生產包含生物活性蛋白的醫學產品的方法和得到的產品的製作方法

2023-07-26 21:25:26 2

生產包含生物活性蛋白的醫學產品的方法和得到的產品的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用於生產包含生物活性蛋白的醫學產品的方法，所述方法包括下述步驟：提供包含溶劑、生物活性蛋白和20%w/w至60%w/w之間的非聚合糖的水性組合物，冷凍所述組合物，由此形成至少一個包含冷凍形式的溶劑的冷凍體，將所述冷凍體在被支持物承載的同時放入乾燥設備中，所述支持物包含一個或多個限制元件，所述限制元件限定所述支持物的一個或多個邊界，其中所述體的至多30%的表面與所述一個或多個限制元件鄰接，將所述乾燥設備中的壓力降至大氣壓以下，給所述體提供熱，以便升華所述體的冷凍溶劑和得到乾燥體。本發明也涉及可通過該方法得到的產品。
【專利說明】生產包含生物活性蛋白的醫學產品的方法和得到的產品 發明領域
[0001] 本發明屬於生物活性蛋白保存領域，具體地為了儲存目的。具體地，本發明涉及一 種用於生產包含生物活性蛋白的醫學產品的方法，所述方法包括：通過在包含糖的保護基 質中冷凍乾燥來保存蛋白。本發明也涉及得到的產品，其具體地是被糖穩定化的包含蛋白 的冷凍乾燥體。

【背景技術】
[0002] 生物活性蛋白（在本說明書中也簡稱為"蛋白"）當在固體介質或液體溶液中儲存 時通常是不穩定的。具體地，蛋白的二級和三級結構(其依賴於分子內的氫鍵）易於變性。 由於二級和三級結構具體地導致蛋白結構的可識別的結構域，該結構的保持對於蛋白的生 物學活性的保持而言經常是關鍵性的。完整生物體經常被複雜的基於脂質的膜和鑲嵌蛋白 包圍，所述鑲嵌蛋白通過其周圍水溶液的性質在結構上穩定化，所述結構的理想性能包括 低自由能狀態。該低自由能狀態難以達到，並且轉換結構以及由生物體自身或伴隨的宿主 細胞產生的蛋白酶使得非常難以以液體形式穩定結構。經常使用冷凍乾燥（凍幹）過程來 穩定生物活性蛋白，在該過程中，將水性組合物(通常包含水作為主要溶劑）冷凍，然後通過 升華進行乾燥。溶劑的除去和使用包含保護性分子(諸如糖分子）的基質的置換，可以通過 防止該蛋白的降解和變性而增加蛋白的穩定性。
[0003] 在冷凍乾燥中，通常將蛋白與保護劑一起在水中混合為混懸液，冷凍，並通過升華 和二次乾燥進行脫水。冷凍的低溫和升華乾燥以及涉及的低表面/體積比可以需要長乾燥 時段。這樣的長乾燥時段可能導致對蛋白的結構損傷。增加乾燥溫度以縮短乾燥時間經常 不是一個選項，因為乾燥溫度必須保持顯著低於保護基質的玻璃化轉變溫度。此外，高幹燥 溫度固有地導致蛋白的生物學活性的損失。當使用非聚合糖作為保護劑時，產生一個特別 的問題。如普遍已知的，非聚合糖非常適合用於穩定生物活性蛋白，但是它們具有以下固 有缺點：得到的基質的玻璃化轉變溫度是相對較低的（通常低於100°c，經常在20-45°C之 間）。具體地，當使用大量糖且冷凍體具有相當厚度（通常高於2 mm)時，這會導致在72-96 小時範圍內的非常長的乾燥時間。具體地，當非聚合糖的量接近20%w/w時，得到的基質變 濃厚，以致於乾燥時間成指數地增加（因此，在本領域中，當目的在於均勻乾燥體時，施加 最多高達15-16%(w/w))。長乾燥時間固有地導致蛋白的生物學活性的顯著損失，且從製備 觀點看是非常沒有吸引力的。
[0004] 在本領域中，已經在US 5, 565, 318中提供了解決方案。該參考文獻提出使用聚合 糖（諸如葡聚糖或蔗聚糖）作為保護劑。由於這樣的聚合糖的玻璃化轉變溫度通常高於非 聚合糖的玻璃化轉變溫度（通常是200°C以上相對於KKTC以下），人們可以使用高得多的 乾燥溫度來達到更短的乾燥時間。但是，這樣的聚合糖的穩定性能遠遠遜於非聚合糖的穩 定性能。並且，達到更短乾燥時間的更高幹燥溫度也可能導致在冷凍乾燥過程本身中更高 的生物活性蛋白降解和或變性速率。
