食療梨汁的製作方法

2023-07-15 23:07:16

食療梨汁的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種食療梨汁的製作方法，包括：將產納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和10263分別進行亞硝基胍誘變，然後混合二者誘變後代，進行細胞融合傳代培養，並在基因組重排技術基礎上進一步採用底物誘導適應性策略，高通量篩選得到高產納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌；將乾酪乳桿菌進行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營養缺陷型的乾酪乳桿菌；將篩選出的納豆芽孢桿菌和乾酪乳桿菌共發酵梨汁，得到富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的梨汁。本發明得到的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的梨汁中，吡咯喹啉醌含量達到70-91ng/mL，納豆激酶活力達到401-615U/mL。
【專利說明】食療梨汁的製作方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物工程與發酵領域，具體涉及一種食療梨汁的製作方法。

【背景技術】
[0002] 納豆由大豆經納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)發酵而成，具有多重生理功效：
[0003] ①納豆對心血管系統的作用：納豆中一種標誌性生理活性物質納豆激酶 (Nattokinase，NK)是能夠溶解血栓的蛋白質，由275個胺基酸殘基組成，分子量27KD左右， 無毒、無副作用，是一種絲氨酸蛋白酶，其溶栓效果甚至超過溶栓製劑尿激酶。納豆激酶除 具有直接溶栓作用外，還具有促進靜脈內皮細胞產生纖維蛋白溶酶原激活劑的能力，從而 間接表現其溶栓活性。納豆中亞油酸佔全脂質的50%，亞油酸能夠降低血漿中膽固醇含量， 有預防動脈硬化、心臟病和高血壓的功效，具有血栓溶解作用；
[0004] ②納豆對消化系統的作用：大豆蛋白質經納豆酶的作用轉化成可溶性多肽和氨 基酸，有利於人體吸收。Ig納豆中含有10億個以上納豆菌，納豆菌繁殖快，能消耗腸道中 的氧，可以抑制引起腸內異常發酵的痢疾桿菌等腐敗菌，促進乳酸菌繁殖，調節腸內細菌平 衡，預防痢疾、腸炎和便秘等。大豆經過納豆菌發酵蓄積了大量蛋白酶、澱粉酶、脂肪酶、酯 酶、纖維素酶和脲酶等酶群，這些生物酶在消化系統中能夠有效調理促進消化吸收。納豆芽 孢桿菌在通過分解利用大豆蛋白進行繁殖的過程中，可以產生大量酵素、維生素、多聚穀氨 酸和多聚果糖等粘性物質，其被覆在胃腸黏膜表面起到保護作用，飲酒時可緩解酒醉。納豆 菌還能殺死腸道出血性大腸桿菌；
[0005] ③納豆對免疫系統的作用：通過接種納豆菌的動物實驗發現，納豆可以提高機體 抵抗力，排除侵入的葡萄球菌，還可以誘發機體幹擾素生成，增強機體免疫力；納豆中含有 活性物質如皂草甙、維生素 B2、維生素 E等，每天食用可除去體內致癌物質，預防癌症發生， 並可軟化血管，促進肌膚光滑；
[0006] ④促進骨骼發育：維生素 K2可促進鈣與蛋白質結合從而促進骨骼形成，在骨骼形 成過程中起著重要作用，而納豆中維生素1(2含量是其他發酵食品的數百倍，有預防骨質疏 松、腰痛等老年病的功效。
[0007] 近年發現納豆還具有其它更豐富廣泛的生理功效，源於其另一種標誌性生理活性 物質-批咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ)，它是繼黃素核苷酸和煙醯胺核苷 酸之後在細菌脫氫酶中發現的第三種輔基，化學名稱為4, 5-二氫-4, 5-二氧化-1-氫吡咯 (2, 3f)醌-2, 7, 9-三羧酸，又名Methaxatin。雖然自然條件下僅少數細菌如Methylovorus、 Deinococcus radiodurans>Gluconobacter oxydans、Klebsiella pneumoniae 等會泛夠合成 PQQ，但在各種植物、動物以及人體內都發現含有微量PQQ。日本科學家測定了 26種常見食 物中的PQQ含量，發現1克食物中PQQ含量在3. 65-61納克不等，例如，蔬菜中的歐芹、青椒， 水果中的奇異果、木瓜，飲品中的綠茶、烏龍茶，以及人們常吃的豆腐。值得注意的是，日本 傳統食物納豆當中PQQ含量最高，達到61納克/克。
[0008] PQQ作為一種普遍存在於動物和植物組織中的氧化還原酶輔基，雖然含量非常低， 但作用重要，不僅是一種新發現的線粒體呼吸鏈組分，參與催化生物體內氧化還原反應，還 具有非常多樣的生物活性，缺乏時會引起哺乳動物諸多代謝障礙，被認為是一種新型維生 素。PQQ對哺乳動物的主要生理作用有：
[0009] ①全面提高人體免疫功能：PQQ作為人類發育的必要因子，能刺激人體細胞生長， 尤其是激活人體B細胞、T細胞，提高人體免疫功能；
[0010] ②防治肝損傷：PQQ能顯著降低血清膽紅素和谷丙轉氨酶水平，調理肝損傷，對肝 髒疾病有極好療效；
[0011] ③減少自由基對人體的傷害=PQQ是一種氧化還原酶輔基，參與生物體內氧化還 原反應，能有效清除體內自由基，減少自由基對人體傷害所引發的各種疾病，如心臟病、癌 症以及各類炎症；
[0012] ④調理各種神經系統疾病：PQQ在體內能促進神經因子合成，調理各種神經系統 疾病；
[0013] ⑤促進胺基酸吸收：PQQ是醌蛋白酶的輔基，參與呼吸鏈電子傳遞，在人體內能促 進胺基酸吸收；
[0014] ⑥促進生長因子合成：生長因子是人類生長的激素，PQQ能刺激人體細胞生長，增 加細胞密度，微量PQQ就能提高生物體組織的代謝能力和生長機能；
[0015] ⑦防治老年痴呆症：PQQ具有修復神經纖維、活化神經元、激活休眠神經細胞的能 力，能有效防治老年痴呆症和改善記憶力；
[0016] ⑧促進穀胱甘肽合成：穀胱甘肽具有重要抗氧化作用和整合解毒作用，PQQ能促 進機體穀胱甘肽合成，防止白內障發生和肝臟膽紅素積累；
[0017] ⑨極強的抗癌功能：PQQ激活自然殺傷細胞（NK)細胞為ANK細胞，使其具有殺腫 瘤作用；使NK細胞等免疫細胞聚集，更有效地殺滅腫瘤細胞；封閉腫瘤細胞載鐵蛋白受體， 阻斷其功能，抑制腫瘤生長、轉移；破壞腫瘤細胞脂質雙層，使腫瘤細胞溶解死亡；阻止腫 瘤細胞DNA複製，促其凋亡。
