表達以及分泌制管張素和endostatin的免疫融合物的製作方法

2023-08-06 04:48:26

專利名稱：表達以及分泌制管張素和endostatin的免疫融合物的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及製備和使用含有血管生成抑制劑的融合蛋白的方法和組合物。更具體地講，本發明涉及製備和使用含有免疫球蛋白Fc區和血管生成抑制劑的稱為免疫融合物(immunofusin)的融合蛋白的方法和組合物。
背景技術：
人們發現兩種有效血管生成抑制劑制管張素(O』Reilly等(1994)Cell 79315)和endostatin(O』Reilly等(1997)Cell 88277)由原發性腫瘤天然產生。這兩種蛋白是內皮細胞增生的特異性抑制劑並通過阻斷血管生成(阻斷供給腫瘤營養的新血管的形成)而抑制腫瘤生長。研究表明，這些血管生成抑制劑甚至在非常高劑量下都是無毒的，它們可以抑制轉移瘤的生長並可以使原發性腫瘤退化到顯微休眠狀態。已鑑定出這兩種抑制劑是非常大的完整分子的蛋白酶解片段。已經發現制管張素是纖溶酶原的一個片段，而endostatin是膠原蛋白XVIII的一個片段。
在癌症領域人們已非常關注這兩種蛋白，因為已經證實它們抑制小鼠中的許多不同類型腫瘤的生長，而沒有明顯的副作用或抗藥性。傳統的化學治療通常導致主要由癌細胞遺傳不穩定性引起的獲得性抗藥性。使用血管生成抑制劑的治療不是把癌細胞作為目標而是針對支持腫瘤生長的正常內皮細胞。因為內皮細胞在遺傳上是穩定的，所以血管生成抑制劑治療可減少抗藥性。這些研究表明，採用endostatin的延長的抗血管生成治療的小鼠不發生抗藥性。因此，對小鼠周期性重複的endostatin治療延長腫瘤休眠期以及停止治療後腫瘤不復發(Boehm等(1997)Nature 390404)。
儘管用小鼠獲得有希望的結果，但是仍然不能用大腸桿菌、杆狀病毒、酵母和哺乳動物表達系統大批量生產臨床級可溶的、有活性的制管張素和endostatin。用大腸桿菌表達獲得不確定組合物的不溶性蛋白聚集物，不能將這種蛋白注射到人體內。其它生產方法諸如杆狀病毒和哺乳動物表達系統得到非常低水平的重組蛋白(O』Reilly等(1997)Cell 88277)。
迄今可以將該低得率表達系統解釋為制管張素和endostatin這兩種是非常大的蛋白內部片段。在缺乏從前體分子中切割的殘基時，該截短蛋白可能沒有進行合適的摺疊。例如，制管張素有26個形成大量二硫鍵的半胱氨酸殘基。在分泌途徑中，制管張素自身的表達不能提供最適環境以正確地形成這些大量的二硫鍵。此外，以大腸桿菌生產的重組endostatin蛋白在透析期間沉澱，可能是由於endostatin的疏水性引起(O』Reilly等(1997)Cell 88277)。
以其現存形式使用制管張素和endostatin主要障礙是不得不將相對大量的蛋白每天注射，持續數星期至數月以達到所需的臨床效果。例如，目前在小鼠模型中，需要劑量20mg/kg/天的endostatin以證實最佳藥效(Boehm等(1997)Nature 390404)。已知急需在臨床上試驗endostatin和制管張素，重要是的得到可以產生大量臨床級物質的生產方法。
在哺乳動物細胞中，已經用來生產高水平表達融合蛋白的一種表達系統是編碼信號序列、免疫球蛋白Fc區和靶蛋白的DNA構成物。這種構成物的融合產物統稱為「免疫融合物」。已經將幾種靶蛋白成功地表達為免疫融合物，它們包括IL2、CD26、Tat、Rev、OSF-2、βIG-H3、IgE受體、PSMA和gp120。這些表達構成物公開於美國專利第5,541,087號和美國專利第5,726,044號，其公開內容均通過引用結合到本文中。
在哺乳動物細胞中，表達重組融合蛋白的主要目的一直是試圖對所述雜種分子賦予新的或有用的特性，例如合適的摺疊、增加溶解度、體內引導細胞因子或毒素、Fc受體結合、補體活化、A蛋白結合、延長循環半壽期和增加穿過血-腦屏障的能力。在哺乳動物細胞中所產生的重組融合蛋白的實例包括細胞因子免疫綴合物(Gillies等(1992)Proc.Natl Acad Sci USA 891428；Gillies等(1993)Bioconjugate Chemistry 4230)、免疫粘附素(Capon等(1989)Nature337525)、免疫毒素(Chaudhary等(1989)Nature 339394)和神經生長因子綴合物(Friden等(1993)Science 259373)。上述每個出版物都通引用結合到本文中。
本發明的一個目的是提供有利於在各種哺乳動物宿主細胞中有效地生產和分泌血管生成抑制劑的新的DNA。本發明的另一個目的是提供治療哺乳動物的方法，該治療方法採用編碼血管生成抑制劑蛋白的核酸或胺基酸序列明確的血管生成抑制劑蛋白，包括非天然的、生物合成或其它人工蛋白諸如合理設計產生的蛋白。
發明概述本發明的特徵是用於製備和使用含有血管生成抑制劑蛋白的融合蛋白的方法和組合物。所述融合蛋白可以促進高水平表達有生物活性的血管生成抑制劑蛋白。然後在給予哺乳動物(例如人)之前，可以將血管生成抑制劑蛋白從所述融合蛋白中切下並將其與藥學上可接受的載體組合。或者，可以將編碼含有血管生成抑制劑的融合蛋白的核酸序列或胺基酸序列明確的含有血管生成抑制劑的融合蛋白與藥學上可接受的載體組合，然後給予所述哺乳動物。
在一方面，本發明提供編碼本發明融合蛋白的核酸分子，例如DNA或RNA分子。所述核酸分子編碼信號序列、免疫球蛋白Fc區和至少一種靶蛋白，本文也稱為血管生成抑制劑蛋白，所述蛋白選自製管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段、具有endostatin活性的膠原蛋白XVIII片段和它們的組合物。在一個優選的實施方案中，所述核酸分子從5』到3』方向依次編碼信號序列、免疫球蛋白Fc區和靶蛋白序列。在另一個優選的實施方案中，所述核酸分子從5』到3』方向順序地編碼信號序列、靶序列和免疫球蛋白Fc區。
在另一個優選的實施方案中，所述免疫球蛋白Fc區包括免疫球蛋白鉸鏈區，而最好是包括至少一個免疫球蛋白重鏈恆定區，例如免疫球蛋白重鏈恆定區第2(CH2)結構域、免疫球蛋白重鏈恆定區第3(CH3)結構域並且根據用來產生Fc區的免疫球蛋白的類型，任選包括免疫球蛋白重鏈恆定區第4(CH4)結構域。在一個更優選的實施方案中，所述免疫球蛋白Fc區包括絞鏈區、CH2結構域和CH3結構域。在某些情況下，所述免疫球蛋白Fc區最好是缺乏至少CH1結構域。儘管所述免疫球蛋白Fc區可以基於任何免疫球蛋白種類，例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，但是優選為基於IgG的免疫球蛋白Fc區。
在另一個實施方案中，可以有效地結合將本發明的核酸摻入到複製型表達載體中，然後可以將其轉染到哺乳動物宿主細胞中。在另一個優選的實施方案中，本發明提供包含本發明的這種核酸序列的宿主細胞。
在另一方面，本發明提供包含或者直接通過多肽鍵或者用多肽接頭的方式，與靶蛋白連接的免疫球蛋白Fc區的融合蛋白，所述靶蛋白選自製管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段、具有endostatin活性的膠原蛋白XVIII片段和它們的組合物。可以將所述靶蛋白通過其C-末端融合到免疫球蛋白Fc區的N-末端。然而，在一個更優選的實施方案中，將所述靶蛋白通過其N-末端融合到免疫球蛋白Fc區的C-末端，在另一個實施方案中，所述融合蛋白可以包含選自製管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段和具有endostatin活性的膠原蛋白XVIII片段的第二靶蛋白。在這種類型的構成物中，第一和第二靶蛋白可以是相同或不相同的蛋白。例如，在一個優選的實施方案中，所述融合蛋白包含第一靶蛋白制管張素、免疫球蛋白Fc區和第二靶蛋白endostatin。可以將第一和第二靶蛋白或者直接地或者用多肽接頭的方連接在一起。另一方面，可以將這兩種靶蛋白或者直接地或者通過多肽接頭連接到所述免疫球蛋白Fc區。在後一種情況下，將第一靶蛋白連接到免疫球蛋白Fc區的N-末端，而將第二靶蛋白連接到免疫球蛋白Fc區的C-末端。
在另一個實施方案中，兩種融合蛋白可以或者通過共價鍵(例如二硫鍵或肽鍵)或者通過非共價鍵結合產生多聚體蛋白。在一個優選的實施方案中，將兩種融合蛋白通過半胱氨酸殘基(最好是位於排列在這兩條鏈的免疫球蛋白Fc區內的免疫球蛋白鉸鏈區內)的一個或多個二硫鍵共價結合。
在一個優選的實施方案中，所述靶蛋白包含分子量約40kD的纖溶酶原片段，並任選地包含SEQ ID NO3所示的胺基酸序列。在另一個優選的實施方案中，所述靶蛋白包含具有SEQ ID NO1所示胺基酸序列的膠原蛋白XVIII片段。此外，所述靶蛋白可以是全長制管張素或endostatin或它們的生物活性片段。在製備某些融合蛋白中所述靶蛋白的來源將取決於所述靶蛋白預期的用途。例如，如果是將所述靶蛋白給予人，則所述靶蛋白最好是人源靶蛋白。
在另一方面，本發明提供生產包含免疫球蛋白Fc區和靶蛋白的融合蛋白的方法，所述靶蛋白選自製管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段和具有endostatin活性的膠原蛋白XVIII片段。所述方法包括步驟(a)提供含有編碼這種融合蛋白的DNA分子(或者有或者沒有信號序列)的哺乳動物細胞和(b)培養所述哺乳動物細胞以生產所述融合蛋白。然後可以將所生產的融合蛋白收集、重摺疊，必要時，採用眾所周知的常規純化技術純化，然後在本領域中使用。假設所述融合蛋白包含在免疫球蛋白Fc區和所述靶蛋白之間排列的蛋白水解酶切割位點，則可以採用常規蛋白水解酶將所述靶蛋白從所述融合蛋白中切除，並且必要時，在使用之前純化。
在另一方面，本發明提供治療需要血管生成抑制劑基本治療的哺乳動物(例如人)的方法。例如，設想可以將本發明的血管生成抑制劑給予腫瘤患者。用血管生成抑制劑治療可以使腫瘤生長減慢或停止，並在某些情況下，可以引起腫瘤消退。治療可以包括給予所述哺乳動物足量的血管生成抑制劑以使腫瘤生長減慢或停止。可以以融合蛋白的形式或核酸、最好是與表達載體有效結合核酸與藥學上可接受的載體組合，提供所述血管生成抑制劑。
從以下詳細描述、附圖和權利要求書中，本發明的前面所述和其它目的、特點和優點將更加顯而易見。
附圖簡述

圖1A-1F是按照本發明構建的典型血管生成抑制劑融合蛋白的示意圖(參見實施例10-15)。所述圖分別描述了，圖1A，制管張素的Fc-Kringle 1；圖1B，制管張素的Fc-內部Kringle 1；圖1C，制管張素的Fc-Endostatin-GlySer接頭-內部Kringle 1；圖1D，制管張素的Fc-Endostatin-GlySer接頭-Kringle 1；圖1 E，Fc-Endostatin-GlySer接頭-制管張素；圖1F，制管張素-Fc-Endostatin。垂直線代表連接排列在所述Fc分子絞鏈區內的連接半胱氨酸殘基(C)任選的二硫鍵。
發明詳述本發明提供融合蛋白，本文是指免疫融合物，所述融合蛋白可用於大批量生產臨床級血管生成抑制劑。在使用之前，可以將所述血管生成抑制劑從免疫融合物蛋白構成物中切下。然而，設想可以將所述免疫融合物或編碼所述免疫融合物的核酸直接給予需要用血管生成抑制劑治療的哺乳動物。
