新突變型氨甲醯磷酸合成酶以及生產由氨甲醯磷酸衍生的化合物的方法

2023-08-06 17:48:41 2

專利名稱:新突變型氨甲醯磷酸合成酶以及生產由氨甲醯磷酸衍生的化合物的方法
技術領域：
本發明涉及微生物學行業，具體涉及生產由氨甲醯磷酸衍生的化合物的方法。更具體地講，本發明涉及利用參與大腸桿菌菌株的精氨酸和嘧啶生物合成途徑的新的抗反饋酶生產由氨甲醯磷酸衍生的化合物，如精氨酸、瓜氨酸和包括乳清酸、尿苷、尿苷5』-一磷酸(UMP)、胞苷和胞苷5』-一磷酸(CMP)在內的嘧啶衍生物。
背景技術：
大腸桿菌的氨甲醯磷酸合成酶(CPSase)能催化由碳酸氫鹽、穀氨醯胺和兩個Mg-ATP分子產生氨甲醯磷酸(CP)的複雜的合成過程，同時釋放出穀氨酸、磷酸和兩個Mg-ADP[Meister A.，Advan.Enzymol.Mol.Biol.，62卷，315-374頁，1989]。CP的合成是兩種生物合成途徑的中間步驟，即嘧啶核苷酸和精氨酸的生物合成途徑中間步驟。在第一個途徑中，CP與天冬氨酸氨甲醯轉移酶(ATCase)偶聯，導致通過兩個步驟形成乳清酸。乳清酸是嘧啶衍生物生物合成的重要的代謝中間產物，所述衍生物包括嘧啶，如尿嘧啶；嘧啶核苷，如乳清苷、尿苷、和胞苷；以及嘧啶核苷酸，如乳清苷5』-一磷酸(OMP)、UMP和CMP。業已證實，在多種細菌的發酵過程中，在培養基中存在乳清酸明顯有助於嘧啶衍生物，即尿嘧啶的生產和積累(US專利3214344)。在第二個途徑中，CP通過烏氨酸氨甲醯轉移酶(OTCase)與烏氨酸偶聯，構成精氨酸生物合成途徑的第六個步驟(由穀氨酸開始)。CPSase由鳥氨酸和IMP(嘌呤核苷酸的前體)激活，並且由UMP抑制。氨甲醯磷酸合成酶由兩個亞基組成。對於棒狀桿菌(EP1026247A1)和屬於埃希氏菌屬和芽孢桿菌屬的細菌來說，業已證實所述亞基是由carA和carB基因編碼的。carAB操縱子的轉錄受到兩個途徑的終產物的累計性抑制[Charlier D.等，分子生物學雜誌，226卷，367-386頁，1992；Wang H.等，分子生物學雜誌，277卷，805-824頁，1998；Glansdorff N.等，嘧啶途徑，6卷，53-62頁，1998]。天然大腸桿菌CPSase是由一個41270Da的小亞基和一個117710Da的大亞基組成的異源二聚體，所述兩個亞基分別由carA和carB基因編碼。小亞基催化穀氨醯胺的水解，並且負責NH3向大亞基的轉移，在大亞基上進行CP的實際合成。大亞基包括底物即碳酸氨鹽、氨的結合位點，兩個獨立的用於結合Mg-ATP的位點，和構成調控結構域的18kDa羧基末端區[Rubio V.等，生物化學，30卷，1068-1075頁，1991；Cervera J.等，生物化學，35卷，7247-7255頁，1996]。另外，有人認為，大亞基具有獨自催化氨甲醯磷酸的合成反應的活性(Stephen D.Rubino等，生物學化學雜誌，206，4382-4386，1987)。
最近披露了CPSase的變構活化形式的結晶結構[Thoden J.等，生物化學，36卷，6305-6316頁，1997；Thoden J.等，ActaCrystallogr.Sec.D.，55卷，8-24頁，1999]。大亞基上被稱為A、B、C的前三個獨立的結構域在結構方面非常相似，但第四個結構域完全不同。D結構域(937-1073號殘基)負責結合以及由效應物IMP、UMP和鳥氨酸進行變構調控。另外，業已證實，兩個殘基，948號絲氨酸和1042號蘇氨酸似乎對於CPSase的變構調控起關鍵作用[Delannay S.等，分子生物學雜誌，286卷，1217-1228頁，1999]。當948號絲氨酸被苯丙氨酸取代時，這種酶變得對UMP和IMP不敏感，但仍然能被鳥氨酸激活，不過激活的程度降低。具有T1042I突變的酶表現出鳥氨酸激活作用的大大減弱。
原則上講，酶的抗反饋(fbr)表現型，是作為在胺基酸序列上的一個或幾個位點上用另一種胺基酸取代相應的胺基酸殘基的結果出現的，並且，這種取代會導致酶的活性降低。例如，用19種其它胺基酸殘基的每一種取代大腸桿菌絲氨酸乙醯轉移酶(SAT)(cysE基因)上的天然Met256，在大多數情況下會導致fbr表現型，但是，突變型SAT蛋白不能恢復天然SAT的活性水平[NakamoriS.等，AEM，64卷，1607-1611頁，1998]。因此，通過上述方法獲得的突變型酶的缺陷是，與野生型酶相比，突變型酶的活性降低。

發明內容
本發明涉及構建在大腸桿菌嘧啶和精氨酸或瓜氨酸生物合成中起關鍵作用的抗反饋的、高活性的酶。
在本發明中，提出了利用carB基因片段的完全隨機化合成大量突變型carB基因的新方法。同時取代胺基酸序列片段上的某些胺基酸殘基(其中，可以定位fbr突變)，能夠產生將活性水平恢復到接近天然蛋白的突變型蛋白，這是因為這種酶的三維結構與天然結構更符合。因此，完成了下面所描述的本發明。
就是說，本發明提供了(1)氨甲醯磷酸合成酶的大亞基，其中，相當於SEQ ID NO20的947-951號位置的胺基酸序列被SEQ ID NO1-9中的任一個胺基酸序列所取代，並且，尿苷5』-一磷酸的反饋抑制作用被脫敏；(2)如(1)的氨甲醯磷酸合成酶的大亞基，其中，氨甲醯磷酸合成酶是大腸桿菌氨甲醯磷酸合成酶。
