核苷酸和靶核苷酸序列在切割位點不是完美匹配(例如，就象MT初級探針和WT靶，圖1，B表)，所述的重疊的結構並沒有形成並且切割被抑制。與非重疊的結構相比，使用的所述結構特異性酶(例如，CLEAVASEVin酶，第三波科技)更加有效率地切割所述的重疊的結構(例如至少340倍)，允許所述等位基因的極好的區分。
所述探針無需溫度循環運轉(turn over)以產生每個靶的許多信號(即，線性信號擴增)。相似地，每個靶特異性產物可允許許多FRET探針的切割。
初級INVADER試驗反應被指向待檢測的靶DNA(或RNA)。所述靶DNA是第一侵入性切割中限制性組分，因為所述INVADER和初級探針以摩爾過量提供。在第二侵入性切割中，限制性的是釋放的flap。當這兩個切割反應相繼進行時，來自混合反應(compositereaction)的螢光信號依據靶DNA的量線性蓄積。
在某些實施方案中，所述INVADER試驗或其它核苷酸檢測試驗用可得的位點設計寡核苷酸和/或橋接寡核苷酸進行。這樣的方法、程序和組合物在美國專利6,194,149、6,358,691、6355,437，美國專利申請序列號09/882,945和PCT申請WO9850403和WO0198537中有描述，所有的專利特異地完整引用作為參考。
在一些優選的實施方案中，如果靶序列存在於樣品中，所述樣品暴露於寡核苷酸和試劑，包括將所述樣品在所述靶序列和所述寡核苷酸之間形成侵入性切割結構的條件下暴露於寡核苷酸和試劑，其中所述侵入性切割結構被所述切割試劑切割而形成切割產物。
在一些實施方案中，所述靶序列包含第一區域和第二區域，所述第二區域在第一區域的下遊並且與其鄰近，所述寡核苷酸包含第一和第二寡核苷酸，其中至少所述第一寡核苷酸的一部分完全互補於靶序列的第一部分，其中所述第二寡核苷酸包含3′部分和5′部分，其中5′部分完全互補於所述靶核酸的第二部分。
在一些優選的實施方案中，如果靶序列存在於樣品中，所述樣品暴露於寡核苷酸和試劑，包括將所述樣品在靶序列和寡核苷酸之間形成侵入性切割結構的條件下暴露於寡核苷酸和試劑，其中所述侵入性切割結構被所述切割試劑切割而形成切割產物。
在一些優選的實施方案中，如果所述靶序列存在於所述樣品中，所述樣品暴露於寡核苷酸和試劑，包括將所述樣品在所述靶序列和所述寡核苷酸之間形成侵入性切割結構的條件下暴露於寡核苷酸和試劑，其中所述侵入性切割結構被切割試劑切割而形成切割產物。
在一些特別優選的實施方案中，靶序列包含第一區域和第二區域，所述第二區域在所述第一區域的下遊並且與其鄰近，並且所述寡核苷酸包含第一和第二寡核苷酸，其中至少所述第一寡核苷酸的一部分完全互補於所述靶序列的所述第一部分，其中所述第二寡核苷酸包含3′部分和5′部分，其中所述5′部分完全互補於所述靶核酸的所述第二部分。
在某些實施方案中，本發明提供了使用INVADER檢測試劑(例如，初級探針、INVADER探針和FRET盒)分析合併的樣品(例如合併的血液樣品或合併的細胞裂解物)的試劑盒。在優選的實施方案中，所述試劑盒進一步包含怎樣進行所述INVADER試驗的說明書，以及在一些實施方案中，怎樣將所述INVADER檢測試驗應用於來自許多個體的合併的樣品或來自單個研究對象的很多細胞(例如，來自活檢樣品)的「合併的」樣品的說明書。
本發明進一步提供了這樣的試驗，其中在用寡核苷酸探針的多輪雜交以及不需要使用溫度循環(即，為了靶核酸鏈周期性的變性)或核酸合成(即，為了靶或探針核酸鏈的基於聚合化的替代)的探針的切割過程中，靶核酸被再使用或再循環。當切割反應在探針被持續放置於靶鏈之上的條件下(例如通過探針-探針替代，或通過探針/靶結合和分離之間的平衡，或者通過包含這些機制的聯合，(Reynaldo等人，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)97511-520(2000))進行時，多重探針能雜交於相同的靶，允許多重切割以及多重切割產物的產生。
INVADER試驗反應
在INVADER DNA試驗的優選實施方案中，兩個寡核苷酸(分辨性的初級探針和INVADER寡核苷酸)一前一後地雜交於靶DNA以形成重疊結構。所述初級探針的5′末端包括不雜交於靶DNA的5′flap(圖1)。結合的INVADER寡核苷酸的3′核苷酸重疊於所述初級探針，但是不需要雜交於靶DNA。CLEAVASE酶識別這個重疊結構，將所述初級探針未配對的5′flap切割下來，將它釋放作為靶特異性產物。所述初級探針經設計以具有與反應溫度相近的融化溫度。因此，在等溫度試驗條件下，過量提供的初級探針在靶DNA上循環。這允許針對每個靶DNA的多輪初級探針切割，以及釋放的5′flap數量的擴增。
在次級反應中，每一個釋放的5′flap能起螢光共振能量轉移(FRET)盒上INVADER寡核苷酸的作用以產生另外一個被CLEAVASE酶識別並切割的重疊結構(圖1)。當FRET盒被切割時，螢光團(F)和淬滅劑(Q)被分開，產生可檢測的螢光信號。與最初的反應相似，釋放的5′flap和FRET盒循環，導致擴增的螢光信號。所述最初和次級反應在相同的孔中同時進行。
所述INVADER試驗的雙體格式實現了在單個孔中兩種DNA序列的同時檢測。最經常地，這包括特定多態性的兩個變異體的檢測(例如，miRNA中)。所述雙體格式使用兩種不同的分辨性初級探針，每種有獨特的5′flap，和兩種不同的FRET盒，每種有波譜截然不同的螢光團。通過設計，釋放的5′flap將只結合於它們各自的FRET盒以產生靶特異性的信號。
在一些實施方案中，本發明提供了包含實行本發明必需的一個或多個組分。例如，本發明提供了儲存或遞送本發明的酶和/或實行切割試驗(例如，所述INVADER試驗)必需的反應組分。以舉例的方式，並不是意將本發明的試劑盒限制為任何特別的配置或組分的聯合，下面的章節描述了實行本發明的試劑盒的一個實施方案
在一些實施方案中，本發明的試劑盒提供了下面的試劑
CLEAVASE酶 初級寡核苷酸
DNA反應緩衝液I INVADER寡核苷酸
FRET盒1(例如，F)
FRET盒2(例如，R)
突變型DNA對照
野生型DNA對照
「無靶」的空白對照
在其它的實施方案中，本發明的試劑盒為了RNA的直接檢測而被配置。這些試劑盒可以提供下面的試劑
CLEAVASE酶 初級探針
寡核苷酸
DNA反應緩衝液I INVADER寡核苷酸
FRET探針1(例如，F)
FRET探針2(例如，R)
次級反應靶1
次級反應靶2
ARRESTOR寡核苷酸1
ARRESTOR寡核苷酸2
突變型DNA對照
野生型DNA對照
「沒有靶」的空白對照
必須有額外的考慮，其與由單一反應中寡核苷酸的特定組合產生的非期望作用有關。一種這樣的作用是背景信號的靶獨立性的產生。某些寡核苷酸與其它的寡核苷酸組合，在所述INVADER試驗中在沒有待檢測的特別靶存在下可以產生信號。將這些寡核苷酸的組合分開到不同的池中能用於減輕該作用。相似地，某些寡核苷酸的組合能夠虛假地抑制來自期望靶的信號產生。再一次，這些組合分開到不同的池中能夠減輕這個作用。