[0005] 在US 2010/0297231中，提供了一個替代解決方案，其中將包含生物活性蛋白和 多元醇（其可以是非聚合糖諸如果糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、核糖、鼠李 糖、山梨醇、木糖醇等）的製劑膨脹成泡沫，此後將所述泡沫冷凍並乾燥成穩定的乾燥的泡 沫組合物。由於所述泡沫包含2 mm或更小的厚度且表面/體積比非常高，即使用高百分比 的非聚合糖也可以得到短乾燥時間。該已知方法的一個缺點是，對於被加工的相對小量的 活性物質而言，泡沫在冷凍乾燥器中佔據大量空間，並且，需要將泡沫研磨成粉末才能進一 步使用，諸如通過吸入來施用，或用於得到預定量的乾燥物質，所述乾燥物質用於在液體中 重構以實現在每天實踐中的應用。另一個缺點是，通常在製劑中包含起泡劑。這會限制得 到的產品的用途。
[0006] 因此，生物活性蛋白的保存，尤其是實現使用最終產品的容易性(從而實現廣譜應 用和獲得提供高保存性能的基質)，仍然提出了一個重大挑戰。本發明的一個目的是滿足該 挑戰。


【發明內容】

[0007] 為了達到本發明的目的，提供了一種用於生產包含生物活性蛋白的醫學產品的方 法，所述方法包括下述步驟：提供包含溶劑、生物活性蛋白和20%w/w至60%w/w之間的非 聚合糖的水性組合物，冷凍所述組合物，由此形成至少一個包含冷凍形式的溶劑的冷凍體， 將所述冷凍體在被支持物承載的同時放入乾燥設備中，所述支持物包含一個或多個限制元 件，所述限制元件限定所述支持物的一個或多個邊界，其中所述體的至多30%的表面與所 述一個或多個限制元件鄰接，將所述乾燥設備中的壓力降至大氣壓以下，和給所述體提供 熱（通常經由傳導和/或輻射），以便升華所述體的冷凍溶劑和得到乾燥體。
[0008] 令發明人驚奇的是，通過使用冷凍乾燥技術(其基於從包含大量非聚合糖的組合 物開始得到各個冷凍體，所述體被乾燥從而確保它們的表面的更大部分不與容器的限制元 件（諸如封閉的底或壁）鄰接)，人們可以在相對較短的時間(基本上低於72-96小時）內 乾燥所述體，儘管事實上表面/體積比遠低於當施加泡沫時的比率，並且儘管事實上厚度 可以甚至超過2 _。目前認為，相對較大量的未與阻止升華的溶劑自由流出冷凍體的元件 (例如典型冷凍乾燥管形瓶的玻璃底和壁）鄰接的表面，是得到這些高糖組合物的有利乾燥 結果所必需的。認識到這一點，顯然，本發明不主要依賴於所述體的形式。例如，當使用立 方體、稜錐體、磚塊體、星形體、菱形體、tic-tac形體或任意其它形式時，當放在支持物上使 得所述體的至多30%的表面與所述支持物的一個或多個限制元件鄰接時，每個體的足夠自 由表面可供升華的溶劑離開所述體。
[0009] 實際上，在現有技術(例如WO 2010/125087)中已知冷凍乾燥技術，其中在冷凍體 的大部分表面不與容器的限制元件鄰接的同時，乾燥所述冷凍體。但是，該參考文獻沒有公 開從包含至少20%w/w的非聚合糖的溶液開始冷凍乾燥包含生物活性蛋白的組合物。對於 除了生物活性蛋白以外的化合物而言，特別是對於穩定的（小）分子而言，通過增加冷凍溶 劑的升華所需的熱的量，可以得到快速的乾燥時間，因為變性經常不是問題。但是，對於生 物活性蛋白而言，這不是一個選項。因此，通常，當乾燥從包含生物活性蛋白的冷凍水性溶 劑構成的體時，使用具有3-10%w/w的非聚合糖的溶劑。