因此，本發明提供包含免疫球蛋白Fc區和至少一種靶蛋白的融合蛋白，靶蛋白在本文是指血管生成抑制劑。血管生成抑制劑最好是選自製管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段、具有endostatin活性的膠原蛋白XVIII片段。然而，設想可以將具有血管生成抑制劑活性的其它多肽(目前已知的或以後發現的)表達成為本文所述類型的融合蛋白。
在如圖1A-1F的附圖中，說明了體現本發明蛋白構成物的6個典型的實施方案。因為優選為二聚體構成物，所以用通過半胱氨酸在相鄰的亞基之間的一對二硫鍵交聯的二聚體進行所有說明。在所述附圖中，圖示二硫鍵通過免疫球蛋白鉸鏈區將兩個免疫球蛋白Fc部分連接在一起，因此具有這些分子的天然形式的特徵。當優選包括Fc鉸鏈區的構成物並且該構成物已經顯示有希望作為治療劑的同時，本發明設想可以根據需要選擇在其它位置上進行交聯。此外，在某些情況下，用於實施本發明的二聚體和多聚體可以由非共價結合而產生，例如，疏水性相互作用。
因為同源二聚體構成物是本發明重要的實施方案，所以圖1說明了這樣的構成物。應當認為異源二聚體結構也是有用的，但正如本領域技術人員已知的，通常難以將它們純化。然而，可以構建用於在包括人類在內的各種哺乳動物物種中對抑制血管生成有活性的構成物，包括同源二聚體和異源二聚體的混合物。例如，所述異源二聚體結構的一條鏈可以包含endostatin，而另一條鏈則可以包含制管張素。
圖1A說明按照實施例10中所述方法生產的二聚體構成物。所述二聚體的每個單體包含包括鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域的免疫球蛋白Fc區1。直接與Fc區I的C端連接的是制管張素2的第一Kringle區，內環和外環兩種。圖1B顯示包含如圖1A中的相同Fc區的本發明的第二個實施方案(參見實施例11)，這時僅具有與Fc區1的C末端連接的制管張素3的Kringle 1的內環。從圖1C到1E描述了本發明所述蛋白構成物的各種實施方案，所述蛋白構成物包括作為靶蛋白的串聯排列和接頭連接的多種血管生成抑制劑。圖1C中，所述靶蛋白包含全長endostatin 4、多肽接頭5和制管張素3的Kringle1的內環。圖1D圖示蛋白包含如圖1A相同的Fc區以及包含全長endostatin 4、多肽接頭5和全部Kringle 1區的制管張素(內環和外環兩種)2的靶蛋白。因為最大C端蛋白結構域包含全長拷貝制管張素7中，所以圖1E與圖1D的構成物不同。
儘管圖1A-1E表示Fc-X型構成物，其中X為所述靶蛋白，但是設想X-Fc型構成物也可用於實施本發明。此外，設想本發明有用的蛋白也可用公式X-Fc-X表示，其中X代表相同或不相同的靶蛋白。圖1F描述了這樣的一種構成物，所述構成物包含N-至C-端方向的全長人制管張素7、包括鉸鏈區的人免疫球蛋白Fc區6和全長人endostatin結構域4。
本文所用的術語「血管生成抑制劑」是指減少或抑制哺乳動物中的新血管形成的任何多肽鏈。關於癌症治療，所述血管生成抑制劑減少或抑制腫瘤內或表面、最好是在實體瘤的裡面或表面的新血管形成。設想採用眾所周知的多種常用方法可以鑑定有用的血管生成抑制劑。這樣的方法包括，例如牛毛細血管內皮細胞增生測定、雞尿囊絨膜(CAM)測定或小鼠角膜測定。然而，優選為CAM測定(參見，例如O』Reilly等(1994)Cell 79315-328和O』Reilly等(1997)Cell 88277-285，其公開內容均通過引用結合到本文中)。概括地講，從受精三天卵白中取出具有完整卵黃的胚胎，然後置於培養皿中。於37℃、3％CO2溫育三天後，將各個胚胎尿囊絨膜置於含有推定的血管生成抑制劑的甲基纖維素板中。在溫育約48小時之後，於顯微鏡下觀察所述尿囊絨膜以提供抑制區的證據。
用於實施本發明優選的血管生成抑制劑包括，例如制管張素(O』Reilly等(1994)Cell 79315-328和美國專利第5,733,876、5,837,682和5，885,795號)和endostatin(O』Reilly等(1997)Cell 88277-285和美國專利第5,854,205號)。如前所述，制管張素和endostatin是內皮細胞增生的特異性抑制劑並能夠通過阻斷血管生成而抑制腫瘤生長，即阻斷供給腫瘤營養的新血管的形成。
已經鑑定制管張素為纖溶酶原的蛋白酶解片段(O』Reilly等(1994)Cell 79315-328和美國專利第5,733,876、5,837,682和5,885,795號，這些公開內容都通過引用結合到本文中)。具體地講，制管張素是含有至少三個纖溶酶原Kringle區的纖溶酶原的38 kDa內部片段。已經鑑定endostatin為膠原蛋白XVIII的蛋白酶解片段(O』Reilly等(1997)Cell 88277-285，其公開內容通過引用結合到本文中)。具體地講，endostatin是膠原蛋白XVIII的20 kDa C-末端片段。本文所用的術語「制管張素」和「endostatin」不僅是指全長蛋白，而且還分別指其變異體和生物活性片段，以及纖溶酶原和膠原蛋白XVIII的生物活性片段。術語生物活性片段，就制管張素而論是指纖溶酶原或制管張素的任何蛋白片段，根據CAM測定所述片段至少具有全長制管張素活性的30％，更優選至少70％和最優選至少90％。術語生物活性片段，就endostatin而論是指膠原蛋白XVIII或endostatin的任何蛋白片段，根據CAM測定所述片段至少具有全長endostatin活性的30％，更優選至少70％和最優選至少90％。
術語變異體包括特定變異體和等位變異體，以及其它天然產生或非天然產生的變異體，例如由常規基因工程方法產生的變異體，它們或者與本文公開的endostatin天然產生的序列或者與本文公開的制管張素天然產生序列至少70％相似或60％相同，更優選至少75％相似或65％相同和最優選的80％相似和70％相同。
為了確定候選多肽是否與參比多肽具有必不可少的相似性或同一性的百分率，首先將候選胺基酸序列和參比胺基酸序列對比，所述序列對比採用Smith和Waterman(1981)，J.Mol.Biol.147195-197中所描述的的動態編程算法(dynamic programming algorithm)和Henikoff和Henikoff(l992)「蛋白質組件的胺基酸取代矩陣」，Proc.NatlAcad Sci.USA 8910915-10919的圖2中所描述的BLOSUM62取代矩陣。對於本發明，缺口插入補償參數(gap insertion penalty)的合適值為-12，而缺口延伸補償參數(gap extension penalty)的合適值為-4。採用Smith-Waterman算法和BLOSUM62矩陣諸如GCG程序組(Oxford Molecular Group，Oxford，英國)進行序列對比的電腦程式是市場上可得到的並被本領域技術人員廣泛使用。
一旦在候選序列和參比序列之間進行了序列對比，就可以計算出相似性的百分數。將每條序列的各個胺基酸按照它們與其它胺基酸的相似性依次比較。如果相對於兩個對比的胺基酸的BLOSUM62矩陣值為零或負數，則相似性的配對數為0；否則相似性的配對數為1.0。相似性的原始數是序列對比的胺基酸相似性的配對數的總和。然後用較小候選序列或參比序列的胺基酸數除原始數，將原始數標準化。所述標準化原始數為相似性的百分率。或者，為了計算同一性的百分率，將每條序列的對比胺基酸依次進行比較。如果所述胺基酸為不相同，同一性配對數為0；否則同一性配對數為1.0。原始同一性的配對數為序列對比的相同胺基酸的總和。然後用較小候選序列或參比序列中的胺基酸數除原始數，將原始數標準化。所述標準化原始數為同一性的百分率。為了計算相似性和同一性的百分率，將插入和缺失忽略不計。因此，儘管在原始序列對比中使用缺口補償參數，但它們不用於本計算。
將本文所公開的靶蛋白表達作為具有免疫球蛋白Fc區的融合蛋白。已知每個免疫球蛋白重鏈恆定區由4或5個結構域組成。所述結構域依次命名如下CH1-鉸合部-CH2-CH3(-CH4)。所述重鏈結構域的DNA序列在免疫球蛋白種類之間存在殘餘同源，例如IgG的CH2結構域與IgA和IgD的CH2結構域以及與IgM和IgE的CH2結構域同源。
本文所用的術語「免疫球蛋白Fc區」不用說是指免疫球蛋白鏈恆定區的羧基端部分，最好是免疫球蛋白重鏈恆定區或它們的一部分。例如，免疫球蛋白Fc區可以包含1)CH1結構域、CH2結構域和CH3結構域，2)CH1結構域和CH2結構域，3)CH1結構域和CH3結構域，4)CH2結構域和CH3結構域或5)兩個或多個結構域和免疫球蛋白鉸鏈區的組合。在一個優選的實施方案中，在所述DNA構成物中所用的Fc區包括至少免疫球蛋白鉸鏈區CH2結構域和CH3結構域，而最好是缺乏至少CH1結構域。
目前衍生重鏈恆定區的優選的免疫球蛋白種類為IgG(Igγ)(γ亞類1、2、3或4)。可以使用其它種類的免疫球蛋白IgA(Igα)、IgD(Igδ)、IgE(Igε)和IgM(Igμ)。在美國專利第5,541,087和5,726,044號中詳細地討論了選擇合適免疫球蛋白重鏈恆定區。從某些免疫球蛋白種類和亞類中選擇特定免疫球蛋白重鏈恆定區序列以獲得特定的結果被認為是在本領域中的技術水平內。編碼免疫球蛋白Fc區的DNA構成物部分最好是包括至少一部分鉸合部結構域和最好至少一部分Fcγ的CH3結構域或在任何IgA、IgD、IgE和IgM中的同源結構域。
根據應用情況，人們可以使用人類以外的物種例如小鼠或大鼠的恆定區基因。用作免疫融合物DNA構成物中的融合配偶體的Fc區一般可以來自任何物種的哺乳動物。當人們不希望在宿主細胞或動物中激發抗Fc區的免疫應答時，所述Fc區可以得自與宿主細胞或動物的相同物種。例如，當宿主動物或細胞是人時，可以使用人Fc；同樣，當宿主動物或細胞是小鼠時，可以使用鼠Fc。此外，這些恆定區構成物的置換或缺失也將是有作用的，其中置換或缺失所述恆定區結構域的一個或多個胺基酸殘基。一個實例是引入在CH2區上段中的胺基酸置換以產生與Fc受體的親和力降低的Fc變異體(Cole等(1997)J.Immunol.1593613)。其中本領域中的一般技術人員可以採用眾所周知的分子生物學技術製備這樣的構成物。
使用人Fcγ1作為Fc區序列有幾個優點。例如，如果血管生成抑制劑Fc融合蛋白被用作生物藥物，則Fcγ1結構域可以對所述融合蛋白賦予效應子功能活性。所述效應子功能活性包括生物活性諸如補體活化、涉及抗體的細胞的細胞毒性、胎盤轉運和增加血清半壽期。Fc結構域還提供通過抗-Fc ELISA來檢測和通過結合到金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)A蛋白(「A蛋白」)來純化。然而，在某些應用情況下，最好是從Fc區消除特異性的效應子功能，諸如Fc受體結合或補體活化。
就血管生成抑制劑免疫融合物而論，免疫球蛋白Fc融合配偶體的一種功能是有利於血管生成抑制劑蛋白的合適摺疊以產生活性血管生成抑制劑蛋白並影響所述活性部分至少在細胞外培養基中的溶解度。由於該Fc融合配偶體是親水性的，所以血管生成抑制劑免疫融合物溶解性好，與例如大腸桿菌中產生的重組endostatm不同(O』Reilly(1997)Cell 88277)。在本文所公開的所有實施例中，都獲得高產率的免疫融合物。血管生抑制劑免疫融合物通常以濃度約30-100μg/ml分泌到培養基中，並可通過A蛋白層析容易地純化成同質性。另外，可以將血管生成抑制劑免疫融合物切割，然後採用常規純化方法進一步純化，採用例如肝素瓊脂糖凝膠法、賴氨酸瓊脂糖凝膠法或親和純化法。