設計探針組合(set)(例如，寡核苷酸和/或其序列)以適合於miRNA檢測試驗中的使用，其利用反應設計和此處提供的最優化的指導方針(見例如，實驗章節)。例如，在一些實施方案中，降低所述反應溫度(例如，到50-60℃)以進行小區域的雜交。
在一些實施方案中，本發明的試劑盒提供了為了進行本發明的方法由使用者供給的額外組分的列表(例如，試劑、供應品和/或設備)。例如，並且不是意在將這樣額外的組分的列表限制於任何特別的組分，這樣的列表的一個實施方案包含了如下
·透明CHILLOUT-14液體蠟(MJ Research)或無RNase的光學級礦物油(Sigma，Cat.No.M-5904)
·96孔聚丙烯微量平板(MJ Research，Cat.No.MSP-9601)
·無菌的1.5ml或2.0ml微量離心管
·無菌的、無DNase/RNase的一次性氣溶膠隔離移液器吸頭
·多道移液器(0.5-10μl，2.5-20μl)
·溫度循環器或其他熱源(例如，實驗室烘箱或加熱塊)
·各式各樣的實驗室設備(試管架、微量移液器、多道移液器、微量離心機、振蕩混合器)
·螢光微量平板讀取器(優選的平板讀取器是從上面讀數的並且配備了有下面特徵的濾光器
激發發射
(波長/帶寬) (波長/帶寬)
485nm/20nm 530nm/25nm
560nm/20nm 620nm/40nm
在一些實施方案中，本發明的試劑盒提供了為了方便本發明的方法執行由使用者供給的額外組分的列表(例如，試劑、供應品和/或設備)。例如，並且不是意在將這樣可選的組分列表限制於任何特別的組分，這樣的列表的一個實施方案包含了如下
·無菌8試管條或微量平板(可選的)
·一次性塑料水槽(可選的)
·平板封口帶(可選的)
在一些實施方案中，本發明的試劑盒提供了為了方便本發明方法的進行由使用者供給的必需組分的列表，為此多個可選物是可接受的(例如樣品製備試劑盒)。例如，並且不是意在將這樣的可選組分的列表限制於任何特別的組分，這樣的列表的一個實施方案包含如下
·QIAGENQI AMP血液試劑盒
·Gentra Systems PUREGENE試劑盒
·Gentra Systems GENERATION產品
在試劑盒的一些實施方案中，提供了詳細的實驗方案。在優選的實施方案中，提供了INVADER試驗反應的彙編的實驗方案(例如，製劑和製造反應混合物的優選程序)。在特別優選的實施方案中，反應混合物的彙編之實驗方案包括電腦或繪圖的幫助，以降低本發明方法執行中犯錯的風險(例如，方便多重反應需要的試劑之體積的計算的表格，以及輔助配置含有許多試驗反應的多孔試驗平板的平板設計指導)。
在一些實施方案中，提供了增補文件，例如補助程序的試驗方案，例如為了額外試劑的製備，或為了用於本發明方法中樣品製備的實驗方案。在優選的實施方案中，增補文件包括為了方便非技術人員或無經驗的使用者對所述方法和試劑的成功使用而提供的指導方針和預防措施列表。在特別優選的實施方案中，增補文件包括解決問題指南，例如，描述了使用者遭遇的可能問題，以及提供了意在幫助使用者解決或避免這樣的問題而提出的解決方案或改正方法的指南。
在優選的實施方案中，樣品被稀釋到相應於每個反應加入10μl的濃度。100ng樣品的濃度應當是15ng/μl。
B.滾環複製
在其它的實施方案中，滾環複製方法(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)被用於miRNA檢測結構的檢測(見例如，美國專利6,344,329、6,143,495、6,316,229、6,210,884、6,183,960和6,235,502；它們的每一個在此引用作為參考)。在一些實施方案中，滾環複製被用來檢測從與miRNA退火的單個寡核苷酸末端的退火產生的環狀miRNA檢測結構。在一些實施方案中，寡核苷酸的末端雜交於沒有重疊的miRNA。這個寡核苷酸在有或無miRNA存在下能夠被連接。然而，所述連接反應在有所述miRNA存在下更有效率。在這樣的實施方案中，將隨著時間檢測的環狀分子水平與缺乏miRNA的對照反應比較。
在其它的實施方案中，所述寡核苷酸的末端雜交於有重疊末端的miRNA以產生侵入性切割結構。這樣的結構在連接之前被切割，因而提高所述環狀檢測結構產生的特異性。
滾環擴增(RCA)包括環狀單鏈DNA分子的複製。在RCA中，滾環複製的引物雜交於環狀核酸分子，之後是使用鏈替代DNA聚合酶的核酸分子的滾環複製。所述擴增發生在單個反應循環的滾環複製之中。滾環複製得到含有核酸序列的串聯重複序列的大DNA分子。這個DNA分子被稱為串聯序列DNA(TS-DNA)。
在一些實施方案中，利用複製之前包括連接操作的連接介導的滾環擴增(LM-RCA)。在所述連接操作中，探針雜交於其同類靶核酸序列(如果存在的話)，之後是雜交探針末端的連接形成共價閉合的單鏈核酸。連接之後，滾環複製引物雜交於探針分子，之後是使用鏈替代DNA聚合酶的環狀分子的滾環複製。一般地，LM-RCA包含將開環探針與靶樣品混合，得到探針-靶樣品混合物，並且在促進所述開環探針和靶序列之間雜交的條件下孵育所述探針-靶樣品混合物，將連接酶與所述探針-靶樣品混合物混合，得到連接混合物，並且在促進所述開環探針連接的條件下孵育所述連接混合物以形成擴增靶環(ATC)，將滾環複製引物(RCRP)與所述連接混合物混合，得到引物-ATC混合物，並且在促進所述擴增靶環和所述滾環複製引物之間雜交的條件下孵育所述引物-ATC混合物，將DNA聚合酶與所述引物-ATC混合物混合，得到聚合酶-ATC混合物，並且在促進所述擴增靶環複製的條件下孵育所述聚合酶-ATC混合物，這裡所述擴增靶環的複製導致串聯序列DNA(TS-DNA)的形成。
C.額外的檢測方法
技術領域：
本發明不限於INVADER試驗或滾環試驗檢測。任何允許miRNA檢測結構的檢測的方法可以被利用。作為示例的，發現用於本發明方法的非限制的檢測試驗在下面有描述。
1.雜交試驗
在本發明的一些實施方案中，檢測結構使用雜交試驗進行檢測。在雜交試驗中，有或無特定核酸序列的存在基於來自樣品的DNA雜交於互補DNA分子(例如，寡核苷酸探針)的能力進行測定。使用各種雜交和檢測技術的各種雜交試驗是可以利用的。試驗挑選的描述在下面有提供。
a.雜交的直接檢測
在一些實施方案中，探針與目的序列的雜交(例如，SNP或突變)通過顯現結合探針(例如，Northern或Southern試驗；見例如Ausabel等人(eds.)，分子生物學當代實驗方案(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley & Sons，NY[1991])直接進行檢測。在這些試驗中，基因組DNA(Southern)或RNA(Northern)從研究對象分離出來。所述DNA或RNA然後用一系列基因組中罕見地並不在待分析的任何標誌物附近切割的限制性酶進行切割。所述DNA或RNA然後被分開(例如，在瓊脂糖凝膠上)並且被轉移到膜上。標記的(例如，通過引入一個放射性核苷酸)探針或特異於待檢測的所述SPN或突變的探針被允許在低、中或高嚴格條件下與所述膜接觸。未結合的探針被去除並且結合的存在通過顯現所述標記的探針進行檢測。