(3)如(1)的氨甲醯磷酸合成酶的大亞基，其中，SEQ ID NO20的947-951號位置的胺基酸序列被SEQ ID NO1-9中的任一個胺基酸序列所取代，並且，尿苷5』-一磷酸的反饋抑制作用被脫敏；(4)如(1)的氨甲醯磷酸合成酶的大亞基，它包括在除了947-951號位置以外的一個或多個位置上的一個或幾個胺基酸的缺失、取代、插入或添加，其中，尿苷5』-一磷酸的反饋抑制作用被脫敏；(5)氨甲醯磷酸合成酶，它包括如(1)-(4)中任一項的氨甲醯磷酸合成酶的大亞基；(6)編碼如(1)-(4)中任一項的氨甲醯磷酸合成酶的DNA，其中，尿苷5』-一磷酸的反饋抑制作用被脫敏；(7)編碼如(1)-(4)中任一項的尿苷5』-一磷酸的反饋抑制作用被脫敏的氨甲醯磷酸合成酶大亞基以及大腸桿菌氨甲醯磷酸合成酶的小亞基的DNA；(8)屬於埃希氏菌屬的細菌，它具有如(6)或(7)的DNA；(9)如(8)的細菌，它具有產生選自L-精氨酸，瓜氨酸和嘧啶衍生物的化合物的能力；(10)如(9)的細菌，其中，所述嘧啶衍生物是乳清酸、尿苷、UMP、胞苷和CMP；(11)一種生產選自L-精氨酸，瓜氨酸和嘧啶衍生物的化合物的方法，該方法包括以下步驟在一種培養基中培養如(8)-(10)中任一項的細菌，以便在培養基中產生並積累所述化合物，並且從所述培養基中收集所述化合物；和(12)如(11)的方法，其中，所述嘧啶衍生物是乳清酸、尿苷、UMP、胞苷和CMP。
在本發明中，術語「CPSase活性」表示催化由碳酸氫鹽、穀氨醯胺和兩個Mg-ATP分子產生氨甲醯磷酸的複雜的合成反應的活性。本發明的「CPSase」可以是由大亞基組成的單一的多肽，或者是包括大亞基和小亞基的異二聚體，只要CPSase具有CPSase活性就行。在本申請中，上面所提到的大亞基和異二聚體可以被統稱為「CPSase」。編碼大亞基和小亞基的DNA可以被稱為「carAB」。
根據本實施方案，具有上述任意一種fbr突變的CTPase可以被稱為「突變型CPSase」，而編碼突變型CPSase的DNA可以被稱為「突變型carB基因」或「突變型carAB基因」，而沒有突變的CPSase可以被稱為「野生型CPSase」。
下面將對本發明作詳細說明。
1突變型CPSase和突變型carB基因隨後，對攜帶有作為carAB操縱子克隆到表達載體上的突變型carB基因的重組克隆的選擇和篩選，以便允許選擇具有不同水平的生物學活性的突變型CPSase的fbr變體。
根據S.Delannay等所獲得的資料(Delannay S.等，分子生物學雜誌，286卷，1217-1228，1999)，大腸桿菌氨甲醯磷酸合成酶的突變型(S948F)對UMP不敏感。根據這些資料，選擇CPSase上包括948號位置在內的部分作為修飾的目標。
所述突變型CPSase和突變型carB基因是通過隨機片段定向誘變獲得的。為了在carB基因上獲得多個突變，將編碼SEQ ID NO20的胺基酸序列上947號亮氨酸-951號穀氨酸殘基的部分的carB基因的15個核苷酸的片段隨機化(參見下文)。隨機化的15個核苷酸的片段能產生412或接近1.5×107個不同的DNA序列，這些序列能編碼五聚體肽的4×105種不同的胺基酸殘基。在這些序列的讀框內不引入終止密碼子的可能性大約為0.95或95。因此，編碼所述肽的947-951號胺基酸殘基的carB片段的隨機化必定能產生大約4×105種不同的胺基酸序列，在CPSase結構的這一肽片段具有多樣性。隨後選擇並篩選攜帶有克隆到表達載體上的突變型carB基因的重組克隆，可以選擇具有不同水平的生物學活性的突變型CPSase的fbr變異體。
本發明定義了適合CPSase的fbr表現型的突變型CPSase的胺基酸序列。因此，根據所述序列，通過用普通方法將突變導入野生型carB基因可以獲得突變型CPSase。野生型carB基因可以是大腸桿菌的carB基因(GenBank保藏號AE000113 U00096SEQ ID NO19的序列上的10158-13379號核苷酸)。carA基因相當於GenBank保藏號U00096的序列上的8992-10140號核苷酸。
在carB基因被用作獲得編碼突變型CPSase的DNA的材料的情況下，突變型carB基因編碼該突變型CPSase的大亞基。在carAB基因被用作所述材料的情況下，突變型carAB基因同時編碼突變型CPSase的大亞基和小亞基。
本發明的突變型CPSase上的947-951號位置上的胺基酸序列是SEQ ID NO1-9中的任意一種序列。在表1中示出了已知fbr CPSase的相應的胺基酸序列，其中，948號位置上的絲氨酸被苯丙氨酸所取代，以及大腸桿菌野生型CPSase的胺基酸序列。在表1中還示出了編碼所述胺基酸序列的核苷酸序列的例子。
表1


突變型CPSase可以包括在除了947-951號位置以外的一個或多個位置上的一個或幾個胺基酸的缺失、取代、插入或添加，只要不損害CPSase的活性就行。「幾個」胺基酸的數量，根據該蛋白三維結構上的胺基酸殘基的位置或類型而有所不同。這是因為以下原因。就是說，某些胺基酸之間具有較高的同源性，並且，這些胺基酸的差別不會對該蛋白的三維結構產生大的影響。因此，本發明的突變型CPSase，可以與構成CPSase的所有胺基酸殘基的同源性不低於30-50％，優選50-70％，並且它具有fbr CPSase活性。在存在尿苷5』-一磷酸的條件下，所述突變型CPSase保留的CPSase活性理想地不低於野生型CPSase活性的25％，優選不低於30％，更優選不低於40％。