[0010] 本發明也體現在包含生物活性蛋白的、基本上均勻的冷凍乾燥體形式的醫學產品 中，所述冷凍乾燥體具有50-1000W之間的體積，所述蛋白分散在非聚合糖的固體基質中， 其特徵在於，所述體包含約21-72%w/v之間的所述糖。最終乾燥體中的21-72%w/v對應於 開始水性組合物中的約20-60%w/w的糖（其可以使用用於計算糖在水中的溶液的近似密度 的公式進行計算：密度?〇.3723X(以克/升為單位的糖濃度）+ 1002.2)。該體可以個 別地操作，在作為醫學產品實際應用之前不需要碾磨或其它形式的再加工，且非常適合於 在基質中存在高密度的非聚合糖的情況下保存生物活性蛋白。優選地，所述體是球狀體。
[0011] 定義 主產：為將來使用而提供，例如用在實驗室中，用在工廠中，作為中間產物，或用於由消 費者（最終用戶）使用。生產包括製備，即以受控的可重複方式生產，以提供較大量的相同 產品。
[0012] 居學產治：可以用於預防、治療或治癒活生物體(特別是人類或非人動物）的疾病 或病症的任何產品。
[0013] 全魏樣沒蛋0 :任何蛋白，其具有三維結構，使得所述蛋白能夠誘導或幹擾活生物 體中的生理學過程，諸如代謝過程或免疫學過程。術語生物活性蛋白可以表示全長蛋白或 其片段。生物活性蛋白的例子是酶、毒素、類毒素、任何（其它）免疫學蛋白（例如微生物 的表面蛋白或其片段）、抗體或其片段等。疫苗通常含有一種或多種生物活性蛋白，無論是 作為活的或殺死的微生物的一部分，還是作為這樣的微生物的分離的或重組表達的亞基。
[0014] 擦任何載體流體，所述流體適合用於溶解和/或分散要運載的物質。
[0015] 細yV :相對於組合物的總質量的質量百分比。
[0016] 細A :相對於組合物的總體積的質量百分比。
[0017] 遊：具有相對較低分子量且通常具有甜味的水溶性碳水化合物的群組中的任一 種。術語糖包括還原糖（諸如果糖和麥芽糖）、非還原糖（諸如蔗糖和海藻糖）、糖醇（諸 如木糖醇和山梨醇）和糖酸（諸如葡糖酸和酒石酸）。
[0018] 姜漢r合遊：單體、二聚體、三聚體和寡聚體糖分子，其包含至多6個單體糖分子。
[0019] 鈇.?具有一定體積，使得它可以個別地用手（手工地）操作，通常具有等於或超過 50W的體積（這等於具有約2 mm的半徑的球體）。優選地，它足夠小以用作施用給動物（術 語"動物"包括人類）的片劑，具體地具有小於2000W的體積。優選地，所述體的體積是在 50W至1500W之間，通常低於1000W，尤其是在75W至750W之間，更尤其是在IOOW至 500W之間。
[0020] 子藥你：小於5%的殘留水分，尤其是小於1?%或1%的殘留水 分。
[0021] 履/級示/f :構成限制表面的實際元件，所述限制表面在限定支持元件的邊界中起 作用。通常，限制元件是容器的封閉（延續）底、側壁或蓋子。但是，它也可以是支持絲架 或網格壁架的接線。
[0022] 襲茲：共享邊界。
[0023] 摩說鈇:形狀像球、但是不一定是完美球形的體。例如，它可以是扁球體，扁長體， 部分地由球體組成且部分地由扁球或扁長體組成的體，具有一個或多個凹痕、邊框或其它 不規則形狀的球體，以上的組合等。
[0024] 本發明的實施方案 在一個實施方案中，在小於48小時內使冷凍溶劑升華。優選地選擇熱流，使得在48小 時內乾燥所述體。這會顯著減少生物活性蛋白處於相對較高的乾燥溫度的時間。令人驚奇 地，在當前的方案中，可以在沒有顯著損失蛋白活性的情況下得到如此短的乾燥時間。優選 地，在小於36小時中，或甚至在16-24小時中，使冷凍溶劑升華。與用於乾燥包含生物活性 蛋白和至少20%w/w的非聚合糖的體的現有技術冷凍乾燥方法相比，這是非常短的乾燥時 間。
[0025] 在另一個實施方案中，所述體的至多20%，優選地甚至至多10%的表面與支持物的 一個或多個限制元件鄰接。通過使更多表面可供溶劑的自由升華（通過使所述體的更少 表面與支持物的限制元件鄰接），似乎可以進一步縮短乾燥時間，同時保留蛋白的生物學活 性。
