犬S100β蛋白的體外表達及其多克隆抗體的製備方法

2023-07-07 16:20:21 1

專利名稱：犬S100β蛋白的體外表達及其多克隆抗體的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種犬siooe蛋白的體外表達及其多克隆抗體的製備方法。
背景技術：
S100蛋白家族是廣泛分布於不同組織的一類分子量(10-13 kDa)較 小的酸性鈣結合蛋白，具有EF手型(螺旋-環-螺旋)鈣離子結合區，目 前發現至少包含21個成員。S100e就是S100蛋白家族最經典的一員。
siooe蛋白特異性地存在於腦組織的膠質細胞胞質中，包括星形神經膠 質細胞、少突膠質細胞、小膠質細胞等，也存在於神經元的亞群和膠質
以及外周神經系統的雪旺氏細胞(Schwanncell)中。研究顯示S100P作 為鈣傳感器蛋白，具有廣泛的生物學活性，如①調節蛋白激酶C和 鈣調蛋白的磷酸化及RNA的合成，從而調節細胞的能量代謝；②作為 細胞內正常成分參與細胞內外鈣離子水平的調節；③增強ATP酶的活 性；④通過神經膠質細胞的旁分泌和自分泌，作用於神經元和神經膠質 細胞，從而促進神經的生長和損傷後修復；⑤激活腦果糖1, 6 -二磷酸 醛縮酶和葡萄糖磷酸變位酶，促進神經的生長和損傷後的修復；⑥作用
於光感受器外膜上的鳥苷酸環化酶。由此可見，siooe在細胞內和細胞
外都具有廣泛的生物學效應。市場上多是針對人、小鼠及大鼠S100I3的 抗體，這些抗體與牛、羊、豬、兔、貓、猴等有一定的交叉反應，但針對犬的S100(3蛋白高特異性、高滴度的抗體目前還沒有。

發明內容
本發明的目的在於提供一種方法易操作，能製備出抗犬siooe蛋
白抗體的犬siooe蛋白的體外表達及其多克隆抗體的製備方法。
本發明的技術解決方案是
一種犬S1OO0蛋白的體外表達方法，其特徵是包括下列步驟
1) 取正常畢格犬坐骨神經，用Trizol試劑提取坐骨神經總RNA;
2) RT-PCR擴增用逆轉錄試劑盒及總RNA進行逆轉錄反應，合 成cDNA第一鏈，再以合成的cDNA為模板，進行犬S100 3基因的PCR 擴增；
3) 連接用克隆載體試劑盒，將PCR產物連接到克隆載體中；
4) 犬S100P cDNA序列的測定將己克隆在克隆載體中的S100 3 cDNA進行測序，測序結果其序列與基因庫中的序列完全一致；
5) 設計S100e表達載體的引物，構建S100P重組原核表達質粒 以上述測序正確的質粒為模板，PCR擴增SIOOP基因片斷；用限制性 內切酶屈o I 、 SamH I消化S100 3的PCR產物和PGEX-4T-1質粒 載體，並進行酶切產物的膠回收；用T4 DNA連接酶將PCR酶切回收 產物和PGEX-4T-1質粒載體酶切回收產物連接；
6) 感受態細胞的製備及重組質粒的轉化用無菌接種棒從感受態 細胞菌株蘸菌液劃無氨苄青黴素LB瓊脂板，37C培養過夜後挑取單個 克隆接種於5mlLB培養基中，細菌培養搖床中37。C、 200轉/分震蕩培 養20小時；取0.5ml該菌液接種於無氨節青黴素100ml LB液體培養基中，37。C振蕩培養2-2.5小時，至OD6o。為0.4-0.5時，放置於4。C冰箱 冷卻l-2小時；將培養液分入兩個50ml離心管中，4"C離心，4000gxl0 分鐘，棄去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml懸浮30分鐘；再4。C離 心，4000gxl0分鐘，棄去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液lml 懸浮。以100^1/管分裝入1.5ml離心管中，-70卩凍存備用；取5filDNA 連接產物加入lOOpl感受態細胞中，旋轉使DNA分散均勻，冰浴30分 鍾，42。C水浴中熱休克90秒，繼續冰浴2-3分鐘後加入LB培養基20(^1， 於37t:緩搖孵育45分鐘，將培養物塗於1.5%含氨節青黴素的瓊脂LB 平板，待膠表面沒有液體流動時，37'C溫箱倒置培養12-16小時；