在本發明中，「相當於947-951號位置的序列的胺基酸序列」表示相當於SEQ ID NO20的胺基酸序列上947-951號位置上的胺基酸序列的胺基酸序列。胺基酸殘基的位置可以改變。例如，如果將一個胺基酸殘基插入N-末端部分，本來位於947號位置上的胺基酸殘基就變成了948號位置。在這種情況下，相當於原有947號位置的胺基酸殘基，在本發明中被稱為947號位置上的胺基酸殘基。
短語「尿苷5』-一磷酸的反饋抑制作用被脫敏」表示反饋抑制作用的程度降低。反饋抑制程度的降低可以通過以下方法測定測定在有尿苷5』-一磷酸的條件下CPSase活性的降低，並且將其與具有SEQ IDNO20的胺基酸序列的蛋白的活性進行比較。另外，短語「尿苷5』-一磷酸的反饋抑制作用被脫敏化」表示抑制作用基本上脫敏就足夠了，並且不需要完全脫敏。具體地講，在用5mM穀氨醯胺作底物時，在有10mM尿苷5』-一磷酸的條件下，突變型CPSase的活性與在沒有尿苷5』-一磷酸的條件下的活性之比理想地不低於50％，優選不低於70％，更優選不低於90％。
例如，可以通過諸如定位誘變的方法修飾所述核苷酸序列，獲得編碼與上述突變型CPSase基本相同的蛋白的DNA，以便使位於特定位點上的一個或幾個胺基酸殘基發生缺失、取代、插入或添加。上述DNA修飾可以通過常用的已知突變處理實現。所述突變處理包括在體外處理含有突變型carB基因的DNA的方法，例如，用羥胺處理，以及用紫外線輻射或諸如N-甲基-N』-硝基-N-亞硝酸胍(NTG)以及亞硝酸之類的通常被用於這種處理的誘變劑處理微生物，例如，具有突變型carB基因的屬於埃希氏菌屬的細菌的方法。
上述核苷酸的取代、缺失、插入或添加還包括天然發生的突變(突變體或變異體)，例如，以具有CPSase的細菌個體的差異或種或屬的差異為基礎。
可以通過從接受過突變處理的具有突變型CPSase的細胞中分離能在嚴格條件下與作為探針的具有已知carB基因序列或其一部分的DNA雜交的DNA，和編碼具有CPSase活性的蛋白的DNA，獲得編碼基本與突變型CPSase相同的蛋白的DNA。
在本文中，術語「嚴格條件」表示能形成所謂的特異性雜交，而不能形成非特異性雜交的條件。用任何數位化的值來精確表達該條件都是困難的。不過，舉例來說，嚴格條件包括這樣一種條件，例如，在這種條件下，彼此之間的同源性不低於50％的DNA可以雜交，而彼此之間的同源性低於以上標準的DNA不能雜交。另外，嚴格條件可以表達為在相當於Southern雜交中的普通洗滌條件的鹽濃度下DNA彼此之間能雜交的條件，例如，60℃，1XSSC，0.1％SDS，優選0.1XSSC，0.1％SDS。
在上述條件下可以雜交的基因包括在該基因的編碼區內產生了一個終止密碼子的基因，以及由於活性中心的突變而沒有活性的基因。不過，通過以下方法可以很方便地消除上述困難將所述基因連接在商業化的表達載體上，並且研究所表達的蛋白的CPSase活性。
當本發明的CPSase是包括突變型大亞基和小亞基的異二聚體時，所述小亞基可以是大腸桿菌野生型CPSase的小亞基。
在本發明中，小亞基可以包括出現在一個或多個位置上的一個或幾個胺基酸的缺失、取代、插入或添加，只要它在與大亞基結合時能具有CPSase活性就行。術語「幾個」的含義與上文描述大亞基時的含義相同。
作為編碼與上述小亞基基本上相同的多肽的DNA，它可以是能在嚴格條件下與含有carA或其部分的DNA雜交的DNA。術語「嚴格條件」的含義與上文所述相同。
2本發明的屬於埃希氏菌屬的細菌。
本發明的屬於埃希氏菌屬的細菌是向其中導入了突變型carB基因的屬於埃希氏菌屬的細菌。例如，屬於埃希氏菌屬的細菌是大腸桿菌。例如，可以通過用重組DNA轉化屬於埃希氏菌屬的細菌，從而導入突變型carB基因，所述重組DNA包括能在屬於埃希氏菌屬的細菌中起作用的載體以及所述突變型carB基因。還可以通過用突變型carB基因取代染色體上的carB基因來導入突變型carB基因。
例如，用於導入所述突變型carB基因的載體可以是諸如pBR322、pMW118、或pUC19之類的質粒載體，諸如11059、1BF101、或M13mp9之類的噬菌體載體，以及諸如Mu、Tn10、或Tn5之類的轉座子。
例如，可以通過以下方法完成將DNA導入屬於埃希氏菌屬的細菌D.A.Morrison的方法(酶學方法，68，326，1979)或用氯化鈣處理受體細菌細胞，以便提高DNA的穿透能力的方法(Mandel，M.，和Higa，A.，分子生物學雜誌，53，159，1970)等。
通過將突變型carB基因導入上述屬於埃希氏菌屬的生產菌，可以提高由氨甲醯磷酸衍生的化合物的產量，所述化合物如L-精氨酸，瓜氨酸和嘧啶衍生物。另外，可以賦予事先導入了突變型carB基因的細菌產生諸如L-精氨酸，瓜氨酸和嘧啶衍生物的化合物的能力。上述嘧啶衍生物包括乳清酸、尿苷、UMP、胞苷和CMP。
例如，具有產生L-精氨酸的活性的屬於埃希氏菌屬的細菌，可以是大腸桿菌菌株AJ11531和AF11538(JP56106598A2)、AJ11593(FERMP-5616)和AJ11594(FERM P-5617)(日本專利公開號57-5693)，VKPM B-7925(俄羅斯專利申請號2000117677)。菌株VKPM B-7925業已於2000年4月10日保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM)。
目前還不知道屬於埃希氏菌屬的L-瓜氨酸生產菌，屬於埃希氏菌屬的乳清酸生產菌，以及屬於埃希氏菌屬的尿苷5』-一磷酸(UMP)生產菌。