[0026] 優選地，所述冷凍體是球狀體，使得與支持物的限制元件鄰接的所述體的表面的 百分比通常低於3%，或甚至接近0%。在另一個實施方案中，所述球狀體具有在50耵至 1000沿之間的體積，該體積接近在2-6 _之間的球狀體半徑（取決於球狀體的形狀）。
[0027] 在一個實施方案中，其中所述支持物的限制元件是底板，所述體被提供成躺在該 底板上，且所述支持物是開放的以允許輻射自由地穿過到達所述底板，通過從存在於所述 支持物上方的乾燥設備中的輻射源發射熱輻射而提供所述熱的至少一部分，以達到所述冷 凍體。已經發現，當通過輻射提供熱（至少部分地）時，可以實現含高糖的體的適當乾燥。 輻射具有以下優點：它不依賴於導熱材料來傳遞熱。
[0028] 在另一個實施方案中，與普通冷凍乾燥方法一致，經由與所述冷凍體鄰接的限制 元件通過熱傳導提供所述熱的至少一部分。儘管事實上在當前方法中所述體的至多30%的 表面與支持物的限制元件鄰接（直到甚至低至1-3%的數字），而在現有技術方法中，這通常 超過50%，這似乎足以給所述體提供適當的熱流。
[0029] 在另一個實施方案中，其中所述支持物的限制元件是底板，所述體被提供成躺在 該底板上，且所述支持物是開放的以允許輻射自由地穿過到達所述底板，通過從存在於所 述支持物上方的乾燥設備中的輻射源發射熱輻射而提供所述熱，以與經由與所述冷凍體鄰 接的限制元件的熱傳導組合地到達所述體（從EP 2249810已知的方案）。已經證實，通過 傳導和輻射實現的組合熱流非常適合用於乾燥這樣的體：所述體的相對較低百分比與支持 物接觸。
[0030] 在一個實施方案中，所述水性組合物中的糖的量選自以下範圍：20_55%w/w、 20-50%w/w、20-45%w/w、25-45%w/w、25-40%w/w、25-35%w/w 和 27-30%w/w。優選地，糖的量高 於25%w/w，通常為約27%w/w。
[0031] 在一個實施方案中，所述糖包含單體和/或二聚體分子，具體地選自葡萄糖、半乳 糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇和木糖醇。
[0032] 在一個實施方案中，其中所述支持物的限制元件是底板，當在乾燥時多個冷凍體 以單層形式位於所述底板上。以此方式，可以以高效方式乾燥大量冷凍體。
[0033] 在另一個實施方案中，所述乾燥體中的殘餘含水量小於2%w/w，通常在0. 5_2%w/w 之間，例如在l_2%w/w之間。
[0034] 將使用下述實施例和附圖更詳細地解釋本發明。
[0035]圖1示意地顯示了第一類支持物，即玻璃瓶，其裝有冷凍的球狀體或液體組合物， 它們在裝入所述支持物中以後冷凍。
[0036] 圖2示意地顯示了在低壓凍幹設備中的乾燥方案。
[0037] 圖3示意地顯示了在低壓凍幹設備中的一個替代乾燥方案。
[0038] 圖4示意地顯示了在低壓凍幹設備中的另一個替代乾燥方案。
[0039] 實施例1是冷凍乾燥高糖組合物的第一個實施例。
[0040] 實施例2是冷凍乾燥高糖組合物的第二個實施例。
[0041] 實施例3是冷凍乾燥高糖組合物的第三個實施例。
[0042] 實施例4是冷凍乾燥高糖組合物的第四個實施例。
[0043] 實施例5是冷凍乾燥高糖組合物的第五個實施例。
[0044] 實施例6提供了根據本發明的醫學產品的穩定性數據。
[0045] 圖 1 圖1示意地顯示了第一類支持物，即玻璃瓶，其裝有冷凍的球狀體或液體組合物，它們 在裝入所述支持物中以後冷凍。該圖描繪了第一玻璃瓶（1)，其裝有約15個每個為約IlOW 的冷凍球體（5)。該圖還描繪了第二玻璃瓶（1'），其裝有I. 5 ml液體組合物，所述液體組 合物已經被冷凍以形成一個冷凍塊（6)。
[0046] 圖 2 圖2示意地顯示了在低壓凍幹設備（設備作為整體沒有顯示）中的乾燥方案。該圖描 繪了承載管形瓶1和1'的架子（10)。管形瓶1裝有冷凍球體5,且管形瓶1'裝有冷凍液 體塊（6)。可以通過內裝的電加熱器（未顯示）來加熱架子。
