排汙口水體中陰溝腸桿菌的多重pcr檢測方法

2023-07-05 20:16:11 1

排汙口水體中陰溝腸桿菌的多重pcr檢測方法
【專利摘要】本發明公開了排汙口水體中陰溝腸桿菌的多重PCR檢測方法，通過陰溝腸桿菌抗體溶液製備和免疫磁珠溶液製備，將待測水樣中用免疫磁珠溶液富集，得到陰溝腸桿菌富集的待檢樣品溶液，然後用DNA提取試劑盒提取DNA模板，再通過多對引物的PCR檢測，若得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四個目的基因片段，則水樣中含有陰溝腸桿菌；該方法水樣中陰溝腸桿菌富集程度高，利於檢測，檢測靈敏，多對引物同時檢測，準確性高。
【專利說明】排汙口水體中陰溝腸桿菌的多重PCR檢測方法
【技術領域】[0001]本發明涉及細菌的PCR檢測技術，具體涉及排汙口水體中陰溝腸桿菌的多重PCR檢測方法。
【背景技術】
[0002]陰溝腸桿菌iBnterobacter cloacae)是腸桿菌屬的成員之一,該菌為革蘭陰性粗短桿菌，廣泛存在於自然界中，在人和動物的腸道、糞便水、泥土、植物中均可檢出，陰溝腸桿菌已成為醫院感染越來越重要的病原菌。因此排汙口水體中陰溝腸桿菌的檢測就可以反應該城鎮的居民感染陰溝腸桿菌的狀況。多重PCR技術針對多個DNA模板或者同一模板的不同區域進行擴增的過程，可一次擴增多個靶基因或基因片段，使檢測的準確性更高。

【發明內容】

[0003]本發明所要解決的技術問題是提供一種排汙口水體中陰溝腸桿菌的多重PCR檢測方法，該方法對排汙口水體中的陰溝腸桿菌進行富集，並用多對引物同時檢測，檢測靈敏度高，準確性高。
[0004]本發明解決上述技術問題所採用的技術方案為:排汙口水體中陰溝腸桿菌的多重PCR檢測方法，其步驟如下:
a、陰溝腸桿菌抗體溶液製備:挑取陰溝腸桿菌單個菌落接種於由胰蛋白酶酶解的酪蛋白大豆液-瓊脂液體培養基(TSBA)中，震蕩培養過夜，7000~8000轉/分下離心5分鐘，沉澱用生理鹽水水洗I次，再用生理鹽水懸浮，加入質量百分濃度為0.5%~1%的甲醛過夜；次日7000~8000轉/分下離心5分鐘，沉澱用生理鹽水洗3次，並用生理鹽水分別配成濃度為IO7~IO9 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液和濃度為101° cfu /ml陰溝腸桿菌菌液，將濃度為IO7~IO9 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml腹腔注射於小鼠中首次免疫，間隔一周，用濃度為IO7~IO9 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml腹腔注射於小鼠中第二次免疫，再隔一周，用濃度為101° cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml注射于于小鼠中加強免疫，加強免疫後第四天，摘除小鼠眼球取血，血液置於37°C下溫育0.5h，4°C下3000轉/分離心15min，得上清，該上清為陰溝腸桿菌抗體溶液；
b、免疫磁珠溶液製備:取100~200μ I羧基磁珠置於離心管中，加入500 μ L活化緩衝液，在漩渦振蕩器上混合均勻，將離心管放置於磁分離架上，待納米磁珠完全被吸附於離心管壁，移出管中液體，用活化緩衝液洗滌納米磁珠一次，洗滌後在離心管中加入活化緩衝液500μ 1、碳二亞胺0.5mg和N-羥基琥珀醯亞胺lmg，在漩渦振蕩器上混合均勻，室溫下活化20 min，移出管中液體，得到活化磁珠，用偶聯緩衝液洗滌活化磁珠二次，洗滌後在離心管中加入濃度為6 mg/ml的上述陰溝腸桿菌抗體溶液15 μ 1，室溫下反應3 h，抽掉上清液，得到免疫磁珠，用偶聯緩衝液洗滌免疫磁珠二次，然後加入含有質量百分濃度I %牛血清白蛋白(BSA)的偶聯緩衝液500 μ I封閉免疫磁珠30min，得到免疫磁珠溶液；所述活化緩衝液為PH為6.0含有吐溫-20 (Tween-20)的NaH2PO4溶液，所述偶聯緩衝液為pH為7.4含有吐溫-20的NaH2PO4溶液，所述活化緩衝液和所述偶聯緩衝液中，NaH2PO4濃度為0.01M,吐溫-20的質量百分濃度為0.05% ；
C、待測樣品富集:取排汙口水樣2ml於試管中，加入0.2ml上述免疫磁珠溶液，室溫輕緩旋轉振蕩30min，移出試管中液體，用磷酸緩衝液洗滌免疫磁珠3~5次，洗滌後加入
0.5ml無菌水，將試管置於磁性細胞分離架上磁性分離3min，取出免疫磁珠，得到陰溝腸桿菌富集的待檢樣品溶液；
d、DNA模板製備:待檢樣品溶液用DNA提取試劑盒提取DNA，得到DNA模板，具體提取依DNA提取試劑盒說明書進行；
