層析顆粒介質的製備方法

2023-07-16 01:28:01

專利名稱：層析顆粒介質的製備方法
技術領域：
本發明涉及製備層析分離介質的方法，特別是製備層析顆粒的聚合反應方法。
背景技術：
用於層析技術的多聚物顆粒可通過雙相懸浮聚合反應合成。如美國專利 4， 340， 483,48711824和6， 423， 666。具體方法是在雙相懸浮系統的連續相中，懸浮液相形 成的液滴為單體混合物，其由一種或多種可聚合的單體及交聯劑組成並在液滴中聚合。如 單體混合物由水溶性的單體及水溶性的交聯劑組成時，至少部分與水不溶的有機液體被用 作懸浮反應的連續相。相反，為懸浮相為非溶於水的單體及非溶於水的交聯劑組成的混合 物。水則作為懸浮聚合反應的連續相。而可聚合的單體可帶有各種特殊的功能基團，如可離 子化的化學基團可用作離子交換樹脂，帶不同長度的烴鏈(碳氫鏈)用於疏水作應和反相 層析樹脂。可聚合的單體也可帶有反應基團，並在填充顆粒形成後衍生成各種特性，如美國 專利U. S. Pat. No. 4， 340， 483所使用的甘氨醯甲基丙烯酸甲脂中的環氧基團。多聚物顆粒 的硬度決定於交聯劑在單體混合物中的相對濃度。為美國專利U. S. Pat. No. 4， 340， 483所 描述交聯劑佔總單體混合物的克分子比可從0. 3到0. 97。對於像蛋白，核酸等類大分子很 難擴散到用此方法合成的多聚物內。故大分子只能與多聚物表面的功能基團結合。因此， 用以上方法合成的多聚物層析介質常表現出低載量，低溶質擴散性，低生產率。

發明內容
為了克服現有技術的不足之處，本發明提供了一種利用二步聚合反應法製備層析 顆粒介質的方法。 第一步，介質單體混合物中的介質單體和交聯劑在雙相懸浮系統中聚合成顆粒。 交聯劑相對於介質單體混合物的相對克分子比為0. 5到1. 0。由於在介質單體混合物中含 有大量的交聯劑，而且由於立體構象的限制，大部分交聯劑中只有其中一個反應基團(如 雙鍵)能參與聚合反應，而留下第二個沒反應的自由的反應基團。多聚物顆粒被收集並清 洗。 第二步，上述帶有大量自由反應基團的(如雙鍵)顆粒懸浮在帶功能基團的單體 溶液中並通過聚合反應使多聚物的自由反應基團與功能單體一起聚合，所使用的功能單體 的一端可共價地連接著各種不同的功能基團。功能單體即可為水溶性或非水溶性單體。由 於功能單體為小分子化合物，容易擴散進多聚物的內部並與其沒反應或自由的反應基團一 起聚合。 本發明方法最大的優勢是可通過控制起始劑的濃度及聚合反應的溫度有效地控 制功能單體的聚合反應，而且水溶性及非水溶性的單體均可用於第二步的聚合反應。經第二步聚合反應後，功能單體聚合成長鏈狀，高密度的功能基團並共價性地連接在多聚物表 面形成一層厚的結合層，為溶質的結合提供大量的結合位點，從而提高了層析介質的載量 和生產率。 因此，一方面，本發明還提供了一種製備具通透性孔的層析分離介質的方法，該方 法包括(a)形成由水溶液液滴及有機連續相組成的懸浮系統，所述的水溶液由介質單體 混合物溶於水組成，所述的介質單體混合物由水溶性的可聚合的化合物與水溶性至少擁有 二個反應基團的交聯劑組成，所述的介質單體混合物在水溶液中的重量百分比濃度為2% 至50%。交聯劑佔總介質單體混合物的克分子比為0. 