[0047] 圖 3 圖3示意地顯示了在低壓凍幹設備中的一個替代乾燥方案。在該方案中，將管形瓶放 在升高的支持物（20)上，所述支持物（20)與被加熱的架子（10)基本上熱絕緣。以此方式， 所述管形瓶將基本上不通過在架子（10)中產生的熱傳導來接收熱。在管形瓶上方存在第 二個加熱的架子（10'），該架子提供有黑色塗層（11)。該黑色塗層會使該架子充當良好輻 射源，向管形瓶發射熱輻射12 (主要是紅外光）。
[0048] 圖 4 圖4示意地顯示了在低壓凍幹設備中的另一個替代乾燥方案。該方案使用2個架子，一 個加熱的架子10充當第一熱源，且一個加熱的架子10'充當第二熱源（通過黑色塗層11， 其為架子10'的底提供輻射表面，對應於圖3中所示的方案）。開放容器15和15'站立在 第一架子10上。容器15裝有冷凍球體（5)的單層，而第二容器15'裝有冷凍液體（6'）。
[0049] 實施例1-5是原理驗證實施例，表明使用根據本發明的方法，可以在合理快的幹 燥周期內得到基本上均勻的乾燥體，儘管事實上超過20%w/w的非聚合糖存在於最初水 性組合物中。對於這些實施例，使用30%鹿糖（w/v)在水中的簡單溶液（其接近27%w/ w)。使用該水性組合物的一部分來製備具有大約IOOW體積的冷凍球體。為此，使用在WO 2010/125084中描述的方法，具體地是在第20頁第33行至第21頁第2行提及的方法（結 合相同國際申請的圖1、2、3和4)。如下所述在實施例中使用所述冷凍球體。
[0050] 在實施例1中，給第一組3個具有大約20 mm直徑的10 ml玻璃低壓凍幹管形瓶 (1)裝入約15個球體（5)，相當於約1.5 ml最初水性組合物。在管形瓶中，這產生約1?層 的球體。在該方案中，低於10%的冷凍球體表面（約1-3%)與支持管形瓶的一個或多個壁 (限制元件）鄰接。給第二組3個對應管形瓶（r)裝入1.5 ml如上文所述的液體組合物， 此後將液體冷凍。以此方式，約60%的冷凍體表面與支持管形瓶的一個或多個壁鄰接。在 圖1中示意地顯示了得到的填充管形瓶。
[0051] 將這些管形瓶放在標準低壓凍幹設備中的架子上，所述設備的主要部分示意地顯 示在圖2中，所述設備已經預先達到約-45°C的溫度。對該低壓凍幹機進行下述冷凍乾燥循 環（表1)。

【權利要求】
1. 一種用於生產包含生物活性蛋白的醫學產品的方法，所述方法包括下述步驟： -提供包含溶劑、生物活性蛋白和20%w/w至60%w/w之間的非聚合糖的水性組合物， -冷凍所述組合物，由此形成至少一個包含冷凍形式的溶劑的冷凍體， _將所述冷凍體在被支持物承載的同時放入乾燥設備中，所述支持物包含一個或多個 限制元件，所述限制元件限定所述支持物的一個或多個邊界，其中所述體的至多30%的表 面與所述一個或多個限制元件鄰接， -將所述乾燥設備中的壓力降至大氣壓以下， -給所述體提供熱，以便升華所述體的冷凍溶劑和得到乾燥體。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述冷凍溶劑在小於48小時中升華。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述冷凍溶劑在小於36小時中升華。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述冷凍溶劑在16-24小時中升華。
5. 根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其特徵在於，所述體的至多20%的表面 與所述支持物的一個或多個限制元件鄰接。
