單克隆免疫球蛋白製劑滅菌方法

2023-08-06 11:49:01 2

專利名稱：單克隆免疫球蛋白製劑滅菌方法
技術領域：
本發明涉及對單克隆免疫球蛋白的製備進行滅菌以減少其中的活性生物汙染物，如病毒、細菌、酵母菌、黴菌、支原菌、蛋白病毒和/或寄生蟲含量的方法。
背景技術：
抗體是由有機體暴露於機體認為是威脅的外部物質而相應於產生的。抗體，或如眾所周知的免疫球蛋白(Ig)是免疫系統的細胞所含有的蛋白質，我們將該細胞稱為B細胞或漿細胞。免疫球蛋白的結構複雜而具有明顯特徵。簡單而言，各個免疫球蛋白由一蛋白質鏈化合物組成，我們將其稱為重鏈與輕鏈。通過額外的二硫鍵使各個重鏈與一單輕鏈連接。並通過額外的二硫鍵依次使所產生的化合物與一同樣重-輕鏈化合物連接。可通過改變重鏈的結構與數量由該細胞將此基本單元組合成若干個專門形式。不同的重鏈結構產生不同的分子，我們將其稱為免疫球蛋白的「類別」。這些類別還可具有不同數量的上述基本單元。
該免疫球蛋白分子的這些各種物理形式的產生是順序發生的。在這一過程中，一單個分子或抗原的分子特異性保持不變。這是因為上述變化均是在該免疫球蛋白分子中的未牽涉到確定該特定免疫球蛋白分子的特異性的那部分發生的。這在B細胞成熟過程中，這種「超變量區域」面臨著異常高度的重組作用。在由該細胞產生該第一免疫球蛋白分子之前，這些重組作用停止。結果，由一相應少量的變量區域基因，該機體產生了大量具有不同特異性的潛在免疫球蛋白分子。
一旦一B細胞與一與其自身的免疫球蛋白分子鍵聯的分子相遇，且在從免疫系統內的其它細胞接受信號的時候，該B細胞首先增殖為大量同樣細胞，(我們將其稱為克隆)，且然後區分成為一免疫球蛋白含有的漿細胞。這樣，將可能被製造的極大量的潛在免疫球蛋白分子限制為識別該機體所必須響應的抗原。
所產生的免疫球蛋白特異性的廣泛數組造成了對機體所正進行的保護，以使機體免受過去製造免疫球蛋白以做抵抗的那些有機體的感染。總體而言，結果為來自一單供體的原生質內所包含的該免疫球蛋白可具有上百萬個有用的免疫球蛋白特異性。既然其包括由該機體內所有漿細胞所製造的免疫球蛋白分子，因此，我們將從原生質製備免疫球蛋白稱為一多克隆免疫球蛋白製劑。
多克隆免疫球蛋白對於治療使製造Ig的能力缺乏或受損的人類疾病尤其有用。既然所有的漿細胞克隆均受到影響，則需要該原生質中所發現的所有免疫球蛋白特異性的混合物以更正該不足。相對而言，當要求特異性的一極端程度時，或當探索一單個限定治療學目標時，多克隆免疫球蛋白並非最佳解決方案。相反，由一單克隆所產生的具有所需特異性的該免疫球蛋白分子所組成的一免疫球蛋白製劑是最精確與最可預測的解決方案。我們將該種製備稱為一單克隆免疫球蛋白。
與多克隆免疫球蛋白相比，單克隆免疫球蛋白具有許多不同之處。它們的單個特異性使其在作為檢測試劑時非常精確。作為治療方法，它們沒有從多克隆免疫球蛋白所產生的混合或危險的副作用，如將具有有害特異性的免疫球蛋白的的導入引入病人。它們的物理特性也會有所不同。既然各個單克隆免疫球蛋白具有一獨特與不變的結構，它的穩定潛力、退化、聚合、溫度敏感性與其它特性也時獨特與不變的。一旦選擇生產一種合適的單克隆免疫球蛋白，其特性將不會改變，且因此能連續生產，並確保其性能與存儲特性。能夠按照製品要求制定產量的能力也使單克隆免疫球蛋白成為多克隆免疫球蛋白一高度合適的替代品。
單克隆免疫球蛋白製劑通常有三種方式。第一種方式涉及一細胞培養系統內，該第二種方式使用了一動物作為單克隆免疫球蛋白的一暫時生物反應器，且該第三種方式涉及將一所需單克隆單克隆免疫球蛋白的基因插入一動物，從而導致該單克隆免疫球蛋白在該動物的流質或組織內持續生產中，使得其能不斷產生(轉基因生產)。
這些方法各會導致病原體將製品汙染。在該第一種方法中，產生該單克隆免疫球蛋白的細胞會庇護在培養系統中可能會產生而未檢測出的病毒。細菌、酵母菌或黴菌對該培養系統的汙染也會發生。
餘下的兩種方法均涉及對一動物的使用，或使該動物作為該單克隆免疫球蛋白製造細胞的宿主，或使其作為一生物反應器以製造該單克隆免疫球蛋白自身。顯然，這些製品面臨著被宿主動物所感染或庇護的病原體汙染的危險。該種病原體包括病毒、細菌、酵母菌、黴菌、支原菌和寄生蟲，等等。
因此，在使用單克隆免疫球蛋白製品之前將製品中含有的所有生物活性汙染物進行去活化處理至關重要，特別是當製品在輸血、器官移植和其他形式的人體治療中直接施行於人體時尤其如此，並且對於在含有各種類型的原生質的介質中製備的，並可能含有支原菌或其他病毒汙染物的各種單克隆免疫球蛋白製品來說，去活化處理也尤其重要。
過去，人們採取的最多的方法是從製品中篩選或檢測出某種特定的汙染物，而不是將製品中的汙染物去除或去活化。汙染物檢測呈陽性的製品不再被使用。例如，篩選步驟可包括從捐血者的血液中檢測某種特定的病毒。然而，這些步驟並不總是可靠，因為其無法檢測出數量很小的病毒。由於可導致虛假的陽性結果，檢測的價值或可靠性打了折扣。虛假陽性結果在某些情況下可危及生命，比如可能導致感染獲得性免疫缺損綜合症(愛滋病)。此外，在某些情況下，需要幾周，甚至幾個月來判斷製品中是否含有汙染物。
在進行實驗以確定破壞病毒活性的技術能力的過程中，很少利用具有意義的實際病毒。這是由於考慮到進行測試的工作者的安全，以及與設備汙染與廢料處理所相關的困難與費用。在此處，使用了同族與同級別的模型病毒。
一般而言，我們承認其活性最難破壞的病毒為那些具有外殼的病毒，該外殼由蛋白質等組成，且其活性最難破壞的病毒為尺寸最小的病毒。γ輻射與大多數其他形式的輻射以顯示這為事實，因為這些病毒小尺寸是它們小基因的產物。輻射對一分子的大量直接影響與分子的尺寸成正比，意思為，目標分子越大，其影響越大。由此推斷，γ輻射已經顯示濾過性毒菌基因越小，將其活性破壞所要求的輻射越高。
與人類與動物衍生的生物學有關的病毒中，相關的最小病毒屬於細小病毒一族與尺寸略大的有蛋白質外殼的肝炎病毒。在人類中，該細小病毒B19，與肝炎A為主要關注對象。在豬衍生產品與組織中，最小的相應病毒為豬細小病毒。既然這種病毒對人類無害，通常將其選擇作為該人類B19細小病毒與肝炎A的模型病毒。我們將對這個模型細小病毒的火星的破壞示範視為能充分證明所使用的方法能夠殺滅人類B19病毒與肝炎A，且擴展而言，其也將能夠殺滅更大與不那麼堅硬的病毒，如人體免疫缺損病毒(HIV)、細胞肥大病毒(CMV)、肝炎B與C等等。
較新的方法旨在去除或去活化製品中的汙染物。這些方法包括熱處理，過濾和向製品中添加化學去活化劑或敏化劑。熱處理要求將製品加熱到約60℃，並保持70小時，但這可能會對敏感製品造成破壞。熱去活化可破壞製品中50％或以上的生物活動。過濾是指對製品進行過濾，用物理方法去除汙染物。遺憾的是，這種方法會將分子重量較大的製品一併去除，並且，在某些情況下，由於製品的分子結構較大，較小的病毒無法通過過濾方法去除。化學敏化步驟是指在制品中添加有毒試劑，使其與病毒的DNA(DNA)/RNA(RNA)結合，並通過紫外線(UV)或輻射進行活化，產生活性中間體和/或自由基，其鍵聯至DNA/RNA或突破病毒DNA/RNA主鏈中的化學鍵，或者將其交鍵或結合，使病毒無法複製。由于敏化劑有毒，甚至可誘變或致癌，不能直接施行於人體，因此該步驟要求將未結合的敏化劑從製品中洗出。
另一種對製品進行滅菌的方法是用γ射線進行照射。在進行大劑量照射時，γ輻射可有效地破壞病毒和細菌。(參看基斯利，Keasly等，《照射之後生命是否存在？》「Is There Life After Irradiation？第二部分，《生物製藥》(BioPharm)1993年7-8月，和萊特曼，Leitman，《血液細胞照射在防止輸血後的移植體抗宿主疾病中的應用》「Use ofBlood Cell Irradiation in the Prevention of Post TransfusionGraft-vs-Host Disease」，《輸血科學》(Transfusion Science)10219-239(1989))。然而，本領域公開發表的論文同時揭示，γ輻射可破壞輻射敏感製品，如血液。特別是大劑量的輻射會對紅細胞、血小板和粒細胞(granulocyte)造成傷害(萊特曼)。美國第4,620,908號專利案提出，蛋白質製品必須在照射之前進行冷凍，以維持蛋白質製品的生存力(viability)。該專利指出，「如果在環境溫度下對蛋白質材料進行γ照射，材料將被完全破壞，即材料的活性將變得極低，實質上不再有效。」這對於當然也是蛋白質的單克隆免疫球蛋白同樣實用。然而，如果為了照射目的將生物製品進行冷凍，然後在施行於人體前將其融化，那麼許多敏感生物製品，比如血液，將失去生存力和活性。
由於存在上述困難，我們仍需要尋找對單克隆免疫球蛋白進行滅菌的方法，其既能降低活性生物汙染物的含量，又不會對單克隆免疫球蛋白造成反作用。
發明說明因此，本發明的目標是提出既能降低活性生物汙染物含量，又能避免對單克隆免疫球蛋白造成反作用的單克隆免疫球蛋白製劑的滅菌方法。本發明的其他目標、特徵和優點將在下文的優選實施例部分進行詳細闡述，通過本說明書的說明和對本發明的實踐，本發明的目標、特徵和優點將更加明顯。本發明的這些目標和優點可經由說明書和權利要求書中所特別指明的組成形式和方法實現和獲得。
依照這些和其他目標，本發明的第一實施例是一種用於將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白製劑滅菌的方法，其包括(i)將單克隆免疫球蛋白製劑的溶劑殘留量減低到足以有效保護生物材料抵禦電離輻射的水平；和(ii)按有效比率用射線對單克隆免疫球蛋白製劑照射一段有效時間，使其得到滅菌。