例如，具有產生L-瓜氨酸活性的屬於芽孢桿菌屬的細菌，可以是枯草芽孢桿菌菌株K-X-1 A-1(ATCC No 15561)和K-X-1 A-9(ATCCNo15562)(美國專利3282794)，芽孢桿菌菌株cit-70(日本公開專利申請號08-089269)。例如，具有產生L-瓜氨酸活性的屬於短桿菌屬的細菌，可以是黃色短桿菌菌株AJ3408(FERM P-1645)(美國專利5164307)和AJ11677(日本後期公開專利申請號57-163488)。例如，具有產生L-瓜氨酸活性的屬於棒桿菌屬的細菌，可以是穀氨酸棒桿菌菌株AJ11588(FERM P-5643)(美國專利5164307)。
例如，具有產生乳清酸活性的屬於芽孢桿菌屬的細菌，可以是枯草芽孢桿菌菌株FERM P-11402，它缺乏乳清酸磷酸核糖基轉移酶(日本公開專利申請號04-004891)。例如，具有產生UMP活性的屬於棒桿菌屬的細菌，可以是抗5-氟尿嘧啶的穀氨酸棒桿菌菌株T-26(FERMBP-1487)，它抗5-氟尿嘧啶和三甲氧苄二氨嘧啶的T-29(FERMBP1488)，以及抗5-氟尿嘧啶和磺胺胍的T-30(FERM BP1489)(歐洲專利EP0312912)。
例如，具有產生UMP活性的屬於棒桿菌屬的細菌，可以是產氨棒桿菌菌株LK40-2(VKPM B-7811)、LK75-15(VKPM B-7812)和LK75-66(VKPM B-7813)(俄羅斯專利申請號99122774)。
3生產L-精氨酸、瓜氨酸和嘧啶衍生物的方法。
通過以下方法能有效生產L-精氨酸，瓜氨酸和嘧啶衍生物等化合物在培養基中培養向其中導入了突變型carB基因的，並且具有產生所述化合物的能力的細菌，在所述培養基中產生並積累所述化合物，以及從所述培養基中收集所述化合物。上述嘧啶衍生物包括乳清酸、尿苷、UMP、胞苷和CMP。
在本發明的方法中，屬於埃希氏菌屬的細菌的培養，從液體培養基中收集並純化化合物，可以用類似於利用細菌通過發酵生產L-精氨酸的常規方法的方式完成。用於培養的培養基可以是合成培養基或天然培養基，只要該培養基包含適量的碳源和氮源以及礦物質，如果必要，還有所使用的細菌所需要的適量養分就行。碳源可以包括各種碳水化合物，如葡萄糖和蔗糖，以及各種有機酸，這取決於所使用細菌的同化能力。可以使用包括乙醇和甘油在內的醇。作為氮源，可以使用氨、諸如硫酸銨的各種銨鹽，諸如胺的其它氮化合物，諸如蛋白腖、大豆水解物和消化過的發酵微生物的天然氮源。作為礦物質，可以使用磷酸二氫鉀，硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵、硫酸錳、碳酸鈣。
培養優選在有氧條件下進行，如搖床培養、通氣培養和攪拌培養。培養通常是在20-40℃的溫度下進行的，優選30-38℃。培養通常是在pH5-9，優選6.5-7.2的條件下進行的。培養基的pH可以用氨、碳酸鈣、各種酸、各種鹼和緩衝液調節。通常，培養1-3天就會導致所述化合物在培養基中積累。
在培養之後，可以通過離心或膜過濾除去諸如細胞等固體物質，分離所述化合物，然後收集並通過離子交換、濃縮和結晶級份之類的方法純化所述化合物。
附圖簡述
圖1表示構建質粒pEL-carAB-wt的示意圖。
圖2表示構建突變型carB基因庫的示意圖。
具體實施方式
將結合下面的實施例對本發明做具體說明。
實施例1通過將來自大腸桿菌染色體的AvaIII-BglII DNA片段(4911bp)克隆到事先用BamHI和PstI消化過的pBluescript II SK(+)載體(Fermentas，Lithuania)上，構建攜帶來自大腸桿菌的野生型carAB基因的質粒pBScarAB-13。
通過用lac啟動子取代T7啟動子，對質粒pET22-b(+)(Novagen，USA)進行修飾。Lac啟動子是通過用質粒pUC18做模板，並用寡核苷酸5』-accagatctgcgggcagtgagcaacgc-3』(SEQ ID NO21)和5』-gtttctagatcctgtgtgaaattgttatccgc-3』(SEQ ID NO22)做引物，通過PCR擴增獲得的。用限制酶BglII和XbaI消化所得到的具有lac啟動子的片段(0.14kb)，並克隆到事先用相同的限制酶消化過的pET22-b(+)載體上。將所得到的質粒pET-Plac用於克隆來自質粒pBScarAB-13的沒有啟動子的carAB基因。
用pBScarAB-13作模板，並且用寡核苷酸5』-cctctagaaataaagtgagtgaatattc-3』(SEQ ID NO23)和5』-cttagcggttttacggtactgc-3』(SEQ ID NO24)作引物，通過PCR擴增獲得carA基因的5』末端(1.18kb)。用XbaI和DraIII消化所得到的片段，並且，通過瓊脂糖電泳純化具有carA基因的5』末端序列的XbaI-DraIII片段(0.61kb)。連接該片段、來自質粒pBScarAB-13的DraIII-SacI片段(具有carA基因和carB基因的3』末端的序列)和載體pET-Plac/XbaI-SacI的混合物，並轉化到大腸桿菌TG1細胞。所獲得的重組質粒pEL-carAB-wt具有受lac啟動子控制的野生型carAB操縱子的序列。
用於PCR擴增的TaKaRa La DNA聚合酶是從Takara Shuzo公司(日本)獲得的，並且在供貨商推薦的條件下使用。