5至1. O，所述的有機連續相為至少 部分不混溶於水的有機溶劑；(b)所述的液滴由可聚合的化合物和交聯劑組成，並通過聚 合反應形成帶通透性孔的固體多孔顆粒，所述的交聯劑至少帶一個自由反應基團；(c)清 洗固體多孔顆粒以去除有機溶劑和未聚合的水溶性可聚合化合物以及水溶性交聯劑；(d) 使功能單體與固體多孔顆粒中至少一個交聯劑上自由反應基團反應。在具體應用中，反應 基團是雙鍵。 在另一方面，本發明提供了一種製備具通透性孔的層析分離介質的方法，該法包 括(a)形成由有機溶液液滴及水為連續相組成的懸浮系統，有機溶液由介質單體混合物 溶於至少部分不混溶於水的有機溶劑成，所述的介質單體混合物由非水溶性的可聚合的化 合物與非水溶性至少擁有二個反應基團的交聯劑組成，介質單體混合物在有機溶液中的重 量百分比濃度為2%至50%，交聯劑佔總介質單位混合物的克分子比為0. 5至1. 0 ; (b)所 述的液滴由可聚合的化合物和交聯劑組成，並通過聚合反應形成具通透性孔的固體多孔顆 粒，交聯劑擁有至少一個自由反基團；(c)清洗固體多孔顆粒以去除水及未聚合的非水溶 性可聚合化合物以及非水溶性交聯劑；(d)使功能單體與固體多孔顆粒中至少一個交聯劑 上自由反應基團反應。 優選地，本發明提供了一種製備具通透性孔的層析分離介質的方法，該方法包括 以下步驟(a)形成由有機溶液液滴及水為連續相組成的懸浮系統，所述的有機溶液由介 質單體混合物溶於至少部分不混溶於水的有機溶劑組成；所述的介質單體混合物由非水 溶性的可聚合化合物和非水溶性至少擁有二個雙鍵的交聯劑組成，所述的介質單體混合物 在有機溶液中的重量百分比濃度為2%至50%，交聯劑佔總介質單體混合物的克分子比為 0. 5至1. 0 ; (b)所述的液滴由可聚合化合物、交聯劑和至少部分不混溶於水的有機溶劑組 成，並通過聚合反應形成帶通透性孔的固體多孔顆粒，其中該交聯劑在經過聚合反應形成 的固體顆粒後，至少帶有一個自由雙鍵；(c)清洗固體多孔顆粒以去除水和未聚合的非水 溶性可聚合化合物以及非水溶性交聯劑；(d)使溶於水的功能單體與固體多孔顆粒中至少 一個交聯劑上的自由雙鍵反應。 本方法具體實施方案中，交聯劑的反應基團為雙鍵，在一些實施例中，顆粒內通透 性孔的平均直徑是O. l微米或小於O. l微米，在另一些實施例中，顆粒內通透性孔的平均直 徑為0. 1微米至0. 5微米，或大於0. 5微米，在一些實施例中，交聯劑佔介質單體混合物的 克分子比為大約0.7到0.9。
具體實施例方式
除非另外說明，下面使用的所有科技術語和本領域內的通用術語具有同樣的意義。本文中所引用的所有專利、文章等都可以在參考文獻中找到全文。如果本文中的術語 和所引用的文章中不一樣，以本申請的術語為準。 本發明的顆粒經二步聚合反應方法合成。本發明的顆粒為不溶於水及許多有機溶 劑的固體，並作為層析柱中的填充材料用作層析分離介質仍保持固體狀態。本顆粒可像其 他層析柱內的固體顆粒填充材料一樣使用。 聚合反應步驟的第一步需要一個雙相懸浮體系包括有機相和水相，如有機相為 連續相，水相則被分散在有機相中，溶於水相中的水溶性可聚合的化合物及水溶性交聯劑 混合物經聚合後形成顆粒。如水相為連續相，有機相則被分散在水相中，溶於有機相中的非 水溶性可聚合化合物及非水溶性交聯劑混合物經聚合後形成顆粒。 如上描述，介質單體混合物既可為由水溶性可聚合化合物和水溶性交聯劑組成的 混合物，或為由非水溶性可聚合化合物和非水溶性交聯劑組成的混合物，介質單體混合物 的重量百分比濃度為2%至大約50%，在一些實施例中，介質單體混合物的重要百分比濃 度為約20%至約40% 。