b.使用「DNA晶片」試驗的雜交的檢測
在本發明的一些實施方案中，變異體序列使用DNA晶片雜交試驗進行檢測。在這個試驗中，一系列寡核苷酸探針被附於固相支持物。所述寡核苷酸探針被設計成對於特定的靶序列是唯一的(例如，miRNA靶序列)。目的DNA樣品與所述DNA「晶片」接觸並且對雜交進行檢測。
在一些實施方案中，所述DNA晶片試驗是GeneChip(Affymetrix，Santa Clara，CA；見例如，美國專利號6,045,996、5,925,525和5,858,659；它們的每個此處引用作為參考)試驗。所述GeneChip技術使用附於「晶片」的寡核苷酸探針的小型、高密度陣列。探針陣列通過Affymetrix的光指示化學合成法進行生產，它聯合了固相化學合成和半導體工業採用的照相平版印刷製作技術。為了定義晶片暴露位點使用了一系列照相平版印刷底片，之後是特異性化學合成步驟，所述方法構建了寡核苷酸的高密度陣列，有每一個探針在陣列中預先確定的位置。多重探針陣列在大的玻璃夾心晶片上同時進行合成。所述夾心晶片然後被切成方塊，並且單獨的探針陣列被包裝在注模塑料盒中，所述盒子保護它們免受環境的影響並且用作雜交的腔室。
待分析的核酸被分離，通過PCR進行擴增，並且用螢光報告基團進行標記。所述標記的DNA然後使用流體工作站(fluidics station)與所述陣列進行孵育。所述陣列然後被插入掃描儀中，在此檢測雜交的模式。收集雜交數據，為已經整合進靶的螢光報告基團的發射光，所述靶結合於所述探針陣列。既然所述陣列上每個探針的序列和位置是已知的，通過互補性，應用於所述探針陣列的靶核酸的身份能夠被測定。
在其它的實施方案中，利用含有電子捕捉探針的DNA微晶片(Nanogen，San Diego，CA)(見例如，美國專利號6,017,696、6,068,818和6,051,380；它們的每個此處引用作為參考)。通過微電子的使用，Nanogen的技術實現了到達和來自半導體微晶片上指定的測試位點的帶電分子之活躍的運動和濃縮(concentration)。對於特定靶序列是唯一的DNA捕獲探針通過電子手段被放置於或「定位於」所述微晶片上的特異性位點。既然DNA具有很強的負電荷，它能通過電子手段被移到正電荷區域。
首先，所述微晶片上一個測試位點或一行測試位點用正電荷電子激活。其次，含有所述DNA探針的溶液被引入到所述微晶片上。負電荷探針很快地移動到帶正電荷的位點，在此它們濃縮並且被化學結合於所述微晶片上的位點。然後清洗所述微晶片，加入截然不同的DNA探針的另一個溶液直到特異性結合DNA探針的陣列完成。
然後對測試樣品通過測定哪個所述DNA捕獲探針雜交於靶序列而分析靶序列的存在。電子電荷也被用於移動和濃縮靶分子至所述微晶片上一個或多個測試位點。在每個測試位點上樣品DNA的電子濃度促進了樣品DNA與互補捕獲探針的快速雜交(雜交可以在數分鐘內發生)。為了從每個位點去除任何未結合的或非特異性結合的DNA，所述位點的極性或電荷被逆轉為帶負電荷的，因此強迫任何未結合的或非特異性結合的DNA回到遠離所述捕獲探針的溶液。基於雷射的螢光掃描儀被用於檢測結合。
在更進一步的實施方案中，基於通過表面張力的不同，隔離平面(晶片)上的流體的陣列技術(ProtoGene，Palo Alto，CA)(見例如，美國專利號6,001,311、5,985,551和5,474,796；它們的每個此處引用作為參考)。Protogene的技術基於流體能夠被隔離在通過化學包被給予的表面張力不同的平面之上的事實。一旦這麼被隔離，寡核苷酸探針通過試劑的噴墨列印在所述晶片上直接合成。帶有由表面張力定義的反應位點的陣列在一套四個壓電噴嘴下被裝在X/Y移動平臺上，每一個噴嘴代表四個標準DNA鹼基的一個。所述移動平臺沿著所述陣列的每行移動並且適當的試劑被遞送到每一個反應位點。例如，Aamidite只被遞送到amidite A在那個合成步驟之中被偶聯的位點等等。普通試劑和清洗液通過覆滿(flooding)整個表面並且然後通過離心將其去除而被遞送。
對於目的靶序列(例如，miRNA靶序列)唯一的DNA探針使用Protogene的技術被附於所述晶片。所述晶片然後與PCR擴增的目的基因接觸。雜交之後，未結合的DNA被去除並且雜交使用任何合適的方法進行檢測(例如，通過整合的螢光基團的螢光去淬滅)。
然而在其它的實施方案中，「珠子試驗」被用於多態性的檢測(Illumina，San Diego，CA；見例如，PCT公開WO 99/67641和WO00/39587，它們的每個在此引用作為參考)。Illumina使用聯合了纖維光束和自己裝配成為陣列的珠子的珠子陣列技術。每個纖維光束依賴於所述光束的直徑而含有數千至數百萬的單個纖維。所述珠子用特異於特定SNA或突變的檢測的寡核苷酸包被。幾批珠子被聯合以形成特異於所述陣列的集合。為了進行試驗，所述珠子試驗與製備好的研究對象的樣品(例如，核酸樣品)接觸。雜交使用任何合適的方法進行檢測。
c.雜交的酶法檢測
在本發明的一些實施方案中，雜交通過特異性結構的酶切割進行檢測。
在一些實施方案中，結合探針的雜交使用TaqMan試驗(PEBiosystems，Foster City，CA；見例如，美國專利號5,962,233和5,538,848，它們的每個此處引用作為參考)進行檢測。所述試驗在PCR反應的過程中進行。所述TaqMan試驗利用了AMPLITAQ GOLD DNA聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性。特異於特定等位基因或突變的探針被包括在所述PCR反應之中。所述探針由有5′報告基因染料(例如，螢光染料)和3′淬滅染料的寡核苷酸組成。在PCR過程中，如果所述探針結合於其靶，AMPLITAG GOLD聚合酶的5′-3′核酸水解活性切割了所述報告基因和所述淬滅染料之間的探針。報告基因染料從淬滅染料分開導致螢光的增加。所述信號隨著PCR的每個循環蓄積並且能用螢光儀進行監測。
在更進一步的實施方案中，多態性使用SNP-IT引物延伸試驗(Orchid Biosciences，Princeton，NJ；見例如，美國專利號5,952,174和5,919,626，它們的每個在此引用作為參考)進行檢測。在這個試驗中，SNP通過使用特異性合成的DNA引物和DNA聚合酶由可疑SNP位置的一個鹼基選擇性延伸所述DNA鏈進行鑑別。目的區域中的DNA被擴增和變性。聚合酶反應然後使用被稱為微流體的小型化系統進行。檢測通過將標記物加入到被懷疑在靶序列位置的核苷酸來完成。所述標記物整合進所述DNA能通過任何合適的方法進行檢測(例如，如果所述核酸含有生物素標記物，檢測可以經由特異於生物素的螢光標記抗體)。
2.其它檢測試驗
