新型腸侵襲性大腸桿菌噬菌體Esc‑COP‑4及其用於抑制腸侵襲性大腸桿菌增殖的用途的製作方法

2023-07-08 00:58:36 2

本發明涉及一種從自然界分離的感染和殺死腸侵襲性大腸桿菌的噬菌體，以及一種使用包含噬菌體作為活性成分的組合物用來預防和治療腸侵襲性大腸桿菌感染的方法。更具體地說，本發明涉及從自然界分離出來的肌尾噬菌體科噬菌體esc-cop-4，其可以特異性地殺死腸侵襲性大腸桿菌菌株，其具有由seqidno：1的核苷酸序列表示的基因組(登記號：kctc12663bp)以及預防腸侵襲性大腸桿菌感染和之後使用包含所述噬菌體的組合物作為活性成分治療的方法。

背景技術：

根據其表面抗原(脂多糖，o)，鞭毛蛋白抗原(鞭毛蛋白，h)和莢膜抗原(多糖，k)的組合，大腸桿菌(e.coli)被認為具有超過9000種血清型。根據發病機制、毒素和o:h血清型，大腸桿菌在病因學上分為腸毒性大腸桿菌(etec)、腸侵襲性大腸桿菌(eiec)、腸道致病性大腸桿菌(epec)和腸出血性大腸桿菌(ehec)。其中，腸侵襲性大腸桿菌(eiec)進入大腸黏膜的上皮細胞，從而通過細胞壞死等形成潰瘍，並引起具有血液和粘液痢疾的桿菌性痢疾。

腸侵襲性大腸桿菌是導致豬腹瀉的重要致病菌。它可以降低感染豬的生長速度，導致死亡，因為治療和預防這種感染的成本很高造成很大的經濟損失。考慮到這種大腸桿菌對畜牧業的重大損害，迫切需要開發一種預防和治療腸侵襲性大腸桿菌感染的方法。已經使用各種抗生素來預防或治療這種腸侵襲性大腸桿菌感染。然而，由於耐抗生素性細菌的增加，迫切需要有效的替代方法。

最近，使用噬菌體作為治療細菌感染的新方法引起了我們的注意。特別地，我們對噬菌體非常感興趣的原因是因為基於噬菌體的治療是一種自然友好的方法。噬菌體是感染細菌的極小微生物，簡稱為噬菌體。一旦噬菌體感染細菌，噬菌體在細菌細胞內增殖。完全增殖後，後代破壞細菌細胞壁逃離宿主，這說明噬菌體具有殺菌能力。噬菌體感染的特徵是特異性高，使得特定噬菌體僅感染特異性細菌。也就是說，可以被特定噬菌體感染的細菌是有限的，這表明噬菌體只能殺死特定細菌並且不會傷害其他細菌。

噬菌體首先由英國細菌學家特沃特(twort)在1915年發現，當時他注意到微球菌菌落被未知的某種東西融化並變得透明。1917年，法國細菌學家d'herelle發現，痢疾病人糞便的濾液中的痢疾志賀菌(shigelladisentriae)被某物融化，並進一步研究了這種現象。結果是，他獨自確定了噬菌體，並將其命名為噬菌體，其意思是病菌殺手。從那時起，已經連續鑑定了特異性地作用於志賀菌(shigella)、傷寒沙門氏菌(salmonellatyphi)和霍亂弧菌(vibriocholerae)等致病菌的噬菌體。

由於噬菌體殺死細菌的獨特能力，已經研究並預期噬菌體是治療細菌感染的更好的方法。然而，fleming發現青黴素之後，由於抗生素的普及，只有東歐國家和前蘇聯的噬菌體研究在繼續。2000年以後，常規抗生素的優點由於耐抗生素性細菌的增加而褪色。因此，噬菌體再次被視為可以代替常規抗生素的新的抗菌劑。

此外，最近全球政府強化對使用抗生素的監管。對噬菌體感興趣的越來越多，工業應用也越來越多。

因此，本發明人嘗試通過使用從自然界中分離的可以選擇性地殺死腸侵襲性大腸桿菌的噬菌體而開發可用於預防或治療腸侵襲性大腸桿菌感染的組合物，並進一步建立使用該組合物預防或治療腸侵襲性大腸桿菌感染的方法。結果是，本發明人分離出適合於此目的的噬菌體，並確定了可將本發明的噬菌體與其他噬菌體區分開的基因組的核苷酸序列。然後，我們已經開發了一種包含分離的噬菌體作為活性成分的組合物，並證實該組合物可以有效地用於預防和治療腸侵襲性大腸桿菌感染，完成本發明。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種從自然界中分離的並可以特異性殺死腸侵襲性大腸桿菌的肌尾噬菌體科的噬菌體esc-cop-4，其具有由seqidno：1的核苷酸序列表示的基因組(登記號：kctc12663bp)。