1隨機片段定向誘變用質粒pBScarAB-13作模板，正義引物P15』-ggtcgtgcgctgNN(T/C)N(T/C)CNN(T/C)NNN(G/A)NNggcgataaagaacgcgtggtg-3』(SEQ ID NO25)(48個鹼基)是根據carB基因的核苷酸序列設計的，並且用標準M13導向序列引物作反義引物。引物P1的固定的12個核苷酸的5』末端和固定的21個核苷酸的3』末端區，分別與carB基因Glu951密碼子下遊和Leu947密碼子上遊的序列同源。
在第一輪PCR中(15次循環)，用具有隨機化15核苷酸區的引物P1合成0.75kb的DNA片段(carB基因的3』-末端)。第一輪PCR是按以下方法進行的。將100納克質粒pBScarAB-13作為模板添加到含有濃度為10皮摩爾的兩種引物的PCR溶液中(50微升)。用2400型DNA熱循環儀(Perkin-Elmer公司，Foster市，加利弗尼亞)進行15次PCR循環(94℃15秒，52℃20秒，72℃1分鐘)。
在第二輪擴增中，再進行15輪擴增(94℃1分鐘，35℃1分鐘，72℃2分鐘)，其中，該片段的(-)鏈起著「引物」作用，進行延伸，以便得到完整的基因序列。
在第三輪擴增中，將10微升該反應混合物的等分樣品添加到含有100皮摩爾正義引物標準M13導向序列引物和作為反義引物的P25』-ccacttcctcgatgacgcgg-3』(SEQ ID NO26)的新鮮90微升反應混合物中，並再進行15次循環(94℃0.5分鐘，55℃20秒，72℃2分鐘)。
通過瓊脂糖凝膠電泳純化編碼carB基因的3』-末端片段的突變型變異體文庫的1.32kb DNA片段，然後用AflII和SacI消化，並進一步與事先用相同的限制酶消化過的pEL-carAB-wt載體連接，以便獲得pEL-carAB-NN。
在隨後的實驗中將大約150納克連接的DNA用於轉化大腸桿菌TG1(supE hsdΔ5 thiΔ(lac-proAB)F』[traD36 proAB+lacIqlacZΔM15])(J.Sambrook等，分子克隆，1989)受體細胞，以便在每一次都得到大約2000個克隆。純化重組質粒(pEL-carAB-NN)文庫，並轉入大腸桿菌細胞VKPM B-6969(carBTn10)，將其用於篩選具有編碼活性CarAB酶的carAB基因的重組質粒pEL-carAB-NN。
2定位誘變為了導入單一突變Ser948Phe，用質粒pBScarAB-13作模板，並且用根據carB基因的核苷酸序列設計的正義引物5』-cgtgcgctgcttttcgtgcgcgaaggcgataaag-3』(34個鹼基)(SEQ ID NO27)和標準M13導向序列引物作反義引物進行PCR。PCR擴增和該片段的克隆是按上述方法進行的。
通過瓊脂糖凝膠電泳，純化具有單一突變的編碼carB基因的3』末端片段的1.32kb DNA片段，用AflII和SacI消化，然後連接到事先用相同的限制酶消化過的pEL-carAB-wt載體上。
用大約100納克所得到的DNA質粒轉化大腸桿菌細胞VKPM B-6969，並篩選攜帶具有單一取代Ser948Phe的活性CarAB酶的重組質粒pEL-carAB-6。
實施例2.新的carB突變型的分離，以及在CPSase上胺基酸取代對催化特性的影響首先在40種重組B-6969(pEL-carAB-NN)克隆上，在由carAB和ArgI(鳥氨酸氨甲基轉移酶)酶催化的由鳥氨酸生物合成瓜氨酸的反應中，評估carAB活性及其對UMP的抗反饋作用。
反應的公式如下CarAB+ArgINH3+HCO3-+2MgATP+鳥氨酸------→瓜氨酸+2MgADP+2Pi在該反應中氨甲醯磷酸合成酶用游離NH4+作底物來自40種B-6969(pEL-carAB-NN)菌株和TG1(pUC18-argI)細胞的蛋白提取物，是通過用硫酸銨(75％的飽和度)沉澱從超聲波處理過的細胞的粗製細胞提取物中製備的。將所述蛋白沉澱溶解在具有以下配方的緩衝液中Tris-HCl(50mM)，pH7.5，2-巰基乙醇(2mM)。
該測試系統包括來自菌株B-6969(pEL-carAB-NN)和TG1(pUC18-argI)的蛋白提取物和以下試劑ATP(8mM)，硫酸鎂(8mM)，硫酸銨(200mM)，碳酸鈉(8mM)以及鳥氨酸(1mM)，pH7.5。使用具有以下配方的液相，通過TLC分析反應混合物中鳥氨酸和瓜氨酸的含量。異丙醇/乙酸乙酯/氫氧化銨/水＝40/20/13/27(v/v)。
將表達活性的並且對UMP有抗反饋作用的突變型CPSase的9個克隆和表達具有單一的Ser948Phe取代的突變型CPSase的一個克隆用於測定突變型酶的活性。
純化來自上述10個克隆的質粒，並通過雙脫氧鏈終止法測定carB基因的隨機片段的序列(表1)。
然後將來自上述9個克隆B-6969(pEL-carAB-NN)和一個克隆B-6969(pEL-carAB-6)的蛋白提取物，用於在由穀氨醯胺或氨合成氨甲醯磷酸(CP)的反應中評估突變型CPSase的活性和fbr。
來自細胞的粗製細胞提取物是通過以下方法製備的對懸浮在0.5毫升緩衝液A(200mM磷酸氫鉀/磷酸二氫鉀，pH8.0，1mM EDTA，1mMPMSF，1mM DTT)的20毫克溼的細胞沉澱進行超聲波處理，然後，用固體硫酸銨進行處理，達到65％的飽和度。在4℃下培養10分鐘之後，以13000rpm的速度將懸浮液離心10分鐘，然後將沉澱溶解在1毫升緩衝液B(20mM磷酸氫鉀/磷酸二氫鉀，pH8.0，50mM氯化鉀，1mM PMSF，1mM DTT)中。用所獲得的蛋白提取物的等分樣品評估CPSase活性。反應公式如下I.穀氨醯胺+CO2+2MgATP+H2O→NH2COOPO32-+2 MgADP+穀氨酸+PiII.NH3+CO2+2MgATP+H2O→NH2COOPO32-+2 MgADP+Pi50微升每一種反應混合物包括反應I--20mM Tris-HCl，pH8.0，100mM氯化鉀，5mM碳酸鈉，10mM ATP，10mM氯化鎂，5mM穀氨醯胺，10微升蛋白提取物；反應II--20mM Tris-HCl，pH8.0，100mM氯化鉀，5mM碳酸鈉，10mM ATP，10mM氯化鎂，200mM硫酸銨，10微升蛋白提取物。