在miRNA檢測結構的檢測中有用的額外的檢測試驗，包括但不限於酶錯配切割方法(例如，Vairagenics，美國專利號6,110,684、5,958,692、5,851,770，此處完整引用作為參考)；聚合酶鏈式反應；分支雜交方法(例如，Chiron，美國專利號5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802，此處完整引用作為參考)；NASBA(例如，美國專利號5,409,818，此處完整引用作為參考)；分子信標技術(例如，美國專利號6,150,097，此處完整引用作為參考；電子傳感器(Motorola，美國專利號6,248,229、6,221,583、6,013,170和6,063,573，此處完整引用作為參考)；循環探針技術(例如，美國專利號5,403,711、5,011,769和5,660,988，此處完整引用作為參考)；DadeBehring信號擴增方法(例如，美國專利號6,121,001、6,110,677、5,914,230、5,882,867和5,792,614，此處完整引用作為參考)；連接酶鏈式反應(Barnay，Proc.Natl.Acad.Sci USA 88，89-93(1991))；以及夾心雜交方法(例如，美國專利號5,288,609，此處完整引用作為參考)。
實驗的
為了證明和進一步闡明某些優選的實施方案和本發明的各個方面，提供下面的實施例，並且不被解釋為限制本發明的範圍。
實施例1
材料和方法
·下面最終濃度(除非有註明的)用於所有的反應
探針＝1μM
INVADER＝1μM
ARRESTOR＝2.67μM
CLEAVASE XII酶＝30ng
所有合成的miRNA寡核苷酸從Dharmacon購買並且在20％變性丙烯醯胺凝膠純化。合成的miRNA被用來測定溫度的最適(見下面)和LOD。
INVADER、探針和ARRESSTOR寡核苷酸由整合DNA技術(IDT)或第三波科技合成，在20％變性丙烯醯胺上進行純化，除非另外有指出。
·下面的2.5×初級反應緩衝液用於(除非另外有註明的)所有的反應
25mM MOPS pH7.5
62.5mM KCl
0.125％Tween 20
0.125％Nonidet NP40
62.5mMMgSO4
5％PEG
·除非另外有指出，所有的反應在第一個熱孵育之前被10μl礦物油覆蓋。
·除非另外有註明，合成的miRNA含有5′羥基。比較5′磷酸化與非磷酸化合成的miRNA靶檢測的實驗指出，INVADER試驗檢測這兩個不同類型合成分子的能力沒有明顯的不同。
實施例2
let7和mir-1的溫度最優化實驗
let-7的寡核苷酸設計顯示在圖5中。mir-1的寡核苷酸設計顯示在圖5中。下面的初級混合物被製成並且在96孔板中在50C±10℃孵育30分鐘。另外，沒有靶的總體混合物(master mix)被製備(加入水取代RNA)。所有的反應用礦物油覆蓋以阻止蒸發。
初級反應完成後，加入5μl下面的次級反應混合物，並且所述反應然後在60℃反應孵育10-15分鐘。
所述反應完成後，所述平板在CYTOFLUOR4000螢光微量平板閱讀器內使用485nm的激發波長和530nm的發射波長進行讀數。結果顯示在圖6和7中。當所述INVADER寡核苷酸的3′末端是2′-氧-甲基化的時候，所述INVADER寡核苷酸的5′末端到所述miRNA的3′末端的堆砌被增強。另外，所述INVADER寡核苷酸5′末端的2′-氧-甲基化增加了反應溫度。延伸INVADER寡核苷酸的2′-氧-甲基化鹼基以至於它們與所述miRNA(SEQ ID NO8(1496-96-02)對let-7a的SEQ ID NO9(1496-96-OlR)設計中SEQ ID NO23(1496-96-03))的最初兩個鹼基的鹼基配對，增加了所述反應的最適溫度但是不增強所述檢測。
實施例3
let-7和miR-1的LOD試驗
測定每一個組合的探針和INVADER寡核苷酸的最優反應溫度和測定最好的工作設計(來自溫度最優淨信號)後，下面的實驗被設置以使用合成的RNA測定所述設計的LOD。下面的反應混合物被分裝到有每個孔含有如下的96孔板中(見下面平板設置)
2.5μl下面的miRNA濃度使用下面的設置以三復樣或四復樣加入
＜--------[miRNA]-----→
所述平板用礦物油覆蓋(10μl)並且在50℃孵育2小時。在初級反應完成後，5μl下面的組分加入到每個孔並且所述平板在60℃孵育1.5小時。所述平板用上面描述的設置(見實施例2)進行讀數。
接著let-7和mir-1的LOD在人類RNA樣品上進行檢測。上面描述的實驗方案被利用。50-100ng組織特異性總的人RNA樣品(Clonetech，Palo Alto，CA)被使用。結果顯示在圖8和10中。使用總RNA所述let-7a INVADER試驗檢測了如以前觀察到的依賴於組織來源的let-7a表達水平相同的組織表達譜(profile)(Pasquinelli等人，40886[2000])。
實施例4
Let-7a、c、e和f的交叉反應實驗
該實施例描述了針對let-7一種亞型的探針和/或INVADER寡核苷酸對於另一個亞型的交叉反應性的分析。採用實施例3中描述的合成的let-7a設置的實驗方案。圖5顯示了寡核苷酸設計。採用下面的平板設置
結果顯示在圖9中。對於let-7a設計，當所述miRNA長度相同、在遠離所述切割位點有一個鹼基改變時，交叉反應性最大。換句話來說，當誤配更加遠離所述切割位點(let-7c)時，INVADER寡核苷酸/miRNA雜交區域的誤配得到高的交叉反應性。當鹼基變化在所述切割位點的對面(或與其接近)時，交叉反應性最低。對於let-7a，最嚴重的交叉反應性是和let-7c，其得到了25％的所述信號。該實施例證明了所述INVADER試驗能夠區分非常相似的miRNA。
實施例5
CLEAVASE IX酶對CLEAVASE XII酶
該實施例描述了用於miRNA試驗的CLEAVASE酶的最優化。上面描述的溫度最優化的試驗方案被利用。使用20ng的CLEAVASE IX酶(第三波科技，Madison，WI)或30ng的CLEAVASE XII酶(第三波科技，Madison，WI)。下面的緩衝液用於CLEAVASE IX酶
2.5X初級反應緩衝液25mM MOPS pH7.5，250mM KCl，0.125％Tween 20，0.125％ Nonidet NP40，31.25mM MgSO4，10％PEG。
7.5X次級反應緩衝液87.5mM MgSO4。
下面的緩衝液被用於CLEAVASE XII酶
2.5X初級反應緩衝液25mM MOPS pH7.5，62.5mM KCl，0.125％Tween 20，0.125％ Nonidet NP40，62.5mM MgSO4，5％ PEG。
7.5X次級反應緩衝液水
LOD實驗的實驗方案與CLEAVASE IX或XII酶一起使用。測定了兩個酶的LOD。結果顯示在圖11中。
當與CLEAVASE IX酶或CLEAVASE XII酶一起分析時信號隨著let-7miRNA量的增加而線性增加。然而，R2值在CLEAVASE XII酶更大，指出了更大的線性關係。另外，所述LOD在CLEAVASE XII酶更低。2.5阿摩爾的檢測淨信號(net signal)在CLEAVASE IX酶是20個計數並且在CLEAVASE XII酶是66.75。