本發明的另一個目的是提供一種適用於預防腸侵襲性大腸桿菌感染的組合物，其包含可以感染和殺死腸侵襲性大腸桿菌的噬菌體esc-cop-4作為活性成分，以及使用所述組合物預防腸侵襲性大腸桿菌感染的方法。

本發明的另一個目的是提供一種適用於治療腸侵襲性大腸桿菌感染的組合物，其包含可以感染和殺死腸侵襲性大腸桿菌的噬菌體esc-cop-4作為活性成分，以及使用所述組合物治療腸侵襲性大腸桿菌感染的方法。

本發明的另一個目的是提供一種用於使用所述組合物預防和治療腸侵襲性大腸桿菌感染的消毒劑。

本發明的另一個目的是提供一種用於使用所述組合物預防和治療腸侵襲性大腸桿菌感染的飲用水添加劑。

本發明的另一個目的是提供一種通過使用所述組合物預防和治療腸侵襲性大腸桿菌的感染而對養殖業有效的飼料添加劑。

為了實現上述目的，本發明提供了一種從自然界分離出來的並可以特異性地殺死腸侵襲性大腸桿菌的肌尾噬菌體科噬菌體esc-cop-4，其具有由seqidno：1的核苷酸序列表示的基因組(登記號：kctc12663bp)，以及使用包含噬菌體作為活性成分的組合物來預防和治療腸侵襲性大腸桿菌感染的方法。噬菌體esc-cop-4由本發明人分離，然後於2014年8月21日保藏於韓國生物科學和生物工藝學研究院韓國典型培養物保藏中心(登記號：kctc12663bp)。

本發明還提供一種適用於預防或治療腸侵襲性大腸桿菌感染的消毒劑、飲用水添加劑和飼料添加劑，其包含噬菌體esc-cop-4作為活性成分。

由於本發明的組合物中包含的噬菌體esc-cop-4有效地殺死腸侵襲性大腸桿菌，因此被認為對預防或治療由腸侵襲性大腸桿菌引起的大腸桿菌腹瀉(感染)是有效的。因此，本發明的組合物可用於預防和治療由腸侵襲性大腸桿菌引起的大腸桿菌腹瀉。在本說明書中，大腸桿菌腹瀉包括伴隨發燒，腹瀉等的大腸桿菌感染引起的症狀。

在本說明書中，術語「治療(treatment)」或「治療(treat)」表示(i)抑制由腸侵襲性大腸桿菌引起的腹瀉；和(ii)緩解由腸侵襲性大腸桿菌引起的腹瀉。

在本說明書中，術語「分離(isolation)」或「分離的(isolated)」表示通過使用不同的實驗技術分離噬菌體的所有操作，和確保能夠區分該噬菌體與其他噬菌體的特徵的操作，還包括通過生物工程技術增殖噬菌體使其有用的操作。

包含在本發明組合物中的藥學上可接受的載體是通常用於製備藥物製劑的藥物載體，其實施例為乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，澱粉，阿拉伯樹膠，磷酸鈣，藻酸鹽，明膠，矽酸鈣，微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素，水，糖漿，甲基纖維素，羥基苯甲酸甲酯，羥基苯甲酸丙酯，滑石，硬脂酸鎂和礦物油，但並不限於此。除了上述成分之外，本發明的組合物還可以包括潤滑劑、潤溼劑、甜味劑、香料、乳化劑、懸浮劑和防腐劑。

在本發明的組合物中，包含噬菌體esc-cop-4作為活性成分。此時，噬菌體esc-cop-4為以下濃度1×101pfu/ml～1×1030pfu/ml或1×101pfu/g～1×1030pfu/g，優選1×104pfu/ml～1×1015pfu/ml或1×104pfu/g～1×1015pfu/g。

本發明的組合物可以由本領域技術人員通過使用單位劑量形式或在多劑量容器中的藥學上可接受的載體和/或賦形劑通過本領域的方法來配製。製劑可以是在油或水溶性介質、提取物、粉末、顆粒、片劑或膠囊中的溶液、懸浮液或乳液的形式。此時，可以另外包含分散劑或穩定劑。