交聯劑佔介質單體混合物的克分子比可以為0. 5至1. O，優選為0. 7 至0. 9，更優選為0. 75至0. 85 (如0. 75)。 可聚合化合物通常是單體其聚合後形成顆粒的多聚物介質，形成多聚物顆粒使用 的可聚合化合物包括乙烯基，烯丙基和異丁烯基化合物，水溶性的化合物包括乙烯乙脂，乙 烯醇，乙烯丙二醇，乙烯吡咯啉酮，丙烯醯胺，甲基丙烯醯胺，羥乙基甲基丙烯酸酯，羥丙基 甲基丙烯酸酯，羥丙基丙烯醯胺，非水溶性化合物包括苯乙烯，羥基苯乙烯，羥甲基苯乙烯， 羥基酚基，甲基丙烯醯胺，丙烯酸縮水甘油酯和甲基丙烯酸酯。 可用於本發明的交聯劑擁有至少二個反應基團(如二個雙鍵)，並與可聚合化學 物反應中直到交聯作用。任何雙功能交聯劑均可使用。水溶性的交聯劑為雙丙烯醯胺，如 N，N'-亞甲雙丙烯醯胺和哌嗪雙丙烯醯胺，非水溶性的交聯劑為雙丙烯脂，異丁烯脂或雙乙 烯基類，如丙烯基甲基丙烯酸酯，雙丙烯基醚亞乙基雙丙烯酸酯，亞乙基雙甲丙烯酸酯，l， 3- 二丙烯氧基-2-丙醇和二乙烯基苯。 經聚合反應及交聯後所形成顆粒中孔的直徑決定於多聚物的疏水性及介質單體 溶劑的極性。在一些具體表現，孔的平均直徑為O. l微米或小於O. l微米。孔的大小也可 通過在介質單體溶劑中加入孔誘發劑進一步控制。 當使用孔誘性劑時，用的量並不苛刻，其最佳使用量可根據使用的誘發劑而改變。 在每個實例中，其最佳用量本領域技術人員能很容易地在通過常規實驗來決定。適用於水 相中介質單體混合物的孔誘發劑包括(但不局限於)乙二醇，聚乙二醇，聚氧乙烯，多糖類 如葡聚糖，和極性溶劑。極性溶劑包括常用於化學合成或高分子化學和一些已知技術。極性 溶劑可以是醇，酮，四氫呋喃，二甲基甲醯胺，二乙基碸，甲基吡咯啉酮以及它們的混合物。 適用於有機相中介質單體混合物的孔誘發劑包括(但不局限於)甲苯，己烷，四氯乙烯或它 們的混合物。這類孔誘發劑也可用作有機相中介質單體混合物的有機溶劑。
用於水溶性介質單體及交聯劑懸浮聚合反應的有機連續相中的有機溶液為至少 部分不混溶於水的有機溶液，並對水相中的介質單體混合物不起化學作用。任何符合上述 性質的廣泛的有機溶液均可使用。此類溶液包括開鏈碳化合物溶液，芳香族溶液及其他化 學類型，其中石蠟族(鏈烷)和異鏈烷烴類溶液最佳。同樣，任何至少部分不混溶於水並能 溶解非水溶性單體混合物的有機溶劑均可用於以水為連續相的有機懸浮相，此類有機溶劑如甲苯，乙烷，四氯乙烯或它們的混合物。 為使懸浮系統穩定，可在連續相中加入懸浮劑或乳化劑，任何能溶於連續相中非 離子形懸浮劑或乳化劑均可使用，如山梨聚糖的衍生物，乙氧基烷基酸類和聚乙氧基醚類。
聚合反應與常規的懸浮聚合反應步驟一樣，單體以分散形式懸浮於連續相中，聚 合反應的起始劑或催化劑溶於介質單體混合相中，現有技術中公知的聚合反應起始劑均可 用於發明，如能產生自由基的起始劑，起始劑的濃度(佔介質單體混合液的百分比濃度)為 約0. 1 %至約2 % ，最好是0. 8至1. 2 % ，適用於水溶性單體的起始劑包括(但不局限於)過 硫酸銨/四甲基乙二胺(TEMED)，2.2'-偶氮基雙(2-氨丙基)鹽酸鹽，2，2'-偶氮雙(N， N'-二亞甲基異丁基胺)，4.4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)，適用於非水溶性單體的引發劑包括 (但不局限於)，2， 2'-偶氮雙(2. 4- 二甲基戊腈)，2， 2'-偶氮雙異丁腈，二甲基2， 2'-偶 氮雙異丁脂，l，l'-偶氮雙(l-環己烷羰基腈)，和2，2'-偶氮雙(2-甲基丁腈)。