除高水平表達外，本發明融合蛋白還顯示較長的血清半壽期，推測可能是由於它們的分子大小較大。例如，在小鼠中，人Fc-人制管張素的血清半壽期為33小時，與之相比人制管張素為4-6小時(O』Reilly等(1996)Nature Medicine 2689)。相信分子量40kD的制管張素和分子量20kD的endostatin都太小以至通過腎過濾有效地清除。相比之下，Fc-制管張素的二聚體形式和二聚體Fc-endostatin分別是145kD和100kD，因為有兩個連接於或者兩個制管張素分子或者兩個endostatin分子的兩個免疫球蛋白Fc區。這樣的二價體結構與制管張素受體和endostatin受體的結合親和力較高。如果血管生成抑制活性是受體介導的，則Fc融合蛋白比單價體制管張素或單價體endostatin自身潛在性更有效地抑制腫瘤。此外，如果制管張素和/或endostatin屬於二聚體蛋白配體類，則Fc對制管張素或endostatin產生的物理性限制使二聚作用成為一種分子內過程，因此，動態平衡有利於二聚體並增強其與受體的結合。也可以通過標準重組DNA技術將半胱氨酸殘基導入到合適位置的單體上以通過共價二硫鍵形成而穩定該二聚體。
本文所用的術語「多價體」是指摻入兩個或多個生物學活性片段的重組分子。形成該多價體分子的蛋白片段可以通過多肽肽接頭連接，所述接頭連接組分部分而不會引起移碼並使每個分子獨立起作用。
本文所用的術語「二價體」是指在本發明融合構成物中含有兩個靶蛋白的多價體重組分子，例如Fc-X分子，其中X獨立地選自製管張素、endostatin或它們的變異體。由於有兩個X部分與免疫球蛋白Fc區(通常其自身是包括至少一部分鉸鏈區和CH3結構域，以及任選的CH2結構域的重鏈片段的二聚體)融合，因此所述分子為二價體(參見，例如圖1A)。如果本發明的融合構成物的形式為Fc-X-X，則所產生的Fc二聚體分子為四價體。可以通過肽接頭將形成Fc-X-X分子的這兩種蛋白連接。二價體分子可以增加所述分子和其受體之間的表觀結合親和力。例如，Fc-endostatin的一個endostatin部分可以以一定親和力結合到細胞上的受體上，同一Fc-endostatin的第二個endostatin部分可以以非常高的親和力(表觀親和力)結合到相同細胞上的第二個受體上。這是因為第一個endostatin部分結合後，第二個endostatin部分與所述受體的物理鄰近效應所致。在抗體結合到抗原的情況下，表觀親和力增加至少104。
本文所用的術語「多聚體」和「多聚體的」是指或者例如通過共價性相互作用(例如通過二硫鍵)共價地或者例如通過疏水性相互作用非共價地使兩條或多條多肽鏈的穩定結合。術語多聚體包括同源多聚體(其中所述多肽是相同的)以及異源多聚體(其中所述多肽是不相同的)。
本文所用的術語「二聚體的」是指特異性多聚體分子，其中兩條蛋白多肽鏈通過共價或非共價性相互作用的穩定連接。應當理解，免疫球蛋白Fc區Fc片段自身通常為包括至少一部分鉸鏈區和CH3結構域和任選的CH2結構域的重鏈片段的二聚體。已知許多蛋白配體是以二聚體結合到它們的受體上。如果蛋白配體X天然地二聚體化，則在Fc-X分子中的X部分將在更大程度上二聚體化，因為二聚體形成過程是濃度依賴性的。通過相聯的免疫球蛋白Fc區連接的兩個X部分的物理鄰近效應將使二聚體形成成為分子內過程，使動態平衡有利於二聚體形成並增強其結合到受體上。
不用說，本發明採用常規重組DNA方法來產生用於實施本發明的Fc融合蛋白。所述Fc融合構成物最好是在DNA水平上產生，並且將所產生的DNA整合到表達載體中，然後表達產生所述免疫融合物。本文所用的術語「載體」不用說是指包含核苷酸序列的任何核酸，所述核苷酸序列可以摻入到宿主細胞中並重組及整合到所述宿主細胞基因組中或作為附加體自主複製。這樣的載體包括線型核酸、質粒、噬菌粒、粘粒、RNA載體、病毒載體等。病毒載體非限制性實例包括反轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。本文所用的術語靶蛋白的「基因表達」或「表達」，不用說是指轉錄DNA序列、翻譯mRNA轉錄物和分泌Fc融合蛋白產物。
有用的表達載體為pdCs(Lo等(1988)Protein Engineering11495，其公開內容通過引用結合到本文中)，其中Fc-X基因的轉錄採用人巨細胞病毒的增強子/啟動子和猿猴病毒40多腺苷酸化信號。所用的人巨細胞病毒的增強子序列和啟動子序列得自Boshart等，1985，Cell 41521中提供的核苷酸-601至+7序列，該文獻公開內容通過引用結合到本文中。所述載體也含有突變二氫葉酸還原酶基因作為選擇標記(Simonsen和Levinson(1983)Proc.Nat Acad Sci USA802495，其公開內容通過引用結合到本文中)。
可以用本發明的DNA序列將合適的宿主細胞轉化或轉染，並且用來表達和分泌靶蛋白。目前用於本發明的優選宿主細胞包括無限增殖雜交瘤細胞、NS/O骨髓瘤細胞、293細胞、中國倉鼠卵巢細胞、海拉(Hela)細胞和COS細胞。
本發明的融合蛋白最好是用常規重組DNA方法產生。所述融合蛋白最好是由編碼信號序列、免疫球蛋白Fc區和靶蛋白(本文也稱為血管生成抑制劑)的DNA分子在宿主細胞中表達產生。優選的構成物可以從5』至3』方向編碼信號序列、免疫球蛋白Fc區和靶蛋白。或者，所述構成物可以從5』至3』方向編碼信號序列、靶蛋白和免疫球蛋白Fc區。
本文所用的術語「信號序列」不用說是指肽區段，所述肽區段在所述宿主細胞中引導分泌血管生成抑制劑免疫融合物蛋白並在翻譯後再切除。本發明的信號序列是一種多核苷酸，它編碼引發轉運蛋白質穿過內質網膜的胺基酸序列。用於本發明的信號序列包括抗體輕鏈信號序列例如抗體14.18 (Gillies等，1989，Jour.of ImmunolMeth.，125191-202)、抗體重鏈信號序列例如MOPC141抗體重鏈信號序列(Sakano等，1980，Nature 2865774)和本領域中已知的任何其它信號序列(參見例如，Watson，1984，Nucleic Acids Research125145)。這些參考文獻都通過引用結合到本文中。
本領域中，信號序列的特徵已經很清楚，並且已知通常含有16-30個胺基酸殘基，以及可以含有更多或更少的胺基酸殘基。通常信號肽由三個區組成鹼性N-端區、中央疏水區和更強極性的C-端區。中央疏水區含有4-12個疏水性殘基，在轉運新生多肽期間，所述疏水性殘基錨定信號肽穿過膜脂層雙分子層。引發後，通常稱為信號肽酶的細胞酶在內質網腔內酶切信號肽。潛在的信號肽切割位點一般在「(-3，-1)規則(rule)」後，因此，典型信號肽在位置-1至-3具有少量中性胺基酸殘基，並在該區域內缺乏脯氨酸殘基。信號肽酶在-1和+1胺基酸之間酶切這樣的一種信號肽。因此，可以將編碼信號序列的DNA部分在分泌期間從所述免疫融合蛋白的氨基端切除。這導致分泌由Fc區和所述靶蛋白組成的免疫融合蛋白。von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.，144683對信號肽序列進行了詳細討論，其公開內容通過引用結合到本文中。
本領域技術人員顯而易見的是，對用於本發明的特定信號序列的適應性可能需要進行某些常規實驗。這種實驗將包括確定信號序列引導分泌免疫融合物的能力，還要確定所用的序列的最佳構型、基因組或cDNA以達到有效分泌免疫融合物。另外，根據von Heijne所述規則(上述參考文獻)，本領域技術人員能夠產生合成信號肽，並用常規實驗測試這樣的合成信號序列的效能。信號序列也稱為「信號肽」、「前導序列」或「前導肽」。
所述信號序列和免疫球蛋白Fc區的融合物本文有時稱為分泌盒。用於實施本發明的典型分泌盒是從5』至3』方向編碼免疫球蛋輕鏈基因的信號序列和人免疫球蛋白γ1基因的Fcγ1區的多核苷酸。免疫球蛋白Fcγ1基因的Fcγ1區最好是包括至少一部分鉸合結構域和至少一部分CH3結構域，或者至少部分鉸合結構域、CH2結構域和CH3結構域。編碼所述分泌盒的DNA可以是其基因組構型或其cDNA構型。
在另一個實施方案中，所述DNA序列編碼所述分泌盒和血管生成抑制劑蛋白之間插入的蛋白酶切割位點。切割位點用於所編碼融合蛋白的蛋白酶剪切，因此從血管生成抑制劑蛋白中分離Fc結構域。本文所用的「蛋白酶切割位點」不用說是指通過蛋白酶或其它蛋白剪切劑優先剪切的胺基酸序列。有用的蛋白酶切割位點包括蛋白酶諸如胰蛋白酶、纖溶酶或腸激酶K識別的胺基酸序列。現在已知許多切割位點/剪切劑對。參見例如美國專利第5,726,044號，其公開內容通過引用結合到本文中。其中所述靶蛋白序列是制管張素、endostatin或其活性變異體的前體分子，通過用內源蛋白酶諸如彈性蛋白酶或纖溶酶或尿激酶剪切產生所需蛋白產物。
本發明也包括含重組制管張素和endostatin或其片段的不同組合的融合蛋白，所述融合蛋白可以大量製備。儘管在抑制腫瘤生長方面已證實有效，但制管張素和endostatin怎樣阻斷血管生成的機制沒有完全弄清楚。制管張素具有幾種Kringle結構，而endostatin具有不同結構的基序，其中每種都可以單獨引起或促使所述蛋白結合到內皮細胞，然後發揮抗血管生成作用。因此，本發明包括制管張素的生物活性片段(諸如Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3及其組合物)和endostatin的生物活性片段的靶蛋白，所述生物活性片段與天然產生的全長制管張素和endostatin生理作用相似。
本發明的另一個實施方案提供血管生成抑制劑的雙功能雜種構成物。本文所用的雙功能雜種分子或構成物是指通過組合兩種蛋白亞基產生的蛋白，其中所述兩種亞基可以得自不同的蛋白。每種蛋白亞基具有其自身獨立的功能，所以在所述雜種分子中，該兩種亞基的功能可以是相加或協同的功能。這樣功能的雜種蛋白使得可以在動物模型中測試製管張素和endostatin的協同作用。優選的雙功能雜種蛋白包含或者直接串聯或者通過多肽接頭串聯至少兩種不同的血管生成抑制劑。例如，在一個優選的實施方案中，所述靶序列編碼按讀框與至少一部分endostatin連接的至少一部分制管張素，而制管張素結構域和endostatin結構域均具有抗血管生成活性或血管生成抑制作用。這兩個單位均可以通過多肽接頭連接。
本文所用的術語「多肽接頭」不用說是指可以將兩個蛋白質或一個蛋白質和一個Fc區連接在一起的肽序列。所述多肽接頭最好是包含多種胺基酸諸如甘氨酸和/或絲氨酸。最好是，所述多肽接頭包括一系列長度約為10-15個殘基的甘氨酸和絲氨酸的肽。參見例如美國專利第5,258,698號，其公開內容通過引用結合到本文中。然而，設想可以通過常規實驗法確定所述最佳接頭的長度和胺基酸組分。
發現如果將制管張素的不同部分表達作為Fc融合分子，則獲得高水平表達，推測可能是因為Fc部分作為一種載體，幫助所述多肽在C-端正確地摺疊。此外，Fc區可以糖基化和在生理pH時高度帶電，因此Fc區可以幫助溶解疏水性蛋白。
本發明也提供生產非人類物種的制管張素和endostatin的Fc融合蛋白的方法。非人類血管生成抑制劑融合蛋白對血管生成抑制劑臨床前期的研究是有作用的，因為一種蛋白質藥物效能和毒性研究在對試驗之前必須在動物模型系統中進行。人蛋白可能在小鼠模型中不產生作用，因為所述蛋白可能誘發免疫應答，和/或具有不同的藥物動力學特徵，而扭曲試驗結果。因此，等效鼠蛋白是在小鼠模型中試驗的人蛋白最好的替代物。