本發明的組合物可以根據使用目的製備為消毒劑、飲用水添加劑或飼料添加劑，但不限於此。

有益效果

使用包含噬菌體esc-cop-4作為活性成分的組合物來預防和治療腸侵襲性大腸桿菌感染的方法與基於包括常規抗生素的化學物質的常規方法相比具有對腸侵襲性大腸桿菌特異性高的優點。這意味著，本發明的組合物可以用於特異性預防或治療腸侵襲性大腸桿菌的感染，而不會影響其他有用的寄宿細菌，因此具有較少的副作用。一般來說，當使用如抗生素的化學物質時，一般寄宿細菌也會受到損害，從而削弱動物的免疫力，具有各種副作用。同時，本發明的組合物使用從自然界中分離的噬菌體作為活性成分，因此其非常自然友好。

附圖說明

參考附圖可以最好地理解本發明的優選實施方式的應用，其中：

圖1是示出噬菌體esc-cop-4的形態的電子顯微照片。

圖2是說明噬菌體esc-cop-4殺死腸侵襲性大腸桿菌的能力的照片。盤上的透明區域是通過溶解細菌細胞形成的斑塊。

具體實施方式

本發明的實際和目前優選的實施方式如下列實施例所示。

然而，應當理解的是，本領域技術人員在考慮到本發明的基礎上可以在本發明的精神和範圍內進行修改和改進。

實施例1：分離能夠殺死腸侵襲性大腸桿菌的噬菌體

從自然界中收集樣品以篩選具有殺死腸侵襲性大腸桿菌能力的噬菌體。用於本文中噬菌體分離的腸侵襲性大腸桿菌是本發明人之前已經分離並鑑定為腸侵襲性大腸桿菌的腸侵襲性大腸桿菌。

噬菌體的分離過程在下文中詳細描述。將收集的樣品加入到tsb培養基(胰蛋白酶大豆液體培養基)(酪蛋白的胰消化物，17g/l；大豆的木瓜酶消化物，3g/l；葡萄糖，2.5g/l；氯化鈉，5g/l；磷酸氫二鉀，2.5g/l)，以1/1000的比例接種腸侵襲性大腸桿菌，然後在37℃下振蕩培養3-4小時。培養完成後，以8000rpm離心20分鐘，回收上清液。回收的上清液以1/1000的比例接種腸侵襲性大腸桿菌，然後在37℃下振蕩培養3-4小時。當樣品含有噬菌體時，為了提高噬菌體的滴定度，將上述步驟重複5次。重複5次後，培養物溶液以8000rpm離心20分鐘，回收上清液。回收的上清液用0.45μm過濾器過濾。將得到的濾液用於斑點測試，以檢查是否包括能夠殺死腸侵襲性大腸桿菌的噬菌體。

斑點測試如下進行：以1/1000的比例在tsb培養基上接種腸侵襲性大腸桿菌，37℃振蕩培養過夜。將上述製備的3ml腸侵襲性大腸桿菌培養液(od600＝1.5)塗在tsa(胰蛋白酶大豆瓊脂；酪蛋白的胰消化物，17g/l；大豆的木瓜酶消化物，3g/l；氯化鈉5g/l；瓊脂，15g/l)板上。將板放在室內乾燥約30分鐘。乾燥後，將10μl所得濾液直接點在腸侵襲性大腸桿菌苔的表面上並乾燥約30分鐘。乾燥後，將板在37℃培養一天，然後檢查在細菌苔表面上透明區域的形成。如果在濾液滴下的地方產生透明區域，則可以判斷為濾液中包含能夠殺滅腸侵襲性大腸桿菌的噬菌體。通過上述步驟，可以獲得含有能夠殺死腸侵襲性大腸桿菌的噬菌體的濾液。

