人的羰基還原酶及其編碼序列的製作方法

2023-08-05 19:14:51

專利名稱：人的羰基還原酶及其編碼序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及生理學、腫瘤學、酶學以及基因工程學領域。具體地，本發明涉及一種在人類腎上腺中表達的蛋白-人的羰基還原酶(簡稱為「hCR」)及其核酸序列。本發明還涉及該蛋白和核酸序列的製備方法和用途。
羰基還原酶一般集中在膜、鞘以及間質細胞中。羰基還原酶屬於短鏈脫氫酶/還原酶家族，對NADP(H)有很強的輔助功能，參與體內多種進程的氧化還原反應而具有重要的生理意義(J Biochem(Tokyo)1996 Aug；120(2):257-63)。
在鼠卵巢中，羰基還原酶並非由促濾泡成熟激素所誘導而產生，而是依賴於促黃體素的激發；但它與母鼠排卵周期緊密相關隨著年齡增長卵巢中羰基還原酶數量的變化直接導致了母鼠動情周期由規則向不規則轉變，而與排卵前卵巢濾泡生長則並不相關(J Reprod Fertil 1998 Jan；112(1):115-21),(J ReprodFertil 1996 Sep；108(1):123-30)。羰基還原酶在母體妊娠期間還參與了前列腺素的代謝(Crit Rev Biochem Mol Biol 1996 Apr；31(2):101-26)。在其他方面，羰基還原酶還起著保護作用，比如K562白血病細胞中表達一種克隆的人羰基還原酶後，可以有效抵禦道諾紅菌素的細胞毒性傷害。(Cancer Res 1995 Oct15；55(20):4646-50)和絕大多數酶不同，羰基還原酶獨特之處是能被脂肪酸激活；和絕大多數酶一樣，羰基還原酶的活性也受到多種物質的抑制。對兔子心臟中脂肪酸對羰基還原酶的抑制作用進行研究發現，脂肪酸上適當長度的碳鏈，共價雙鍵以及羧基都是抑制羰基還原酶的重要因素(Biol Pharm Bull.1999 Jul；22(7):731-3.)。
另有研究發現，兔子腎臟中羰基還原酶催化醋磺己脲還原反應時若有帶酮基藥物存在，其效果將受到極大抑制(J Enzyme Inhib 1997 Feb；11(4):285-92)。有機汞劑也能使羰基還原酶失活，說明它的活性中心或附近存在行使重要功能的半胱氨酸殘基。Tinguely JN等人研究發現，227位半胱氨酸是參與反應的活性殘基，它與底物結合以及穀胱甘肽結合均有關係(Eur J Biochem.1999Feb；260(1):9-14.)(Adv Exp Med Biol 1997；414:563-8)。除了227位半胱氨酸殘基，17位賴氨酸與39位精氨酸也是羰基還原酶的兩個基本殘基，兩者都與NADP(H)結合有關(J Biochem(Tokyo)1996 Aug；120(2):257-63)。
在本發明被公布之前，尚未有任何公開或報導過本專利申請中提及的人類的羰基還原酶的胺基酸序列或其核酸序列。
本發明的第一目的就是提供一種新的人基因hCR(Genbank AccessionNo.AF113123)，該基因編碼人的羰基還原酶(簡稱為「hCR」)。
本發明的第二目的是提供一種新的人蛋白hCR。
本發明的第三目的是提供一種利用重組技術生產上述的新的人hCR蛋白和核酸序列的方法。
本發明還提供了這種人hCR蛋白多肽和編碼序列的應用。
在本發明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有人hCR蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第4-738位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第4-738位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.7所示的胺基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第4-738位的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，提供了一種分離出的人hCR蛋白質多肽，它包括具有SEQ ID NO.7胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
在本發明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。
在本發明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉化的宿主細胞。在一個實例中該宿主細胞是大腸桿菌；在另一實例中，該宿主細胞是真核細胞。
在本發明的另一方面，還提供了一種產生具有人hCR蛋白質活性的多肽的方法，該方法包括(1)將編碼具有人hCR蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成人hCR蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第4-738位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人hCR蛋白的重組細胞；(3)在適合表達人hCR蛋白多肽的條件下，培養步驟(2)中的重組細胞；(4)分離出具有人hCR蛋白活性的多肽。
較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.6中第4-738位的序列。
本發明還提供了與hCR蛋白多肽特異性結合的抗體。