本發明的第二實施例是一種用於將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白製劑滅菌的方法，其包括(i)向生物材料中添加至少一種穩定劑，其劑量應足以有效保護單克隆免疫球蛋白製劑抵禦輻射；和(ii)按有效比率用射線對單克隆免疫球蛋白製劑照射一段有效時間，使其得到滅菌。
本發明的第三實施例是一種用於將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白製劑滅菌的方法，其包括(i)將單克隆免疫球蛋白製劑的溶劑殘留量減低到足以有效保護單克隆免疫球蛋白製劑抵禦輻射的水平；(ii)向生物材料中添加至少一種穩定劑，其劑量應足以有效保護單克隆免疫球蛋白製劑抵禦輻射；和(iii)按有效比率用射線對單克隆免疫球蛋白製劑照射一段有效時間，使其得到滅菌。在本實施例中，步驟(i)和(ii)可互相顛倒。
本發明還提供了一種組合物，其包括至少一個單克隆免疫球蛋白與一至少一個穩定劑，該穩定劑是從由下列物質組成的群中選出的抗壞血酸或其鹽或酯；穀胱甘肽；6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸；尿酸或其鹽或酯；甲硫氨酸；組氨酸；N-乙醯基半胱氨酸；二肽(dipetide)甘氨酸-甘氨酸；地奧司明；水飛薊素；一抗壞血酸或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物；一抗壞血酸或其鹽或酯、尿酸或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物；以及一尿酸或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物，該至少一種穩定劑的劑量能有效保持該單克隆免疫球蛋白在用輻射與此組合物滅菌後能繼續使用。


圖1和2顯示某些穩定劑對暴露於45kGy低劑量γ照射的凍幹的抗胰島素單克隆免疫球蛋白的保護效果。
圖3A-3C顯示某些穩定劑對暴露於45kGy低劑量γ照射的凍幹的抗胰島素單克隆免疫球蛋白的保護效果。
圖45顯示首次凍幹(primary lyophilizing)和二次凍幹(secondary lyophilizing)對單克隆免疫球蛋白敏感性的保護效果。
圖6-11顯示某些穩定劑對凍幹的抗胰島素單克隆免疫球蛋白的活性的保護效果。
圖12顯示當以高比率(30kGy/小時)照射試樣時，穩定劑對凍幹的抗胰島素單克隆免疫球蛋白的活性的保護效果。
圖13顯示穩定劑對接受γ射線照射後的免疫球蛋白M(igM)的活性的效果。
圖14與15顯示穩定劑對於接受γ輻射照射後的固定抗胰島素單克隆免疫球蛋白的效果。
圖16A、16B、17A與17B顯示抗壞血酸鹽在變化的濃度中對接受γ輻射照射後的固定抗胰島素單克隆免疫球蛋白的效果。
圖18A-18H顯示了穩定劑對接受γ輻射照射後由人類血清白蛋白或蔗糖所補充的凍幹的抗胰島素單克隆免疫球蛋白的效果。
圖19A-19F顯示穩定劑對接受γ射線照射後的牛血清白蛋白所補充的凍幹的抗胰島素單克隆免疫球蛋白的效果。
圖20A與20B在具有或不具有抗壞血酸鹽的情況下，各種劑量的γ輻射對抗胰島素單克隆免疫球蛋白的效果。
圖21A與21B顯示低pH(4.5)值對於L-抗壞血酸對暴露於45kGyγ照射單克隆免疫球蛋白的效果的效果。
圖22顯示由對受豬細小病毒(PPV)汙染的單克隆免疫球蛋白進行γ輻射照射而將濾過性毒菌活性破壞的程度。
圖23A與23B顯示當使液體或凍幹形式單克隆免疫球蛋白受e-電波輻射的照射時，抗壞血酸鈉鹽的存在與否對於對於所達到的活性保持力程度的效果。
具體實施例方式
定義除非另外定義，否則本說明書中使用的所有技術和科學術語均與所屬技術領域的技術人員通常理解的含義相同。本說明中提及的所有的專利案和出版物均以引用方式明確併入本文中。
除非上下文另有明確說明，本說明書中所使用的單數形式「一個、」「一個、」與「該」包括單數參照意。
本說明書中所使用的術語「免疫球蛋白」與術語「抗體」同義，且包括所有類別的免疫球蛋白，其包括，而不限制於以下幾種IgG、IgM、IgA、IgD、IgE以及免疫球蛋白的所有亞類，如由包括人類的動物細胞中所找到或產生的IgG亞類IgG1、IgG2、IgG2、與IgG4。術語「免疫球蛋白」包括膜免疫球蛋白與分泌免疫球蛋白。膜免疫球蛋白是B細胞的橫跨膜蛋白質，且作用為B細胞的抗體受體。除了缺乏在膜免疫球蛋白的C-終點的該胺基酸的橫跨膜區域，分泌免疫球蛋白結構上與其膜配對物相同。分泌免疫球蛋白存在於細胞外的流質與分泌物中。
術語「免疫球蛋白」還包括免疫球蛋白片段，其包括，而不限制於以下幾種片段F(ab』)2、Fab』、Fab、Fc、Facb、pFc』、與Fd，以及該技術中所知的免疫球蛋白衍生物與代謝物。免疫球蛋白的代謝物是一活性有機體所進行的免疫球蛋白代謝所產生的。該技術範圍內已知有多種方法製備免疫球蛋白的各種衍生物，其通常涉及打破該免疫球蛋白中的肽或二硫鍵。也可眼生該免疫球蛋白，以包括變型或人造或非自然胺基酸。免疫球蛋白的衍生物還包括與一半族成對，該半族可如一毒素(例如，白喉毒素、篦麻毒素)、一標籤分子(例如二氫螢光素、德克薩斯紅)、一治療或診斷用放射性原子或分子(例如125I)、一酶(例如抗生物素蛋白、山葵過氧化物酶、鹼性磷酸酯酶)等等。免疫球蛋白可包括後平移變型，例如，磷酸化、glyocsylation、十四醯化、含異戊間二烯基化、ADP-核糖基化、甲基化、乙醯化、羥基化、羧化、與氧化變型，或可陽離子化或陰離子化以改變該免疫球蛋白的整個電荷。
本說明書中所使用的術語「單克隆免疫球蛋白」指一單克隆所產生的同類免疫球蛋白，其與多克隆免疫球蛋白相比照。單克隆免疫球蛋白通常由使用聚乙烯乙二醇(PEG)將具有免疫性的老鼠或耗子的脾細胞與一非分泌器骨髓瘤熔合而製備的雜種細胞製造而成。將該熔合混合物平攤在HAT媒介上，其包括次黃嘌呤、氨喋呤與胸苷。則氨喋呤會將代謝途徑堵塞，但如果存在次黃嘌呤與胸苷，能將該堵塞旁路。該骨髓瘤細胞缺乏這種旁路，且因而在HAT媒介中死亡。在培養一或兩星期後，脾細胞自然死亡，但熔合的細胞生存下來，因為它們具有骨髓瘤的不死性與脾細胞的代謝旁路。一些熔合的細胞分泌抗體，且以一特定化驗方法檢測該上清液。隨後克隆生所需抗體的井。還可通過熟悉基因工程技術者所熟悉的各種技術生產單克隆免疫球蛋白，其導致了一單個套為單個免疫球蛋白代碼的內在基因的誘導或結構性表達，或其牽涉將一套基因的一套或一部分加入一細胞或有機體，從而導致一單個套為單個免疫球蛋白代碼的內在基因的誘導或結構性表達。
可使用上述技術結合微晶細胞培養在生物細胞培養(例如一腹水培養)中或通過轉基因技術生產單克隆免疫球蛋白。轉基因技術包括將一個或多個基因插入一受體有機體中。隨後該受體有機體連續或根據引導生產這些基因的蛋白質製品，並將其合併或分泌進入一組織(包括蛋)或流質(包括血液、汗液、奶液、或尿液)。隨後收穫所導致的組織或流質，並由其淨化出所需的單克隆免疫球蛋白。
本說明書中所使用的術語「單克隆免疫球蛋白的製備」包括而不限制於以下幾種(1)單獨由單克隆免疫球蛋白(如一單個特異性或結合具有不同特異性和/或不同類的單克隆免疫球蛋白)所組成的組合物，且其會包含雜質(包括通過轉基因方法由單克隆球蛋白所生產的一組織或流質自然產生的部分)；(2)組合物，其包括單克隆免疫球蛋白、藥物可接受稀釋液、載體、助理液、脂質體與其他治療性試劑，等等，如此技術所了解；(3)部分淨化的進程中單克隆免疫球蛋白中間體製備；以及(4)包含單克隆免疫球蛋白或其上固定由或排列有單克隆免疫球蛋白的物質。以下將說明優選的「單克隆免疫球蛋白的製備」。
在治療學應用中，單克隆免疫球蛋白一般與緩衝或鹽溶液結合。該單克隆免疫球蛋白還可與另一治療學試劑結合。例如，評估防止血小板聚合的抗血小板單克隆免疫球蛋白可用於長期治療，以防止血栓症的形成。在此應用中，該抗血小板單克隆免疫球蛋白與阿司匹林同時使用。該單克隆免疫球蛋白與其他治療學試劑可同時包裝，以通過(例如)靜脈注射而使用。這也可以直接包含在一單個容器中的形式進行。包裝的一更先進形式的實例為在脂質體中使用單克隆免疫球蛋白。一般而言，通過鍵聯至所需細胞或組織的結構上或內從而將該免疫球蛋白嵌入該作為目標試劑的脂質體的至少外層中。隨後脂質體中所含藥物這個特定場所釋放，提供了更濃的藥物治療法，其比一般系統性治療法具有更大的治療指數。
對於治療用途而言，一般以在氮或真空下密封的液體、凍結、或(凍結-乾燥)凍幹形式提供該單克隆免疫球蛋白。隨後，通常將該單克隆免疫球蛋白與滅菌水重組(若需要，或按需要解凍)，並經過一適當途徑，施行，如通過直接或在放置於一靜脈(IV)包內後進行肌肉注射或靜脈注射。根據本發明，可使單克隆免疫球蛋白的製備在任何階段接受照射，包括但不限制於一原材料、一淨化的或部分淨化的進行中中間體，大量或單獨或多重劑量密封，在密封前或密封后，在稀釋以進行施行，或在該IV包或其它運輸工具其自身內。該照射可在任何便利溫度下進行，該溫度需不對製備過程產生有害效果，且會在製備的凍結或共晶點以上或以下。有多種單克隆免疫球蛋白的製備方法可用於治療用途，如表1所列


上表來源《酶聯免疫吸附測定實際指南》，D.M.卡梅尼(Kemeny)，帕加馬出版社(Pergamon Press)*FD-凍結-乾燥(凍幹)，L-液體，I-固定於一表面，C-包含乾燥材料的膠囊(口服給藥)單克隆免疫球蛋白的製備還可找到作為研究工具的應用方法，其中大量用於診斷目的，尤其在血液工作中。涉及單克隆免疫球蛋白的一般的研究工具與診斷測試包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)、磁珠基礎測定與分離套件、以及螢光激活細胞分析和/或分類，等等。在由實驗室技術人員使用時，為了維護與安全，需要將該種診斷工具滅菌。用於診斷目的的單克隆免疫球蛋白的製備通常包括一固體支撐，如一量杆或塑料盤，其上或其內通過共價化學反應、乾燥或其它已知方法固定有該單克隆免疫球蛋白。根據本發明，一完全商業包裝或套件、包括其上安裝有該單克隆免疫球蛋白的該固體支撐、說明書、試劑容器(例如一用於產生一標準曲線的參照樣本)，等等，可根據本發明將該商業包裝或套件滅菌。表2提出了許多商業診斷單克隆免疫球蛋白製品。