6. 根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述體的至多10%的表面與所述支持物 的一個或多個限制元件鄰接。
7. 根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其特徵在於，所述冷凍體是球狀體。
8. 根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述球狀體具有在50沿至1000沿之間 的體積。
9. 根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其中所述支持物的限制元件是底板， 所述體被提供成躺在該底板上，且所述支持物是開放的以允許輻射自由地穿過到達所述底 板，其特徵在於，通過從存在於所述支持物上方的乾燥設備中的輻射源發射熱輻射而提供 所述熱的至少一部分，以達到所述冷凍體。
10. 根據權利要求1-8中的任一項所述的方法，其特徵在於，經由與所述冷凍體鄰接 的限制元件通過熱傳導，提供所述熱的至少一部分。
11. 根據權利要求1-8中的任一項所述的方法，其中所述支持物的限制元件是底板， 所述體被提供成躺在該底板上，且所述支持物是開放的以允許輻射自由地穿過到達所述底 板，其特徵在於，通過從存在於所述支持物上方的乾燥設備中的輻射源發射熱輻射，提供所 述熱，以與經由與所述冷凍體鄰接的限制元件的熱傳導組合地到達所述體。
12. 根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其特徵在於，所述水性組合物中的糖 的量選自以下範圍：20-55%w/w、20-50%w/w、20-45%w/w、25-45%w/w、25-40%w/w、25-35%w/w 和 27-30%w/w。
13. 根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其特徵在於，所述糖包含單體和/或 二聚體分子。
14. 根據權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述糖包含葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、 蔗糖、海藻糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇和/或木糖醇。
15. 根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其中所述支持物的限制元件是底板， 其特徵在於，當在乾燥時多個冷凍體以單層形式位於所述底板上。
16. 根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其特徵在於，所述乾燥體中的殘餘含 水量小於2%w/w。
17. -種包含生物活性蛋白的、基本上均勻的冷凍乾燥體形式的醫學產品，所述冷凍 乾燥體具有50-1000W之間的體積，所述蛋白分散在非聚合糖的固體基質中，其特徵在於， 所述體包含約21-72%w/v之間的所述糖。
18. 根據權利要求17所述的體，其特徵在於，所述體是球狀體。
19. 一種包含生物活性蛋白的、基本上均勻的冷凍乾燥體形式的產品，所述冷凍乾燥 體具有50-1000W之間的體積，所述體可通過根據權利要求1-16中的任一項所述的方法得 到。
【文檔編號】A61K9/19GK104428004SQ201380036052
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年7月9日 優先權日:2012年7月10日
【發明者】K.奧康內爾, S.布錢安 申請人:英特維特國際股份有限公司