標準Lewis肺癌小鼠模型(O』Reilly等(1997)Cell 88277)用來比較可溶性人Fc-人制管張素、人Fc-人Endostatin、鼠Fc-鼠制管張素、鼠Fc-鼠Endostatin與大腸桿菌表達系統產生的所述不可溶的蛋白。在Lewis肺癌模型中在抑制腫瘤生長方面，可溶的Fc融合蛋白比用大腸桿菌產生的相應蛋白更有效。此外，將實驗小鼠近親交配，其腫瘤是誘發而不是自發產生。因此，在小鼠模型中的效能可能與抗人腫瘤的效能無關。採用狗的臨床前期研究將提供關於這些血管生成抑制劑對自發性腫瘤的效能更準確的信息，因為有大量天然發生的自發性狗腫瘤。生產本發明的鼠(mu)Fc-鼠制管張素、鼠Fc-鼠endostatm和狗(ca)Fc-狗制管張素、狗Fc-狗endostatin的方法將有利於血管生成抑制劑在鼠和狗兩個系統中的臨床前研究。
本發明提供通過給予本發明的DNA、RNA或蛋白治療血管生成性疾病(condition mediated by angiogenesis)的方法。血管生成性疾病包括，例如實體瘤；血源性腫瘤(blood born tumors)、轉移瘤、良性瘤包括血管瘤、聽神經瘤、神經纖維瘤、粒性結膜炎和膿性肉芽腫；類風溼性關節炎；牛皮癬；眼部血管生成性疾病(糖尿病性視網膜病、早產兒視網膜病、黃斑變性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼)；晶狀體後纖維組織形成、發紅(rubeosis)、遺傳性出血性毛細血管擴張症候群；心肌血管生成；斑性新血管形成；毛細管擴張；血友病患者關節血管纖維瘤和創傷性肉芽；以及內皮細胞過度或異常刺激、腸粘連、動脈硬化、硬皮病性疤痕和肥大性疤痕即疤痕疙瘩。
本文公開的DNA構成物可用於基因治療，其中將endostatin基因或制管張素基因通過各種方式之一傳遞到細胞中，例如與啟動子連接的天然DNA或病毒載體內的DNA。進入細胞後，則表達制管張素基因和/或endostatin基因或基因片段，而所述蛋白在體內產生以發揮其正常生物功能。本發明的DNA構成物可高水平表達所述融合蛋白。本發明的融合蛋白也可用於治療血管生成性疾病，而且比天然血管生成抑制劑和其它重組血管生成抑制劑具有更好的臨床效果，因為本發明的血管生成抑制劑免疫融合物比所述其它重組血管生成抑制劑或單獨的天然血管生成抑制劑具有更長的血清半壽期。由於所述二價體和二聚體結構，本發明的二價體形式和二聚體形式應具有更強的結合親和力。由於通過所融合的Fc區或柔性多肽接頭連接的兩種不同血管生成抑制劑可能的協同作用，本發明的雙功能雜種分子可具有更好的臨床效果。
可以將本發明的組合物通過任何合適的方式給予動物，所述給藥為直接(例如，局部注射、植入或局部給予組織部位)或全身性(例如胃腸外或口服)給予。如果所述組合物以胃腸外提供，諸如靜脈內、皮下、眼、腹膜內、肌內、頰、直腸、陰道、眼框內、腦內、顱內、椎管內、心室內、鞘內、腦池內、囊內、鼻內或通過氣霧劑給予，所述組合物最好是包含部分水或生理上可匹配的液體懸浮液或溶液。因此，所述載體(carrier)或媒介物(vehicle)為生理上可接受的以便除了傳遞所需組合物給患者之外，沒有另外負面影響患者的電解質和/或容積平衡。用於所述製劑的液體介質因此可以包括正常生理鹽水(例如，9.85％NaCl水溶液，0.15M，pH7-7.4)。
每次給予所述免疫融合物的劑量範圍優選為50ng/m2-lg/m2，更優選為5μg/m2-200 mg/m2，而最優選為0.1mg/m2-50 mg/m2。每次給予編碼所述免疫融合物的核酸的劑量範圍優選為1μg/m2-100mg/m2，更優選為20μg/m2-10mg/m2，而最優選為400μg/m2-4mg/m2。然而設想在本領域技術水平內，通過常規實驗法可以很好確定給予的最佳方式和劑量。
通過以下非限制的實施例進一步說明本發明。
實施例實施例1.人Fc-人Endostatin的表達按照Lo等的學說((1998)Protein Engineering 11495)，將人endostatin表達作為人Fc-人endostatin(huFc-huEndo)融合蛋白。Fc是指人免疫球蛋白γ的Fc片段(SEQ ID NO1所示為其DNA序列；SEQ IDNO2所示為其胺基酸序列)。(聚合酶鏈式反應PCR)用來連接endostatin cDNA (SEQ ID NO3；其胺基酸序列公開於SEQ ID NO4中)，用於表達Fc-Endo融合蛋白。正向引物或者是5』-CC CCG GGTAAA CAC AGC CAC CGC GAC TTC C(SEQ ID NO5；所編碼的胺基酸公開於SEQ ID NO6中)或者是5』-C AAG CTT CAC AGC CACCGC GAC TTC C(SEQ ID NO7；所編碼的胺基酸公開於SEQ IDNO8中)，其中XmaI位點或HindIII位點後是編碼endostatin N-端的序列。具有XmaI位點的引物使endostatin cDNA連接到IgGFc區CH3結構域末端的XmaI位點。具有HindIII位點的引物使endostatin cDNA連接到pdCs-Fc(D4K)載體的HindIII位點，所述載體在所述融合蛋白連接點含有腸激酶識別位點Asp4-Lys(LaVallie等(1993)J.Biol.Chem.26823311-23317)。所述反向引物是5』-C CTC GAG CTA CTT GGAGGC AGT CAT G(SEQ ID NO9)，將所述引物設計置於翻譯終止密碼子(STOP codon)(反密碼子，CTA)緊接在endostatin C-端之後，而這之後是XhoI位點。將所述PCR產物克隆並測序，並將XmaI-XhoI片段連接到XmaI和XhoI消化產生的pdCs-Fc載體上。同樣，將編碼endostatin的HindIII-XhoI片段連接到經適當消化的pdCs-huFc(D4K)載體中。通過電穿孔NS/O細胞，隨後在含有100nM氨甲蝶呤的生長培養基中選擇，獲得穩定表達Fc-endo或Fc(D4K)-endostatin的克隆。通過抗-人Fc ELISA (實施例3)測定並通過SDS-PAGE證實蛋白表達水平，其顯示約52kD蛋白產物。通過有限稀釋將最佳生產克隆亞克隆。實施例2.細胞培養和轉染關於瞬時轉染，通過質粒DNA與磷酸鈣共沉澱(Sambrook等(1989)Molecular Cloning-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY)或按照供應商的方法通過採用脂轉染胺+(LipofectAMINE Plus)(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)的脂轉染，將所述質粒引入人腎293細胞中。
為了獲得穩定轉染的克隆，通過電穿孔將質粒DNA引入小鼠骨髓瘤NS/O細胞中。將NS/O細胞生長於用10％胎牛血清補充的Dulbecco改進的Eagle培養基中。將約5×106細胞用PBS洗滌一次，並再次懸浮於0.5mlPBS中。然後將10μg線狀化質粒DNA與所述細胞一起在冰上的基因脈衝發生器容器(Gene Pulser Cuvette)(0.4cm電極缺口(electrode gap)BioRad，Hercules，CA)中溫育10分鐘。採用設定0.25V和500μF的基因脈衝發生器(Gene Pulser)(BioRad，Hercules，CA)進行電穿孔。將它們重新懸浮於生長培養基中之後，使細胞在冰上恢復10分鐘，然後平板接種到兩個96孔板上。通過生長在100nM氨甲蝶呤(MTX)中選擇穩定轉染的克隆，MTX在轉染後2天加入。給所述細胞每3天更換培養基1次，連續3次以上，然後在2-3周出現MTX-抗性克隆。通過抗-Fc ELISA測定克隆上清液，以鑑定出高生產克隆。分離高生產克隆，然後在含100nM MTX生長培養基中培養。
用於抗-muFc ELISA的方法相似，只是將ELISA板用PBS中0.5μg/ml AffiniPure山羊抗-鼠IgG(H＋L)(Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA)以100μl孔進行包被；而第二抗體為結合辣根過氧化物酶的山羊抗-muIgG(Fcγ)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，以15000稀釋倍數使用。對於抗-caFc ELISA，ELISA板同樣用PBS中的5μg/ml AffiniPure兔抗-狗IgG(Fc片段特異性)(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)以100μl孔進行包被；而第二抗體為結合辣根過氧化物酶的AffinPure兔抗-狗IgG(Fc片段特異性)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，以15000稀釋倍數使用。實施例4.人Fc-人制管張素的表達基本上按實施1所述將人制管張素(DNA序列見SEQ ID NO10；胺基酸序列見SEQ ID NO11)表達為人Fc-人制管張素(huFc-huAngio)融合蛋白。PCR用來連接制管張素cDNA(SEQ ID NO3)，以用pdCs-huFc或pdCs-huFc(D4K)載體表達。相應的正向引物為5』-CC CCGGGT AAG AAA GTG TAT CTC TCA GAG(SEQ ID NO12；所編碼的胺基酸見SEQ ID NO13)和5』-C CCC AAG CTT AAA GTG TATCTC TCA GAG (SEQ ID NO14；所編碼的胺基酸見SEQ ID NO15)，其中XmaI位點或HindIII位點之後為編碼制管張素N-端的序列。反向引物是5』-CCC CTC GAG CTA CGC TTC TGT TCC TGA GCA(SEQ ID NO16)，設計所述引物使翻譯終止密碼子(STOP codon)(反密碼子，CTA)緊接在制管張素C-端之後，而再後是XhoI位點。將所述PCR產物克隆並測序，然後將所產生的編碼制管張素的XmaI-XhoI片段和HindIII-XhoI片段分別連接到pdCs-huFc和pdCs-huFc(D4K)載體上。按實施例2和3所述，選擇並測定穩定表達huFc-huAngio和huFc(D4K)-huAngio的NS/0克隆。實施例5.鼠Fc-鼠-Endostatin的表達基本上按實施1所述將鼠endostatm(DNA序列見SEQ IDNO17；胺基酸序列見SEQ ID NO18)和鼠Fc(DNA序列見SEQ IDNO19；所編碼的胺基酸見SEQ ID NO20)表達為鼠Fc-鼠endostatin(muFc-muEndo)融合蛋白。PCR用來連接endostatin cDNA(SEQ IDNO4)，以用pdCs-muFc(D4K)載體表達。正向引物為5』-C CCC AAGCTT CAT ACT CAT CAG GAC TTT C(SEQ ID NO21；所編碼的胺基酸見SEQ ID NO22)，其中HindIII位點之後為編碼endostatin N-端的序列。反向引物為5』-CCC CTC GAG CTA TTT GGA GAA AGAGGT C(SEQ ID NO23)，設計所述引物使翻譯終止密碼子(STOPcodon)(反密碼子，CTA)緊接在endostatin C-端之後，而這之後是XhoI位點。