e、PCR檢測:30μ I的PCR反應體系為:10 XPCR緩衝液2.5 μ 1，濃度25mM的MgCl2液
1.5 μ 1，濃度IOmM的dNTP液1.5 μ 1，濃度5U/ μ I的T aq DNA聚合酶0.2 μ 1，濃度都為10 μ M 的引物 irp2-F、irp2_R、FhuA-F、FhuA-R、SodB-F、SodB-R, Slt-F、Slt-R 各 1.0 μ 1，上述DNA模板2 μ 1，餘量為雙蒸水；PCR反應條件為94° C變性5 min, 94° C變性45s，55° C退火45s，72° C延伸lmin，35個循環，72° C延伸10 min ;PCR反應產物用質量百分濃度1.4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因片段，若得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四個目的基因片段，則排汙口水體中含有陰溝腸桿菌，所述引物irp2-F的核苷酸序列為:AAGGATTCGC TGTTACCGGA C，所述引物 irp2_R 的核苷酸序列為:AACTCCTGAT ACAGGTGGC,所述引物FhuA-F的核苷酸序列為:CAGCAGAACA ACCGAAGCAA GA，所述引物FhuA-R的核苷酸序列為:TTGAGGTCGT GGCGTAATCG T，所述引物SodB-F的核苷酸序列為:ACCACCAGGCGTATGTCACT AA,所述引物SodB-R的核苷酸序列為:TGCCGAAAGA TTTGGCGATT,所述引物SI t-F的核苷酸序列為:CGCAGCCGCT ACGCACAAAT，所述引物SI t_R的核苷酸序列為:TCGGTTACAT CGCTACCCAT CA。
[0005]上述引物是根據陰溝腸桿菌的基因組序列，應用primer Express 3.0軟體設計並篩選得到，引物由上海生工合成。
[0006]與現有技術相比，本發明的優點在於排汙口水體中陰溝腸桿菌的多重PCR檢測方法，通過陰溝腸桿菌抗體溶液製備和免疫磁珠溶液製備，將待測水樣中用免疫磁珠溶液富集，得到陰溝腸桿菌富集的待檢樣品溶液，然後用DNA提取試劑盒提取DNA模板，再通過多對引物的PCR檢測，若得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四個目的基因片段，則水樣中含有陰溝腸桿菌；該方法水樣中陰溝腸桿菌富集程度高，利於檢測，檢測靈敏，多對引物同時檢測，準確性高。
【具體實施方式】
[0007]以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0008]實施例1
陰溝腸桿菌抗體溶液製備:挑取陰溝腸桿菌(ATCC 13047)單個菌落接種於TSBA液體培養基(購於上海生工)中震蕩培養過夜，7000~8000轉/分下離心5分鐘，沉澱用生理鹽水水洗I次，再用生理鹽水懸浮，加入質量百分濃度為0.5%~1%的甲醛過夜；次日7000~8000轉/分下離心5分鐘，沉澱用生理鹽水洗3次，並用生理鹽水分別配成濃度為IO7~IO9 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液和濃度為IO7~IO9 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液，將濃度為IO7~IO9 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml腹腔注射於小鼠中首次免疫，間隔一周，用濃度為IO7~IO9 Cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml腹腔注射於小鼠中第二次免疫，再隔一周，用濃度為101°cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml注射于于小鼠中加強免疫，加強免疫後第四天，摘除小鼠眼球取血，血液置於37°C下溫育0.5h，4°C下3000轉/分離心15min，得上清，該上清為陰溝腸桿菌抗體溶液待用；
免疫磁珠溶液製備:取濃度為30mg /ml納米磁珠液100~200 μ I置於離心管中，再加入活化緩衝液500 μ I，在漩渦振蕩器上混合均勻，將離心管放置於磁分離架上，待納米磁珠完全被吸附於離心管壁，移出管中液體，用活化緩衝液洗滌納米磁珠一次，洗滌後在離心管中加入活化緩衝液500μ 1、碳二亞胺0.5mg和N-羥基琥珀醯亞胺lmg，在漩渦振蕩器上混合均勻，室溫下活化20 min，移出管中液體，得到活化磁珠，用偶聯緩衝液洗滌活化磁珠二次，洗滌後在離心管中加入偶聯緩衝液485 μ I和濃度為6 mg/ml的上述陰溝腸桿菌抗體溶液15μ 1，室溫下反應3 h，抽掉上清液，得到免疫磁珠，用偶聯緩衝液洗滌免疫磁珠二次，然後加入含有質量百分濃度1% BSA的偶聯緩衝液500 μ I封閉磁珠30min，得到免疫磁珠溶液待用；上述活化緩衝液為PH 6.0、含有質量百分濃度為0.05%的Tween-20、濃度0.01M的NaH2PO4溶液，上述偶聯緩衝液為pH 7.4、含有質量百分濃度為0.05%Tween-20、濃度為