介質單體混合相與連續相分別配製，然後經攪拌混合直至平衡，懸浮相液滴的大 小可通過控制攪拌的方法，力度和乳化劑的用量。本發明中，液滴的大小並沒有限制，例如 懸浮液滴可以為20微米至200微米。 一旦懸浮系統形成後，通過增加溫度及吹入氮氣至聚 合反應完成。 聚合反應完成後，顆粒經收集，清洗以去除懸浮溶劑及沒參加反應的化合物。
本發明的第二步，以上帶大量沒參與反應或自由反應基團(如雙鍵)被懸浮在功 能單體溶液當中，功能單體以共價鍵形式連接著不同的功能基團，功能單體既可為水溶性 或非水溶性單體。 功能單體可為已知的，用於層析分離技術上作為吸附劑任何單體(如親和，疏水 相互作用，離子交換等。)此類單體包括(但不限於)非離子型單體，離子型單體，親水單 體，疏水單體和易反應單體。易反應單體是指單體上擁有特殊的功能基團可通過與其它分 子發生化學反應並使其不可逆地連接到多聚物鏈上，用於本發明的功能單體包括鏈烴化合 物，芳香族化合物或雜環化合物，但它們必須擁有可聚合反應的基團(如雙鍵)。舉例如，丙 烯基，烯丙基，乙烯基化合物或類似化合物。 更明確地說，陰離子型的單體用作形成陰離子性的吸附劑(如陽離子交換介質)。 用於陽離子交換介質的功能基團(如連接在乙烯基單體上的)包括羧基(如丙烯酸)，磺酸 基，(如丙烯醯胺基甲基丙磺酸，乙烯磺酸，和烯丙氧羥丙基磺酸)或磷酸基團(如，N-磷 酸乙基丙烯醯胺)。
陽離子型的單體用作形成陽離子性的吸附劑包括以下功能基團，如氨基(如二乙 氨乙基異丁烯醯胺，三甲氨乙基異丁烯醯胺，二烯丙基二甲基氯化胺，和烯丙基二甲氨)。
疏水型單體用於形成疏水作應吸附劑包括辛基丙烯醯胺，辛基異丁烯醯胺，苯基 丙烯醯胺和丁基丙烯醯胺。 活性單體用於親和層析上形成預活化基團(這些預活性基團可進一步與新需配 基結合)。包括脫水甘油丙烯酸酯，脫水甘油甲基丙烯酸酯，丙烯基脫水甘油醚，丙烯醛，丙 烯醯胺基丁醛，二甲基乙縮醛，丙烯酸酐，丙烯醯氯N-丙烯醯琥珀醯亞胺和丙烯氯甲酸酯。
功能單體在溶劑中的重量百分比濃度為2%至80%。在具體應用中可以是20% 至60% ，溶劑可為水，水和有機溶液混合液或有機溶液，聚合反應所用的引發劑或催化劑加 入到單體溶液中，起始劑的濃度可從O. 2%至5%。前面所討論過的引發劑均可用於功能單
7體與多聚物顆粒中保留的反應基團(如沒參加聚合反應的雙鍵)發生聚合反應。多聚物顆 粒與功能單體溶液混合併通過攪拌使懸浮液穩定。顆粒在功能單體溶液中的體積百分比為 10%至80%，最好是30%至60% (V/V)懸浮液經加溫並吹進氮氣至聚合反應完成。
實施例 以下將通過實施例進一步非限定性地說明本發明。 實施例一用水溶性單體及水溶性交聯劑製備層析顆粒 用水溶性單體及水溶性交聯劑製備層析顆粒描述如下 第一步，製備帶雙鍵的基礎顆粒 用以下化合物配製水溶液， 水 22. 5毫升 甲基吡咯啉酮 7. 5毫升 N， N'-亞甲基雙丙烯醯胺 4. 5克 羥丙基異丁烯酯 1.5毫升 4. 4'-偶氮雙(4-氰戊酸) 30毫克(水溶液用65t:溶解所有單體後加入起始劑) 亞甲基雙丙烯醯胺和羥丙基異丁烯酯的總和佔總溶液的重量百分比為21.0%。交 聯劑佔總單體的克分子比為0. 75。溶液與由200毫升isoparH和2毫升sp-80組成的有機 溶液混合。在65t:下用250rpm攪拌10分鐘吹入氮氣。聚合反應可在15分鐘內發生，溫度 因反應的放熱而在25分鐘內增加至75°C。 20分鐘後停止吹入氮氣，並保持攪拌二小時，合 成的顆粒經回收，甲醇清洗及55t:乾燥。