上表來源《酶聯免疫吸附測定實際指南》，D.M.卡梅尼(Kemeny)，帕加馬出版社(Pergamon Press)*FD-凍結-乾燥(凍幹)，L-液體，I-固定於一表面，C-包含乾燥材料的膠囊(口服給藥)本說明書中所使用的術語「滅菌」指根據本發明使在所處理單克隆免疫球蛋白製劑中所發現的至少一種活性生物汙染物含量降低。
本說明書中所使用的術語「生物汙染物」指當與單克隆免疫球蛋白製劑直接或間接接觸時可對單克隆免疫球蛋白製劑或其受體產生有害作用的汙染物。這些生物汙染物包括所屬技術領域的技術人員已知的各種病毒、細菌和寄生蟲，通常存在於或感染全血(whole blood)或血液成分等單克隆免疫球蛋白製劑。生物汙染物包括，但不僅限於以下幾種病毒，比如人類免疫缺陷病毒和其他逆轉錄病毒(retrovirus)、皰疹病毒、細小病毒(parvovirus)、費羅病毒(filovirus)、環形病毒(circovirus)、副粘病毒(paramyxovirus)、巨細胞病毒(Cytomegalovirus)、肝炎病毒(包括B型肝炎和C型肝炎)、痘病毒、披膜病毒(Togavirus)、埃布斯滕巴爾病毒(EbsteinBarrvirus)和細小病毒(parvovirus)；細菌，比如埃希氏桿菌、芽孢桿菌、彎曲菌、鏈球菌和葡萄球菌；寄生蟲，比如錐體蟲(Trypanosoma)和瘧原蟲，包括瘧原蟲種；酵母菌、黴菌、支原菌；以及蛋白病毒。本說明書中所使用的術語「活性生物汙染物」指有能力導致有害作用的生物汙染物。
本說明書中所使用的術語「生物相容溶液」(biologicallycompatible solution)指通過懸浮或溶解等方式含有單克隆免疫球蛋白，並保持其活性，即保持其基本生物和生化特徵的溶液。這些生物相容溶液最好含有有效劑量的至少一種抗凝劑。
本說明書中所使用的術語「生物相容緩衝溶液」指pH值和滲透屬性(如滲透壓、滲透濃度和/或膠體滲透壓)適合於保持單克隆免疫球蛋白完全性的生物相容溶液。適當的生物相容緩衝溶液的pH值通常在4到8.5之間，並且等滲，或適度低滲或高滲。所屬技術的技術人員了解並可方便地得到生物相容緩衝溶液。
本說明書中所使用的術語「穩定劑」指一種化合物或材料，能夠在當單克隆免疫球蛋白製劑接受照射的劑量不足，妨礙了該單克隆免疫球蛋白製劑的安全和有效使用時減少對生物材料的破壞。穩定劑包括，但不僅限於以下幾種抗氧化劑，如抗壞血酸和生育醇；以及自由基淨化劑，如乙醇。穩定劑的優選實例包括，但不僅限於以下幾種脂肪酸，包括6，8二巰基辛酸(硫辛酸)及其衍生物和類似物(α、β、二氫化、雙降和四環硫辛酸)、硫辛酸，6，8二巰基辛酸、dihydrolopoate(DL-6，8-二硫辛酸甲酯)、硫辛醯胺、二硫甲酯和四環二硫辛酸、呋喃脂肪酸；油酸、亞油酸和棕櫚酸及其酸鹽和衍生物；類黃酮、苯基丙醇和黃酮醇，如槲皮黃酮、芸香苷及其衍生物，芹菜素、氨基黃酮、兒茶酚、桔皮苷以及柚苷；胡蘿蔔素，包括β胡蘿蔔素；C0-Q10；葉黃素；多羥基醇，如丙三醇、甘露醇；糖類，如木糖、葡萄糖、核糖、甘露糖、果糖、海藻糖；胺基酸類，如組氨酸、N-乙醯半胱氨酸(NAC)、穀氨酸、色氨酸、鈉carpryl N-乙醯氨酸癸醯基鈉和甲硫氨酸；疊氮化物，如疊氮化鈉；酶，如超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化氫酶；尿酸及其衍生物，如1，3-二甲基尿酸和二甲基硫脲；別嘌呤醇；硫醇類，如穀胱甘肽和巰基丙氨酸；微量元素，如硒；維生素，如維生素A、維生素C(包括其衍生物和鹽類，如抗壞血酸鈉和棕櫚醯抗壞血酸維生素C)和維生素E(及其衍生物和鹽類，如醋酸生育酚和α三烯生育酚)；色原烷醇-α-C6；6羥基2，5，7，8-四甲基Chroma-2羧基酸(Trolox)及其衍生物；外源蛋白質，如凝膠和白蛋白；三-3-甲基-2-苯基-2-吡唑啉-5-1(MCI-186)；西替沃酮；puercelin；柯因；二甲基亞碸(DMSO)；哌嗪二乙磺酸(PIPES)；咪唑；甲氧基補骨脂素(MOPS)；1，2-二噻烷-4，5-二醇；還原物質，如丁羥甲醚(BHA)和丁羥甲苯(BHT)；膽固醇；丙丁酚；吲哚衍生物；水楊乙汞；氨基類固醇衍化物(Lazaroid)和甲磺酸替拉扎特；proanthenols；原花青素；硫酸銨；聚乙烯醇超氧化物歧化酶(PEG-SOD)；N-第三丁基-α-苯基硝酸靈(PBN)；和4-異煙肼-2，2，6，6-四甲基胡椒酸-1-烴氧基(Tempol)；抗壞血酸鹽、尿酸鹽與Trolox C的混合物(Asc/urate/Trolox C)；蛋白質，肽與二肽；甘氨酸均二肽甘氨酸-甘氨酸(Gly-Gly)；減少的穀胱甘肽；地奧司明；普普若加林(pupurogalin)；五倍子酸及其衍生物，包括但不限制於丙基五倍子酸；，硫化甲醛鈉與水飛薊素。
本說明書中所使用的術語「溶劑殘留量」指單克隆免疫球蛋白製劑中的自由液體(freely-available liquid)含量。自由液體是指存在於單克隆免疫球蛋白製劑中，但是不與單克隆免疫球蛋白製劑中的某種或更多種非液體成分結合或複合的水或有機溶劑(如乙醇、異丙醇、聚乙二醇，等等)液體。自由液體包括細胞內水分。本說明書所引用的溶劑殘留量是指採用經美國食品及藥物管理局(FDA)批准的，經過修正的卡爾-費歇爾法(Karl Fischer method)測定的含量(梅爾(Meyer)和博伊德(Boyd)，《化學分析》(Analytical Chem.)，31，215-219，1959；梅(May)等人，《化學標準化》(Biol.Standardization)，10，249-259，1982；FDA生物製品鑑定和研究中心，備審案件號89D-0140，83-93；1990)。根據縮使用的溶劑，可通過本技術領域內已知的方法確定其它溶劑的殘留水平。也可將殘留溶劑與溶質的比例視為反映了該溶劑內的該溶質的濃度。當這樣表達時，溶質濃度越高，殘留溶劑量越低。
本說明書中所使用的術語「敏化劑」指一種能夠選擇性地針對病毒、細菌、蛋白病毒和/或寄生蟲汙染物的物質，使其對輻射去活化更加敏感，因而與不添加敏化劑的情況相比，可以採用較低的輻射率和/或較短的照射時間。適當的敏化劑包括，但不僅限於以下幾種補骨脂素及其衍生物和類似物(包括3碳乙氧基補骨脂素(3-carboethoxypsoralens)；白芷素、凱林(khelins)和含有滷代物和半水溶物(watersolubilization moiety)的香豆素，如四價銨離子或磷離子；核酸結合化合物；溴化血卟啉；鄰-二苯；羥基茜草素；卟啉(porphorin)；二聚血卟啉酯衍生物的滷代物或金屬代物、二聚血卟啉衍生物、苯卟啉衍生物、氫化二苯卟啉(hydrodibenzoporphyrin)二順丁烯二醯亞胺、氫化二苯卟啉、二氰化二磺(dicyano disulfone)、四乙酸二苯卟啉，和四乙酸二苯卟啉三丙酸氨基化合物；可用滷素或金屬原子改良的阿黴素和道諾黴素；紡錘菌素；BD肽、S2肽；S-303(ALE化合物)；染料，如金絲桃素、亞甲基藍、四溴螢光素、螢光素(及其衍生物)，黃素、部花青540；感光化合物，如佛手柑內酯；和SE肽。
本說明書中所使用的術語「輻射」指具有足夠能量將被照射單克隆免疫球蛋白的至少一些組分滅菌的輻射。輻射類型包括，但不僅限於以下幾種(i)粒子輻射(亞原子粒子流，如中子、電子、和/或質子流)；(ii)電磁輻射(從不同的電磁場中產生，如無線電波、可見光(單色與多色)和不可見光、紫外線、X射線和γ射線以及其混合物)。我們經常將該種輻射稱為電離(能夠在被照射材料上產生離子)輻射，如γ射線，以及非電離輻射，如可見光。該種輻射的來源可以變換，但一般而言，只要在一適當時間與一適當比率來產生滅菌效果，具體來源的材料區別很小。在實際應用中，γ輻射通常是由鈷與銫的同位素產生，而X射線由發射X輻射的機器產生，且在被稱為「電子束」輻射的方法中，通常使用一電子來將材料滅菌，其涉及通過一機器進行生產。
B.特別優選實施例本發明的第一優選實施例為一種用於滅菌對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白製劑的方法，其步驟包括(i)將單克隆免疫球蛋白中的溶劑殘留量減低到足以有效保護該單克隆免疫球蛋白製劑抵禦輻射的水平；以及(ii)按有效比率用射線對單克隆免疫球蛋白製劑照射一段有效時間，使單克隆免疫球蛋白製劑得到滅菌。
本發明的第二實施例是一種用於滅菌對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白製劑的方法，其包括(i)向生物材料中添加至少一種穩定劑，其劑量應足以有效保護單克隆免疫球蛋白製劑抵禦輻射；和(ii)按有效比率用射線對單克隆免疫球蛋白製劑照射一段有效時間，使單克隆免疫球蛋白製劑得到滅菌。
本發明的第三實施例是一種用於滅菌對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白製劑的方法，其包括(i)將生物材料的溶劑殘留量減低到足以有效保護單克隆免疫球蛋白製劑抵禦輻射的水平；(ii)向生物材料中添加至少一種穩定劑，其劑量應足以有效保護單克隆免疫球蛋白製劑抵禦輻射；和(iii)按有效比率用射線對單克隆免疫球蛋白製劑照射一段有效時間，使其得到滅菌。在本實施例中，步驟(i)和(ii)可互相顛倒。