0.01M 的 NaH2PO4 溶液；
待測樣品富集:取寧波市象山縣象山港排汙口水樣2ml於試管中，加入0.2ml上述免疫磁珠溶液，室溫輕緩旋轉振蕩30min，移出試管中液體，用磷酸緩衝液洗滌免疫磁珠3~5次，洗滌後加入0.5ml無菌水，將試管置於磁性細胞分離架上磁性分離3min，取出免疫磁珠，得到陰溝腸桿菌富集的待檢樣品溶液；
DNA模 板製備:待檢樣品溶液用DNA提取試劑盒(購於上海生工)提取DNA，得到DNA模板，具體提取依DNA提取試劑盒說明書進行；
PCR檢測:30μ1的PCR反應體系為:10XPCR緩衝液2.5 μ 1，濃度25mM的MgCl2液
1.5 μ 1，濃度IOmM的dNTP液1.5 μ 1，濃度5U/ μ I的T aq DNA聚合酶0.2 μ 1，濃度都為10 μ M 的引物 irp2-F、irp2_R、FhuA-F、FhuA-R、SodB-F、SodB-R, Slt-F、Slt-R 各 1.0 μ 1，上述DNA模板2 μ 1，餘量為雙蒸水；PCR反應條件為94° C變性5min，94° C變性45s，55° C退火45s，72° C延伸lmin，35個循環，72° C延伸10 min ;PCR反應產物用質量百分濃度1.4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因片段，得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四個基因片段，排汙口水體中含有陰溝腸桿菌，引物irp2-F的核苷酸序列為:AAGGATTCGCTGTTACCGGA C，引物 irp2_R 的核苷酸序列為:AACTCCTGAT ACAGGTGGC,引物 FhuA-F 的核苷酸序列為:CAGCAGAACA ACCGAAGCAA GA，引物FhuA-R的核苷酸序列為:TTGAGGTCGTGGCGTAATCG T，引物 SodB-F 的核苷酸序列為:ACCACCAGGC GTATGTCACT AA，引物 SodB-R的核苷酸序列為:TGCCGAAAGA TTTGGCGATT,引物Slt-F的核苷酸序列為:CGCAGCCGCTACGCACAAAT，引物 Slt-R 的核苷酸序列為:TCGGTTACAT CGCTACCCAT CA。
[0009]實施例2
與實施例1基本相同，所不同的只是排汙口水樣取自於寧波市奉化江江東排汙口，PCR檢測後，得到816bp基因片段，排汙口水體中未含有陰溝腸桿菌。
[0010]實施例3
與實施例1基本相同，所不同的只是排汙口水樣取自於寧波市奉化江海曙排汙口，PCR檢測後，得到1216bp基因片段，排汙口水體中未含有陰溝腸桿菌。[0011]實施例4
與實施例1基本相同，所不同的只是排汙口水樣取自於寧波市甬江江東排汙口，得到816bp、502bp 二個基因片段，排汙口水體中未含有陰溝腸桿菌。
[0012]實施例5
與實施例1基本相同，所不同的只是排汙口水樣取自於定波市甬江江北排汙口，得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四個基因片段，排汙口水體中含有陰溝腸桿菌。
[0013]實施例6:特異性和 靈敏性
與實施例1的DNA模板製備和PCR檢測基本相同，所不同的只是直接用陰溝腸桿菌(ATCC 13047)，和陰溝腸桿菌接近的螢光假單胞菌(ATCC 13525)，遲緩愛德華菌(ATCC15947)、大腸桿菌(ATCC25922)進行DNA模板製備和PCR檢測，只是陰溝腸桿菌得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四個目的基因片段，另外3種其它細菌仍只得到1_2個基因片段，說明特異性高。陰溝腸桿菌DNA模板濃度梯度l-100ng，分別用PCR檢測，檢測限為(100cfu/ml,說明靈敏性強。
【權利要求】