[0018] 在天然食品中，納豆獨有NK，並且PQQ含量最豐富。納豆中的NK和PQQ由納豆芽 孢桿菌產生。納豆是日常健康食品，納豆芽孢桿菌是公認安全的食品級微生物（GRAS微生 物），對納豆芽孢桿菌進行定向選育，然後與乳酸菌共發酵，製備富含NK和PQQ的食品，對於 人們在日常飲食中補充NK和PQQ、充分發揮NK和PQQ的生理調理作用具有重要意義。
[0019] 梨含蛋白質、脂肪、鈣、磷、鐵和葡萄糖、果糖、蘋果酸、胡蘿蔔素及多種維生素。梨 有止咳平喘功效，梨皮和梨葉、花、根也均可入藥，有潤肺、消痰、清熱、解毒等功效；梨中含 有豐富B族維生素，能保護心臟，減輕疲勞，增強心肌活力，降低血壓；梨所含的配糖體及鞣 酸等成分，能祛痰止咳，對咽喉有養護作用；梨有較多糖類物質和多種維生素，易被人體吸 收，增進食慾，對肝臟具有保護作用；梨性涼並能清熱鎮靜，常食能使血壓恢復正常，改善頭 暈目眩等症狀；食梨能防止動脈粥樣硬化，抑制致癌物質亞硝胺的形成，從而防癌抗癌；梨 中果膠含量很高，有助於消化、通利大便；煮熟的梨有助於腎臟排洩尿酸和預防痛風、風溼 病、關節炎。梨汁保留了梨的營養成分。梨汁經乳酸菌發酵後，將進一步形成乳酸菌素、活 性脂肪酸、以乳酸為主的有機酸等諸多食療物質。
[0020] 乳酸菌發酵除能產生諸多食療成分外，還能賦予怡人的甜酸口感。納豆芽孢桿菌 發酵則能產生NK和PQQ。本發明通過選育納豆芽孢桿菌和乾酪乳桿菌及其共發酵，開發出 富含NK和PQQ的食療發酵梨汁。但如果幹酪乳桿菌與納豆芽孢桿菌在同一體系中生長不 平衡會導致一種菌在競爭中排斥另一種，共發酵無法順利進行。關於生理特性，即使在野生 狀態下，乳酸菌胞壁蛋白酶PrtS也只有少數菌株具有且活力不高，分解蛋白質獲得必需氨 基酸的能力不足，而納豆芽孢桿菌具有較強蛋白酶活力，其分解蛋白質產生胺基酸和肽可 滿足乳酸菌對胺基酸的需求。納豆芽孢桿菌兼性厭氧，通過消耗氧氣也促進乳酸菌生長和 產酸。在本發明中，除了納豆芽孢桿菌和乾酪乳桿菌兩者之間存在不嚴格偏利共生關係外， 更通過選育手段使乾酪乳桿菌因形成甲硫氨酸營養缺陷（Met-)而與納豆芽孢桿菌形成嚴 格偏利共生關係，從而保證了乾酪乳桿菌與納豆芽孢桿菌的共發酵順利進行。
[0021] 納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的代謝途徑迄今尚未完全明了，從而無法通過理性優 化手段提高納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的產率。而且由於糖、胺基酸、脂類、核苷酸四大有 機物代謝之間的相通和密切關聯，使得微生物細胞代謝網絡既顯示出剛性（Rigidity)又 顯示出柔性（Plasticity)，處於嚴格控制之中，剛性表現為牽一髮而動全身，從而在許多情 形下，即使明了代謝途徑，定點理性突變也並不能獲得理想表型，而柔性表現為對整個代謝 網絡中處於不同節點但又相關的途徑進行協同突變後，會表現出新的代謝屬性。欲提高納 豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的產率，不明了其代謝途徑並不成為不可逾越的障礙，只要有合 適的非理性優化手段（Unrational optimization technique),對所有可能與NK和PQQ合 成有關的主流及旁支途徑統籌優化,實現多位點協同突變,並通過高通量篩選使多位點協 同突變的表型從突變庫中凸顯，即可實現提高納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ產率的目標。
[0022] 隨機突變是最常見的非理性優化手段，雖然它能夠產生突變位點數量足夠大的突 變庫，但在突變庫中，各突變位點往往是分散獨立於單個細胞中，相互之間無法優化組合， 而且大多不產生可見表型，從而使得絕大多數突變隱沒於突變庫中而不能得到篩選。
[0023] 基因組重排（Genome Shuffling)是在隨機突變的基礎上發展起來的新型誘變育 種技術。它是在通過隨機突變產生突變位點數量足夠大的突變庫的基礎上，進一步通過 細胞融合使各突變位點優化組合，從而使突變指數級上升特別是增加大量表型可見突變。 基因組重排為利用微生物代謝網絡這種柔性進行多點協同突變的菌種選育提供了技術支 撐。Zhang等（2002)首先以傳統誘變方法獲得一個突變庫，篩選出若干個正向突變株作為 出發株，然後通過多輪遞推原生質體融合的方式使眾多基因隨機重組，實現基因組重排，最 終從突變庫中篩選出性狀被提升的目的菌株；St印hanopoulos (2002)通過基因組重排改 造了細菌表型；Patnaik等（2002)利用基因組產品技術實現了乳酸桿菌的一株工業菌株 的改良，令其在pH 4.0下乳酸產量為出發野生菌株的3倍；Gao等（2012)通過兩輪基因 組重排，使 Clostridium acetobutylicum CICC 8012 產 Acetone-Butanol-Ethanol (ABE) 提高了 34. 53% ;Ge 等（2012)通過基因組重排獲得 Saccharomyces cerevisiae GS3-10， 其對五碳糖和六碳糖的轉化率達到69. 48 %和100%，而出發菌株為14. 83 %和100%， 乙醇產率達到47.08g/L，而出發菌株為18. 12g/L;Kang等（2011)通過基因組重排，使 Aureobasidium pullulans產普魯藍多糖大幅度提高，並且遺傳穩定；Zheng等（2010)通 過基因組重排提高了 Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538的D-乳酸產率和耐 酸性；John等（2008)通過原生質體融合式的基因組重排，獲得了以木薯-甘蔗渣為基質 的乳酸商廣菌株；Yu等（2008)通過基因組重排獲得了糖耐度提商從而乳酸廣率增加的 Lactobacillus rhamnosus ;Wang等（2007)通過基因組重排獲得了耐酸度提高從而乳酸產 率增加的 Lactobacillus rhamnosus。