將所述PCR產物克隆並測序，然後將所產生的編碼endostatin的HindIII-XhoI片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體上。如實施例2和3中所述，選擇並測定(抗-muFc ELISA)穩定表達muFc(D4K)-muEndo的NS/O克隆。實施例6.鼠Fc-鼠制管張素的表達基本上按實施例所述將鼠制管張素(DNA序列見SEQ ID NO24；胺基酸序列見SEQ ID NO25)表達為鼠Fc-鼠制管張素(muFc-muAngio)融合蛋白。PCR用來連接所述制管張素cDNA(SEQ ID NO6)，以便以pdCs-Fc(D4K)載體表達。正向引物為5』-C CCC AAG CTT GTG TATCTG TCA GAA TGT AAG CCC TCC TGT CTC TGA GCA(SEQ IDNO26；所編碼的胺基酸見SEQ ID NO27)，其中HindIII位點之後為編碼制管張素N-端的序列。反向引物是5』-CCC CTC GAG CTACCC TCC TGT CTC TGA GCA(SEQ ID NO28)，設計所述引物使翻譯終止密碼子(STOP codon)(反密碼子，CTA)緊接在制管張素C-端之後，而這之後是XhoI位點(CTCGAG)。將所述PCR產物克隆並測序，然後將編碼制管張素的HindIII-XhoI片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體上。如實施例2和3所述，選擇並測定(抗-muFc ELISA)穩定表達muFc(D4K)-muAngio的NS/O克隆。實施例7.狗Fc(caFc)的表達將從狗血中分離的狗外周血單核細胞(PBMC)用來製備mRNA。用逆轉錄酶和寡聚物(dT)合成第一條cDNA鏈後，採用正向引物5』-CC TTA AGC GAA AAT GGA AGA GTT CCT CGC(SEQ ID NO29；所編碼的胺基酸見SEQ ID NO30)，其中緊靠編碼狗Fc鉸鏈區序列的上遊導入AfIII位點；以及反向引物5』-C CTC GAG TCA TTT ACCCGG GGA ATG GGA GAG GGA TTT CTG(SEQ ID NO31)，其中在狗Fc翻譯終止密碼子(STOP codon)(反密碼子，TCA)之後導入XhoI位點，進行PCR以擴增狗Fc(Kazuhiko等，(1992)JP 1992040894-A1)。所述反向引物還導入沉默突變以產生XmaI限制酶切位點，該位點有利於通過接頭-連接物構建pdCs-caFc(D4K)載體，然後連接到編碼狗endostatm或制管張素的DNA構成物上。用同樣的方法構建pdCs-huFc，Lo等(Lo等，Protem Engineering(1998)11495)對其進行了詳細地論述，如下構建pdCs-huFc的表達載體。將編碼狗Fc的AflII-XhoI片段連接到編碼所述輕鏈信號肽的XbaI-AflII片段以及XbaI-XhoI消化的pdCs載體。所產生的pdCs-caFc表達載體然後用來轉染293細胞。轉染後約3天，通過A蛋白層析純化所述上清液。採用結合過氧化物酶的兔抗-狗IgG(Fc片段特異性)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，在SDS-PAGE後再通過蛋白質印跡分析，確定狗Fc (DNA序列見SEQ ID NO32；胺基酸序列見SEQ ID NO33)的表達。實施例8.狗Fc-狗Endostatin的表達基本按實施例5所述將狗endostatin的編碼序列(DNA序列見SEQID NO34；胺基酸序列見SEQ ID NO35)連接到HindIII-XhoI片段上以表達Fc融合蛋白。在3』端，引入終止密碼子(STOP codon)，例如通過PCR緊接在編碼C-末端賴氨酸殘基的密碼子之後引入終止密碼子，而這之後是NotI限制酶切位點。然而在5』端，有一個DraIII限制酶切位點便於重組。化學合成一個HindIII粘端和一個DraIII粘端組成的寡核苷酸雙鏈體，然後用來連接編碼其餘的狗endostatin cDNA的DraIII-XhoI限制性片段。所用的雙鏈體如下所示HindIII5'-AGCTT CAC ACC CAC CAG GAC TT C CAG CCG GTG CTG CAC CTG(SEQID NO36)A GTG TGG GTG GTC CTG AAG GTC GGC CAC GAC GTG-5』(SEQID NO38)DraIII在所述雙鏈體中第一個CAC編碼狗endostatin N-端組氨酸殘基。因此編碼狗全長endostatin的HindIII-XhoI片段可連接到HindIII-XhoI消化的pdCs-caFc載體(參見實施例7)用於表達。如實施例2和3中所述，選擇並通過抗-caFc ELISA測定穩定表達caFc-caEndo的NS/O克隆。在SDS-PAGE上分析並通過蛋白質印跡分析確定所述蛋白產物。實施例9.狗Fc-狗制管張素的表達基本上按以上實施例所述，連接編碼狗全長制管張素的cDNA(DNA序列見SEQ ID NO39；胺基酸序列見SEQ ID NO40)以表達caFc融合蛋白。簡單地說，在3』端引入終止密碼子(STOP codon)，例如通過PCR緊接在編碼C-端賴氨酸殘基的密碼子之後引入終止密碼子，而這之後是NotI限制酶切位點而不是XhoI位點。因為在狗制管張素的cDNA中有一個內部XhoI限制酶切位點。在5』端，緊接在制管張素N-端的上遊按讀框引入HindIII位點。然後將編碼狗全長制管張素的HindIII-NotI片段連接到HindIII-NotI消化的pdCs-caFc載體(其中通過接頭連接將NotI位點引入XhoI位點處)用於表達。如實施例2和3中所述，選擇並通過抗-caFc ELISA測定穩定表達caFc-caAngio的NS/O克隆。在SDS-PAGE上分析並通過蛋白質印跡分析確定所述蛋白產物。實施例10.鼠制管張素的鼠Fc-K1的表達制管張素包含纖溶酶原的5個Kringle結構域中的前4個。為了測定是否任何一個或幾個Kringle結構域決定所觀察到的制管張素的抗-血管生成活性，則可產生單個Kringle結構域或其組合物用於測試。為了證實Fc作為融合蛋白配偶體的作用，鼠制管張素的第一個Kringle結構域(K1)的表達用以下方式實現。第一個Kringle結構域終止於鼠制管張素的Glu-87處(SEQ ID NO25)。在該位置的cDNA中有一個合適的NsiI限制酶切位點，以便NsiI消化後，將第4個鹼基3』-突出端通過T4聚合酶去除以產生一個平端。將翻譯終止密碼子通過連接到回文接頭TGA CTC GAG TCA(SEQ ID NO41)引入緊接在編碼Glu-87的GAA下遊，其中所述終止密碼子TGA之後是XhoI位點。然後將編碼該截短制管張素的HindIII-XhoI片段即只是第一個Kringle，連接到pdCs-muFc(D4K)載體中用於表達。按抗-muFc ELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時表達和穩定表達中均獲得高水平表達。實施例11.鼠制管張素的鼠Fc-innerK1的表達Kringle結構域由多個環組成，包括外環和內環。在鼠制管張素的第一個Kringle中，所述內環明確為Cys 55和Cys 79，它們在所述環的鹼基處一起形成一個二硫鍵。內環Cys-67與外環的一個Cys殘基形成另一個二硫鍵以產生所述Kringle結構。為了測試內環是否具有抗-血管生成活性，將它如下表達為muFc-innerK1(Kringle 1)。用編碼第一個Kringle的DNA片段作模板，具有序列5』GGG CCT TGGAGC TAC ACT ACA(SEQ ID NO42；所編碼的胺基酸見SEQ IDNO43)的誘變引物用來通過PCR使TGC(Cys-67)誘變為AGC(Ser)。如果將Kringle 1的內環表達但不表達其外環，則這保證Cys-67不形成二硫鍵。具有序列5』GCGGATCCAAGCTT AGT ACA CAT CCCAAT GAG GG (SEQ ID NO44；所編碼的胺基酸見SEQ ID NO45)的上遊引物用來緊接5』Ser-43(AGT)的密碼子按讀框引入HindIII位點。將一個BamHI位點也引入緊接在HindIII位點的上遊。所述BamHI位點用於連接以下實施例12所示柔性Gly-Ser接頭末端處的BamHI位點。因此，通過鼠制管張素Glu-87將編碼Ser-43的HindIII-XhoI DNA片段連接於pdCs-muFc(D4K)載體用於表達。用抗-muFc ELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時表達和穩定表達中均獲得高水平表達muFc-innerK1。實施例12.鼠制管張素的鼠Fc-鼠Endo-GlySer接頭-innerK1的表達雜種分子鼠Fc-鼠Endo-innerK1包含通過含甘氨酸和絲氨酸殘基的一個多肽接頭連接到鼠制管張素第一個Kringle內環的鼠Fc-鼠Endo。如下裝配所述DNA構成物。
在鼠endostatin cDNA的3』末端有一個BspHI位點。為了在鼠endostain的C-端引入一個甘氨酸和絲氨酸殘的柔性接頭，將編碼endostatin的540-bp HindIII-BspHI片段連接到SEQ ID NO46和SEQID NO48中公開的寡核苷酸形成的重疊寡核苷酸雙鏈體。SEQ IDNO46編碼的胺基酸接頭見SEQ ID NO47。
將編碼鼠endostatin和Gly-Ser接頭HindIII-BamHI的片段亞克隆到標準克隆載體中。然後將BamHI位點用來引入編碼實施例11中的innerK1的BamHI-XhoI片段。將所產生的編碼muEndo-GlySer接頭-innerK1的HindIII-XhoI片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體用於表達。以抗-muFc ELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時表達和穩定表達中均獲得高水平表達muFc-muEndo-GlySer接頭-innerK1。實施例13.鼠制管張素的鼠Fc-鼠Endo-GlySer接頭-K1的表達雜種分子鼠Fc-鼠Endo-K1包含通過含甘氨酸和絲酸殘基的多肽接頭連接到鼠制管張素的第一個Krmgle的鼠Fc-鼠Endo。將所述DNA構成物如下裝配。