1.排汙口水體中陰溝腸桿菌的多重PCR檢測方法，其特徵在於步驟如下：a、陰溝腸桿菌抗體溶液製備：挑取陰溝腸桿菌單個菌落接種於由胰蛋白酶酶解的酪蛋 白大豆液_瓊脂液體培養基中，震蕩培養過夜，7000?8000轉/分下離心5分鐘，沉澱用 生理鹽水水洗1次，再用生理鹽水懸浮，加入質量百分濃度為0. 5%?1%的甲醛過夜；次日 7000?8000轉/分下離心5分鐘，沉澱用生理鹽水洗3次，並用生理鹽水分別配成濃度為 107?109 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液和濃度為101Q cfu /ml陰溝腸桿菌菌液，將濃度為107? 109 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml腹腔注射於小鼠中首次免疫，間隔一周，用濃度為107? 109 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml腹腔注射於小鼠中第二次免疫，再隔一周，用濃度為1(T cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml注射于于小鼠中加強免疫，加強免疫後第四天，摘除小鼠眼 球取血，血液置於37°C下溫育0. 5h，4°C下3000轉/分離心15min，得上清，該上清為陰溝 腸桿菌抗體溶液；b、免疫磁珠溶液製備：取100?200yl羧基磁珠置於離心管中，加入500 u L活化緩 衝液，在漩渦振蕩器上混合均勻，將離心管放置於磁分離架上，待納米磁珠完全被吸附於離 心管壁，移出管中液體，用活化緩衝液洗滌納米磁珠一次，洗滌後在離心管中加入活化緩衝 液500ia、碳二亞胺0. 5mg和N-羥基琥珀醯亞胺lmg，在漩渦振蕩器上混合均勻，室溫下活 化20 min，移出管中液體，得到活化磁珠，用偶聯緩衝液洗滌活化磁珠二次，洗滌後在離心 管中加入濃度為6 mg/ml的上述陰溝腸桿菌抗體溶液15 yl，室溫下反應3 h，抽掉上清液， 得到免疫磁珠，用偶聯緩衝液洗滌免疫磁珠二次，然後加入含有質量百分濃度1 %牛血清白 蛋白的偶聯緩衝液500 u 1封閉免疫磁珠30min，得到免疫磁珠溶液；所述活化緩衝液為pH 為6. 0含有吐溫-20的NaH2P04溶液，所述偶聯緩衝液為pH為7. 4含有吐溫_20的NaH2P04 溶液，所述活化緩衝液和所述偶聯緩衝液中，NaH2P04濃度為0. 01M，吐溫-20的質量百分濃 度為0. 05% ；c、待測樣品富集：取排汙口水樣2ml於試管中，加入0.2ml上述免疫磁珠溶液，室溫 輕緩旋轉振蕩30min，移出試管中液體，用磷酸緩衝液洗滌免疫磁珠3?5次，洗滌後加入，0.5ml無菌水，將試管置於磁性細胞分離架上磁性分離3min，取出免疫磁珠，得到陰溝腸杆 菌富集的待檢樣品溶液；d、DNA模板製備：待檢樣品溶液用DNA提取試劑盒提取DNA，得到DNA模板，具體提取依 DNA提取試劑盒說明書進行；e、PCR檢測：30iil的PCR反應體系為：10XPCR緩衝液2.5 yl，濃度25mM的MgCl2液，1.5u 1，濃度10mM的dNTP液1. 5 y 1，濃度5U/ yl的T aq DNA聚合酶0. 2 y 1，濃度都為 10 uM 的引物 irp2-F、irp2_R、FhuA-F、FhuA-R、SodB-F、SodB-R、Slt_F、Slt-R 各 1. 0 y 1， 上述DNA模板2 iil，餘量為雙蒸水；PCR反應條件為94° C變性5 min,94° C變性45s， 55° C退火45s，72° C延伸lmin，35個循環，72° C延伸，10 min ;PCR反應產物用質量百 分濃度1. 4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因片段，若得到816bp、1507bp、502bp和，1216bp 四個目的基因片段，則排汙口水體中含有陰溝腸桿菌，所述引物irp2-F的核苷酸序列為： AAGGATTCGC TGTTACCGGA C，所述引物 irp2_R 的核苷酸序列為：AACTCCTGAT ACAGGTGGC, 所述引物FhuA-F的核苷酸序列為：CAGCAGAACA ACCGAAGCAA GA，所述引物FhuA-R的核 苷酸序列為：TTGAGGTCGT GGCGTAATCG T，所述引物SodB_F的核苷酸序列為：ACCACCAGGC GTATGTCACT AA,所述引物SodB-R的核苷酸序列為：TGCCGAAAGA TTTGGCGATT,所述引物SI t-F的核苷酸序列為:CGCAGCCGCT ACGCACAAAT，所述引物SI t_R的核苷酸序列為:TCGGTTACAT CGC TACCCAT CA。
【文檔編號】C12Q1/68GK103540666SQ201310496295
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月22日 優先權日:2013年10月22日
【發明者】蘇秀榕, 周君, 張春丹, 李曄, 王中華, 李春麗, 張迪駿, 何偉娜 申請人:寧波大學