另外，在有10mM UTP的情況下，進行一系列的反應I，以便評估CPSase的反饋抑制水平。
在37℃下溫育10分鐘之後，通過添加等體積的乙醇終止反應，在-20℃下冷卻10分鐘，並且在室溫下以13000rpm的速度離心1分鐘。在-20℃下冷卻上清液。
通過毛細管區帶電泳分析反應混合物中CP的含量。分離是在Quanta 4000E毛細管電泳系統(「Waters」，USA)上進行的，在254納米下用UV間接檢測。通過靜水壓力實施注射25秒。所述分離是用未包衣的熔凝矽石毛細管進行的(75u內徑，*60釐米，有效長度為53釐米)，並且在-25kV電壓下工作。將溫度保持在20℃。分離緩衝液由50mM Tris-鹼，25mM苯甲酸(用於間接檢測)，pH8.5，0.25mM TTAB(四乙醯-三甲基-溴化銨)(用於恢復電滲流)組成。
在表2中，示出了在CP合成反應中測定的突變型CPSase的活性和fbr的數據。
表2.突變型CPSase的活性


因此，突變型CPSase對UMP基本上是不敏感的，但是，所述單一突變能顯著降低酶的活性。這些結果表明，947-951號胺基酸殘基的肽片段決定UMP的反饋抑制作用，並且決定突變型CPSase的催化效率。
將編碼wt CarAB和突變型CarAB-34的基因克隆到質粒pMW119上。為此，用限制酶SacI和XbaI消化質粒pEL-carAB-wt和pEL-carAB-34(因為所述質粒具有兩個XbaI位點，要進行部分消化)，並且將編碼carAB基因的片段克隆到事先用相同限制酶消化過的pMW119載體上。結果，構建了具有受lac啟動子控制的carAB基因的低拷貝數質粒pMW119-carAB-wt和pMW119-carAB-34。
實施例3.用具有突變型carAB基因的菌株生產乳清酸作為抗6-氮尿嘧啶(1毫克/毫升)的突變型菌株，菌株311來源於具有插入argA基因的Tn10的大腸桿菌K12(VKPM B-3853)。菌株311業已在2001年3月5日保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM)，保藏號為VKPM B-8085，並且，按照布達佩斯條約的規定於2002年7月17日將原始保藏轉成了國際保藏。
用質粒pMW-carAB-wt和pMW-carAB-34轉化菌株311，並且在有不同濃度的尿苷的條件下檢測所得到的菌株的乳清酸產量。
試管發酵的培養條件如下1/20稀釋過的過夜培養物，60克/升葡萄糖，25克/升硫酸銨，2克/升磷酸二氫鉀，1克/升硫酸鎂，0.1毫克/升硫胺素，5克/升酵母提取物Difco，25克/升白堊，1升自來水(pH7.2)。葡萄糖和白堊是分別消毒的。將2毫升培養基放入試管中，並在32℃下搖動培養3天。通過HPLC評估乳清酸產量(表3)。
表3.菌株311(pMW119)、311(pMW-carAB-wt)、311(pMW-carAB-34)的乳清酸產量水平


如表3所示，具有突變型carAB基因的菌株311(pMW-carAB-34)能比具有野生型carAB基因的親本菌株311(pMW119)和菌株311(pMW-carAB-wt)產生更多的乳清酸。
實施例4.利用具有突變型carAB基因的菌株生產精氨酸和/或瓜氨酸作為抗6-氮尿嘧啶(1毫克/毫升)的突變體，業已從在基因ilvA上插入了轉座子Tn5的菌株大腸桿菌57(VKPM B-7386)的衍生物中篩選到了精氨酸生產菌株333和374。菌株333和374業已在2001年3月5日保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM)，保藏號分別為VKPM B-8084和VKPM B-8086，隨後按照布達佩斯條約的規定於2002年7月將原始保藏轉成了國際保藏。
用質粒pMW-carAB-wt和pMW-carAB-34轉化菌株333和374，並檢測這些重組菌株的精氨酸和瓜氨酸產量。
試管發酵是按照與例3相同的方法進行的。
在含有100毫克/升尿苷的合成培養基中，菌株333(pMW-carAB-wt)和333(pMW-carAB-34)的精氨酸和/或瓜氨酸產量水平如表4所示。
表4.菌株333(pMW-carAB-wt)和333(pMW-carAB-34)的精氨酸和/或瓜氨酸產量水平


在含有100毫克/升尿苷的合成培養基中，菌株374(pMW-carAB-wt)和374(pMW-carAB-34)的瓜氨酸產量水平如表5所示。
表5.菌株374(pMW-carAB-wt)和374(pMW-carAB-34)的瓜氨酸產量水平


如表4所示，具有突變型carAB基因的菌株333(pMW-carAB-34)比具有野生型carAB基因的菌株能產生更多的精氨酸和瓜氨酸。如表5所示，菌株374(pMW-carAB-34)能比具有野生型carAB基因的菌株產生更多的瓜氨酸。