依照本發明的方法，在用輻射對單克隆免疫球蛋白製劑進行照射之前，應降低單克隆免疫球蛋白製劑的溶劑殘留量。溶劑殘留量應降低到足以保護單克隆免疫球蛋白製劑抵禦輻射的水平。溶劑殘留量的適當水平取決於接受照射的特定單克隆免疫球蛋白製劑的性質和特點，也可由所屬技術領域的技術人員根據經驗確定。優選情況為，當溶劑是水時，溶劑殘留量應低於約2.0％，低於1.0％更好，低於0.5％更好，最好是低於0.2％。
根據本發明的方法，可通過熟悉此技術領域者所熟悉的一種方法可將該待滅菌單克隆球蛋白固定於一固體表面。
根據本發明的方法，可將照射比率優化以產生製品回復與完成操作所需時間的最有利組合。通過此處所說明的方法的適當應用，可達到低比率(小於等於3kGy/小時)與高比率(大於等於3kGy/小時)。
儘管不希望與任何操作性理論結合，但是人們公認降低溶劑殘留量可降低單克隆免疫球蛋白製劑的自由度，因而保護其抵禦電離性輻射的影響。通過將單克隆免疫球蛋白製劑的溫度降低到其低共熔點或凝固點以下來降低單克隆免疫球蛋白製劑的自由度可獲得相似結果。這些結果允許採用更高的照射率。因此，此處所說明餓方法可在任何不會導致損害該單克隆免疫球蛋白的溫度下進行。
可採用所屬技術領域的技術人員已知的任何方法和技術來降低單克隆免疫球蛋白製劑中的溶劑殘留量，從而將溶劑從單克隆免疫球蛋白製劑中去除。該方法可包括，但不限制於蒸發、濃縮、離心濃縮、玻璃化與噴濺乾燥。降低單克隆免疫球蛋白製劑的溶劑殘留量的一種特別優選方法是凍幹法。根據本發明的特別優選實施例，可將生物材料在照射之前儲存在真空或惰性空氣中(惰性氣體優選，如氦或氬，高分子重量惰性氣體更佳，最好是氬)進行凍幹。
本發明中所採用的輻射可以是任何能夠將需處理的單克隆免疫球蛋白製劑中的一種或更多種生物汙染物有效去活化的輻射。該輻射可為微粒子輻射，包括e電波輻射。優選的輻射為電磁輻射，包括可見光、UV光與電磁輻射的各種波長的混合物，且特別優選的輻射形式是γ輻射。
根據本發明的方法，用輻射照射單克隆免疫球蛋白製劑的比率應足以將單克隆免疫球蛋白製劑的一種或更多種生物汙染物有效去活化。適當的照射比率取決於輻射的特定形式以及被照射的特定單克隆免疫球蛋白製劑和被去活化的特定生物汙染物的性質和特點。適當的照射比率也可由所屬技術領域的技術人員根據經驗確定。在滅菌程序持續過程中，照射比率最好保持不變。當這無法實行時，可利用一可變或間斷輻射。
根據本發明的一個特別優選實施例，照射的比率不應超過約3.0KGy/小時，在約0.1kGy/小時和3.0kGy/小時之間優選，在約0.25kGy/小時和2.0kGy/小時之間更佳，在約0.5kGy/小時和1.5kGy/小時之間更佳，在約0.5kGy和1.0kGy/小時之間最佳。
根據本發明的另一特別優選實施例，照射比率至少為約3.0kGy/小時，至少為約6kGy/小時優選，至少為約16kGy/小時更佳，至少為約30kgy/小時更加，至少為約45kgy/小時或以上最佳。
用輻射照射單克隆免疫球蛋白製劑一段時間，使單克隆免疫球蛋白製劑中的一種或更多種生物汙染物有效地去活化。與照射比率相結合，適當的照射時間導致應用於該單克隆免疫球蛋白的照射的適當劑量。適當的電離時間取決於輻射的特定形式和比率，以及被照射的特定生物材料和被去活化的特定生物汙染物的性質和特徵。適當的電離時間還可由所屬技術領域的技術人員根據經驗確定。
在用輻射照射單克隆免疫球蛋白製劑之前，可選擇向單克隆免疫球蛋白製劑中添加至少一種有效劑量的敏化劑，以增強該照射的抗微生物效果，同時使用此處所說明的方法將照射對單克隆免疫球蛋白的有害效果最小化。適當的敏化劑為所屬技術領域的技術人員已知的敏化劑。
依照本發明的方法，對單克隆免疫球蛋白製劑進行照射可在任何對需處理的單克隆免疫球蛋白製劑無害的溫度下進行。根據本發明的一個優選實施例，在環境溫度下照射單克隆免疫球蛋白製劑。根據本發明的一個替代優選實施例，在對比溫度下，最好在單克隆免疫球蛋白製劑的凝固點或低共熔點或更低的溫度下照射單克隆免疫球蛋白製劑。
為了避免該單克隆免疫球蛋白的退化，單克隆免疫球蛋白製劑的pH值小於7，優選為小於6，更佳為小於5，更佳為小於4，且最佳為小於3。
應當理解，可將此處所說明的若干方法組合使用以進一步將輻射對單克隆免疫球蛋白的有害效果最小化，同時維持該輻射過程的抗微生物屬性的充分效力。
C.實施例以下實施例用來說明，而並非限制本發明。所屬技術領域的技術人員，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種修正和改進。除非另有說明，所有輻射均使用一60Co來源實現。
例13在本實驗中，我們通過將凍幹抗胰島素單克隆免疫球蛋白暴露於45kGy的低劑量γ輻射來評估某些穩定劑的保護效果。測試的穩定劑為抗壞血酸鈉、蛋氨酸和硫辛酸。
方法在2ml玻璃小試管中，將總容積為0.5ml，含有50μg抗胰島素單克隆免疫球蛋白5mg牛血清白蛋白(1％)和無穩定劑或50mM穩定劑的試樣凍幹。在真空狀態中將試樣塞緊。用γ射線照射試樣(總劑量45kGy，比率1.83kGy/小時，溫度4℃)，然後用水重組。
用標準ELISA協議測定獨立副樣的抗體結合活性96孔微滴定板，用2.5μg/ml的胰島素抗原覆蓋一夜。採用從5μg/ml開始的抗胰島素單克隆免疫球蛋白試樣的三重連續稀釋液。使用50ng/ml的與磷酸酶共軛的山羊抗小鼠Ig。在DEA緩衝液中使用1mg/ml的∑104鹼性磷酸酶基質。通過405-620nm的吸收率測定結合活性。
通過估算接受照射的試樣的滴定曲線相對於未接受照射試樣的位移(即觀察到同樣結合量所需的免疫球蛋白濃縮)來測定相對保護作用，未接受照射試樣處於未接受照射試樣的最大吸收率標誌的約50％處。
結果不含穩定劑的凍幹試樣在經受45kGy的γ照射後保持50％的免疫球蛋白活動性。這一結果與先前45kGyγ照射幾乎破壞了在溶液中接受照射的免疫球蛋白的全部活性的結果形成了對照。因此，顯而易見，通過凍幹減少殘留水分可非常有效地保護該單克隆免疫球蛋白。
添加抗壞血酸鈉使試樣在接受照射之後能夠完全恢復其活性。經過與未接受照射的試樣相比可以發現，蛋氨酸和硫辛酸也能充分恢復活性(76-83％)。實驗結果如圖1和2所示。使用普普羅加林(pupurogalin)可得到相似結果(65％的恢復活性)(數據未顯示)。
例2在本實驗中，我們通過將凍幹抗胰島素單克隆免疫球蛋白暴露於45kGy的低劑量γ輻射來評估某些穩定劑的保護效果。測試的穩定劑為抗壞血酸鈉、N-乙醯半胱氨酸、穀胱甘肽以及尿酸/trolox混合物和抗壞血酸/尿酸/trolox混合物。
方法在3ml玻璃小試管中，將總容積為1.0ml，含有100μg抗胰島素單克隆免疫球蛋白、10mg牛血清白蛋白(1％)和無穩定劑或穩定劑的試樣凍幹。在真空狀態中將試樣塞緊。用γ射線照射試樣(總劑量45kGy，比率1.83kGy/小時，溫度4℃)，然後用1.0ml水重組。
用標準ELISA協議測定獨立副樣的球蛋白結合活性96孔Maxisorb滴定板，用2.5μg/ml的胰島素抗原覆蓋一夜。採用從5μg/ml開始的抗胰島素單克隆免疫球蛋白試樣的三重連續稀釋液。使用50ng/ml的與磷酸酶共軛的山羊抗小鼠Ig。通過405-620nm的吸收率測定結合活性。
採用平行線分析軟體包(PLA 1.2，Stegmann Systemberatung)測定相對保護作用。
結果不含穩定劑的凍幹試樣在經受45kGy的γ照射後保持70％的球蛋白活動性。這一結果不同於先前45kGyγ照射幾乎破壞了在溶液中接受照射的免疫球蛋白的全部活性的結果。因此，顯而易見，通過凍幹減少殘留水分可非常有效地保護蛋白質。
添加抗壞血酸鈉使試樣在接受照射之後使活性增加恢復20％，即照射之後，活動性恢復90％。其他穩定劑恢復活性77-84％。實驗結果如圖3A-3C所示。
例3在本實驗中，我們測定首次凍幹(製品中仍留有相對「高水分」)和首次與二次凍幹的結合(使製品只含「低水分」)對單克隆免疫球蛋白敏感度的效果。
方法在3ml玻璃小試管中，將總容積為1.0ml，含有100μg抗胰島素單克隆球蛋白(mAb)、10mg牛血清白蛋白(1％)和無穩定劑或100mM穩定劑的試樣凍幹(使用首次凍幹或首次與二次凍幹的結合)。在真空狀態中將試樣塞緊。用γ射線照射試樣(總劑量45kGy，比率2.03到2.13kGy/小時之間，溫度4℃)，然後用1.0ml水重組。
用標準ELISA協議測定獨立副樣的免疫球蛋白結合活性Maxisorb滴定板，用2.5μg/ml的胰島素抗原覆蓋一夜。採用從5μg/ml開始的抗胰島素單克隆免疫球蛋白試樣的三重連續稀釋液。使用50ng/ml的與磷酸酶共軛的山羊抗小鼠Ig。通過405-620nm的吸收率測定結合活性。
結果不添加穩定劑時，已經經過二次「低水分」乾燥期的抗胰島素免疫球蛋白在照射之後的恢復度更好，即在不添加穩定劑的情況下，較低的總水分含量可改善恢復度。
然而，在添加穩定劑時，球蛋白在經過45kGy照射後具有非常好的恢復度，無論是僅經過首次「高水分」乾燥期的試樣還是經過了二次「低水分」乾燥期的試樣。
本實驗的結果如圖4與圖5所示。
例4在本實驗中，我們某些穩定劑對凍幹抗胰島素單克隆免疫球蛋白的活性的保護效果。測試的穩定劑為抗壞血酸鈉、trolox/抗壞血酸/尿酸混合物、N-乙醯半胱氨酸和穀胱甘肽。
方法凍幹，並在真空狀態下塞緊添加了1％人類血清白蛋白(以及5％蔗糖，可選)的抗胰島素單克隆免疫球蛋白，然後照射試樣(總劑量45kGy，比率1.83到1.88kGy/小時之間)採用上述的標準ELISA協議測定球蛋白結合活性。