在本發明中，「分離的」、「純化的」或「基本純的」DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語「人hCR蛋白(或多肽)編碼序列」指編碼具有人羰基還原酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中第4-738位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID NO.6序列的編碼框第4-738位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID NO.6中第4-738位核苷酸序列同源性低至約70％的簡併序列也能編碼出SEQ ID NO.7所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第4-738位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO.6中從核苷酸第4-738位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與天然的人hCR相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，「基本純的」蛋白質或多肽是指其至少佔樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按乾重或溼重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。
在本發明中，術語「人hCR蛋白或多肽」指具有人羰基還原酶蛋白活性的SEQID NO.7序列的多肽。該術語還包括具有與天然人hCR相同功能的、SEQ ID NO.7序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人hCR蛋白的活性片段和活性衍生物。該術語還包括具有或不具有起始甲硫氨酸的hCR蛋白。
本發明的人hCR多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與人hCR DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人hCR多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人hCR多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括人hCR多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人hCR多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
在本發明中，「人hCR保守性變異多肽」指與SEQ ID NO.7的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行替換而產生。
表1
發明還包括人hCR蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人hCR多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。在生產本發明的人hCR多肽時，可以將人hCR編碼序列可操作地連於表達調控序列，從而形成人hCR蛋白表達載體。
如本文所用，「可操作地連於」指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，「可操作地連於」意味著相鄰，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
本發明還提供了對人hCR特異的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。
在本發明中，可以使用一系列本領域已知的方法來製備針對人hCR特異的抗體。例如，將提純的人hCR基因產物或它的抗原片段注射入動物體內以產生多克隆抗體。同樣，表達人hCR或它的抗原片段的細胞也可以用來對動物致免疫而產生抗體。根據本發明製備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可以用雜交瘤技術製備(例如，Kohler et al.,Nature 256:495,1975；Kohler et al.,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler et al.,Eur.J.Immunol.6:292,1976)。本發明的抗體包括可以阻抑人hCR功能的抗體，也可以是不影響人hCR功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人hCR基因產物的片段或功能域致免疫而產生，而人hCR基因產物及其片段可以用重組方法產生或用多肽合成儀進行合成。與非修飾形式的人hCR基因產物結合的抗體，可以通過用在原核細胞例如E.coli中產生的基因產物來免疫動物而得到。與翻譯後修飾形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽結合的抗體，可以通過用在真核細胞如酵母或昆蟲細胞中產生的基因產物的來免疫動物而得到。
本發明的人hCR抗體可以用來鑑定表達人hCR蛋白或多肽的細胞，如腎上腺細胞。例如，可以用一種可檢測的分子例如螢光素異硫氰酸(FITC)來標記人hCR特異抗體，然後讓人hCR特異抗體與細胞樣品接觸，再用螢光顯微鏡或流式細胞儀檢測出與人hCR特異抗體結合的細胞。