將編碼鼠Endo-GlySer接頭的HindIII-BamHI片段的BamHI末端(實施例12)通過以下連接物連接到編碼鼠制管張素Kringle 1的HindIII-XhoI片段(實施例10)。BamHI5』GA TCC TCA GGC C (SEQ ID NO49)G AGT CCG GTCGA (SEQ ID NO50)HindIII所述連接物具有一個HindIII的粘端，連接時不需要再產生HindIII位點。因此，將所產生的編碼muEndo-GlySer接頭-Kringle 1的HindIII-XhoI片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體用於表達。用抗-muFcELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時表達和穩定表達中均獲得高水平表達muFc-muEndo-GlySer接頭-K1。實施例14.鼠Fc-鼠Endo-GlySer接頭-鼠制管張素的表達雜種分子鼠Fc-鼠Endo-GlySer接頭-鼠制管張素包含通過含甘氨酸和絲酸殘基的多肽接頭連接到鼠制管張素的鼠Fc-鼠Endo。將所述DNA構成物基本上如下裝配。將編碼鼠Endo-GlySer接頭的HindIII-BamHI片段BamHI末端(實施例12)通過實施例13中所述連接物連接到編碼鼠制管張素的HindIII-XhoI片段。將所產生的編碼鼠Endo-GlySer接頭-鼠制管張素的HindIII-XhoI片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體用於表達。用抗-muFc ELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時表達和穩定表達中均獲得高水平表達鼠Fc-鼠Endo-GlySer接頭-鼠制管張素。實施例15.人制管張素-人Fc-人Endo的表達雜種分子人制管張素-人Fc-人Endo包含通過肽鍵連接到人Fc＝人Endo的人制管張素。將所述DNA構成物如下裝配。首先通過PCR產生編碼人制管張素但無終止密碼子的HindIII-XhoI片段，以使制管張素的最後胺基酸殘基的密碼子緊接著是XhoI位點的CTCGAG。通過以下AflII-HindIII連接物，將5』末端的HindIII連接到輕鏈信號肽的XbaI-AfIII片段(Lo等，Protein Engineering(1998)11495)AfIII5』TTAAGCGGCC(SEQ ID NO51)CG CGG GTCGA (SEQ ID NO52)HindIII』在連接時，上述連接物的HindIII粘端不再產生HindIII位點。在3』末端，通過以下XhoI』-AfIII連接物，將XhoI位點連接到編碼人Fc-人-Endo的AfIII-XhoI片段的AfIII位點XhoI』5』TCGACTCCGGC (SEQ ID NO53)GAGGCCGAATT (SEQ ID NO54)AfIII在連接時，上述連接物的XhoI粘端不再產生XhoI位點。所產生的編碼信號肽-人制管張素-人Fc-人endostatin的XbaI-XhoI片段克隆到pdCs載體上用於表達。用抗-muFc ELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時表達和穩定表達中均獲得高水平表達。實施例16.藥物代謝動力學在一組藥物代謝動力學研究中，將移植100-200mm3Lewis肺腫瘤的C57/BL6小鼠，每隻鼠注射720μg人Fc-人制管張素到其尾靜脈中。根據O』Reilly所描述的實際治療方案(O』Reilly(1996)NatureMedicine 2689)，選擇在該研究中使用的腫瘤大小和人Fc-人制管張素的劑量。在注射後1/2、1、2、4、8、24和48小時從眼眶後採取血樣。在抗-人Fc ELISA後再用蛋白質印跡分析分析所述血樣。發現人Fc-人制管張素的循環半壽期在小鼠中約為32小時，而蛋白質印跡分析顯示高於90％的人-Fc-人制管張素以完整的分子保持循環。
還以200μg/小鼠的劑量在無腫瘤的Swiss小鼠中重複所述藥物代謝動力學研究。在這種情況下，發現人Fc-人制管張素的循環半壽期約為33小時。
等同實施方案本發明可以體現為其它具體的但不偏離其精神或基本特徵的形式。因此認為前述實施方案是在所有方面說明而不是限制本文所描述的發明。因此本發明的範圍由附屬的權利要求書限定而不是由以上所述限定，因此本發明包括在權利要求書等同目的和範圍內的所有修改。
序列表110Lo，Kin-MingLi，YueGillies，StePhen D120表達以及分泌制管張素和ENDOSTATIN的免疫融合物130LEX-006PC140141150US 60/097,8831511998-08-25160S4170PatentIn Ver.2.02101211696212DNA213人220221CDS222(1)..(696)223人免疫球蛋白γ的Fc片段400 1gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca 48Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala1 5 10 15cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc 96Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro20 25 30aag gac acc ctc atg arc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg 144Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val35 40 45gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg 192Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val50 55 60gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag 240Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln65 70 75 80tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag 288Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 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Asn Val Phe195 200 205tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag672Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys210 215 220agc ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa696Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys225 2302102211232212PRT213人4002Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala1 5 10 15Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro20 25 30Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val35 40 45Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val50 55 60Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln65 70 75 80Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln85 90 95Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala100 105 110Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro115 120 125Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr130 135 140Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser145 150 155 160Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr165 170 175Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr180 185 190Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe195 200 205Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys210 215 220Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys225 2302103211549212DNA213人220221CDS222(1)..(549)223endostatin4003cac agc cac cgc gac ttc cag ccg gtg ctc cac ctg gtt gcg ctc aac 48His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn1 5 10 15agc ccc ctg tca ggc ggc atg cgg ggc atc cgc ggg gcc gac ttc cag 96Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln20 25 30tgc ttc cag cag gcg cgg gcc gtg ggg ctg gcg ggc acc ttc cgc gcc 144Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala35 40 45ttc ctg tcc tcg cgc ctg cag gac ctg tac agc atc gtg cgc cgt gcc 192Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala50 55 60gac cgc gca gcc gtg ccc arc gtc aac crc aag gac gag ctg ctg ttt 240Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe65 70 75 80ccc agc tgg gag gct ctg ttc tca ggc tct gag ggt ccg ctg aag ccc 288Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro85 90 95ggg gca cgc ate ttc tcc ttt gac ggc aag gac gtc ctg agg cac ccc 336Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro100 105 110acc tgg ccc cag aag agc gtg tgg cat ggc tcg gac ccc aac ggg