實施例6
miR-135、GAPDH和U6 RNA
A.檢測miR135的寡核苷酸的設計
該實施例描述了miRNA miR135試驗設計和LOD的測定。miR-1的實驗如實施例2和3描述地進行。所述寡核苷酸設計在圖5中有描述。為了mir-135miRNA的檢測每個所述設計(A-D)利用了不同的INVADER和探針寡核苷酸。比較所有所述設計進行的溫度最優化實驗的結果顯示在圖13中。設計D產生最高的信號。使用試驗設計D的LOD實驗的結果顯示在圖14中。
圖14A呈現了在每個指出的靶濃度從四個重複試驗產生的粗計數。每一個靶濃度得到的平均計數表示淨信號並且是零之上的倍數(FOZ)。在這個實驗中miR-135靶的檢測限是164 zmoles，相當於98,743個分子。圖14B含有在每個濃度得到的平均計數的圖示，並且指出INVADER試驗在測試的許多濃度範圍是線性的。
B.檢測GAPDH和U6 RNA的寡核苷酸的設計
在一些情形下，例如雙體試驗中共同檢測一般在所有細胞中以恆定水平與一個或多個miRNA種類一起存在的RNA是期望的，所述RNA以組織特異性的方式表達。INVADER試驗因此被設計成一般在所有細胞類型中可見的兩個截然不同的RNA人三磷酸甘油醛脫氫酶(hGAPDH)和U6的RNA。
在hGAPDH的情況下，下面的寡核苷酸被用於雙體miRNA檢測試驗INVADER寡核苷酸(SEQ ID NO41)；探針(SEQ ID NO42)；ARRESTOR寡核苷酸(SEQ ID NO43)；SRT寡核苷酸(SEQ IDNO49)，FRET寡核苷酸(紅色染料)(SEQ IN NO48)。
在U6的情況下，從秀麗新小杆線蟲到小鼠到芥屬(arabidopsis)到人類8個不同種類的U6 RNA序列比對，以鑑定適合於「通用」INVADER試驗設計的區域。所述比對顯示在圖12中；產生以檢測這個序列的寡核苷酸序列是SEQ ID NO93-95。
在細胞裂解物上使用SEQ ID NO45-47與這些寡核苷酸進行的初始試驗證明了來自U6反應的信號在miRNA信號之前達到非常飽和，可能因為細胞內大量的U6 RNA。因此，進行滴定反應，以確定稀釋探針和INVADER寡核苷酸的濃度是否會使得這個探針組合適合用於終濃度範圍從1μM到12.5nM的INVADER和探針的雙體miRNA檢測試驗。12.5-50nM之間的所述INVADER和探針寡核苷酸的終濃度適於miR-1d和let-7a的雙體miRNA檢測。ARRESTOR、SRT和FRET探針濃度如在前面的實施例中描述的。進一步的實驗證明了用「通用」U6RNA寡核苷酸(SEQ IN NO93-95)的U6RNA的檢測與用SEQ ID NO45-47的檢測相當。
實施例7
細胞裂解物中let-7、GADPH和U6 RNA的檢測
A.細胞裂解物中let 7a的檢測
這個實施例描述了直接在總細胞RNA中以及來自人骨肉瘤細胞系MG63(第三波科技，Madison，WI；目錄號CRL-1427)的未誘導的成纖維細胞中let-7 miRNA的檢測。總細胞RNA，如以前描述地(Chomczynski等人，分析生物化學(Anal.Biochem.)162156-156(1987))，使用TRIZOL(Gibco-BRL)進行提取，並且細胞裂解物如Eis等人，自然生物技術(Nature Biotechnology)，19673-6(2001)進行製備；兩個發表文章在此引用作為參考。
反應如下進行設置。等分的5μl細胞裂解物、裂解緩衝液中為所示濃度的合成miRNA靶(Eis等人，自然生物技術(NatureBiotechnology)，19673-6(2001))或5μl 20ng/μl tRNA(作為無靶對照)用移液器加入到微量滴定平板適當的孔中。初級反應總體混合物被製成用於96個反應，含有下面的試劑。
5μl初級反應總體混合物的分裝物加入到含有適當靶或對照的孔中。所述平板用礦物油(10μl)覆蓋並且在53℃孵育2小時。初級反應完成後，5μl的下列組分加入到每個孔中，並且所述平板在60℃孵育1.5小時。所述平板使用上面描述的設置進行讀數(見實施例2)。
所有靶以四復樣進行試驗。對總RNA和細胞裂解物進行試驗之不同細胞數所獲得的平均計數作圖於圖15中。從已知量的合成let-7amiRNA的INVADER試驗獲得的標準曲線被用於外推每個細胞的let-7a拷貝數。產生細胞裂解物之細胞的數量在細胞裂解之前的接種程序過程中如Eis等人，自然生物技術(Nature Biotechnology)，19673-6(2001)中描述地進行測定，此處引用作為參考。在這個實驗中，在從156個細胞獲得的總RNA提取物中達到了細胞裂解物的檢測限。
B.沒有Mg++存在的裂解
可選的裂解程序開展如下。已經指出當使用上面的裂解程序時，長mRNA，即來自GADPH，沒有檢測到預期的量。進行所述實驗以檢查Mg++對裂解物中RNA提取的作用。在有或無MgCl2存在下裂解的提取物與使用如上面描述地使用TRIZOL製備的總細胞RNA提取物進行比較。
Hela細胞(7.5×106細胞)懸浮在100μl的帶有100mM KCl之10mM MOPS緩衝溶液中，pH7.5。10μl分裝物加入到單獨(separate)的試管內並且用100μl如下製備的兩個不同裂解緩衝液裂解
所有的試管然後在80℃孵育15分鐘以裂解細胞，然後離心收集碎片。各種裂解物5μl的分裝物如下加入到INVADER反應。
初級INVADER反應如上面let-7a描述的；GADPH(SEQ ID NO41-43)和U6(SEQ ID NO45-47在50nM終濃度)的PI寡核苷酸混合物也被製成。
*初級INVADER反應如上面let-7a描述的；GADPH(SEQ ID NO41-43)和U6(SEQ ID NO45-47在50nM終濃度)的PI寡核苷酸混合物也被製成。
初級反應混合物在49℃孵育1小時。下面第二反應混合物的分裝物然後被加入
次級反應混合物包括在如實施例7A中所示濃度的SRT(對於let-7，SEQ ID NO22；對於GADPH和U6，SEQ ID NO49)靶，FRET寡核苷酸(對於let-7，SEQ ID NO21；對於GADPH和U6，SEQ ID NO48)，arrestors(對於let-7，SEQ IN NO7；對於GAPDH，SEQ ID NO43以及對於U6，SEQ ID NO47)。
次級反應在60℃進行1小時。反應在如實施例2中描述的CYTOFLUOR微量平板讀取器進行讀數。結果呈現在圖16中，表明GAPDH信號的存在依賴於裂解緩衝液中無Mg++的存在，而U6 RNA信號不管有無Mg++的存在都保持相對恆定。額外的實驗證實，所有的RNA在與無Mg++存在的裂解中獲得那些RNA相當水平的總細胞RNA中是可檢測到的。
實施例8
多種miRNA檢測備選的INVADER試驗設計
A.let-7A檢測備選設計