7) 、重組克隆的篩選及酶切鑑定從上述培養板中挑取6個克隆接 種於5ml含氨苄青黴素的LB培養基中，37C震蕩培養過夜，以鹼裂解 法提取質粒DNA，限制性內切酶消化l小時，電泳鑑定DNA目的片斷 是否正確構建於表達載體中；
8) 用鑑定正確的重組質粒轉化感受態細胞，挑取含重組質粒的菌 體單斑至2ml LB培養基中37"C振蕩培養過夜，其中LB培養基中含氨 苄青黴素量為50mg/L;將lml菌液加入到含50ml LB培養基的1000ml 培養瓶中，37'C振蕩培養至OD,為0.6，取lml菌液作為未誘導的對 照組，餘下菌液中加入異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度分 別為0. 1 mmol/L， 37"C誘導4小時；同時以轉化了 pGEX-4T-l載體的 感受態細胞作陰性對照；將誘導、末誘導的含pGEX-4T-l載體的BL21 菌液菌液各lml，室溫10000g離心1分鐘，棄去上清，0.01MPBS 500W 重懸，加入等體積2 x SDS電泳上樣緩衝液，10(TC煮沸5分鐘，然後膠中各加入20ix 1懸 液，電泳結束後凝膠經考馬斯亮藍染色、脫色後檢測融合蛋白表達情況。 感受態細胞為DH5 a或BL21 。
一種犬S100e蛋白的多克隆抗體的製備方法，其特徵是包括下
列步驟
將20ml轉化了 pGEX-4T-S100P的感受態細胞接種到1000ml LB培 養基中進行擴大培養，37"C震蕩培養至0De。。為0.6左右，加入異丙基 - 3 -D-硫代半乳糖苷至終濃度為0. 1 mmol/L， 37。C誘導4小時，菌液 離心，超聲破碎後，吸附、洗脫GST-SIOOP融合蛋白；將洗脫液放入預 處理的透析袋中，夾緊，放入去離子水中，4"C透析24小時，收集透析 後的液體;用12% SDS聚丙烯醯胺凝膠檢測經過洗脫、透析後的GST-S100 3融合蛋白；收集上述蛋白質後，第一次用弗氏完全佐劑與抗原乳化後 免疫大耳兔，3周後用弗氏不完全佐劑與抗原乳化後加強免疫，4次免 疫後，兔放血，收集抗血清；其中轉化了pGEX-4T-S100e的感受態細胞
的製備方法與犬sioo e蛋白的體外表達方法中相同。
吸附、洗脫GST-S1OO0融合蛋白的具體方法是用GE healthcare 公司的glutathione s印harose吸附GST-S100 0融合蛋白，再用10 mM 的還原型GSH洗脫glutathione s印harose。
本發明所述製備的抗體，包括在兔、羊、鼠等動物體內製備相應動
物來源的抗犬siooe蛋白多克隆抗體，這些多克隆抗體在體內外均可 特異性的與犬sioo e蛋白相結合。
本發明的優越性在於以PGEX-4T-1為基礎所構建的體外S100e表達系統在BL21中能高效地表達目的蛋白，進一步以成熟的方法進行 純化，可方便地獲得大量的GST-S100e融合蛋白。另外，經此蛋白免
疫大耳兔所製備的兔抗犬siooe血清滴度高、特異好，完全可以滿足
相關實驗的需要。


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下面結合附圖和實施例對本發明作迸一步說明。
圖1是目的基因S1003的測序結果示圖。
圖2是原核表達質粒pGEX-4T-S100e構建示圖。
圖3是細菌裂解產物電泳後考馬斯亮藍染色結果示圖。
圖4是GST-S100P融合蛋白經glutathione sepharose純化後電泳示圖。
圖5是製備的抗體與細菌表達的S100P融合蛋白Western Blot結果示圖。
圖6是製備的抗體與犬坐骨神經中的S100p蛋白Western Blot結果示圖。
圖7是製備的抗體與犬坐骨神經中的S100P蛋白免疫組化結果示圖。
具體實施例方式
實施例1:
一種犬SIOOP蛋白的體外表達方法，包括下列步驟
步驟1)、取正常畢格犬坐骨神經，用Trizol試劑提取坐骨神經總步驟2)、RT-PCR擴增用Qiagen公司逆轉錄試劑盒及2 u g總RNA 進行逆轉錄反應，合成cDNA第一鏈，再以合成的cDNA為模板，進行 犬S100 3基因的PCR擴增；
步驟3)、連接用Promega公司的pGEM-T Vector試劑盒，將PCR 產物連接到克隆載體pGEM-T Vector中；
步驟4)、犬3 cDNA序列的測定將已克隆在克隆載體 pGEM-T Vector中的S100e cDNA進行測序，測序結果其序列與基因 庫中的序列完全一致；
1 ATGTCGCAGCTGGAGAAGGCGGCGCTGGCCCTGCTCGACGTGTTCCAGCA 51 GTACTCGGCGCGGGCGGGTGGTGGGCGCAGGCTGAGGAAGGCCGACGTCA
151 CAGGAGGTCGTGGACAAGGTCATGGAGACACTGGACAGTGACGGAGACGG 201 CGAGTGCGACTTCCAGGAGTTCGTGGCCTTCGTGGCTATGGTCACCACCG 251 CCTGCCACGAGTTCTTCGAGCACGAGTGA
步驟5)、設計S100e表達載體的引物，構建S100e重組原核表達 質粒以上述測序正確的質粒為模板，PCR擴增S100e基因片斷。用 限制性內切酶，o 1、BawH I消化S100e的PCR產物和PGEX-4T-1 原核表達質粒載體，並進行酶切產物的膠回收。用T4 DNA連接酶將 PCR酶切回收產物和PGEX-4T-1原核表達質粒載體的酶切回收產物連 接；
步驟6)、感受態細胞的製備及重組質粒的轉化用無菌接種棒從-70 。C保存的DH5 a菌株中蘸少許菌液劃無氨苄青黴素LB瓊脂板，37°。培 養過夜後挑取單個克隆接種於5ml LB培養基中，置細菌培養搖床中於 37°C、 200轉/分震蕩培養20小時。取0.5ml該菌液接種於無氨苄青黴
10素100ml LB液體培養基中，37。C震蕩培養2-2.5小時，至OD,為0.4-0.5 時，放置於4"C冰箱冷卻l-2小時。將培養液分入兩個50ml離心管中， 4T:離心，4000gxl0分鐘，棄去上清，用冰浴的0.1MMgCl2 25ml懸浮 30分鐘。4。C離心，4000gxl0分鐘，棄去上清，加入冰浴的0.1MCaCl2-甘油溶液lml懸浮。以10(Hd/管分裝入1.5ml離心管中，-7(TC凍存備用。 取5|Lil DNA連接產物加入10(^1感受態細胞中，輕輕旋轉數次使DNA 分散均勻，冰浴30分鐘，42。C水浴中熱休克90秒，繼續冰浴2-3分鐘 後加入LB培養基200)Li1，於37t:緩搖孵育45分鐘，將培養物適量塗於 1.5%瓊脂LB平板(含氨苄青黴素)，待膠表面沒有液體流動時，37°C 溫箱倒置培養12-16小時；
步驟7)、重組克隆的篩選及酶切鑑定從上述培養板中挑取6個 克隆接種於5ml含氨苄青黴素的LB培養基中，37匸震蕩培養過夜，以 鹼裂解法小量提取質粒DNA，限制性內切酶消化1小時，電泳鑑定DNA 目的片斷是否正確構建於表達載體中；
步驟8)、目的蛋白的表達BL21感受態細胞的製備(方法同上述 DH5a感受態細胞的製備)。用鑑定正確的pGEX-4T-S100e重組質粒 轉化BL21感受態細胞，挑取含重組質粒的菌體單斑至2ml LB培養基 (含氨苄青黴素50mg/L)中37'C震蕩培養過夜。將lml菌液加入到含 50mlLB培養基的1000ml培養瓶中，37"震蕩培養至OD6(X)為0.6左右， 取lml菌液作為未誘導的對照組，餘下菌液中加入異丙基-(3-D-硫代半 乳糖苷(IPTG)至終濃度為O. 1 mmol/L， 37'C誘導4小時。同時以轉 化了 pGEX-4T-l載體的BL21細菌作陰性對照。將誘導、末誘導的pGEX-4T-l載體的BL21菌液各lml，室溫lOOOOg離心1分鐘，棄去上 清，0.01MPBS 500jil重懸，加入等體積2xSDS電泳上樣緩衝液，100 。C煮沸5分鐘，然後以12000g離心1分鐘，在12% SDS聚丙烯醯胺凝 膠中各加入20iU懸液，電泳結束後凝膠經考馬斯亮藍染色、脫色後檢 測融合蛋白表達情況。 實施例2:
一種犬S100P蛋白的多克隆抗體的製備方法，包括下列步驟在 經實施例1步驟，證實有目的蛋白表達後，將20ml轉化了 pGEX-4T-S100 3的BL21細菌接種到1000mlLB培養基中進行擴大培養，37"C震蕩培 養至OD6oc為0.6左右，加入異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃 度為0. 1 mmol/L， 37匸誘導4小時。菌液離心，超聲破碎後，用GE healthcare公司的glutathione sepharose吸附GST-S100P融合蛋白。用 10 mM的還原型GSH洗脫glutathione sepharose，將洗脫液放入預處理 的透析袋中，夾緊，放入去離子水中，4"C透析24小時，收集透析後的 液體。用12% SDS聚丙烯醯胺凝膠檢測經過洗脫、透析後的GST-S100 P融合蛋白。參照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書，定量透析後蛋白 質的濃度。收集足夠量的蛋白質後，第一次用弗氏完全佐劑與抗原乳化 後免疫大耳兔，3周後用弗氏不完全佐劑與抗原乳化後加強免疫，4次 免疫後，兔放血，收集抗血清。利用protein G法純化抗血清，並利用 ELISA方法確定純化後抗體的滴度。再用純化後的抗體對細菌目的蛋白 條帶和動物組織中的S100P蛋白進行檢測，確定抗體的特異性。
結果1、目的蛋白獲得了高效的表達。2、以Western方法證明獲得的抗體能識別細菌表達的和犬坐骨神經中的S100e蛋白。3、以免疫 組化的方法證明得到的抗體能有效地識別犬坐骨神經中的S100P蛋白。 (見圖5、圖6、圖7)。
權利要求
1、一種犬S100β蛋白的體外表達方法，其特徵是包括下列步驟1)取正常畢格犬坐骨神經，用Trizol試劑提取坐骨神經總RNA；2)RT-PCR擴增用逆轉錄試劑盒及總RNA進行逆轉錄反應，合成cDNA第一鏈，再以合成的cDNA為模板，進行犬S100β基因的PCR擴增；3)連接用克隆載體試劑盒，將PCR產物連接到克隆載體中；4)犬S100βcDNA序列的測定將已克隆在克隆載體中的S100β cDNA進行測序，測序結果其序列與基因庫中的序列完全一致；5)設計S100β表達載體的引物，構建S100β重組原核表達質粒以上述測序正確的質粒為模板，PCR擴增S100β基因片斷；用限制性內切酶Xho I、BamH I消化S100β的PCR產物和PGEX-4T-1質粒載體，並進行酶切產物的膠回收；用T4 DNA連接酶將PCR酶切回收產物和PGEX-4T-1質粒載體酶切回收產物連接；6)感受態細胞的製備及重組質粒的轉化用無菌接種棒從感受態細胞菌株蘸菌液劃無氨苄青黴素LB瓊脂板，37℃培養過夜後挑取單個克隆接種於5ml LB培養基中，細菌培養搖床中37℃、200轉/分震蕩培養20小時；取0.5ml該菌液接種於無氨苄青黴素100ml LB液體培養基中，37℃振蕩培養2-2.5小時，至OD600為0.4-0.5時，放置於4℃冰箱冷卻1-2小時；將培養液分入兩個50ml離心管中，4℃離心，4000g×10分鐘，棄去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml懸浮30分鐘；再4℃離心，4000g×10分鐘，棄去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml懸浮。