結果以45kGy的劑量照射添加了1％HSA的抗胰島素單克隆免疫球蛋白導致其活動性平均損失約33％。添加下列穩定劑可明顯改善恢復度20mM抗壞血酸鈉(恢復度100％)；200μMtrolox/1.5mM尿酸/20mM抗壞血酸(恢復度87％)；20mM N-乙醯基-半胱氨酸(恢復度82％)。以45kGy的劑量照射添加了1％蔗糖的含有1％HSA的抗胰島素單克隆免疫球蛋白導致其活動性平均損失約30％。添加下列穩定劑可明顯改善恢復度20mM抗壞血酸鈉(恢復度88％)；200μM trolox/1.5mM尿酸/20mM抗壞血酸(恢復度84％)；20mM N-乙醯基-半胱氨酸(恢復度72％)。
這些實驗的結果如圖6-11所示。
例5在本實驗中，我們測定當試樣經受高比率(30kGy/小時)照射時，穩定劑(抗壞血酸)對凍幹抗胰島素單克隆免疫球蛋白的活性的保護效果。
方法凍幹抗胰島素單克隆免疫球蛋白，並以的30kGy/小時的比率對其進行照射(總劑量45kGy)。採用上述的標準ELISA協議測定免疫球蛋白結合活性。
結果以45kGy的劑量照射凍幹抗胰島素單克隆免疫球蛋白導致其活動性平均損失約32％。添加20mM抗壞血酸鈉可將活性恢復到未照射試樣的85％。本實驗的結果如圖15所示。
例6在本實驗中，我們以低比率照射添加或不添加穩定劑的特別用於鼠IgG3的IgM單克隆免疫球蛋白。
方法照射液體抗鼠IgG3單克隆IgM(在含10mM疊氮化鈉的PBS緩衝液中；抗體濃度為666μg/μl)，比率1.8kGy/小時，總劑量為10kGy或45kGy。試樣不含穩定劑，或者含有包括20mM檸檬酸、300μM尿酸和200mM抗壞血酸的穩定劑混合物。
使用鼠IgG3作為覆蓋抗原，以及與磷酸酶共軛的抗白鼠IgM檢驗抗體，根據標準ELISA協議分析免疫球蛋白活性。
結果在接受總劑量為10kGy或45kGy的γ照射後，不含穩定劑的液體試樣喪失了所有功能性免疫球蛋白活性。但是，如果添加穩定劑混合物，接受10kGyγ照射後，活性可完全恢復，接受45kGyγ照射後，活性恢復88％。本實驗的結果圖13所示。
例7在本實驗中，使用固定的抗人類胰島素單克隆免疫球蛋白，使其暴露至45kGy的低劑量γ照射後，將測定特定穩定劑的保護效果。受檢測穩定劑為抗壞血酸鈉、降低的穀胱甘肽、硫化甲醛鈉、與聚丙二醇。
方法於4℃在覆蓋緩衝中將兩培養板用100μl/井的新製備的2μg/毫升抗胰島素免疫球蛋白覆蓋過夜。用PBS將該培養板簡單衝洗三次。製備PBS中的各穩定劑的一兩重連續稀釋液。向各井加入100μl選定的穩定劑。將該板緊緊用一蓋墊覆蓋。於將4℃一塊板以1.92kGy/小時總共照射45kGy。該控制板接受了0kGy且將其在4℃儲存。
用一標準ELISA協議確定免疫球蛋白結合活性。將該板井清空並用一整個容積的PBS清洗4次。將整個容積的阻塞緩衝(約380μl)加入所有井中，並在37℃培育兩個小時。將所有井用一整個容積的TBST(TBSpH 7.4並具有0.05％TWEEN 20)清洗4次。將一百μl的在結合緩衝中的59ng/毫升生物素標籤的胰島素加入各個井。用一板封條將該板覆蓋，並在37℃培育1.5小時並不斷搖晃(實驗室濃度測定搖晃器設置為3)。將井用TBST清洗4次。將一百μl的在結合緩衝中的0.5μg/毫升磷酸酶標籤鏈黴胍加入各個井。用一板封條將該板覆蓋，並在37℃培育一小時並不斷搖晃。隨後將井用TBST清洗4次。將一百μ1的在DEA緩衝中的0.1克/毫升∑104磷酸酶基板加入各個井。隨後在37℃將該板培育一小時並不斷搖晃。每5分鐘間隔於405nm-628nm確定吸收率。
結果如圖14與15所示，抗壞血酸鈉顯示了一依賴劑量的效果。包括31-250mM之間的抗壞血酸鈉表現出73-81％的保留活性的增加。
包含穀胱甘肽的樣本體現出25％的單克隆免疫球蛋白活性保持力的增加，其取決於穀胱甘肽的濃度約為31mM。
用硫化甲醛鈉處理的樣本體現出在穩定劑濃度為31mM的情況下，比控制樣本多出約50％的維持活性。
所有三種形式的聚丙二醇(意即，聚丙二醇P400(Fluka31250)；聚丙二醇P1200(Fluka81370)；以及聚丙二醇P2000(Fluka81380)體現出一保護效果。用聚丙二醇處理的樣本體現出比控制樣本多出約50-60％的活性保持力的增加。
例8在本實驗中，確定保護固定抗胰島素單克隆免疫球蛋白抵禦45kGy的γ照射的抗壞血酸鈉的最佳濃度。同時還確定了1.5mM尿酸的存在是否對暴露至γ照射的固定單克隆免疫球蛋白的穩定性是否有任何效果。
方法於4℃在覆蓋緩衝中將兩培養板用100μl/井的新製備的2μg/毫升抗胰島素免疫球蛋白覆蓋過夜。丟棄覆蓋溶液，並用PBS將該培養板簡單衝洗二次。將二十五μl的4X抗壞血酸鹽溶液加入適當的井中。將七十五μl的水加入該無尿酸鹽的井中(a-d行)。將二十五μl的水加入包含尿酸鹽的井中(e-h行)將十五μl的3mM尿酸鹽加入該包含尿酸鹽的井中(e-h行)。將該板緊緊用一96-井蓋墊覆蓋。於4℃將一塊板以1.9kGy/小時總共照射45kGy。在4℃將另一控制板儲存作為一行動控制。
用一標準ELISA協議確定免疫球蛋白結合活性。將該板井清空並用一整個容積的PBS清洗兩次。通過將整個容積的阻塞緩衝(約380μl)加入所有井中，並在37℃培育兩個小時，使得不存在具體的結合點被阻塞。將所有井用TBST清洗三次。將一百μl的在結合緩衝中的10ng/毫升生物素標籤的胰島素(在結合緩衝內按照1∶100,000稀釋)加入各個井。用一板封條將該板覆蓋，並在37℃培育一小時並不斷搖晃(實驗室濃度測定搖晃器設置為三)。將井用TBST清洗，每套兩次，共四套，通常每套間隔五分鐘。將一百μl的在結合緩衝中的25ng/毫升磷酸酶標籤鏈黴胍(在結合緩衝內按照1∶20,000稀釋)加入各個井。用一板封條將該板覆蓋，並在37℃培育一小時並不斷搖晃。隨後將井用TBST清洗，每套兩次，共四套，通常每套間隔五分鐘。將一百μl的在DEA緩衝中的1ng/毫升∑104磷酸酶基板加入各個井。隨後在37℃將該板培育一小時並不斷搖晃。每5分鐘間隔於405nm-628nm確定吸收率。
結果我們確定，在一水性環境中(存在尿酸的情況下)，為固定抗胰島素單克隆免疫球蛋白提供最大保護所需要的抗壞血酸鈉的最佳濃度為150mM。在約150mM的抗壞血酸鹽濃度的情況下，所達到的抗胰島素結合活性的恢復約為50％。加入1.5mM的尿酸導致了抗壞血酸劑量曲線的略微左移(-5mM)，並顯示出以一較低濃度達到最大的活性回復。圖16A顯示了完整的數據套，且圖16B是確定這些值所使用的數據的關鍵區域的擴展。
例9在本實驗中，確定保護固定抗胰島素單克隆免疫球蛋白抵禦45kGy的γ照射的抗壞血酸鈉的最佳濃度。實驗還確定了2.25mM尿酸的存在是否會影響抗壞血酸鹽的穩定效果穩定性。
方法於4℃在覆蓋緩衝中將兩培養板用100μl/井的新製備的2.5μg/毫升抗胰島素免疫球蛋白覆蓋過夜。丟棄覆蓋溶液，並用PBS將該培養板簡單衝洗二次。將二十五μl的4X抗壞血酸鹽溶液加入適當的井中。將七十五μl的水加入該無尿酸鹽的井中(a-d行)。將七十五μl的尿酸鹽堆加入包含尿酸鹽的井中(e-h行)(f.c＝2.25mM)。將該板緊緊用一96-井蓋墊覆蓋。於4℃將一塊板以1.9kGy/小時總共照射45kGy。在4℃將另一控制板儲存作為一行動控制。
按照例8所述確定單克隆免疫球蛋白的結合活性。
結果如圖17A與17中所顯示，我們確定，在一水性環境中(存在尿酸的情況下)，為固定抗胰島素單克隆免疫球蛋白提供最大保護所需要的抗壞血酸鈉的最佳濃度為70mM。這與例8形成對比，例8顯示了抗壞血酸鈉的最佳濃度為150mM。在此例中達到了約100％的抗胰島素結合活性的回覆，二在例8中知達到了約50％。在約150mM的抗壞血酸鹽濃度的情況下，所達到的抗胰島素結合活性的恢復約為50％。加入尿酸(2.5mM)再次導致了抗壞血酸劑量曲線的略微左移(-5mM)，並顯示出以一較低抗壞血酸鹽濃度(-25mM)達到最大的活性回復。我們發現，對於無尿酸的受照射樣本，其存在一雙相屬性。在0-20抗壞血酸鹽之間，回復率大大提高，在20-50mM的抗壞血酸鹽之間平穩，隨後再次升高直至觀察到約為70mM的抗壞血酸鹽的最大恢復率。
例10在本實驗中，我們將評估各種穩定劑對於受照射的由1％人類血清白蛋白(HSA)與5％蔗糖不中的凍幹抗胰島素單克隆免疫球蛋白的保護效果。受測穩定劑為抗(壞雪酸mM)；trolox(200mM)、尿酸(1.5mM)、與抗壞雪酸(20mM)的混合物；n-乙醯基-1-半胱氨酸(20mM)；降低的穀胱甘肽(20mM)；與二肽，Gly-Gly(20mM)。
方法將樣本凍幹約64小時，在真空下停止，並由鋁製折壓封條密封。在4℃以1.83-1.88kGy/小時的劑量率總共照射樣本45.1-46.2kGy。
用一標準ELISA協議確定單克隆免疫球蛋白結合活性。於4℃將Maxisorp板用人類重組細胞胰島素以2.5μg/毫升覆蓋過夜。在37℃用200μl的堵塞緩衝(PBS，pH7.4，2％BSA)將該板堵塞兩小時並用清洗緩衝(TBS，pH7，0.05％TWEEN20)清洗六此。將樣本重新懸浮在500μl的高純度水(100ng/μl)中，在一300μlU型底部的板中稀釋至5μg/毫升，用堵塞緩衝將該板覆蓋過夜活兩小時。執行三重連續稀釋，最終濃度為0.0022μg/毫升。在37℃將板培育一個小時，並不斷攪動，然後用一清洗緩衝清洗6次。在結合緩衝中將磷酸酶標籤山羊抗鼠IgG(H+L)稀釋至50ng/毫升，並將100μl加入各個井。並在37℃將板培育一個小時，在37℃培育一小時，並不斷攪動。然後用一清洗緩衝清洗6次。將一百μl的∑104基板(1克/毫升在DEA緩衝中)加入各個井，並在室溫下進行反應。減去620nM吸收率後，一MultiskanMCC/340上的板讀數為405nM。