[0024] 基因組重排也為進行微生物代謝組學分析提供了支撐。經過基因組重排而代謝 優化的目的菌其遺傳背景來源於出發菌，故通過比對目的菌與出發菌的蛋白表達譜差異， 輔以代謝流和代謝控制分析技術，即可解析導致代謝優化的關鍵酶及有關途徑的調控機 制。Luo 等（2012)通過基因組重排使 Streptomyces gilvosporeus ATCC 13326 的遊黴素 (natamycin)產率明顯升高，Streptomyces gilvosporeus ATCC 13326 的蛋白表達譜發生 明顯改變，34種蛋白表達上升而20種蛋白表達下降，提示與遊黴素合成有關的牽涉廣泛的 代謝網絡得到優化；Zhang等（2010)通過基因組重排，使Propionibacterium shermanii產 Vb12大幅度提高，重排後菌株38種蛋白表達發生改變，其中22種蛋白表達上升而16種蛋白 表達下降，在表達上升的22種蛋白中，有6種是V b12合成途徑中的酶，提示與V B12合成有關 的牽涉廣泛的代謝網絡得到優化。
[0025] 但目前基因組重排在策略上存在一定缺陷，主要是選育培養基與發酵培養基之間 無關聯，使得選育到的菌株在發酵時目標產物產率遠低於預期。針對此問題，本發明在進行 基因組重排選育時，選育平板中添加一定比例的發酵培養基組分，而發酵培養基中添加一 定比例的選育平板組分，使得選育與發酵兩環節之間形成關聯，保障了選育環節表現出高 產表型的菌株在發酵時依然表現出高產表型，此即為本發明的底物誘導適應性策略。因此， 在對納豆芽孢桿菌高產NK兼PQQ表型進行基因組重排選育時，在選育平板中添加一定比例 梨汁，而在梨汁發酵時則添加一定比例豆芽汁。


【發明內容】

[0026] 本發明提供了一種食療梨汁的製作方法。本發明在基因組重排技術基礎上進一 步採用底物誘導適應性策略，對納豆芽孢桿菌所有可能與NK和PQQ合成有關的主流及旁 支途徑統籌優化，實現多位點協同突變，進而通過高通量篩選使多位點協同突變的表型從 突變庫中凸顯，獲得能夠在梨汁發酵中高產NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-503。 同時，通過隨機誘變獲得甲硫氨酸營養缺陷（Me〇乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota-Met-，LcS-MeO。LcS-Mef 在生長速度上高於 BN-NKPQQ-RWX-503,但前者對後者 營養依賴，兩者之間形成穩定共生關係，保障了共發酵順利完成，從而獲得富含NK和PQQ的 梨汁。
[0027] -種食療梨汁的製作方法，包括以下步驟：
[0028] 1)、將產NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263分別進行亞硝基 胍誘變；然後混合二者誘變後代，進行細胞融合傳代培養，在基因組重排技術基礎上進一步 採用底物誘導適應性策略，高通量篩選得到高產NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌，命名為納豆芽 孢桿菌 BN-NKPQQ-RWX-503 ;
[0029] 細胞融合傳代培養實現基因組改組，使納豆芽孢桿菌10261和10623所有誘變後 代的優勢突變得到優化整合。如有必要，可對融合後代進行第二輪或者多輪誘變及融合，直 至選育出NK兼PQQ產率高且生長旺盛、遺傳穩定、適合作為生產菌株的高產NK兼PQQ納豆 芽孢桿菌。
[0030] 2)、將乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)進行亞硝基胍誘變，從中篩選 出甲硫氨酸營養缺陷型的乾酪乳桿菌，命名為乾酪乳桿菌LcS-Meif (Lactobacillus casei Shirota-Met-)；
[0031] 3)將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-503和乾酪乳桿菌LcS-Mef共發酵梨汁，得到 富含NK和PQQ的梨汁，得到的富含NK和PQQ的梨汁即為食療梨汁。
[0032] 本發明在基因組重排技術基礎上進一步採用底物誘導適應性策略，對納豆芽孢杆 菌所有可能與NK和PQQ合成有關的主流及旁支途徑統籌優化，實現多位點協同突變，進而 通過高通量篩選使多位點協同突變的表型從突變庫中凸顯，獲得能夠在梨汁發酵中高產NK 兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-503。同時，通過隨機誘變獲得甲硫氨酸營養缺陷 (Met )幹釀乳桿菌LcS-Met。
[0033] 欲使乾酪乳桿菌與納豆芽孢桿菌順利共發酵，兩者之間應形成共生關係。本發 明的策略是使通常情況下競爭佔優的乾酪乳桿菌成為甲硫氨酸營養缺陷（LcS-MeO，從 而在代謝上對納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-503形成依賴，其所需要的甲硫氨酸（Met) 由納豆芽孢桿菌供給，即形成嚴格的偏利共生關係。雖然LcS-Mef在生長速度上高於 BN-NKPQQ-RWX-503,但前者對後者營養依賴，兩菌之間形成穩定共生關係，保障了共發酵順 利完成，從而獲得富含NK和PQQ的梨汁。
[0034] 所用納豆芽孢桿菌和乾酪乳桿菌均屬於食品級安全微生物，共發酵得到的富含NK 和PQQ的梨汁中，PQQ含量達到70-91ng/mL。NK活力達到401-615U/mL。所獲得的梨汁富 含納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有梨汁固有的滋味和發酵後特有的風味。
[0035] 步驟1)中，納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263採用現有技術，納豆芽孢 桿菌10261來自中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽區酒仙橋中 路24號院6號樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號為10261 ;納豆芽孢桿菌10263來自中 國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽區酒仙橋中路24號院6號樓； 保藏日期為2002年，菌種保持編號為10263;乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota) 來自養樂多（上海）有限公司；小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb採用市售產品，購自嘉興元科 生物科技有限公司，商品號為YK-Ab-013。