這個實施例描述了let-7a miRNA檢測備選的寡核苷酸設計的創造和測試。在一系列的實驗中，產生了一套可選的設計，其中所述INVADER寡核苷酸和所述探針寡核苷酸的靶特異性區域均是11個核苷酸長。產生了第二套設計，其中所述探針寡核苷酸的靶特異性區域是10個核苷酸長，所述INVADER寡核苷酸是12個核苷酸長。
1.寡核苷酸設計
a.11聚體探針和INVADER寡核苷酸設計
圖5顯示了檢測let-7a miRNA備選的核苷酸設計，其中探針和INVADER寡核苷酸的靶特異性區域都是11個核苷酸長。SEQ ID NO50-51提供了所述INVADER和探針都是線性的設計。SEQ ID NO6含有形成了莖環結構的探針寡核苷酸；SEQ ID NO5，形成莖環結構的INVADER寡核苷酸)；SEQ ID NO5-6，兩個都有莖環的探針和INVADER寡核苷酸。
b.10聚體探針和12聚體INVADER寡核苷酸設計
圖5顯示了檢測let-7a miRNA的一套備選的寡核苷酸設計，其中所述探針的靶特異性區域包含10個核苷酸，INVADER寡核苷酸的那些靶特異性區域包含12個核苷酸。SEQ ID NO52-53提供了INVADER和探針寡核苷酸都是線性的設計。SEQ ID NO2含有形成了莖環結構的探針寡核苷酸；SEQ ID NO1，形成了莖環結構的INVADER寡核苷酸。
2.Let-7a miRNA之檢測備選寡核苷酸設計的溫度最優化譜(profile)
溫度最優化實驗進行如下。總和混合物被製成用於24個反應。每個反應含有下面的
*探針和INVADER寡核苷酸的多種組合如圖16-17所示用於這個實驗中。
次級反應混合物如let-7的實施例3中描述的。適當的時候，製成ARRESTOR序列以對應(compliment)所述探針完整的環和靶特異性區域，且朝著所述探針5′末端延伸6個鹼基。
在11聚體溫度最優化實驗的情況下，初級反應在50±9℃進行1小時，之後是如實施例2中描述的在60℃下15分鐘的次級反應。對於所述10聚體探針，和12聚體INVADER寡核苷酸一起，初級反應在50±9℃進行15分鐘，之後是在60℃的15分鐘的次級反應。
其中INVADER和探針寡核苷酸的靶特異性部分是11個核苷酸長之設計的結果呈現在圖18中。圖18A顯示了每個設計的溫度最優化譜。圖18B顯示了每個設計標準化的最大限度的執行，包括每個設計的最優溫度。其中探針寡核苷酸的靶特異性部分是10個鹼基，INVADER寡核苷酸是12個鹼基之設計的結果呈現在圖19中。圖19A顯示了溫度最優化譜，並且圖19B顯示了每個設計標準化的最大限度的執行。
這些結果的檢查提示，設計導致最大限度執行的設計取決於反應條件和形成的miRNA-寡核苷酸雜交體的相對穩定性的不同而不同。例如，當兩個寡核苷酸的靶特異性區域都是11個鹼基長時，所述探針靶特異性區域具有49℃的預期Tm，所述INVADER靶特異性區域有37℃的預期Tm。在這個情況下，INVADER寡核苷酸-miRNA相互作用的穩定化給這個設計提供了改善的試驗實施。然而，對於探針是10聚體並且INVADER寡核苷酸是12聚體的let-7a設計，所述兩個寡核苷酸的靶特異性區域具有大約相等的Tm。在這個情況下，兩個寡核苷酸均是環狀的設計運行地最好。
3.使用兩個可選設計的let-7a的LOD
實驗如實施例3中描述地進行設置以比較所述雙環設計和所述單環設計的LOD，其中INVADER寡核苷酸形成了莖環結構。
測定LOD的反應以四復樣進行。反應混合物含有下面的試劑(終濃度)
5μl miRNA的分裝物以圖20中指出的終濃度加入到含有反應混合物的孔中。初級反應在實施例8B中測定的每個設計的最優化溫度(成環的INVADER寡核苷酸設計為50℃，雙環設計為53℃)進行1.5小時。次級反應如在實施例2和3中描述地進行設置並且在60℃進行1小時。
圖20中的結果顯示了產生的淨信號，其為miRNA摩爾量的函數。所述圖表的線性範圍指出使用所述INVADER環狀設計比雙環設計從特定量的miRNA產生更多的信號。相似地，圖20中所述表的檢查表明在每個miRNA水平高於零的倍數數值比單環設計的更大。兩個設計在測試的最低濃度(等同於大約16,000分子的2.68×10-20摩爾或26.8仄摩爾(zeptomole))得到了足夠的FOZ。
4.全長的對於截短的ARRESTOR寡核苷酸
進行實驗以評價例如如圖4和12中所示的全長ARRESTOR分子對於截斷的ARRESTOR分子的相對性能，其中所述全長的ARRESTOR分子在環周圍的其5′末端延伸，貫穿探針miRNA特異性區域的全長並且至5′flap區域，所述截短的ARRESTOR分子僅僅互補於探針的miRNA特異性區域和所述5′flap的一部分，但是不延伸到環狀區域或更遠區域。反應如下進行設置以檢測合成的let-7amiRNA
6μl初級反應混合物的分裝物加入到微量滴定平板適當的孔中，之後加入如下表中指出的4μl合成let-7a miRNA的分裝物或4μl溶於蒸餾水的10ng/μl tRNA的分裝物。初級INVADER反應在53℃孵育1.5小時。
次級反應混合物的分裝物如下加入
次級反應在60℃孵育1.5小時。微量滴定平板如實施例2描述地進行讀數。結果顯示在圖17中。
這些結果表明，當互補於所述探針miRNA特異性部分的全長的或截斷的ARRESTOR寡核苷酸用於次級INVADER反應中時，信號的產生或檢測限沒有明顯地不同。
B.使用線性探針和INVADER寡核苷酸可選的設計
對可選的設計進行測試，其中所述探針和INVADER寡核苷酸都含有通用序列，並且沒有寡核苷酸形成髮夾。所述設計的示意圖呈現在圖4中。所述通用序列存在於INVADER寡核苷酸的5′末端和探針寡核苷酸的3′末端。加入短的互補的「捕獲」寡核苷酸，並且包含2′-氧-甲基殘基，允許它在miRNA(例如SEQ ID NO60)的存在下促進同軸堆積。產生miR-15(SEQ ID NO58、59和60)和mir-135(SEQID NO63-65)的設計。最初的設計雖然在無miRNA靶的存在下導致了高的非特異性背景信號，但是指出了用這樣的通用捕獲寡核苷酸檢測miRNA是可行的。
實施例9
環中核苷酸殘基2′-氧-甲基化的作用
這個實施例描述了旨在評定用於檢測miRNA之整合於所述探針和INVADER寡核苷酸中的一些或全部2′-氧-甲基殘基被2′-脫氧殘基取代的作用的實驗。在前述的實施例中呈現的所有設計都包括了如實施例2中描述的所述環區域中的2′-氧-甲基殘基。進行實驗以測試為了檢測let-7a miRNA設計的INVADER和探針寡核苷酸中一些或全部2′-氧-甲基殘基被2′脫氧殘基取代的作用。
圖5顯示了改良的let-7a設計。SEQ ID NO5-6含有如實施例2中描述的2′-氧-甲基殘基。SEQ ID NO73-74中的設計在所有的位置都含有2′脫氧殘基；並且在SEQ ID NO75-76中的那些設計，在鄰近靶的所述莖幹部分中含有2′-氧-甲基殘基。