如圖18A-18H中所顯示，用1％HSA補充的凍幹抗胰島素單克隆免疫球蛋白，用γ將其照射至45kGy，導致了其活性平均降低1.5倍(親抗原性平均降低33％)。
在存在穩定劑的情況下將樣本照射至45kGy會產生變化的結果20mM抗壞血酸鹽＝~100％回復200uM trolox，1.5mM尿酸鹽，20mM抗壞血酸鹽＝~87％回復
20mM降低的穀胱甘肽＝~76％回復20mM Gly-Gly＝~100％回復在將樣本照射至45kGy時，將5％的蔗糖加入包含1％HSA的凍幹抗胰島素單克隆免疫球蛋白會導致樣本活性平均回復70％(活性平均降低約1.5倍或親抗原性平均降低30％)。
在存在前述穩定劑的情況下，當樣本被輻射至45kGy時，若加入了5％的蔗糖，則活性會降低20mM抗壞血酸鹽＝-88％回復200uM trolox，1.5mM尿酸鹽，20mM抗壞血酸鹽＝-84％回復20mM降低的穀胱甘肽＝-69％回復20mM Gly-Gly＝-79％回復將20mM抗壞血酸鹽，20mM Gly-Gly或加入20mM的抗壞血酸鹽與Gly-Gly加入具有不同特異性的另一單克隆IgG製備中(抗-Igλ光鏈)，會達到相似的結果。
例11在本實驗中，評估了抗壞血酸鹽(Asc，20mM)，抗壞血酸鹽(20mM)/尿酸鹽(1.5mM)/trolox(200uM)雞尾酒(AUT)、n-乙醯基-半胱氨酸(中性形式NAC-n，酸性形式NAC-a，都為20mM)，Gly-Gly(20mM)，降低的穀胱甘肽(GSH，20mM)，地奧司明(39.3uM)與水飛薊素(246uM)對凍幹抗胰島素單克隆免疫球蛋白的保護效果。
方法在3ml玻璃小試管中，將總容積為1.0ml，含有100μg抗胰島素單克隆免疫球蛋白，附帶有10克BSA(1％)以及/無相關穩定劑的樣本凍幹。在真空狀態中γ射線照射樣本(總劑量45kGy，劑量比率1.83kGy/小時之間，溫度4℃)，然後用1ml水重組。對不包含免疫球蛋白的四重樣本進行卡爾·費希爾溼度分析。
通過一標準ELISA協議確定獨立性獨立樣本的免疫球蛋白結合活性將Maxisorp板用2.5μg/毫升的胰島素抗原覆蓋過夜。在5μg/毫升時開始對該抗胰島素單克隆免疫球蛋白使用三重連續稀釋。在50克/毫升使用山羊抗鼠磷酸酶共軛。採用平行線分析軟體包(PLA1.2，Stegmann Systemberatung)計算與其相應未受照射樣本相比受照射樣本的相對力量值。由賓夕法尼亞州Westchester的M-scan公司實施質譜分析法。
如圖19A-19F所顯示，在存在1％牛血清白蛋白的情況下對凍幹抗胰島素單克隆免疫球蛋白進行照射會導致其固定抗原免疫球蛋白的親抗原性損失約30％(相對於未受照射的樣本)。單獨添加抗壞血酸鹽將回復改進20％，使得在照射後約回復90％的親抗原性。添加抗壞血酸鹽/尿酸鹽/trolox雞尾酒/二肽甘氨酸Gly-Gly、中性n-乙醯基-半胱氨酸、降低的穀胱甘肽、或水飛薊素會導致親抗原性回復77-84％。
將200mM抗壞血酸鹽，200mM Gly-Gly或加入200mM的抗壞血酸鹽與Gly-Gly加入具有不同特異性的另兩個其他單克隆IgG製備中(抗-Igλ光鏈與抗IgG1)，會達到相似的結果。
例12在本實驗中，評估了在存在或不存在抗壞血酸鹽的情況下以液體形式受照射的抗胰島素單克隆免疫球蛋白抗壞血酸鹽的穩定性。
方法將抗胰島素單克隆免疫球蛋白稀釋至1克/毫升，並在4℃時在存在或不存在200mM抗壞血酸鹽的情況下用γ射線照射至一總劑量為0，15，或45kGY的程度。
大體按照前一實例中所述通過一標準ELISA協議確定獨立性獨立樣本的免疫球蛋白結合活性。
結果如圖20A與20B所顯示，與室內稀釋控制與0kGy加抗壞血酸鹽控制相比，加入200mM抗壞血酸鹽導致用15Kgvy的射線照射的樣本的免疫球蛋白結合活性回復100％，且導致用45Kgvy的射線照射的樣本的免疫球蛋白結合活性回復71.7％與80.4％。按照由聚丙烯醯胺凝膠電泳所確定，在不存在穩定劑的情況下對抗胰島素免疫球蛋白的照射導致了蛋白質的退化，如在聚丙烯醯胺凝膠上的高分子重量帶所顯示。此外，顯然，材料大大損失了。加入200mM的抗壞血酸鹽對於在15kGy與45kGy受輻射的免疫球蛋白具有一保護性效果，如一完整IgG1帶與一重及輕鏈帶所顯示。
當均分該15kGy加200mM抗壞血酸鹽的副本時，該抗原結合活性與該稀釋控制的結合活性並無顯著不同。與其相比，與室內稀釋控制與槳料控制相比，將包含抗壞血酸的樣本照射至45kGy會導致親抗原性相應平均降低2-與2.5-成。該SDS-PAGE分析表明在不存在抗壞血酸的情況下，照射該抗胰島素單克隆免疫球蛋白會導致材料大量損失，並產生一高分子重量退化。加入200mM抗壞血酸鹽能防止退化形成，並導致在照射至15Gy與45kGy後，該免疫球蛋白相應回復約80％與約50％。
例13執行本實驗以確定是否低pH值(4.5)會減少L-抗壞血酸對被用γ射線照射至45kGy的單克隆免疫球蛋白的穩定效果。
方法於pH6.8與4.5時在存在與不存在200mM L-抗壞血酸的情況下將液體形式的抗胰島素單克隆Ig(抗人類胰島素單克隆免疫球蛋白，淨化的克隆#7F8；升華設計國際#E86102M，7125000組)以一1.774kGy/小時(60Co)的比率照射至一總劑量為45kGy。在照射後，在一ELISA測試重使用胰島素覆蓋板作為目標測試分析樣本的抗原-特定結合能力。經由標準SDS-PAGE電泳在降低與未降低條件下對Ig進行結構分析。
結果如圖21A與21B所顯示，該ELISA功能測試清晰的顯示出在存在抗壞血酸鹽的情況下，單克隆免疫球蛋白的回覆並不取決於pH值。pH值6.8與4.5的圖表實際上是雙重的。加入抗壞血酸時並在照射之後，在兩個pH值中均可看到活性略微損失，然而此降低的程度與當不存在抗壞血酸鹽的情況下進行照射而導致的活性完全損失相比是很小的。
SDS-PAGE電泳凝膠顯示出在pH3.8與pH4.5的情況下，若不存在抗壞血酸，則在45kGy時該免疫球蛋白會完全被破壞。加入200mM的抗壞血酸在照射後維持了同樣透明的結構。若pH值為4.5則可消除退化現象。
這些結果表明，在存在200mM抗壞血酸的情況下，可至少將單克隆Ig照射至45kGy，同時在pH值6.7與4.5保持結構與活性。
例14在本實驗重，評估了在將一用豬細小病毒(PPV)感染的抗胰島素單克隆免疫球蛋白用60Coγ射線以約1.8kGy/小時的比率在4℃時進行照射時濾過性毒菌滅活水平與單克隆免疫球蛋白活性保持力。
方法我們利用PPV作為人類細小病毒B19的一模型病毒，該病毒被人們視為在人類來源的生物物質中所關注的最困難的非包絡病毒，它是細小病毒族其他成員的極其相似物，我們也將該其他細小病毒族成員視為動物來源的生物物質中最困難的病毒。
將一高滴定率穿入一用於抵抗胰島素的單克隆免疫球蛋白的製備中。將一殺蟲劑，(抗壞血酸鈉鹽)加入一些樣本中，最終濃度為200mM。
在4℃時於1.8kGy/小時的大約比率將待照射樣本暴露至60Co輻射。
在照射一些樣本後，取出穿入樣本的整除部分並將其用於滴定剩餘感染病毒粒子的數量。簡單而言，以一被成為細胞病理效應測試(CPE)的濾過性毒菌檢測生物鑑定法來測試該樣本。一細胞系，其能被PPV病毒感染，並被其細胞溶解(豬腎細胞，也被成為PK-13細胞)，將該細胞系加入96-井測試板以形成一約70％匯合的單層。以一限制連續稀釋(5重稀釋)將樣本的四重整除部分加入該井。然後將板培育7-8添，並檢查以確定活細胞是否還存留在該井中。按卡伯(Karber)的說明使用一限制-稀釋方法分析所產生的數據，以確定該濾過性毒菌的滴定率，該結果在附圖中了有所顯示，為每毫升Log10TCID50滴定率。
結果如以下的表4與圖22所顯示，對γ射線的應用以一依賴劑量的方式有效阻止了該病毒的活動。將200mM的抗壞血酸鈉鹽加入該單克隆免疫球蛋白導致了在較低劑量的濾過性毒菌滅活顯著降低，但在較高劑量時，此效果要小很多。將45kGy的γ射線應用於包含抗壞血酸鹽的樣本導致4組以上的濾過性毒菌滅活。


例15執行本實驗中以評估在存在或不存在抗壞血酸鈉鹽的情況下將液體與凍幹形式的單克隆免疫球蛋白用e電波輻射照射時所達到的活性保持力水平方法測試液體的抗胰島素IgG1，並在凍幹後也驚醒測試。準備具有或不具有200與20mM抗壞血酸鈉鹽的樣本，樣本相應為液體與凍幹狀態。
在77-88°F時，以一大約為45kGy/小時的比率將待照射樣本(具有或不具有抗壞血酸鹽)暴露至e電波輻射。該e-電波能量為7MeV，且所給總劑量為約45kGy。控制樣本由未受照射的樣本與一參照控制樣本組成，該未受照射的樣本具有或不具有抗壞血酸鹽傳送至或來自該照射點，該參照控制樣本並不被傳送至該照射點。在傳輸過程中，將樣本保持在4℃。下表5顯示了樣本表5樣本

在照射之後，用蒸餾水重組該凍幹樣本。然後按實例10中所說明的抗人類胰島素ELISA測試檢測所有的樣本。由於該濃度的Ig產生了最大OD的約50％，手動測量抗原結合活性的恢復情況。
入下表6中可見，當處於液體狀態時，應用e電波輻射能完全滅活該Ig。在存在抗壞血酸鹽的情況下，活性明顯回復，但回復程度有限。
在照射以前，將Ig凍幹，這對於活性回複比單獨將抗壞血酸鹽加入液體要具有更大效果。當將無抗壞血酸鹽的Ig照射時，約有50％的抗原結合活性回復。在凍幹之前加入20mM抗壞血酸鹽導致活性完全回復。該ELISA的結果如圖23A與23B所顯示。
表6大約抗原結合活性

以上對本發明進行了充分說明，應當理解在不脫離本發明的範圍及其任何實施例的情況下，所屬技術領域的技術人員當可在更廣或等同的條件、模式和其他參數範圍內實施本發明。本說明書中所提及的所有專利或文獻均以引用方式完整併入本文中。所引用的任何文獻是未在其歸檔日期前的發表，且不應當將其視為承認本發明不比先前發明的該文獻日期居前。