110味之素株式會社120新突變型氨甲醯磷酸合成酶以及生產由氨甲醯磷酸衍生的化合物的方法130OP1367140
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223人工序列描述引物40030ctttccgtgc gcgaa 152103121115212DNA213人工序列
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223人工序列描述引物40031cttttcgtgc gcgaa 15210322111149212DNA213大腸桿菌(Escherichia coli)40032ttgattaagt cagcgctatt ggttctggaa gacggaaccc agtttcacgg tcgggccata 60ggggcaacag gttcggcggt tggggaagtc gttttcaata cttcaatgac cggttatcaa 120gaaatcctca ctgatccttc ctattctcgt caaatcgtta ctcttactta tccccatatt 180ggcaatgtcg gcaccaatga cgccgatgaa gaatcttctc aggtacatgc acaaggtctg 240gtgattcgcg acctgccgct gattgccagc aacttccgta ataccgaaga cctctcttct 300tacctgaaac gccataacat cgtggcgatt gccgatatcg atacccgtaa gctgacgcgt 360ttactgcgcg agaaaggcgc acagaatggc tgcattatcg cgggcgataa cccggatgcg 420gcgctggcgt tagaaaaagc ccgcgcgttc ccaggtctga atggcatgga tctggcaaaa 480gaagtgacca ccgcagaagc ctatagctgg acacaaggga gctggacgtt gaccggtggc 540ctgccagaag cgaaaaaaga agacgagctg ccgttccacg tcgtggctta tgattttggt 600gccaagcgca acatcctgcg gatgctggtg gatagaggct gtcgcctgac catcgttccg 660gcgcaaactt ctgcggaaga tgtgctgaaa atgaatccag acggcatctt cctctccaac 720ggtcctggcg acccggcccc gtgcgattac gccattaccg ccatccagaa attcctcgaa 780accgatattc cggtattcgg catctgtctc ggtcatcagc tgctggcgct ggcgagcggt 840gcgaagactg tcaaaatgaa atttggtcac cacggcggca accatccggt taaagatgtg 900gagaaaaacg tggtaatgat caccgcccag aaccacggtt ttgcggtgga cgaagcaaca 960ttacctgcaa acctgcgtgt cacgcataaa tccctgttcg acggtacgtt acagggcatt 1020catcgcaccg ataaaccggc attcagcttc caggggcacc ctgaagccag ccctggtcca 1080cacgacgccg cgccgttgtt cgaccacttt atcgagttaa ttgagcagta ccgtaaaacc 1140gctaagtaa 114921033211382212PRT213大腸桿菌(Escherichia coli)40033Leu Ile Lys Ser Ala Leu Leu Val Leu Glu Asp Gly Thr Gln Phe His
1 5 10 15Gly Arg Ala Ile Gly Ala Thr Gly Ser Ala Val Gly Glu Val Val Phe20 25 30Asn Thr Ser Met Thr Gly Tyr Gln Glu Ile Leu Thr Asp Pro Ser Tyr35 40 45Ser Arg Gln Ile Val Thr Leu Thr Tyr Pro His Ile Gly Asn Val Gly50 55 60Thr Asn Asp Ala Asp Glu Glu Ser Ser Gln Val His Ala Gln Gly Leu65 70 75 80Val Ile Arg Asp Leu Pro Leu Ile Ala Ser Asn Phe Arg Asn Thr Glu85 90 95Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Lys Arg His Asn Ile Val Ala Ile Ala Asp100 105 110Ile Asp Thr Arg Lys Leu Thr Arg Leu Leu Arg Glu Lys Gly Ala Gln115 120 125Asn Gly Cys Ile Ile Ala Gly Asp Asn Pro Asp Ala Ala Leu Ala Leu130 135 140Glu Lys