以100μl/管分裝入1.5ml離心管中，-70℃凍存備用；取5μl DNA連接產物加入100μl感受態細胞中，旋轉使DNA分散均勻，冰浴30分鐘，42℃水浴中熱休克90秒，繼續冰浴2-3分鐘後加入LB培養基200μl，於37℃緩搖孵育45分鐘，將培養物塗於1.5％含氨苄青黴素的瓊脂LB平板，待膠表面沒有液體流動時，37℃溫箱倒置培養12-16小時；7)、重組克隆的篩選及酶切鑑定從上述培養板中挑取6個克隆接種於5ml含氨苄青黴素的LB培養基中，37℃震蕩培養過夜，以鹼裂解法提取質粒DNA，限制性內切酶消化1小時，電泳鑑定DNA目的片斷是否正確構建於表達載體中；8)用鑑定正確的重組質粒轉化感受態細胞，挑取含重組質粒的菌體單斑至2ml LB培養基中37℃振蕩培養過夜，其中LB培養基中含氨苄青黴素量為50mg/L；將1ml菌液加入到含50ml LB培養基的1000ml培養瓶中，37℃振蕩培養至OD600為0.6，取1ml菌液作為未誘導的對照組，餘下菌液中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度分別為0.1mmol/L，37℃誘導4小時；同時以轉化了pGEX-4T-1載體的感受態細胞作陰性對照；將誘導、末誘導的含pGEX-4T-1載體的BL21菌液菌液各1ml，室溫10000g離心1分鐘，棄去上清，0.01M PBS 500μl重懸，加入等體積2×SDS電泳上樣緩衝液，100℃煮沸5分鐘，然後以12000g離心1分鐘，在12％SDS聚丙烯醯胺凝膠中各加入20μl懸液，電泳結束後凝膠經考馬斯亮藍染色、脫色後檢測融合蛋白表達情況。
2、根據權利要求l所述的犬S100e蛋白的體外表達方法，其特徵 是感受態細胞為DH5a或BL21。
3、 一種犬S100 3蛋白的多克隆抗體的製備方法，其特徵是包括 下列步驟將20ml轉化了 pGEX-4T-S100 g的感受態細胞接種到1000ml LB培 養基中進行擴大培養，37t:震蕩培養至OD咖為0.6左右，加入異丙基 -e-D-硫代半乳糖苷至終濃度為O. 1 ranol/L， 37。C誘導4小時，菌液 離心，超聲破碎後，吸附、洗脫GST-S1OO0融合蛋白；將洗脫液放入預 處理的透析袋中，夾緊，放入去離子水中，4。C透析24小時，收集透析 後的液體;用12% SDS聚丙烯醯胺凝膠檢測經過洗脫、透析後的GST-S100 P融合蛋白；收集上述蛋白質後，第一次用弗氏完全佐劑與抗原乳化後 免疫大耳兔，3周後用弗氏不完全佐劑與抗原乳化後加強免疫，4次免 疫後，兔放血，收集抗血清；其中轉化了pGEX-4T-S100P的感受態細胞的製備方法與犬siooe蛋白的體外表達方法中相同。
4、 根據權利要求3所述的犬siooe蛋白的多克隆抗體的製備方法，其特徵是吸附、洗脫GST-S100e融合蛋白的具體方法是用GE healthcare公司的glutathione s印harose吸附GST-S100 P融合蛋白， 再用10 mM的還原型GSH洗脫glutathione s印harose。
全文摘要
本發明公開了一種犬S100β蛋白的體外表達及其多克隆抗體的製備方法，包括提取犬坐骨神經總RNA、RT-PCR擴增、連接、犬S100βcDNA序列的測定、設計S100β表達載體的引物構建S100β重組原核表達質粒、感受態細胞的製備及重組質粒的轉化、重組克隆的篩選及酶切鑑定、目的蛋白的表達及多克隆抗體製備等步驟。本發明以PGEX-4T-1為基礎所構建的體外S100β表達系統在BL21中能高效地表達目的蛋白，進一步以成熟的方法進行純化，可方便地獲得大量的GST-S100β融合蛋白。另外，經此蛋白免疫大耳兔所製備的兔抗犬S100β血清滴度高、特異好，完全可以滿足相關實驗的需要。
文檔編號C12N15/12GK101451136SQ20081019669
公開日2009年6月10日 申請日期2008年9月17日 優先權日2008年9月17日
發明者斐 丁, 梅 劉, 炎 劉, 堅 吳, 蔣茂榮, 顧曉松 申請人:南通大學