權利要求
1.一種用於將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白製劑滅菌的方法，該方法包括(i)將單克隆免疫球蛋白製劑的溶劑殘留量減低到足以有效保護所述單克隆免疫球蛋白製劑抵禦所述輻射的水平；以及(ii)按有效比率用適當射線對所述單克隆免疫球蛋白製劑照射一段使所述單克隆免疫球蛋白製劑得到有效滅菌的時間。
2.一種用於將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白製劑滅菌的方法，該方法包括(i)向單克隆免疫球蛋白製劑中添加至少一種穩定劑，其劑量應足以有效保護所述單克隆免疫球蛋白製劑抵禦所述輻射；和(ii)按有效比率用適當射線對單克隆免疫球蛋白製劑照射一段使所述單克隆免疫球蛋白製劑得到有效滅菌的時間。
3.一種用於將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白製劑滅菌的方法，該方法包括(i)向單克隆免疫球蛋白製劑中添加至少一種穩定劑，其劑量應足以有效保護所述單克隆免疫球蛋白製劑抵禦所述輻射；和(ii)按低比率用適當射線對單克隆免疫球蛋白製劑照射一段使所述生物材料得到有效滅菌的時間。
4.一種用於將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白製劑滅菌的方法，該方法包括(i)將生物材料的溶劑殘留量減低到足以有效保護所述單克隆免疫球蛋白製劑抵禦所述輻射的水平；和(ii)按低比率用適當射線對所述單克隆免疫球蛋白製劑照射一段使所述單克隆免疫球蛋白製劑得到有效滅菌的時間。
5.一種用於將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白製劑滅菌的方法，該方法包括(i)將單克隆免疫球蛋白製劑的溶劑殘留量減低到足以有效保護所述單克隆免疫球蛋白製劑抵禦所述電離輻射的水平；(ii)向所述單克隆免疫球蛋白製劑中添加至少一種穩定劑，其劑量應足以有效保護所述單克隆免疫球蛋白製劑抵禦所述輻射；和(iii)按有效比率用適當射線對所述單克隆免疫球蛋白製劑照射一段有效時間，使所述單克隆免疫球蛋白製劑得到滅菌，其中步驟(i)和(ii)可按顛倒順序實施。
6.一種用於將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白製劑滅菌的方法，該方法包括(i)將單克隆免疫球蛋白製劑的溶劑殘留量減低到足以有效保護所述單克隆免疫球蛋白製劑抵禦所述電離輻射的水平；(ii)向所述單克隆免疫球蛋白製劑中添加至少一種穩定劑，其劑量應足以有效保護所述單克隆免疫球蛋白製劑抵禦所述輻射；以及(iii)按低比率用適當射線對所述單克隆免疫球蛋白製劑照射一段有效時間，使所述單克隆免疫球蛋白製劑得到滅菌，其中步驟(i)和(ii)可按顛倒順序實施。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述溶劑為水。
8.根據權利要求4所述的方法，其中所述溶劑為水。
9.根據權利要求5所述的方法，其中所述溶劑為水。
10.根據權利要求6所述的方法，其中所述溶劑為水。
11.根據權利要求7所述的方法，其中所述殘留水量通過添加一種有機溶劑來減少。
12.根據權利要求8所述的方法，其中所述殘留水量通過添加一種有機溶劑來減少。
13.根據權利要求9所述的方法，其中所述殘留水量通過添加一種有機溶劑來減少。
14.根據權利要求10所述的方法，其中所述殘留水量通過添加一種有機溶劑來減少。
15.根據權利要求1所述的方法，其中所述溶劑為有機溶劑。
16.根據權利要求4所述的方法，其中所述溶劑為有機溶劑。
17.根據權利要求5所述的方法，其中所述溶劑為有機溶劑。
18.根據權利要求6所述的方法，其中所述溶劑為有機溶劑。
19.根據權利要求1所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量後將該單克隆免疫球蛋白製劑懸浮於一有機溶劑中。
20.根據權利要求4所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量後將該單克隆免疫球蛋白製劑懸浮於一有機溶劑中。
21.根據權利要求5所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量後將該單克隆免疫球蛋白製劑懸浮於一有機溶劑中。
22.根據權利要求6所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量後將該單克隆免疫球蛋白製劑懸浮於一有機溶劑中。
23.根據權利要求7所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量後將該單克隆免疫球蛋白製劑懸浮於一有機溶劑中。
24.根據權利要求8所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量後將該單克隆免疫球蛋白製劑懸浮於一有機溶劑中。
25.根據權利要求9所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量後將該單克隆免疫球蛋白製劑懸浮於一有機溶劑中。
26.根據權利要求10所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量後將該單克隆免疫球蛋白製劑懸浮於一有機溶劑中。
27.根據權利要求11所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量後將該單克隆免疫球蛋白製劑懸浮於一有機溶劑中。
28.根據權利要求12所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量後將該單克隆免疫球蛋白製劑懸浮於一有機溶劑中。
29.根據權利要求13所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量後將該單克隆免疫球蛋白製劑懸浮於一有機溶劑中。
30.根據權利要求14所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量後將該單克隆免疫球蛋白製劑懸浮於一有機溶劑中。
31.根據權利要求15所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量後將該單克隆免疫球蛋白製劑懸浮於一有機溶劑中。
32.根據權利要求16所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量後將該單克隆免疫球蛋白製劑懸浮於一有機溶劑中。
33.根據權利要求17所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量後將該單克隆免疫球蛋白製劑懸浮於一有機溶劑中。
34.根據權利要求18所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量後將該單克隆免疫球蛋白製劑懸浮於一有機溶劑中。
35.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白製劑選自IgG與其片段、衍生物、及代謝物；IgM與其片段、衍生物、及代謝物；IgA與其片段、衍生物、及代謝物；IgD與其片段、衍生物、及代謝物；IgE與其片段、衍生物、及代謝物；以及其混合物。
36.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白是IgG或其片段或其衍生物或其代謝物。
37.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白是IgM或其片段或其衍生物或其代謝物。
38.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白是IgA或其片段或其衍生物或其代謝物。
39.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白是IgD或其片段或其衍生物或其代謝物。
40.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白是IgE或其片段或其衍生物或其代謝物。
41.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白包括選自以下的免疫球蛋白F(ab』)2、Fab』、Fab、Fc、Facb、pFc』、與Fd；或其衍生物與代謝物。
42.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該有效比率不得大於約3.0kGy/小時。
43.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該有效比率不得大於約2.0kGy/小時。
44.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該有效比率不得大於約1.0kGy/小時。
45.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該有效比率不得大於約0.3kGy/小時。