除了在細胞表面檢測人hCR外，還可以用Western印跡技術分析該蛋白質。細胞裂解液可以從培養細胞或取自病人的組織標本如腎上腺中提取，並溶解在含有去汙劑的裂解緩衝液中。然後用SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分離細胞提取物(同時將提純的人hCR多肽作為陽性對照)，接著通過電泳雜交將其轉移到硝酸纖維素上。為了用Western印跡免疫探測人hCR多肽，可以使用典型的抗體結合檢測方法，例如放射自顯影或鹼性磷酸酶檢測方法。並可使用免疫接種血清或不相關的單克隆抗體作為非特異反應的對照。
還可用Nothern印跡法技術分析人hCR基因產物的表達，即分析人hCR的RNA轉錄物在細胞中的存在與否和數量。
人hCR DNA的Nothern印跡分析和人hCR特異抗體的Western印跡分析可以聯合使用，以證實人hCR在生物樣本中的表達。人hCR DNA還可以用於Southern印跡分析或原位雜交分析，以將該基因定位於染色體上，並可進行遺傳連鎖分析以找出其它可能的疾病相關基因。
此外，本發明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人hCR核苷酸編碼序列的8-100個或更多個核苷酸，較佳地為15-50個連續核苷酸。該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼人hCR的核酸分子。
本發明還提供了檢測樣品中是否存在人hCR核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然後檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增後的產物，其中PCR擴增引物對應於人hCR核苷酸編碼序列，並可位於該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
此外，根據本發明的人hCR核苷酸序列和胺基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質的同源性基礎上，篩選人hCR同源基因或同源蛋白。
為了得到與人hCR基因相關的人cDNAs或基因組DNAs的點陣，可以用DNA探針篩選人cDNA或基因組DNA文庫，這些探針是在低嚴緊條件下，用32P對人hCR的全部或部分做放射活性標記而得的。最適合於篩選的cDNA文庫是來自人腎上腺組織的文庫。來自參與內分泌的其它人體組織或特定人體細胞株的cDNA文庫也可用於篩選目的。構建來自感興趣的細胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學領域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech,Palo Alto,Cal.。這種篩選方法可以識別與人hCR相關的基因家族的核苷酸序列。
根據核苷酸相似性篩選人hCR同源物可以按如下方法完成。對人體腎上腺cDNA文庫(Clontech,Palo Alto,Cal.)，使用一段包含人hCR基因序列的全部或部分的隨機引物化DNA探針進行篩選。要完成對與人hCR序列至少有70％同源性的DNA插入序列的克隆的鑑定，可以使用雜交溫度為55℃的雜交液，然後用0.5×SSC和O.1％SDS清洗。用這種方法識別的克隆的DNA插入序列可以進一步用DNA限制性內切酶分析和DNA測序來評價它與人hCR基因的相似性。組織表達的分布可以用上述的Northern印跡法技術分析。
人hCR同源物也可以用針對人hCR蛋白或多肽的抗體來識別。例如，可以用標準的方法對商品化的或者用已知方法構建的，來自細胞或者組織例如腎上腺的表達文庫進行篩選。將文庫倒入平皿，菌落轉移到一張硝化纖維素膜上，使表達的重組蛋白結合到膜上。然後就可以用特異性的人hCR抗體進行典型的抗體結合和檢測。用這種方法所識別出克隆中的DNA插入序列，可以進一步用DNA限制性內切酶分析和DNA測序進行分析以評價它與人hCR基因的相似性。新識別的基因的組織表達分布可以同樣地按上述方法進行分析。
本發明的人hCR核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的eDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工化學合成的方法來合成有關序列。在本申請之前，現有技術已完全可以通過先合成多個多核苷酸小片段，然後再進行連接而獲得編碼本發明人hCR蛋白的的核酸序列。然後，可將該核酸序列引入本領域中各種現有的DNA分子(如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
除了用重組法產生之外，本發明蛋白的片段還可用固相技術，通過直接合成肽而加以生產(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis,WHFreeman Co.,San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質可以用手工或自動進行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City,CA)來自動合成肽。可以分別化學合成本發明蛋白的各片段，然後用化學方法加以連接以產生全長的分子。