進行INVADER反應以比較三個不同設計的信號產生和溫度的最優化。反應如實施例8中LOD試驗中描述的，包括100pM合成的miRNA、1μM探針和10μM INVADER寡核苷酸。初級反應在所示溫度進行15分鐘；次級反應在60℃進行5分鐘。
INVADER試驗的結果顯示在圖21中，顯示其中所述莖環結構包含2′-氧-甲基殘基的設計產生最多的信號，之後是其中鄰近靶的鹼基包含2′-氧-甲基殘基的設計。完全包含2′-脫氧殘基的寡核苷酸產生最低水平的信號。
另一套實驗如下設計以測試額外的設計變異有更短髮夾的探針和INVADER寡核苷酸，有更穩定的環的或可選的有更短的環的探針和INVADER寡核苷酸，只有三個2′-氧-甲基殘基的探針和INVADER寡核苷酸。初級反應如下設置以測試miR-15的檢測。
對下面的探針/INVADER寡核苷酸的聯合進行測試。
初級反應混合物如下製成
5μl初級反應混合物的分裝物以下面的終量加入到5μl合成的miR-15RNA0、0.1阿摩爾(amole)、0.33阿摩爾、1.09阿摩爾。初級反應在52.5℃孵育2小時。
次級反應混合物如下製成
加入5μl的分裝物，反應在600℃孵育45分鐘。
結果，以相對螢光單位(RFU)，呈現如下。
這些結果提示，其中探針寡核苷酸含有截短的髮夾和包含2′-氧-甲基殘基的高度穩定的四環探針寡核苷酸的設計與最初的INVADER寡核苷酸的設計(2′-氧-甲基殘基，TTTT環，長髮夾)相組合，可以產生稍微更高的FOZ值。否則，沒有一個可選的設計寡核苷酸套提供了任何在最初設計之上的提高。值得注目的是所有DNA寡核苷酸與最初嵌合探針寡核苷酸的組合給出大約等同於用嵌合探針和INVADER寡核苷酸獲得的那些FOZ值。在一些應用中，所有DNAINVADER寡核苷酸的取代是期望的，以降低寡核苷酸合成成本，並且製備不會犧牲檢測限。
更進一步的實驗證明了通過往反應中加入更多的RNA(例如裂解物、純化的總RNA、合成的miRNA)用特別的寡核苷酸集合補償亞優化(suboptimal)信號的產生是可能的。相似地，如實施例1中描述的各種寡核苷酸(即探針、INVADER、ARRESTOR或其多種組合)被凝膠純化的額外的實驗指出，所有三種類型寡核苷酸的標準凝膠純化給出了最大的信號。如果其它的寡核苷酸，即INVADER和ARRESTOR寡核苷酸在合成之後脫鹽，那麼獲得大約等於用凝膠純化探針的最大水平的信號水平是可能的。
實施例10
來自多重組織類型的總RNA中miRNA表達的檢測
這個實施例描述了為了測試INVADER試驗的適當性進行的實驗，以檢測提取自不同組織類型的總RNA中不同的miRNA類型。為了評價組織特異性基因表達，每一個設計的溫度最優化和LOD先被測定。
1.INVADER和探針寡核苷酸設計
設計INVADER試驗寡核苷酸以檢測miR-15、miR-16和miR125bmiRNA種類。這些試驗的設計呈現在圖5中。Let-7a和miR-135的設計分別在實施例2和6中有描述。
2.溫度最優化和LOD的測定
為了每一個這些寡核苷酸組合，溫度最優化實驗如實施例8中描述地而被實施。每一個初級反應包括1nM靶miRNA，並且在50±9℃的溫度範圍內進行15分鐘。次級反應如實施例2中描述的，並且在60℃進行1至1.5小時。最優溫度如下
一旦獲得溫度最優化，每個miRNA種類的LOD如實施例8中描述地進行測定。所有LOD是30仄摩爾。
3.基因表達譜(profiling)
基因表達譜在提取自20個不同組織類型的總RNA上進行。總RNA從Clontech購買(Palo Alto，CA，目錄號K4008-1，Human TotalRNA Master Paneln)。對於let-7a，每個反應中對50ng的總RNA進行測試；對於其它的miRNA種類，對100ng的總RNA進行測試。所有反應如實施例8中所述進行設置；初級反應在最優溫度進行1.5小時；次級反應是如上描述的。
每個miRNA種類的基因表達譜呈現在圖23中。這些結果指出INVADER試驗能被用於檢查不同組織類型中miRNA的表達。這些數據進一步提示let-7a和miR-125b表達於各種各樣的組織中；其它的miRNA種類似乎對於有限數量的組織類型更有特異性。
實施例11
不同的寡核苷酸長度對miRNA的INVADER試驗檢測的作用
這個實施例描述了探針和INVADER寡核苷酸長度的改變對let-7a 22個核苷酸的miRNA檢測的影響。特別地是，這些實驗比較了如下兩種miRNA的檢測所述探針和INVADER寡核苷酸的末端之間形成理想堆積相互作用的miRNA的檢測，和形成5′和3′重疊的miRNA的檢測以及在所述5′和3′末端得到單個核苷酸缺口的miRNA的檢測。
圖24顯示了分析三種類型設計的結果。SEQ ID NO5-6顯示了22個核苷酸靶與成環的探針和INVADER寡核苷酸的側面末端之間完美的堆積。在SEQ ID NO83-84中，探針和INVADER寡核苷酸都延伸了一個鹼基，得到了5′和3′重疊。在SEQ ID NO85-86中，探針和INVADER寡核苷酸相對於SEQ ID NO5-6的設計都截短了一個鹼基，得到了在兩個末端的一個核苷酸缺口。
設置INVADER試驗以測試這些寡核苷酸組合對於合成let-7amiRNA檢測的執行。反應如實施例8中所述進行，包括100pM合成的let-7a miRNA、1μM探針和10pM INVADER寡核苷酸。初級反應在53℃進行15分鐘；次級反應如實施例2中描述地在60℃進行5分鐘。結果呈現在圖24中。
這些數據指出在這個實驗中，在miRNA靶兩個末端的單個核苷酸重疊導致信號的產生降低大約30％，最優溫度降低2℃。然而，所述靶兩個末端的一個核苷酸缺口都不降低信號的產生，但是它確實降低了最優反應溫度5℃。
實施例12
miRNA與前體RNA以及與編碼DNA的區別
為了測定INVADER miRNA試驗是否能從miRNA靶的前體RNA以及從編碼所述miRNA的DNA區分miRNA靶本身而進行實驗。
A.前體交叉反應性測試
前體let-7 RNA(SEQ ID NO87)體外進行轉錄，通過毛細管電泳進行分析以測定它是否含有模仿let-7a miRNA的任何片段。最短的汙染片段估計是大約45個核苷酸。LOD反應基本上如實施例3中描述地在如下表中指出的前體或合成的5′P let-7a miRNA濃度下進行。PI混合物含有10pM探針SEQ ID NO6和100μM INVADER寡核苷酸SEQ ID NO5。初級反應在53℃進行1小時；基本上如實施例3中描述的次級反應混合物(FRET探針SEQ ID NO21，SRT SEQ ID NO22和ARRESTOR SEQ ID NO7)的次級反應在58℃進行1小時。這個實驗的結果指出這個miRNA試驗對於前體RNA有大約4％的交叉反應性。
B.RNA對DNA信號的區別