第二步，製備用於陽離子交換介質的層析顆粒。
用來自第一步的基礎顆粒製備陽離子交換介質，其由以下化合物組成





水
丙烯酸鈉
乾燥基礎顆粒
過硫酸銨
NNN' N' _四甲基乙二胺
100毫升 8克
4克(水合狀態約為25毫升) 500毫克 l毫升
丙烯酸鈉佔總溶液的重量百分比濃度為8%，基礎顆粒佔總溶液的重量百分比為 4%，溶液在室溫下用80rpm攪拌15分鐘，吹入氮氣，聚合反應大約在5分鐘內開始，並在10 分鐘內溫度升至3(TC， 15分鐘後停止氮氣並繼續攪拌2小時，反應後的顆粒回收並清洗。
製備用於疏水反應介質的層析顆粒。 用來自第一步的基礎顆粒製備疏水反應介質，由以下化合物組成
甲基吡咯啉酮 100毫升 丁基丙烯醯胺 4克 乾燥基礎顆粒 4克 2. 2'-偶氮雙(2-甲基丁腈)400毫克 丁基丙烯醯胺佔總溶液的重量百分比濃度為4%，基礎顆粒佔總溶液的重量百分 比為4% ，溶液在85t:下用80rpm攪拌15分鐘，吹入氮氣。聚合反應大約在5分鐘內開始， 並在10分鐘內溫度到達89°C ， 15分鐘後停止氮氣並繼續攪拌2小時，反應後的顆粒回收並清洗。 實施例二用非水溶性單體及非水溶性交聯劑製備層析顆粒。 用非水溶性單體及非水溶性交聯劑製備層析顆粒描述如下 第一步，製備帶雙鍵的基礎顆粒 用以下化合物配製有機溶液 甲苯 10毫升 二乙烯基苯 7毫升 苯乙烯 2. 4毫升 2. 2' _偶氮雙異丁腈 40毫克 二乙烯基苯和苯乙烯的總和佔總溶液的重量百分比為43%，交聯劑佔總單體的克 分子比為0.75。溶液與由150毫升水，7克PA-18(聚乙烯醇)和2毫升油酸鈉組成的水溶 液混合，在65t:下用300rpm攪拌10分鐘，吹入氮氣20分鐘，並保持攪拌6小時，合成的顆 粒經回收，甲醇清洗並55t:乾燥。
第二步，製備具環氧基活性基團的層析顆粒。 用來自第一步的基礎顆粒製備具環氧基活性基團的介質，由以下化合物組成
甲基吡咯啉酮 100毫升 縮水甘油醚 10毫升 乾燥基礎顆粒 6克 2. 2'-偶氮雙(2-甲基丁腈) 400毫克 縮水甘油醚佔總溶液的重量百分比濃度為10%，基礎顆粒佔總溶液的重量百分比 為6X，溶液在85t:下用80rpm攪拌15分鐘，吹入氮氣。聚合反應在15分鐘內開始。30分 鍾後停止氮氣並繼續攪拌2小時，反應後的顆粒回收並清洗。
製備用於陰離子交換介質的層析顆粒。 用來自第一步的基礎顆粒製備陰離子交換介質，由以下化合物組成 甲基妣咯啉酮 50毫升 水 50毫升 二乙氨乙基異丁烯醯胺 10毫升 乾燥基礎顆粒 6克 4' 4-偶氮雙(4-氰基戊酸)400毫克 二乙氨乙基異丁烯醯胺佔總溶液的重量百分比濃度為9%，基礎顆粒佔總溶液的 重量百分比為6%，溶液在85t:下用80rpm攪拌15分鐘吹入氮氣。聚合反應在15分鐘開 始，30分鐘後停止氮氣並繼續攪拌2小時，反應後的顆粒回收並清洗。
權利要求