之後，從上述確認具有能夠殺死腸侵襲性大腸桿菌細胞的噬菌體的濾液中分離出噬菌體。常規的斑塊測試用於純噬菌體的分離。具體來說，通過使用滅菌的尖端拾取斑塊測試過程中形成的斑塊，然後將其加入到腸侵襲性大腸桿菌的培養液中，然後培養4-5小時。培養完成後，以8000rpm離心20分鐘，得到上清液。在回收的上清液中以1/50的比例接種腸侵襲性大腸桿菌培養物，然後培養4-5小時。為了增加噬菌體的滴定度，將上述步驟重複至少5次。然後，以8000rpm離心20分鐘，得到上清液。用獲得的上清液進行斑塊測試。一般來說，純噬菌體分離不是一次性完成的，因此通過使用上述形成的斑塊重複上述步驟。在重複步驟至少5次後，得到含有純噬菌體的溶液。通常重複分離純噬菌體的步驟，直到產生的斑塊在尺寸和形態上相似。通過電子顯微鏡觀察確認最終的純噬菌體分離。直到在電子顯微鏡下確認純噬菌體分離之前，重複上述步驟。在電子顯微鏡下的觀察用常規方法進行。簡言之，將含有純噬菌體的溶液裝載在銅格柵上，隨後用2％的乙酸鈾醯陰性染色。乾燥後，在透射電子顯微鏡下觀察形態。本發明中分離出的噬菌體的電子顯微鏡照片如圖1所示。從形態上觀察，上述分離的噬菌體被鑑定為屬於肌尾噬菌體科噬菌體。

含有上述確認的純噬菌體的溶液進行純化。將腸侵襲性大腸桿菌細胞的培養液以噬菌體溶液總體積的1/50的體積加入到含有純噬菌體的溶液中，然後再培養4-5小時。培養完成後，以8000rpm離心20分鐘，得到上清液。重複該過程5次，得到含有足夠數目噬菌體的溶液。將最終離心得到的上清液用0.45μm過濾器過濾，然後用常規聚乙二醇(peg)沉澱。特別地，將peg和nacl加入到100ml濾液中，直到達到10％peg8000/0.5mnacl，在4℃下靜置2～3小時。然後，以8000rpm離心30分鐘，得到噬菌體沉澱物。將所得噬菌體沉澱物重新懸浮於5ml緩衝液(10mm三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，10mmmgso4，0.1％明膠，ph8.0)中。該溶液被稱為噬菌體懸浮液或噬菌體溶液。

結果，收集上述純化的噬菌體，將其命名為噬菌體esc-cop-4，然後於2014年8月21日在韓國生物科學和生物工藝學研究院韓國典型培養物保藏中心保藏(登記號：kctc12663bp)。

實施例2：噬菌體esc-cop-4基因組的分離和序列分析

如下分離噬菌體esc-cop-4的基因組。將基因組從實施例1獲得的噬菌體懸浮液中分離。首先，為了去除懸浮液中的腸侵襲性大腸桿菌的dna和rna，將脫氧核糖核酸酶i和核糖核酸酶a各200u分別加入到10ml的噬菌體懸浮液中，在37℃下培養30分鐘。30分鐘後，為了去除脫氧核糖核酸酶i和核糖核酸酶a活性，加入500μl0.5m乙二胺四乙酸(edta)，培養10分鐘。將懸浮液在65℃下進一步培養10分鐘，然後加入100μl蛋白酶k(20mg/ml)以破壞噬菌體的外壁，然後在37℃下培養20分鐘。之後，加入500μl10％十二烷基硫酸鈉(sds)溶液，然後在65℃培養1小時。加入10ml比例為25:24:1的苯酚：氯仿：異戊醇混合物，然後充分混合。將混合物以13,000rpm離心15分鐘以分離每層。得到上層液體，向上層加入體積為上層體積的1.5倍的異丙醇，然後以13,000rpm離心10分鐘以沉澱噬菌體的基因組。收集沉澱後，向沉澱物中加入70％乙醇，然後以13,000rpm離心10分鐘以洗滌沉澱。回收洗滌的沉澱物，真空乾燥，然後溶於100μl水中。重複該步驟以獲得足夠量的噬菌體esc-cop-4基因組。

通過在首爾國立大學環境管理國家儀器中心使用illuminami-seq裝置進行下一代測序(ngs)分析上述獲得的噬菌體esc-cop-4基因組的核苷酸序列。結果表明，噬菌體esc-cop-4的最終基因組的大小為168,161bp，全基因組的核苷酸序列為seqidno：1。