為了檢測細胞裂解物中的let-7a miRNA如實施例7中所述進行反應。在用INVADER試驗的檢測之前，1μl 8μg/μl RNAse A(Qiagen公司)的分裝物加入到80μl細胞裂解物中並且在37℃孵育2.25個小時。RNAse A處理的樣品不能產生任何背景之上的信號，指出缺乏RNAse A的試驗中產生的信號起因於miRNA靶，而不是編碼DNA的檢測(圖16)。進行更進一步的實驗，其中RNAse A在初級反應之前或次級反應之前加入。當RNAse A在初級反應之前加入時，沒有信號產生，與以前的結果一致。當RNAse A在初級反應之後加入，沒有觀察到丟失的信號，進一步指出檢測的信號是因為RNA並且RNAse對例如CLEAVASE酶的其它反應組分沒有不利的作用。
實施例13
雙重形式miRNA的檢測
產生為了miR-124a的寡核苷酸設計。這些寡核苷酸能用於檢測兩個天然發生的miRNA，一個長21個核苷酸，另一個22個核苷酸。
溫度最優化反應基本上如實施例3中描述地被設置，使用1nM合成的miRNA靶、25分鐘的初級反應和15分鐘的次級反應。這些反應中使用的寡核苷酸列於圖5中(SEQ ID NO90-92)。兩個不同長度的miRNA靶的溫度譜(profile)顯示在圖22中並且指出相同的寡核苷酸設計能被用於檢測兩個靶。
實施例14
siRNA檢測的寡核苷酸設計
與前述的實施例中描述的那些相似的方法可以相似地被用於檢測siRNA。圖25闡述了β-肌動蛋白siRNA檢測的兩個可選的INVADER試驗設計。這個siRNA在Harborth，J.等人，細胞科學雜誌(Journalof Cell Science)，1144557-4565(2001)中有描述。對於每個有義和反義鏈存在一個設計；檢測這個siRNA的示範性實例的寡核苷酸列於圖6中，SEQ ID NO101-106。
上面詳述中提到的所有出版物和專利此處引用作為參考。本發明描述的方法和系統的各種修飾和變異對於本領域的技術人員將是顯而易見的，而不偏離本發明的領域和精神。儘管本發明連同特別的優選實施例有描述，應當理解所要求的本發明不應當被不適當地限制於這樣特別的實施方案。當然，對分子生物學、基因或相關領域的技術人員是顯而易見的為了進行本發明所描述的模式的各種修飾意在落入下面的權利要求範圍之中。
權利要求
1.一種方法，包括
a)將幹擾RNA靶雜交於至少一種核酸，所述核酸含有不互補於所述幹擾RNA靶以產生檢測結構的序列；以及
b)檢測所述檢測結構。
2.根據權利要求1的方法，其中所述幹擾RNA靶是miRNA。
3.根據權利要求1的方法，其中所述幹擾RNA靶是siRNA。
4.根據權利要求3的方法，其中所述siRNA是雙鏈。
5.根據權利要求1的方法，其中所述檢測結構包含侵入性切割結構。
6.根據權利要求2的方法，其中所述檢測結構包含為了形成聯合所述miRNA的侵入性切割結構而配置的第一和第二寡核苷酸。
7.根據權利要求2的方法，其中所述檢測結構包含為了形成聯合所述miRNA的侵入性切割結構而配置的第一寡核苷酸。
8.根據權利要求6的方法，其中所述第一寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述3′部分為了雜交於所述靶序列而配置，其中所述5′部分為了不雜交於所述靶序列而配置。
9.根據權利要求6的方法，其中所述第二寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述5′部分為了雜交於所述靶序列而配置，其中所述3′部分為了不雜交於所述靶序列而配置。
10.根據權利要求1的方法，其中所述檢測包括侵入性切割試驗的使用。
11.根據權利要求1的方法，其中所述檢測結構包含雜交於所述miRNA的環形寡核苷酸以產生環形檢測結構。
12.根據權利要求11的方法，其中所述檢測包括滾環複製試驗的使用。
13.根據權利要求1的方法，其中所述檢測包括選自如下的檢測試驗的使用測序試驗、聚合酶鏈式反應試驗、雜交試驗、採用互補於突變的探針之雜交試驗、微陣列試驗、珠子陣列試驗、引物延伸試驗、酶錯配切割試驗、支鏈雜交試驗、NASBA試驗、分子信標試驗、循環探針試驗、連接酶鏈式反應試驗、侵入性切割結構試驗、ARMS試驗以及夾心雜交試驗。
14.根據權利要求1的方法，其中所述檢測在細胞裂解物中進行。
15.根據權利要求1的方法，其中檢測多種不同的miRNA。
16.根據權利要求15的方法，其中所述多種miRNA包含第一miRNA和第二miRNA，所述第二miRNA為具有多態性的所述第一miRNA。
17.根據權利要求1的方法，進一步地包括檢測第二核酸靶。
18.根據權利要求17的方法，其中所述第二核酸靶是RNA。
19.根據權利要求18的方法，其中所述第二核酸靶選自U6和GAPDH。
20.根據權利要求2的方法，其中所述miRNA選自Let-7、miR-1、miR-135、miR-15、miR-16、miR125b、miR-1d和miR124a。
21.一種試劑盒，其包含為了當雜交於幹擾RNA靶序列時形成檢測結構而配置的核酸，其中所述核酸包含不互補於所述幹擾RNA靶序列的序列。
22.根據權利要求21的試劑盒，其中所述檢測結構包含侵入性切割結構。
23.根據權利要求22的試劑盒，其中所述第一寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述3′部分為了雜交於所述靶序列而配置，其中所述5′部分為了不雜交於所述靶序列而配置。
24.根據權利要求22的試劑盒，其中所述第二寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述5′部分為了雜交於所述靶序列而配置，其中所述3′部分為了不雜交於所述靶序列而配置。
25.根據權利要求21的試劑盒，其中所述檢測結構包含雜交於所述miRNA的環形寡核苷酸以產生環形檢測結構。
26.根據權利要求25的試劑盒，其中所述檢測結構是用於滾環複製試驗的檢測結構。
27.根據權利要求21的試劑盒，其中所述幹擾RNA靶是miRNA。
28.根據權利要求21的試劑盒，其中所述幹擾RNA靶是siRNA。
29.根據權利要求27的試劑盒，其中所述miRNA選自Let-7、miR-1、miR-135、miR-15、miR-16、miR-lb、miR-124a和miR125b。
30.根據權利要求21的試劑盒，其中所述試劑盒為了檢測miRNA靶和至少一個其它的RNA靶而配置。
31.根據權利要求21的試劑盒，其中所述試劑盒為了檢測細胞裂解物中所述幹擾RNA靶序列而配置。
全文摘要
本發明涉及幹擾RNA(諸如微小RNA(miRNA)和小幹擾RNA(siRNA))和其它短核酸分子的組合物及其檢測和表徵的方法。更加特別地，本發明涉及幹擾RNA表達的檢測和定量分析的改進方法。本發明更進一步地提供了miRNA和siRNA的變異體和類型的檢測。
文檔編號A61K48/00GK1753993SQ20038010977
公開日2006年3月29日 申請日期2003年12月18日 優先權日2002年12月18日
發明者J·E·達爾伯格, H·T·阿拉維, V·萊米柴夫, B·P·奈裡, M·奧爾森－穆諾茲, L·柴哈克, S·M·奧爾森 申請人:第三次浪潮技術公司