46.根據權利要求1、2或5的任何一項所述的方法，其中該有效比率大於約3.0kGy/小時。
47.根據權利要求1、2或5的任何一項所述的方法，其中該有效比率至少為約6.0kGy/小時。
48.根據權利要求1、2或5的任何一項所述的方法，其中該有效比率至少為約18.0kGy/小時。
49.根據權利要求1、2或5的任何一項所述的方法，其中該有效比率至少為約45kGy/小時。
50.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中在一低氧環境中維持該單克隆免疫球蛋白。
51.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中在一低氬環境中維持該單克隆免疫球蛋白。
52.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中在一真空環境中維持該單克隆免疫球蛋白。
53.根據權利要求1、4、5或6的任何一項所述的方法，其中通過選自以下方法的方法降低該殘留溶劑量凍幹、乾燥、濃縮、加入溶質、蒸發、化學萃取、噴濺乾燥、以及玻璃化。
54.根據權利要求1、4、5或6的任何一項所述的方法，其中該殘留溶劑量低於10％。
55.根據權利要求1、4、5或6的任何一項所述的方法，其中該殘留溶劑量低於5％。
56.根據權利要求1、4、5或6的任何一項所述的方法，其中該殘留溶劑量低於2％。
57.根據權利要求1、4、5或6的任何一項所述的方法，其中該殘留溶劑量低於1％。
58.根據權利要求1、4、5或6的任何一項所述的方法，其中該殘留溶劑量低於0.5％。
59.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中在進行照射該單克隆免疫球蛋白製劑的步驟之前，將至少一個敏感器添加至該單克隆免疫球蛋白製劑中。
60.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白製劑包含至少一個蛋白病毒以作為生物汙染物。
61.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白製劑包含至少一個病毒作為生物汙染物。
62.根據權利要求1或4所述的方法，其中在進行照射該單克隆免疫球蛋白製劑的步驟之前，至少將一個穩定劑添加至該單克隆免疫球蛋白製劑。
63.根據權利要求2、3、5或6的任何一項所述的方法，其中至少一個該穩定劑是抗氧化劑。
64.根據權利要求2、3、5或6的任何一項所述的方法，其中至少一個該穩定劑是自由基淨化劑。
65.根據權利要求2、3、5或6的任何一項所述的方法，其中至少一個該穩定劑由於其反應氧氣特性而降低損壞。
66.根據權利要求2、3、5或6的任何一項所述的方法，其中至少一個穩定劑選自抗壞血酸或其鹽或酯；穀胱甘肽；6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸；尿酸或其鹽或酯；甲硫氨酸；組氨酸；N-乙醯基半胱氨酸；硫辛酸；硫化甲醛鈉；五倍子酸或其衍生物；桔酸丙酯；以及該穩定劑中兩種或多種的混合。
67.根據權利要求66所述的方法，其中該兩個或多個該穩定劑的混合物選自抗壞血酸或其鹽或其酯與尿酸或其鹽或其酯的混合物，抗壞血酸或其鹽或其酯以及6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物；抗壞血酸或其鹽或酯、尿酸或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物；以及尿酸或其鹽或酯的混合物；硫辛酸；硫化甲醛鈉；五倍子酸或其衍生物；五倍子酸丙酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物。
68.根據權利要求2、3、5或6的任何一項所述的方法，其中至少一個該穩定劑包含二肽甘氨酸-甘氨酸。
69.根據權利要求2、3、5或6的任何一項所述的方法，其中至少一個該穩定劑包含地奧司明。
70.根據權利要求2、3、5或6的任何一項所述的方法，其中至少一個該穩定劑包含水飛薊素。
71.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射為粒子輻射或電磁輻射或其混合物。
72.根據權利要求71的一項所述的方法，其中該電磁輻射選自無線電波、微電波、可見與不可見光，紫外線，X射線輻射，γ輻射與其組合。
73.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是γ輻射。
74.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是電子束。
75.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是可見光。
76.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是紫外線。
77.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是X射線輻射。
78.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是多色可見光。
79.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是一個或多個波長的可見光與紫外線的組合。
80.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是在環境溫度下執行的。
81.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是在一低於該環境溫度的溫度下執行的。
82.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是在單克隆免疫球蛋白的凝固點以下的溫度下執行的。
83.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是在單克隆免疫球蛋白的共晶點以下的溫度下執行的。
84.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白製劑的pH值小於7。
85.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白製劑的pH值小於6。
86.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白製劑的pH值小於5。
87.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白製劑的pH值小於4。
88.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白製劑的pH值小於3。
89.一種組合物，其包括至少一個單克隆免疫球蛋白以及至少一個選自以下物質的穩定劑抗壞血酸或其鹽或酯；穀胱甘肽；6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸；尿酸或其鹽或酯；甲硫氨酸；組氨酸；N-乙醯基半胱氨酸；二肽甘氨酸-甘氨酸；水飛薊素；硫辛酸；硫化甲醛鈉；五倍子酸鹽或其衍生物；桔酸丙酯；抗壞血酸或其鹽或酯與尿酸或其鹽或酯的混合物；抗壞血酸或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物；抗壞血酸或其鹽或酯以及尿酸或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物，尿酸或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物，該至少一個穩定劑的劑量能有效保持該單克隆免疫球蛋白使得在用輻射對該組合物進行滅菌後能夠將其按目的使用。
90.根據權利要求89所述的該組合物，其具有一殘留溶劑量，其低至足以在用照射對該組合物進行消毒時保持該單克隆免疫球蛋白使得在用輻射對該組合物進行滅菌後能夠將其按目的使用。
91.根據權利要求89所述的該組合物，其具有一低於10％的殘留溶劑量。
92.根據權利要求89所述的該組合物，其具有一低於5％的殘留溶劑量。
93.根據權利要求89所述的該組合物，其具有一低於2％的殘留溶劑量。
94.根據權利要求89所述的該組合物，其具有一低於1％的殘留溶劑量。
95.根據權利要求89所述的該組合物，其具有一低於0.5％的殘留溶劑量。
96.根據權利要求89所述的該組合物，其具有一小於7的pH值。
97，根據權利要求89所述的該組合物，其具有一小於6的pH值。
96.根據權利要求89所述的該組合物，其具有一小於5的pH值。
97.根據權利要求89所述的該組合物，其具有一小於4的pH值。
98.根據權利要求89所述的該組合物，其具有一小於3的pH值。
全文摘要
提出對單克隆免疫球蛋白製劑進行滅菌以減少其中的活性生物汙染物，如病毒、細菌、酵母菌、黴菌、支原菌和寄生蟲含量的方法。
文檔編號A61K47/14GK1541110SQ02815742
公開日2004年10月27日 申請日期2002年6月13日 優先權日2001年6月14日
發明者T·格列布, W·H·伯吉斯, W·N·德羅安, R－Y·福格, M·J·麥克費, D·M·曼, A·麥克貝恩, ８, T 格列布, 伯吉斯, 吮炊, 德羅安, 曼, 麥克費 申請人:科利昂特有限公司