[0036] 所述的底物誘導適應性基因組重排後的高通量篩選具體包括：①製備2個平板 豆芽汁梨汁固體培養基（梨汁佔平板總量的10% -15%，使得選育培養基與發酵培養基 之間發生關聯，此即為本發明的底物誘導適應性策略），其中一個將小鼠抗PQQ IgG單抗 PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個將瓊脂糖-纖維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽孢杆 菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變融合後代塗布其中一個平板後，再用纖維素膜影印 至另一個平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平板A中，高產PQQ誘變融合後代菌落 周圍形成肉眼可見沉澱線，根據沉澱圈直徑大小可肉眼判斷產PQQ量大小；④平板B中，高 產NK誘變融合後代菌落周圍形成透明圈，根據透明圈直徑大小可肉眼判斷產NK活力高低； ⑤平板A與平板B中，高產PQQ菌落與高產NK菌落處於同一位置者，即為高產NK兼PQQ的 納豆芽孢桿菌。
[0037] 所獲得的高產NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-503保藏於斜面豆芽汁梨 汁固體培養基中。
[0038] 所述的平板豆芽汁梨汁固體培養基和斜面豆芽汁梨汁固體培養基以IL計，由以 下量的組分組成：
[0039] 梨汁 100?150mL; 鹿糖 4.0?6.0g; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 餘量。
[0040] 進一步優選，所述的平板豆芽汁梨汁固體培養基和斜面豆芽汁梨汁固體培養基以 IL計，由以下量的組分組成：
[0041] 梨汁 100?150mL; 蔗糖 5.0g; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 餘量。
[0042] 所述的豆芽汁的製備：剛出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸濃縮至IOOOmL後過 濾，得到豆芽汁。
[0043] 該平板豆芽汁梨汁固體培養基的配方有利於納豆芽孢桿菌菌落形成和高通量篩 選。該斜面豆芽汁梨汁固體培養基的配方有利於納豆芽孢桿菌保藏。
[0044] 本發明中，採用基因組重排技術選育納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-503時，選育平 板中添加一定比例的發酵培養基組分（梨汁），而發酵培養基中添加一定比例的選育平板 組分（豆芽汁），使得選育與發酵兩環節之間形成關聯，促使選育環節表現出高產表型的菌 株在發酵時依然表現出高產表型，此即為本發明的底物誘導適應性策略。
[0045] 步驟2)中，所述的從中篩選出甲硫氨酸營養缺陷型的乾酪乳桿菌，具體包括：① 製備2個平板MRS固體培養基，其中一個將甲硫氨酸（Met)配入（Met添加量為10-15mg/ L)，為平板C，另一個為單純MRS固體培養基平板（平板D)，為平板D ;②將誘變後的乾酪乳 桿菌（Lactobacillus casei Shirota)塗布其中一個平板後，再用纖維素膜影印至另一個 平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出現菌落 而平板D未出現菌落，或平板C上的菌落顯著大於平板D上的菌落，則該菌落為甲硫氨酸營 養缺陷型乾酪乳桿菌，命名為乾酪乳桿菌LcS-Met^保藏於斜面MRS固體培養基中。
[0046] 所述的平板MRS固體培養基和斜面MRS固體培養基以IL計，由以下量的組分組 成：
[0047] 蛋白腖 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 梓檬酸氧二銨 2.Og; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 鱗酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 餘量；
[0048] 該MRS固體培養基的pH值保持在6. 2?6. 4。
[0049] 該MRS固體培養基有利於乾酪乳桿菌菌落形成和甲硫氨酸營養缺陷型乾酪乳杆 菌的篩選。
[0050] 本發明中，採用隨機誘變技術獲得甲硫氨酸營養缺陷（MeO的乾酪乳杆 菌（Lactobacillus casei Shirota-Meif，LcS-Meif)。LcS-Meif在生長速度上高於 BN-NKPQQ-RWX-503,但前者對後者營養依賴，兩者之間形成穩定共生關係，通過構建共生關 系的策略實現納豆芽孢桿菌與乾酪乳桿菌的共發酵，獲得富含NK和PQQ的梨汁。
[0051] 步驟3)中，在共發酵之前，將BN-NKPQQ-RWX-503和LcS-Mef分別進行活化培養， BN-NKPQQ-RWX-503在豆芽汁梨汁液體培養基中進行活化培養，培養溫度為34?36°C (優 選35°C )，LcS-Met-在MRS液體培養基中進行活化培養，培養溫度為36?38°C (優選 37〇C ) 〇
[0052] 所述的豆芽汁梨汁液體培養基以IL計，由以下量的組分組成：
[0053] 梨汁 100 ?150mL ;
[0054] 鹿糖 4. 0 ?6. Og ;
[0055] 豆芽汁 餘量。
[0056] 所述的豆芽汁梨汁液體培養基以IL計，優選的，由以下量的組分組成：
[0057] 梨汁 100 ?150mL ;
[0058] 蔗糖 5. Og ;
[0059] 豆芽汁 餘量。
[0060] 該豆芽汁梨汁液體培養基的配方有利於納豆芽孢桿菌增殖培養。豆芽汁製備：剛 出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸濃縮至IOOOmL後過濾，得到豆芽汁。
[0061] 所述的MRS液體培養基以IL計，由以下量的組分組成：
[0062] 蛋白腖 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫 80 l.OmL； 水 餘量；
[0063] 該MRS液體培養基的pH值保持在6. 2?6. 4。
[0064] 該MRS液體培養基有利於乾酪乳桿菌增殖培養。