通過使用網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)上的blast研究了上述獲得的噬菌體esc-cop-4的基因組序列與先前報導的噬菌體基因組序列的相似性。從blast結果確認的是噬菌體esc-cop-4的基因組序列與志賀菌(shigella)噬菌體pss-1(基因庫登記號：km501444.1)，大腸桿菌噬菌體rb10(基因庫登記號：km606999.1)，大腸桿菌噬菌體rb9(基因庫登記號：km606998.1)，大腸桿菌噬菌體rb7(基因庫登記號：km606997.1)和大腸桿菌噬菌體rb6(基因庫登記號：km606996.1)具有很高的同源性(98％，95％，95％，95％和95％)。然而，他們的基因組大小彼此不同。確切地說，噬菌體esc-cop-4的全基因組的大小測定為168,161bp，而志賀菌噬菌體pss-1的全基因組大小為164,999bp，大腸桿菌噬菌體rb10的全基因組大小為168,401bp，大腸桿菌噬菌體rb9的大小為168,395bp，大腸桿菌噬菌體rb7的大小為168,395bp，大腸桿菌噬菌體rb6的大小為168,394bp。此外，噬菌體esc-cop-4基因組內的orf(開放閱讀框)的數量測定為267個orf，而志賀菌噬菌體pss-1中的orf數為266個orf，大腸桿菌噬菌體rb10的orf數為272個orf，大腸桿菌噬菌體rb9的orf數為272個orf，大腸桿菌噬菌體rb7的orf為272個orf，大腸桿菌噬菌體rb6的orf為271個orf。

基於該結果得出結論，噬菌體esc-cop-4應該是以前未報導的新型噬菌體。

實施例3：噬菌體esc-cop-4對腸侵襲性大腸桿菌的殺傷能力的研究

研究了分離的噬菌體esc-cop-4對腸侵襲性大腸桿菌的殺傷能力。為此，通過與實施例1中所述相同的方式通過斑點測試觀察透明區域的形成。用於該研究的腸侵襲性大腸桿菌共有10個菌株，其之前已經由本發明人分離並鑑定為腸侵襲性大腸桿菌。噬菌體esc-cop-4顯示了對本實驗中使用的9個腸侵襲性大腸桿菌的殺傷能力。殺傷能力試驗的代表性結果如圖2所示。同時，還研究了噬菌體esc-cop-4殺死金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)，糞腸球菌(enterococcusfaecalis)，屎腸球菌(enterococcusfaecium)，植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)，乳房鏈球菌(streptococcusuberis)和銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)的活性。結果是，確定了噬菌體esc-cop-4不具有針對這些微生物的殺傷活性。

因此，證實了噬菌體esc-cop-4具有殺死腸侵襲性大腸桿菌細胞的特異性能力和針對腸侵襲性大腸桿菌的廣譜抗菌譜，這表明本發明的噬菌體esc-cop-4可用作用於預防和治療腸侵襲性大腸桿菌感染的組合物的活性成分。

實施例4：噬菌體esc-cop-4對腸侵襲性大腸桿菌感染的預防作用

將100μl噬菌體esc-cop-4溶液以3×108pfu/ml加入到含有9mltsb的試管中。對於含有9ml的tsb的另一個試管，僅添加相同體積的tsb。然後，將腸侵襲性大腸桿菌培養物加入到每個管中以製備od600為0.5的細菌懸浮液。之後，將試管轉移到37℃的培養箱中，然後振蕩培養，期間觀察腸侵襲性大腸桿菌的生長。如表1所示，在添加有噬菌體esc-cop-4溶液的管中，腸侵襲性大腸桿菌的生長受到抑制，而在沒有噬菌體esc-cop-4溶液的管中，腸侵襲性大腸桿菌的生長沒有被抑制。

表1

腸侵襲性大腸桿菌的生長抑制

上述結果表明，噬菌體esc-cop-4不僅抑制腸侵襲性大腸桿菌的生長，而且可以殺死它們。因此，噬菌體esc-cop-4可以用作用於防止腸侵襲性大腸桿菌感染的組合物的活性成分。

實施例5：噬菌體esc-cop-4對腸侵襲性大腸桿菌感染的治療作用

研究了噬菌體esc-cop-4對受腸侵襲性大腸桿菌影響的動物的治療作用。4隻25天大斷奶仔豬為一組，共2組豬在豬圈(1.1米×1.0米)中飼養14天。安裝供暖系統，控制周圍環境。控制豬圈的溫度和溼度，每天清潔地板。在實驗的第7天，使用口服注射管給所有動物口服1ml腸侵襲性大腸桿菌懸浮液。上述給藥的腸侵襲性大腸桿菌懸液製備如下：將腸侵襲性大腸桿菌在tsb培養基中於37℃培養18小時，通過離心收集細菌細胞。將鹽水(ph7.2)加入到細菌細胞沉澱中以使細胞懸浮液濃度為109cfu/ml。從腸侵襲性大腸桿菌激發的第二天起，實驗組(噬菌體溶液處理的豬)以與上述給藥相同的方式口服給藥噬菌體esc-cop-4(109pfu/頭)一天兩次。對照組(噬菌體溶液未處理的豬)無任何處理。給兩組提供同樣的飼料和飲水。在腸侵襲性大腸桿菌激發之後，每天都觀察動物是否發生腹瀉。通過測量腹瀉指數進行觀察。根據糞便一致性(fc)評分(正常：0，鬆散糞便：1，中度腹瀉：2和嚴重腹瀉：3)，腹瀉指數設定如下。結果示於表2。