Ala Arg Ala Phe Pro Gly Leu Asn Gly Met Asp Leu Ala Lys145 150 155 160Glu Val Thr Thr Ala Glu Ala Tyr Ser Trp Thr Gln Gly Ser Trp Thr165 170 175Leu Thr Gly Gly Leu Pro Glu Ala Lys Lys Glu Asp Glu Leu Pro Phe180 185 190His Val Val Ala Tyr Asp Phe Gly Ala Lys Arg Asn Ile Leu Arg Met195 200 205Leu Val Asp Arg Gly Cys Arg Leu Thr Ile Val Pro Ala Gln Thr Ser210 215 220Ala Glu Asp Val Leu Lys Met Asn Pro Asp Gly Ile Phe Leu Ser Asn225 230 235 240Gly Pro Gly Asp Pro Ala Pro Cys Asp Tyr Ala Ile Thr Ala Ile Gln245 250 255Lys Phe Leu Glu Thr Asp Ile Pro Val Phe Gly Ile Cys Leu Gly His260 265 270Gln Leu Leu Ala Leu Ala Ser Gly Ala Lys Thr Val Lys Met Lys Phe275 280 285Gly His His Gly Gly Asn His Pro Val Lys Asp Val Glu Lys Asn Val290 295 300Val Met Ile Tbr Ala Gln Asn His Gly Phe Ala Val Asp Glu Ala Thr305 310 315 320Leu Pro Ala Asn Leu Arg Val Thr His Lys Ser Leu Phe Asp Gly Thr325 330 335
Leu Gln Gly Ile His Arg Thr Asp Lys Pro Ala Phe Ser Phe Gln Gly340 345 350His Pro Glu Ala Ser Pro Gly Pro His Asp Ala Ala Pro Leu Phe Asp355 360 365His Phe Ile Glu Leu Ile Glu Gln Tyr Arg Lys Thr Ala Lys370 375 380
權利要求
1.氨甲醯磷酸合成酶的大亞基，其中，SEQ ID NO20的947-951位的胺基酸序列被SEQ ID NO1-9中的任意一種胺基酸序列所取代，並且，尿苷5』-一磷酸的反饋抑制被脫敏。
2.權利要求
1的氨甲醯磷酸合成酶的大亞基，其中，所述的氨甲醯磷酸合成酶是來自大腸桿菌的野生型氨甲醯磷酸合成酶。
3.一種氨甲醯磷酸合成酶的大亞基，其由SEQ ID NO20中的947-951號位置的胺基酸序列被SEQ ID NO1-9中任意一種胺基酸序列所取代後所得的胺基酸序列組成，並且，尿苷5』-一磷酸的反饋抑制被脫敏。
4.權利要求
1的氨甲醯磷酸合成酶的大亞基，它包括在除了947-951號位置以外的位置上的一個或幾個胺基酸的缺失、取代、插入或添加，其中，尿苷5』-一磷酸的反饋抑制被脫敏。
5.一種氨甲醯磷酸合成酶，它包含權利要求
1-4中任意一項的氨甲醯磷酸合成酶的大亞基。
6.一種編碼權利要求
1-4中任一項的氨甲醯磷酸合成酶大亞基的DNA，其中，尿苷5』-一磷酸的反饋抑制被脫敏。
7.一種編碼權利要求
1-4中任一項的尿苷5』-一磷酸反饋抑制被脫敏的氨甲醯磷酸合成酶大亞基和大腸桿菌氨甲醯磷酸合成酶小亞基的DNA，其中，所述的小亞基是由SEQ ID NO33所示的胺基酸序列組成的蛋白。
8.一種屬於埃希氏菌屬的細菌，它具有權利要求
6或7的DNA。
9.權利要求
8的細菌，它具有生產選自L-精氨酸、瓜氨酸和嘧啶衍生物的化合物的能力。
10.權利要求
9的細菌，其中，所述嘧啶衍生物是乳清酸、尿苷、尿苷5』-一磷酸、胞苷和胞苷5』-一磷酸。
11.一種生產選自L-精氨酸、瓜氨酸和嘧啶衍生物的化合物的方法，該方法包括以下步驟在培養基中培養權利要求
8-10中任意一項的細菌，以便在該培養基中產生並積累所述化合物，以及從所述培養基中收集所述化合物。
12.權利要求
11的方法，其中，所述嘧啶衍生物是乳清酸、尿苷、尿苷5』-一磷酸、胞苷和胞苷5』-一磷酸。
專利摘要
利用具有突變型氨甲醯磷酸合成酶的屬於埃希氏菌屬的細菌生產了L-精氨酸、瓜氨酸和包括乳清酸、尿苷、尿苷5』-一磷酸(UMP)、胞苷和胞苷5』-一磷酸(CMP)在內的嘧啶衍生物，其中，相當於野生型氨甲醯磷酸合成酶上947-951號位置的胺基酸序列被SEQ ID NO1-9中任意一種胺基酸序列所取代，並且該細菌中尿苷5』-一磷酸的反饋抑制作用被脫敏。
文檔編號C12N9/00GKCN1316015SQ02127623
公開日2007年5月16日 申請日期2002年8月5日
發明者L·R·普蒂特斯恩, S·V·斯米爾諾夫, I·B·奧爾特曼, A·E·諾維科瓦, V·A·科利亞羅瓦, M·M·古斯亞廷爾, Y·G·羅斯託瓦, T·A·亞珀斯卡亞 申請人:味之素株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非專利引用 (1),