[0065] 將BN-NKPQQ-RWX-503和LcS-Met_共發酵含梨汁的發酵培養基，具體包括：將活化 後的BN-NKPQQ-RWX-503和LcS-Met_混合，形成混合菌液，將混合菌液接種至含梨汁的發酵 培養基，紗布封口培養後得到富含NK和PQQ的梨汁。
[0066] 所述的含梨汁的發酵培養基以IL計，由以下量的組分組成：
[0067] 鹿糖 50.Og; 酪氨酸 〇.5g; 穀氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; Λ7.芽 il- IOOmL; 梨汁 餘量。
[0068] 所述的梨汁的製備包括：水中加梨的果肉，碾磨成漿汁，得到梨汁。具體地，如 IOOmL水中加10?25g梨果肉，碾磨成漿汁。
[0069] 混合菌液中，所述的BN-NKPQQ-RWX-503和LcS-Mef的混合密度比為1:2?1:5。
[0070] 所述的混合菌液接種至含梨汁的發酵培養基的接種量為1 %?5%。
[0071] 所述的紗布封口培養的條件為：37°C?42°C六層紗布封口培養24h?36h。
[0072] 共發酵時，在含梨汁的發酵培養基中，添加酪氨酸和穀氨酸對BN-NKPQQ-RWX-503 進行代謝調控，促進PQQ合成，添加麥芽糖對BN-NKPQQ-RWX-503進行代謝調控，促進NK生 成，添加豆芽汁促進BN-NKPQQ-RWX-503在梨汁發酵過程中的增殖。本發明中，納豆芽孢杆 菌與乾酪乳桿菌選育及其共發酵製備的發酵梨汁富含納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有梨汁固 有的滋味和發酵後特有的風味。
[0073] 與現有技術相比，本發明具有如下優點：
[0074] -、本發明使用的納豆芽孢桿菌和乾酪乳桿菌均屬於食品級安全微生物。
[0075] 二、首次採用基因組重排技術優化NK和PQQ合成途徑，對納豆芽孢桿菌所有可能 與NK和PQQ合成有關的主流及旁支途徑統籌優化，實現多位點協同突變，進而通過高通量 篩選使多位點協同突變的表型從突變庫中凸顯。同時，在基因組重排技術基礎上進一步採 用底物誘導適應性策略，保障了選育環節表現出高產表型的菌株在發酵時依然表現出高產 表型，獲得能夠在梨汁發酵中高產NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-503。
[0076] 三、首次採用構建共生關係的策略實現納豆芽孢桿菌與乾酪乳桿菌的共發酵。通 過隨機誘變獲得甲硫氨酸營養缺陷（MeO乾酪乳桿菌LcS-Met' LcS-Mef在生長速度上 高於BN-NKPQQ-RWX-503,但前者對後者營養依賴，兩者之間形成穩定共生關係，保障了共發 酵順利完成，從而獲得富含NK和PQQ的梨汁。
[0077] 四、從結構上看，PQQ通過酪氨酸和穀氨酸之間形成肽鍵連接環化而成。本發明通 過在含梨汁的發酵培養基中添加酪氨酸和穀氨酸對BN-NKPQQ-RWX-503進行代謝調控，促 進PQQ合成。通過在含梨汁的發酵培養基中添加麥芽糖對BN-NKPQQ-RWX-503進行代謝調 控，促進NK生成。通過在含梨汁的發酵培養基中添加豆芽汁促進BN-NKPQQ-RWX-503在梨 汁發酵過程中的增殖，從而得到富含NK和PQQ的梨汁，PQQ含量達到70-91ng/mL。NK活力 達到401-615U/mL。所獲得的梨汁富含納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有梨汁固有的滋味和氣 味。

【具體實施方式】
[0078] 在實施例中，有關培養基配製如下，
[0079] (a)所述的豆芽汁梨汁液體培養基配製完成後，121°C滅菌15min，以IL計，由以下 量的組分組成：
[0080] 梨汁 130mL ;
[0081] 鹿糖 5. Og ;
[0082] 豆芽汁 餘量；
[0083] 該豆芽汁梨汁液體培養基的配方有利於納豆芽孢桿菌增殖培養。豆芽汁製備：剛 出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸濃縮至IOOOmL後過濾，得到豆芽汁。
[0084] (b)所述的豆芽汁梨汁固體培養基（平板）配製完成後，121°C滅菌15min，以IL 計，由以下量的組分組成：
[0085] 梨? 丨· 130mL； 蔗糖 5.0g; 瓊脂 1..8g; 豆芽汁 餘量；
[0086] 該豆芽汁梨汁固體培養基（平板）的配方有利於納豆芽孢桿菌菌落形成和高通量 篩選。
[0087] (c)所述的豆芽汁梨汁固體培養基（斜面）配製完成後，121°C滅菌15min，以IL 計，由以下量的組分組成：
[0088] 梨? 丨· 130mL； 蔗糖 5.0g; 瓊脂 丨..8g; 豆芽汁 餘量；
[0089] 倒試管斜面
[0090] 該豆芽汁梨汁固體培養基（斜面）的配方有利於納豆芽孢桿菌的保藏。
[0091] (d)所述的MRS液體培養基配製完成後，121°C滅菌15min，以IL計，由以下量的組 分組成：
[0092] 蛋白腖 l〇.〇g;
[0093] 牛肉膏 l〇.〇g; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 〇.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫 80 l.OmL； 水 餘量；
[0094] pH 6. 2 ?6. 4
[0095] 該MRS液體培養基有利於乾酪乳桿菌增殖培養。
[0096] (e)所述的MRS固體培養基（平板）配製完成後，121°C滅菌15min，以IL計，由以 下量的組分組成：
[0097] 蛋白腖 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 梓檬酸氧二按 2.Og; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 餘量；
[0098] pH 6. 2 ?6. 4
[0099] 該MRS固體培養基有利於乾酪乳桿菌菌落形成和篩選。
[0100] (f)所述的MRS固體培養基（斜面）配製完成後，121°C滅菌15min，以IL計，由以 下量的組分組成：
[0101] 蛋白腖 l〇.〇g; 牛肉膏 l〇.〇g;
[0102] 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 餘量；