表2

糞便一致性評分

從上述結果可以確認，本發明的噬菌體esc-cop-4可以非常有效地治療由腸侵襲性大腸桿菌引起的感染。

實施例6：飼料添加劑和飼料的製備

使用噬菌體esc-cop-4溶液製備含有濃度為1×108pfu/g的噬菌體esc-cop-4的飼料添加劑。其製備方法如下：向噬菌體溶液中加入麥芽糖糊精(40％，w/v)，然後加入海藻糖到終濃度10％。混合均勻後，將混合物冷凍乾燥。最後，將乾燥的混合物研磨成細粉末。上述乾燥過程可以用真空乾燥、溫熱乾燥或在室溫下乾燥來代替。為了製備對照飼料添加劑進行比較，製備不含噬菌體但僅含有緩衝液(10mm三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，10mmmgso4，0.1％明膠，ph8.0)的飼料添加劑。

將上述兩種飼料添加劑分別與1000倍體積的豬飼料混合，得到兩種最終的飼料。

實施例7：飲用水添加劑和消毒劑的製備

飲用水添加劑和消毒劑在使用目的上不同，但組合物相同，因此它們以相同的方式製備。使用噬菌體esc-cop-4溶液製備含有濃度為1×108pfu/ml的噬菌體esc-cop-4的飲用水添加劑(或消毒劑)。特別地為了製備飲用水添加劑(或消毒劑)，將噬菌體esc-cop-4溶液加入到緩衝溶液中達到1×108pfu/ml，混合均勻。為了比較，將上述緩衝溶液本身用作不含噬菌體的飲用水添加劑(或消毒劑)。

製備的兩種飲用水添加劑(或消毒劑)以1:1000的比例在水中稀釋，然後用作飲用水或消毒劑。

實施例8：對養豬業的影響

研究了實施例6和實施例7中製備的飼料、飲用水和消毒劑對養豬業的影響。特別地，研究重點是通過實施例5中糞便一致性評分的腹瀉情況。共30隻仔豬分為3組，每組由10隻仔豬組成(a組：飼料試驗組，b組：飲用水試驗組；c組：消毒劑試驗組)。實驗持續2周。每組分為兩小組，每小組包括5隻仔豬。根據噬菌體esc-cop-4處理與否分組(小組①：用噬菌體esc-cop-4處理；小組-②：未用噬菌體處理)。在該實驗中使用的仔豬是20天大的斷奶仔豬，並且在分開的彼此間隔足夠距離的房間中飼養。每個小組如表3所示被劃分並命名。

表3

養豬實驗的小組

按照表3所示的常規飼料供給方法提供飼料，提供實施例6中製備的飼料。根據表3中所示的常規供水方法提供飲用水，提供實施例7中製備的飲用水。消毒劑與常規消毒劑一起輪流處理一周三次。也就是說，在噴灑本發明的消毒劑的那一天，沒有用常規的消毒劑進行處理。結果示於表4。

表4

養豬實驗的糞便一致性評分

從上述結果可以確認，本發明製備的飼料、飲用水和消毒劑在降低動物腹瀉方面是有效的。因此，可以得出結論，本發明的組合物可以有效地用於提高動物養殖的生產率。

本領域技術人員將理解的是，在前面的說明書中公開的概念和具體實施方式可以容易地被用作修改或設計用於實現本發明的相同目的的其他實施方式的基礎。本領域技術人員還將理解的是，這些等同的實施方式不脫離如所附權利要求中闡述的本發明的精神和範圍。

保藏單位名稱：韓國生物科學和生物工藝學研究院

保藏編號：kctc12663bp

保藏日期：20140821

序列表

尹特榮生物科技株式會社

新型腸侵襲性大腸桿菌噬菌體esc-cop-4及其用於抑制腸侵襲性大腸桿菌增殖的用途

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