cgc 384Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg115 120 125agg ctg acc gag agc tac tgt gag acg tgg cgg acg gag gct ccc tcg 432Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser130 135 140gcc acg ggc cag gcc tcc tcg ctg ctgggg ggcagg ctc ctg ggg cag 480Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln145 150 155 160agt gcc gcg agc tgc cat cac gcc tac atc gtg ctc tgc att gag aac 528Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn165 170 175agc ttc atg act gcc tcc aag 549Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys1802104211183212PRT213人4004His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn1 5 10 15Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln20 25 30Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala35 40 45Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala50 55 60Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe65 70 75 80Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro85 90 95Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro100 105 110Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg115 120 125Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser130 135 140Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln145 150 155 160Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn165 170 175Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys180210521130212DNA213人工序列220223人工序列的描述人Fc-Endo的正向引物220221CDS222(3)..(29)4005cc ccg ggt aaa cac agc cac cgc gac ttc c 30Pro Gly Lys His Ser His Arg Asp Phe1 521062119212PRT213人工序列4006Pro Gly Lys His Ser His Arg Asp Phe1 5210721126212DNA213人工序列220223人工序列的描述人Fc-Endo的正向引物220221CDS222(2)..(25)4007c aag ctt cac agc cac cgc gac ttc c 26Lys Leu His Ser His Arg Asp Phe1 521082118212PRT213人工序列4008Lys Leu His Ser His Arg Asp Phe1 5210921126212DNA213人工序列220223人工序列的描述人Fc-endo的反向引物4009cctcgagcta cttggaggca gtcatg 26210102111089212DNA213人220221CDS222(1)..(1089)223制管張素400 10aaa gtg tat ctc tca gag tgc aag act ggg aat gga aag aac tac aga 48Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg1 5 10 15ggg acg atg tcc aaa aca aaa aat ggc atc acc tgt caa aaa tgg agt 96Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser20 25 30tcc act tct ccc cac aga cct agattc tca cct gct aca cac ccc tca 144Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser35 40 45gag gga ctg gag gag aac tac tgc agg aat cca gac aac gat ccg cag 192Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln50 55 60ggg ccc tgg tgc tat act 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100 105 110tgg gac tct cag agc cca cac gct cat gga tac att cct tcc aaa ttt384Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe115 120 125cca aac aag aac ctg aag aag aat tac tgt cgt aac ccc gat agg gag432Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu130 135 140ctg cgg cct tgg tgt ttc acc acc gac ccc aac aag cgc tgg gaa ctt480Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu145 150 155 160tgc gac atc ccc cgc tgc aca aca cctcca cca tct tct ggt ccc acc 528Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr165 170 175tac cag tgt ctg aag gga aca ggt gaa aac tat cgc ggg aat gtg gct576Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala180 185 190gtt acc gtt tcc ggg cac acc tgt cag cac tgg agt gca cag acc cct624Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro195 200 205cac aca cat aac agg aca cca gaa aac ttc ccc tgc aaa aat ttg gat672His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp210 215 220gaa 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Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr165 170 175Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala180 185 190Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro195 200 205His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp210 215 220Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His225 230 235 240Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys245 250 255Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro260 265 270Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser275 280 285Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser290 295 300Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr305 310 315 320Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp325 330 335Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr340 345 350Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala355 3602101221129212DNA213人工序列220223人工序列的描述人Fc-Angio的正向引物220221CDS222(3)..(29)40012cc ccg ggt aag aaa gtg tat crc tca gag 29Pro Gly Lys Lys Val Tyr Leu Ser Glu1 5210132119212PRT213人工序列40013Pro Gly Lys Lys Val Tyr Leu Ser Glu1 52101421128212DNA213人工序列220223人工序列的描述人Fc-Angio的正向引物220221CDS222(2)..(28)40014c ccc aag ctt aaa gtg tat ctc tca gag 28Pro Lys Leu Lys Val Tyr Leu Ser Glu1 5210152119212PRT213人工序列40015Pro Lys Leu Lys Val Tyr Leu Ser Glu1 52101621130212DNA213人工序列220223人工序列的描述人Fc-Angio的反向引物40016cccctcgagc tacgcttctg ttcctgagca 3021017211552212DNA213小家鼠220221CDS222(1)..