[0103] pH 6. 2 ?6. 4
[0104] 倒試管斜面
[0105] 該MRS固體培養基（斜面）有利於乾酪乳桿菌保藏。
[0106] (g)所述的含梨汁的發酵培養基以IL計，由以下量的組分組成：
[0107] 蔗糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 穀氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; V 芽?|· IOOmL; 梨汁 餘量。
[0108] (h)所述的梨汁的製備包括：1000mL水中加200g梨果肉，碾磨成漿汁。
[0109] 本發明實施例中，納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263採用現有技術，納豆 芽孢桿菌10261來自中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽區酒仙 橋中路24號院6號樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號為10261 ;納豆芽孢桿菌10263 來自中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽區酒仙橋中路24號院 6號樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號為10263 ;乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)來自養樂多（上海）有限公司；小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb採用市售產品，購 自嘉興元科生物科技有限公司，商品號為YK-Ab-013。
[0110] 實施例1
[0111] 本發明通過納豆芽孢桿菌與乾酪乳桿菌選育及其共發酵製備富含NK和PQQ的梨 汁，包括以下步驟：
[0112] (1)高產NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-503的選育
[0113] 採用底物誘導適應性策略，通過基因組重排及高通量篩選技術獲得高產NK兼PQQ 的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-503,具體方法為：首先構建納豆芽孢桿菌突變庫，將已獲 得的產NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌10261和10263分別進行亞硝基胍誘變；然後混合二者誘 變後代，進行細胞融合（促融劑為聚乙二醇4000)，傳代培養，實現基因組改組，使納豆芽孢 桿菌10261和10623所有誘變後代的優勢突變得到優化整合，選育出NK兼PQQ產率高且生 長旺盛、遺傳穩定、適合作為生產菌株的高產NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌。
[0114] 突變庫高通量篩選：①製備2個豆芽汁梨汁固體培養基平板（梨汁佔平板總量的 10-15%，使得選育培養基與發酵培養基之間發生關聯，此即為本發明的底物誘導適應性策 略），其中一個將小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個將瓊脂糖-纖維蛋 白配入，形成平板B ;②將納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變融合後代塗布 其中一個平板後，再用纖維素膜影印至另一個平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平 板A中，高產PQQ誘變融合後代菌落周圍形成肉眼可見沉澱線，根據沉澱圈直徑大小可肉眼 判斷產PQQ量大小；④平板B中，高產NK誘變融合後代菌落周圍形成透明圈，根據透明圈直 徑大小可肉眼判斷產NK活力高低；⑤平板A與平板B中，高產PQQ菌落與高產NK菌落處於 同一位置者，即為高產NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌。所獲得的高產NK兼PQQ的納豆芽孢杆 菌命名為BN-NKPQQ-RWX-503,保藏於豆芽汁梨汁固體培養基（斜面）中。
[0115] (2)甲硫氨酸營養缺陷（MeO的乾酪乳桿菌（LcS-MeO的選育
[0116] 將乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)進行亞硝基胍誘變，從中篩選出 甲硫氨酸營養缺陷型（LcS-MeO。
[0117] LcS-Met-篩選：①製備2個MRS固體培養基平板，其中一個將甲硫氨酸（Met)配 入（平板C，Met添加量為10-15mg/L)，另一個為單純MRS平板（平板D);②將乾酪乳桿菌 (Lactobacillus casei Shirota)的誘變後代塗布其中一個平板後，再用纖維素膜影印至 另一個平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出 現菌落而平板D未出現菌落，或平板C上的菌落顯著大於平板D上的菌落，則該菌落甲硫氨 酸營養缺陷型乾酪乳桿菌，命名為LcS-Met^保藏於MRS固體培養基（斜面）中。
[0118] (3)BN-NKPQQ-RWX-503 的活化培養
[0119] 將保存於豆芽汁梨汁固體培養基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-503取一環，接種至 豆芽汁梨汁液體培養基活化，培養溫度35°C，培養結束菌種密度達到10 9cfu/mL左右。
[0120] (4) LcS-Meif 的活化培養
[0121] 將保存於MRS固體培養基（斜面）中的LcS_Met_取一環，接種至MRS液體培養基 37°C活化培養，培養結束菌種密度達到10 9cfu/mL左右。
[0122] (5)富含NK和PQQ的梨汁的發酵製備