一種製備具通透性孔的層析分離介質的方法，該方法包括以下步驟a)形成由有機溶液液滴及水為連續相組成的懸浮系統，所述的有機溶液由介質單體混合物溶於至少部分不混溶於水的有機溶劑組成；所述的介質單體混合物由非水溶性的可聚合化合物和非水溶性至少擁有二個雙鍵的交聯劑組成，所述的介質單體混合物在有機溶液中的重量百分比濃度為2％至50％，交聯劑佔總介質單體混合物的克分子比為0.5至1.0；b)所述的液滴由可聚合化合物、交聯劑和至少部分不混溶於水的有機溶劑組成，並通過聚合反應形成帶通透性孔的固體多孔顆粒，其中該交聯劑在經過聚合反應形成的固體顆粒後，至少帶有一個自由雙鍵；c)清洗固體多孔顆粒以去除水和未聚合的非水溶性可聚合化合物以及非水溶性交聯劑；d)使溶於水的功能單體與固體多孔顆粒中至少一個交聯劑上的自由雙鍵反應。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述的固體多孔顆粒內通透性孔的平均直徑小於等於O. l微米。
3. 根據權利要求1所述的方法，其中所述的介質單體混合物含有孔誘發劑。
4. 根據權利要求3所述的方法，其中所述的孔誘發劑選自甲苯，己烷，甲氯乙烯或它們的混合物。
5. 根據權利要求1所述的方法，其中交聯劑佔總介質單體混合物的克分子比為0. 7至0. 9。
6. 根據權利要求1所述的方法，其中介質單體混合物在有機溶液中的重量百分比濃度為20%至40%。
7. 根據權利要求1所述的方法，其中所述的可聚合化合物選自乙烯基，烯丙基，丙烯基和異丁烯基化合物。
8. 根據權利要求7所述的方法，其中所述的可聚合化合物選自苯乙烯，羥苯乙烯，羥甲基苯乙烯，羥酚基甲基丙烯甲醯胺，甲基丙烯酸甘油酯和甲基丙烯酸酯。
9. 根據權利要求1所述的方法，其中所述的交聯劑是雙丙烯酯，雙異丁烯酯或雙乙烯基類化合物。
10. 根據權利要求9所述的方法，其中所述的交聯劑包括烯丙基甲基丙烯酸酯，二烯丙基醚，亞乙基二丙烯酸酯，亞乙基二甲基丙烯酸酯，l，3-二烯丙氧基_2-丙醇和二乙烯基苯。
11. 根據權利要求1所述的方法，其中有機溶劑包括甲苯，乙烷，甲氯乙烯，或它們的混合物。
12. 根據權利要求1所述的方法，其中介質單體混合物還包含一種聚合反應起始劑。
13. 根據權利要求12所述的方法，其中聚合反應起始劑選自包括2，2'-偶氮雙(2，4-二甲基戊腈)，2，2'-偶氮雙異丁基腈，二甲基2，2'-偶氮雙異丁脂，l，l'-偶氮雙(l-環己烷羰基腈)和2， 2'-偶氮雙(2-甲基丁腈)。
14. 根據權利要求1所述的方法，其中功能單體含有陰離子功能基團，其包括羧基，磺酸基和磷酸基。
15. 根據權利要求1所述的方法，其中功能單體含有陽離子功能基團，其包括二乙氨乙基異丁烯醯胺，三甲氨乙基異丁烯醯胺，二烯丙基二甲基氯化胺和烯丙基二甲胺。
16. 根據權利要求1所述的方法，其中功能單體溶於溶液中，該溶液還含有一種聚合反 應起始劑。
17. 根據權利要求1所述的方法製備顆粒狀的層析分離介質。
全文摘要
本發明涉及層析顆粒介質的製備方法，特別是利用二步聚合反應製備層析顆粒的方法。該方法包括介質單體混合物中的介質單體及交聯劑溶解於被懸浮在連續相中的液體液滴中，並聚合成顆粒。該顆粒內含有大量擁有至少一個未反應或如雙鍵的自由反應基團的交聯劑。所述的顆粒被懸浮在功能單體的溶液中，顆粒上自由反應基團與功能單體反應形成具有功能基團的層析顆粒。
文檔編號B01J20/26GK101791542SQ20101012881
公開日2010年8月4日 申請日期2004年4月30日 優先權日2004年4月30日
發明者姜韜, 廖加明 申請人:北京九強生物技術有限公司