(552)223endostatin400 17cat act cat cag gac ttt cag cca gtg crc cac ctg gtg gca ctg aac 48His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn1 5 10 15acc ccc ctg tct gga ggc atg cgt ggt atc cgt gga gca gat ttc cag 96Thr Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln20 25 30tgc ttc cag caa gcc cga gcc gtg ggg ctg tcg ggc acc ttc cgg gct 144Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ser Gly Thr Phe Arg Ala35 40 45ttc ctg tcc tct agg ctg cag gat ctc tat agc atc gtg cgc cgt gct192Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala50 55 60gac cgg ggg tct gtg ccc arc gtc aac ctg aag gac gag gtg cta tct240Asp Arg Gly Ser Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Val Leu Ser65 70 75 80ccc agc tgg gac tcc ctg ttt tct ggc tcc cag ggt caa gtg caa ccc288Pro Ser Trp Asp Ser Leu Phe Ser Gly Ser Gln Gly Gln Val Gln Pro85 90 95ggg gcc cgc atc ttt tct ttt gac ggcaga gat gtc ctg aga cac cca 336Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Arg Asp Val Leu Arg His Pro100 105 110gcc tgg ccg cag aag agc gta tgg cac ggc tcg gac ccc agt ggg cgg384Ala Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Ser Gly Arg115 120 125agg ctg atg gag agt tac tgt gag aca tgg cga act gaa act act ggg432Arg Leu Met Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Thr Thr Gly130 135 140gct aca ggt cag gcc tcc tcc ctg ctg rca ggc agg ctc ctg gaa cag480Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Ser Gly Arg Leu Leu Glu Gln145 150 155 160aaa gct gcg 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35 40 45Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala50 55 60Asp Arg Thr Gly Val Pro Val Val Asn Leu Arg Asp Glu Val Leu Phe65 70 75 80Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Gln Leu Lys Pro85 90 95Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Arg Asp Val Leu Gln His Pro100 105 11Ala Trp Pro Arg Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Ser Gly Arg115 120 125Arg Leu Thr Asp Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ala130 135 140Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Ala Gly Arg Leu Leu Glu Gln145 150 155 160Glu Ala Ala Ser Cys Arg His Ala Phe Val Val Leu Cys Ile Glu Asn165 170 175Ser Val Met Thr Ser Phe Ser Lys1802103621141212DNA213人工序列220223人工序列的描述HindIII/DraIII接頭上鏈220221CDS222(3)..(41)40036ag ctt cac acc cac cag gac ttc cag ccg gtg ctg cac ctg 41Leu His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu1 5 102103721113212PRT213人工序列40037Leu His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu1 5 102103821134212DNA213人工序列220223人工序列的描述HindIII/DraIII接頭下鏈40038gtgcagcacc ggctggaagt 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1.編碼一種融合蛋白的DNA分子，它包括(a)信號序列；(b)免疫球蛋白Fc區；和(c)靶蛋白序列，該靶蛋白選自製管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段、具有endostatin活性的膠原蛋白XVIII片段和它們的組合物。
2.權利要求1的所述DNA，其中所述信號序列、所述免疫球蛋白Fc區和所述靶蛋白序列從5』到3』方向按順序編碼。
3.權利要求1的所述DNA，其中所述信號序列、所述靶蛋白序列和所述免疫球蛋白Fc區從5』到3』方向依次編碼。
4.權利要求1的所述DNA，其中所述免疫球蛋白Fc區包含一個免疫球蛋白鉸鏈區。
5.權利要求1的所述DNA，其中所述免疫球蛋白Fc區包含一個免疫球蛋白鉸鏈區和一個免疫球蛋白重鏈恆定區結構域。
6.權利要求1的所述DNA，其中所述免疫球蛋白Fc區包含一個鉸鏈區和一個CH3結構域。
7.權利要求1的所述DNA，其中所述免疫球蛋白Fc區缺乏至少所述CH1結構域。
8.權利要求1的所述DNA，其中所述免疫球蛋白Fc區編碼至少一部分免疫球蛋白γ。
9.用於轉染哺乳動物細胞的複製型表達載體，所述載體包含權利要求1的所述DNA。
10.包含權利要求1的所述DNA的哺乳動物細胞。
11.包含免疫球蛋白Fc區和靶蛋白的融合蛋白，其中所述靶蛋白選自製管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段、具有endostatin活性的膠原蛋白XVIII片段和它們的組合物。
12.權利要求11的所述融合蛋白，其中所述纖溶酶原片段的分子量約為40kD並包含SEQ ID NO3所示胺基酸序列。
13.權利要求11的所述融合蛋白，其中所述靶蛋白包含SEQ IDNO3所示胺基酸序列。
14.權利要求11的所述融合蛋白，其中所述膠原蛋白XVIII片段包含SEQ ID NO1所示胺基酸序列。
15.權利要求11的所述融合蛋白，其中所述靶蛋白包含至少兩種選自製管張素、endostatin、纖溶酶原片段和膠原蛋白XVIII片段的分子，其中將所述兩種分子通過一個多肽接頭連接。
16.權利要求11的所述融合蛋白，其中所述靶蛋白連接到所述免疫球蛋白Fc區的N-末端。
17.權利要求11的所述融合蛋白，其中所述靶蛋白連接到所述免疫球蛋白Fc區的C-末端。
18.一種多聚體蛋白，它包含至少兩種權利要求11的通過二硫鍵連接的融合蛋白。
19.權利要求18的所述多聚體蛋白，其中至少一種所述融合蛋白的靶蛋白為制管張素，而至少一種所述融合蛋白的靶蛋白為endostatin。
20.權利要求18的所述多聚體蛋白，其中兩種所述融合蛋白的靶蛋白均為制管張素。
21.權利要求18的所述多聚體蛋白，其中兩種所述融合蛋白的靶蛋白均為endostatin。
22.權利要求11的所述融合蛋白，它還包含一個第二靶蛋白，所述第二靶蛋白選自製管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段和具有endostatin活性的膠原蛋白XVIII片段。
23.權利要求22的所述融合蛋白，其中所述第二靶蛋白通過多肽接頭連接到所述第一靶蛋白。
24.權利要求22的所述融合蛋白，其中所述第一靶蛋白連接到所述免疫球蛋白Fc區的N-末端，而所述第二靶蛋白連接到所述免疫球蛋白Fc區的C-末端。
25.一種多聚體融合蛋白，它包含至少兩種權利要求11的融合蛋白，其中所述融合蛋白通過多肽鍵連接。
26.產生融合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟a)提供權利要求10的所述哺乳動物細胞；和b)培養所述哺乳動物細胞以生產所述融合蛋白。
27.權利要求26的所述方法，它包括收集所述靶蛋白的附加步驟。
28.權利要求26的所述方法，它包括從所述靶蛋白切除所述免疫球蛋白Fc區的附加步驟。
29.治療血管生成性疾病的方法，該方法包括將權利要求1的所述DNA給予需要血管生成抑制劑的哺乳動物的步驟。
30.治療血管生成性疾病的方法，該方法包括將權利要求9的所述載體給予需要血管生成抑制劑的哺乳動物的步驟。
31.通過給予制管張素或endostatin緩解病情的治療方法，該方法包括將有效量權利要求11的所述融合蛋白給予患所述疾病的哺乳動物的步驟。
全文摘要
所公開的內容為編碼一種免疫球蛋白Fc－血管生成抑制劑融合蛋白的核苷酸序列,例如DNA序列或RNA序列。所述血管生成抑制劑可以是制管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段或具有endostatin活性的膠原蛋白ⅩⅧ片段。可以將所述核苷酸序列插入到合適的表達載體中並在哺乳動物細胞中表達。此外所公開的內容還有通過表達這種核苷酸序列生產一系列免疫球蛋白Fc－血管生成抑制劑融合蛋白。所公開的內容還有使用這種核苷酸序列和融合蛋白治療血管生成性疾病的方法。
文檔編號C07K19/00GK1326467SQ99812456
公開日2001年12月12日 申請日期1999年8月25日 優先權日1998年8月25日
發明者K·M·羅, Y·李, S·D·吉利斯 申請人:利思進藥品公司