[0123] 將活化的BN-NKPQQ-RWX-503與LcS_Met_混合，使混合菌液中二者密度比為 1:2 (I X IO8CFMAiL: 2 X 108CFM/mL)，混合菌液以1 %接種量接種含梨汁的發酵培養基，42°C 六層紗布封口培養24h，得到富含NK和PQQ的梨汁。含梨汁的發酵培養基中所含豆芽汁、酪 氨酸、穀氨酸和麥芽糖對BN-NKPQQ-RWX-503合成NK和PQQ進行代謝調控，豆芽汁有利於納 豆芽孢桿菌增殖，麥芽糖有利於NK合成，而PQQ由酪氨酸和穀氨酸通過肽鍵連接環化而成。 發酵結束後，梨汁中NK活力401U/mL，PQQ含量70ng/mL。所獲得的梨汁富含納豆激酶和吡 咯喹啉醌，具有梨汁固有的滋味和發酵後特有的風味。
[0124] 實施例2
[0125] 本發明通過納豆芽孢桿菌與乾酪乳桿菌選育及其共發酵製備富含NK和PQQ的梨 汁，包括以下步驟：
[0126] (1)高產NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-503的選育
[0127] 採用底物誘導適應性策略，通過基因組重排及高通量篩選技術獲得高產NK兼PQQ 的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-503,具體方法為：首先構建納豆芽孢桿菌突變庫，將已獲 得的產NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌10261和10263分別進行亞硝基胍誘變；然後混合二者誘 變後代，進行細胞質融合（促融劑為聚乙二醇4000)，傳代培養，實現基因組改組，使納豆芽 孢桿菌10261和10623所有誘變後代的優勢突變得到優化整合，選育出NK兼PQQ產率高且 生長旺盛、遺傳穩定、適合作為生產菌株的高產NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌。
[0128] 突變庫高通量篩選：①製備2個豆芽汁梨汁固體培養基平板（梨汁佔平板總量的 10-15%，使得選育培養基與發酵培養基之間發生關聯，此即為本發明的底物誘導適應性策 略），其中一個將小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個將瓊脂糖-纖維蛋 白配入，形成平板B ;②將納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變融合後代塗布 其中一個平板後，再用纖維素膜影印至另一個平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平 板A中，高產PQQ誘變融合後代菌落周圍形成肉眼可見沉澱線，根據沉澱圈直徑大小可肉眼 判斷產PQQ量大小；④平板B中，高產NK誘變融合後代菌落周圍形成透明圈，根據透明圈直 徑大小可肉眼判斷產NK活力高低；⑤平板A與平板B中，高產PQQ菌落與高產NK菌落處於 同一位置者，即為高產NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌。所獲得的高產NK兼PQQ的納豆芽孢杆 菌命名為BN-NKPQQ-RWX-503,保藏於豆芽汁梨汁固體培養基（斜面）中。
[0129] (2)甲硫氨酸營養缺陷（MeO的乾酪乳桿菌（LcS-MeO的選育
[0130] 將乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)進行亞硝基胍誘變，從中篩選出 甲硫氨酸營養缺陷型（LcS-MeO。
[0131] LcS-Mett帝選：①製備2個MRS固體培養基平板，其中一個將甲硫氨酸（Met)配入 (平板C，Met添加量為10-15mg/L)，另一個為單純MRS固體培養基平板（平板D);②將幹 酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)的誘變後代塗布其中一個平板後，再用纖維素 膜影印至另一個平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置， 平板C出現菌落而平板D未出現菌落，或平板C上的菌落顯著大於平板D上的菌落，則該菌 落甲硫氨酸營養缺陷型乾酪乳桿菌，命名為LcS-Met^保藏於MRS固體培養基（斜面）中。
[0132] (3)BN-NKPQQ-RWX_503 的活化培養
[0133] 將保存於豆芽汁梨汁固體培養基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-503取一環，接種至 豆芽汁梨汁液體培養基活化，培養溫度35°C，培養結束菌種密度達到10 9cfu/mL左右。
[0134] (4) LcS-Met_ 的活化培養
[0135] 將保存於MRS固體培養基（斜面）中的LcS_Met_取一環，接種至MRS液體培養基 37°C活化培養，培養結束菌種密度達到10 9cfu/mL左右。
[0136] (5)富含NK和PQQ的梨汁的發酵製備
[0137] 將活化的BN-NKPQQ-RWX-503與LcS_Met_混合，使混合菌液中二者密度比為 1:5 (I X 108CFM/mL: 5 X 108CFM/mL)，混合菌液以5 %接種量接種含梨汁的發酵培養基，37°C 六層紗布封口培養36h，得到富含NK和PQQ的梨汁。含梨汁的發酵培養基中所含豆芽汁、酪 氨酸、穀氨酸和麥芽糖對BN-NKPQQ-RWX-503合成NK和PQQ進行代謝調控，豆芽汁有利於納 豆芽孢桿菌增殖，麥芽糖有利於NK合成，而PQQ由酪氨酸和穀氨酸通過肽鍵連接環化而成。 發酵結束後，梨汁中NK活力615U/mL，PQQ含量91ng/mL。所獲得的梨汁富含納豆激酶和吡 咯喹啉醌，具有梨汁固有的滋味和發酵後特有的風味。
[0138] 本發明中採用色譜法測定PQQ，具體步驟參照"Noji N，Nakamura T, Kitahata N, et al. Simple and sensitive method for pyrroloquinoline quinone (PQQ)analysis in various foods using liquid chromatography/electrospray-lonization tandem mass spectrometry. J Agri Food Chem, 2007, 55 (18): 7258-7263·，'。
[0139] 本發明中採用瓊脂糖-纖維蛋白原平板法測定NK活力。測定步驟：將發酵液過濾 後點種在瓊脂糖-纖維蛋白平板上，37°C孵育18h，以尿激酶作為標準品，通過測量透明圈 直徑計算納豆激酶相當於尿激酶的活力單位（U/mL)。
【權利要求】
1. 一種食療梨汁的製作方法，其特徵在於，包括以下步驟： 1)、將產納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263分別進 行亞硝基胍誘變；然後混合二者誘變後代，進行細胞融合傳代培養，高通量篩選得到高產納 豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌，命名為納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-503 ; 2) 、將乾酪乳桿菌進行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營養缺陷型的乾酪乳桿菌， 命名為乾酪乳桿菌LcS-Met_; 3)將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-503和乾酪乳桿菌LcS-Met_共發酵梨汁，得到富含 納豆激酶和吡咯喹啉醌的梨汁。
2. 根據權利要求1所述的食療梨汁的製作方法，其特徵在於，步驟1)中，所述的高通 量篩選具體包括：①製備2個平板豆芽汁梨汁固體培養基，其中一個將小鼠抗PQQIgG單 抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個將瓊脂糖-纖維蛋白配入，形成平板B;②將納豆芽孢 桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變融合後代塗布其中一個平板後，再用纖維素膜影 印至另一個平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平板A中，高產吡咯喹啉醌的誘變融 合後代菌落周圍形成肉眼可見沉澱圈，根據沉澱圈直徑大小可肉眼判斷產吡咯喹啉醌量大 小；④平板B中，高產納豆激酶的誘變融合後代菌落周圍形成透明圈，根據透明圈直徑大小 可肉眼判斷產納豆激酶活力高低；⑤平板A與平板B中，高產吡咯喹啉醌菌落與高產納豆激 酶菌落處於同一位置者，即為高產納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌。
3.根據權利要求2所述的食療梨汁的製作方法，其特徵在於，步驟1)中，所述的平板豆 芽汁梨汁固體培養基和斜面豆芽汁梨汁固體培養基以IL計，由以下量的組分組成： 梨il· 100?150mL; 庶糖 4.0?6.Og; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 餘量。
4.根據權利要求1所述的食療梨汁的製作方法，其特徵在於，步驟2)中，所述的從中 篩選出甲硫氨酸營養缺陷型的乾酪乳桿菌，具體包括：①製備2個平板MRS固體培養基，其 中一個將甲硫氨酸配入，為平板C，另一個為單純MRS固體培養基平板，為平板D;②將誘變 後的乾酪乳桿菌塗布其中一個平板後，再用纖維素膜影印至另一個平板，使平板C和平板D 互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出現菌落而平板D未出現菌落，或 平板C上的菌落顯著大於平板D上的菌落，則該菌落為甲硫氨酸營養缺陷型乾酪乳桿菌。
5.根據權利要求4所述的食療梨汁的製作方法，其特徵在於，步驟2)中，所述的平板 MRS固體培養基和斜面MRS固體培養基以IL計，由以下量的組分組成： 蛋白腖 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 梓檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 餘量； 該MRS固體培養基的pH值保持在6. 2?6. 4。
6. 根據權利要求1所述的食療梨汁的製作方法，其特徵在於，步驟3)中，在共發酵之 前，將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-503和乾酪乳桿菌LcS-Met_分別進行活化培養，納豆 芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-503在豆芽汁梨汁液體培養基中進行活化培養，培養溫度為34? 36°C，乾酪乳桿菌MRS液體培養基中進行活化培養，培養溫度為36?38°C。
7. 根據權利要求6所述的食療梨汁的製作方法，其特徵在於，步驟3)中，所述的豆芽汁 梨汁液體培養基以IL計，由以下量的組分組成： 梨汁 100?150mL ; 鹿糖 4. 0?6. Og ; 豆芽汁 餘量； 所述的MRS液體培養基以IL計，由以下量的組分組成： 蛋白腖 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 〇.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫 80 l.OmL； 水 餘量； 該MRS液體培養基的pH值保持在6. 2?6. 4。
8. 根據權利要求1所述的食療梨汁的製作方法，其特徵在於，步驟3)中，將納豆芽孢杆 菌BN-NKPQQ-RWX-503和乾酪乳桿菌LcS-Met_共發酵梨汁，具體包括：將活化後的納豆芽孢 桿菌BN-NKPQQ-RWX-503和乾酪乳桿菌LcS-Met_混合，形成混合菌液，將混合菌液接種至含 梨汁的發酵培養基，紗布封口培養後得到富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的梨汁。
9. 根據權利要求8所述的食療梨汁的製作方法，其特徵在於，步驟3)中，所述的含梨汁 的發酵培養基以IL計，由以下量的組分組成： 蔗糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 穀氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; Λ7.芽?|· IOOmL; 梨汁 餘量。
10. 根據權利要求1所述的食療梨汁的製作方法，其特徵在於，步驟3)中，所述的梨汁 的製備包括：水中加梨的果肉，碾磨成漿汁，得到梨汁。
【文檔編號】A23L1/29GK104432320SQ201410749515
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月10日 優先權日:2014年12月10日
【發明者】張哲滔, 阮子琦, 莫凡, 鄧惟, 吳淵 申請人:杭州元佩特生物科技有限公司