本發明蛋白的編碼序列可用於基因定位。例如，通過螢光原位雜交技術(FISH)，將cDNA克隆與分裂中期的染色體進行雜交，可以準確地進行染色體定位。該技術可以使用短至約500bp的cDNA；也可以使用長至約2000bp或者更長的cDNA。對於該技術，可參見Verma等人，Human Chromosomes:A Manual ofBasic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦序列被定位於染色體上的某個精確位置，將可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數據相關聯。這些遺傳圖譜數據是可以獲得的，例如通過孟德爾(Mendelian)人遺傳資料庫(可通過Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在網上獲得)。然後，通過連鎖分析來鑑定基因與已定位於同一染色體區域的疾病之間的相關性。
接著，有必要確定患病個體和健康個體之間的cDNA或基因組序列方面的差異。如果某一突變存在於部分或全部患病個體但不存在於正常個體，那麼該突變可能就是該疾病的致病因素。
利用本發明的人hCR蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與人hCR發生相互作用的物質或，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發明人hCR蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、腹膜內、皮下、皮內、或局部給藥。
以本發明的人hCR蛋白為例，可以將其與合適的藥學上可接受的載體聯用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質和藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的人hCR蛋白可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
當本發明的人hCR蛋白多肽被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施用於哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
通過同源檢索發現，本發明的新的hCR基因具有與已發表並被確認為家豬CR蛋白的基因高度同源的序列，並且本發明的新蛋白具有與家豬CR蛋白高度保守的胺基酸序列。所以，本發明的人hCR是家豬CR蛋白基因的一個同源基因而具有相似的功能。
此外，17位賴氨酸與39位精氨酸是羰基還原酶的兩個基本殘基，兩者都與NADP(H)結合有關。本發明的人羰基還原酶蛋白序列同樣存在17位賴氨酸和39位精氨酸。而且，在公用資料庫中查詢可知本發明的蛋白序列中也存在若干短鏈脫氫酶/還原酶家族成員特異性標籤序列。這些都表明，本發明的hCR蛋白序列與已報導過的各種羰基還原酶序列結構上的相似性，從而說明本序列也有同樣的生理功能。


圖1為本發明的人hCR與家豬CR基因核酸序列(GenBank Accession No.D16511)的同源比較(FASTA)圖。其中，相同的核苷酸用「|」標出。
圖2為本發明的人hCR蛋白與家豬CR蛋白的胺基酸序列(SwissProtAccession No.Q29529)的同源比較(FASTA)圖。其中，相同的胺基酸在兩個序列之間用「|」標出，相似的胺基酸用「+」標出。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1人hCR基因的克隆1．組織分離(Tissue isolation)腎上腺來源於5個正常成年男性供體，在死後四小時內取出腎上腺組織，立即置於液氮中冷凍保存。
2．mRNA的分離(mRNA isolation)取出組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩後，再移入玻璃勻漿器內。勻漿後移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents,Gibco,NY,USA)。用甲醛變性膠電泳鑑定總RNA質量。用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA，定量。
3．cDNA文庫的構建(Construction of cDNA library)以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，反轉錄引物見SEQ ID NO.1。補平末端後，加含EcoRⅠ切點的接頭，接頭序列分別見SEQ ID NO.2和3。磷酸化EcoRⅠ末端後，用XhoⅠ限制性內切酶消化1.5小時，再進行片段分離。過柱篩選長度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉澱，無菌水溶解，連接至Uni-ZAP XR載體(Stratagene,CA9203,USA)，以Zap-eDNA Gigapack Ⅲ Gold Cloning Kit(Stratagene,CA9203,USA)進行包裝，宿主菌使用XL 1-lue MRF′(Stratagene,CA9203,USA)細菌。塗板並測定滴度。
4．測序及資料庫建立(Seqencing and Database Constructing)挑選文庫中有外源片段插入的克隆，擴增後抽提質粒(Qiagen,Germany)，用T3和T7作為3′端和5′端的通用引物，採用終止物螢光標記(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer,USA)上進行EST大規模測序。測序結果用FACTURA軟體去除載體序列，傳輸到SUN Ultra 450 Server上進行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟體包(Wisconsin group,USA)中的BLAST和FASTA軟體搜索已有的資料庫(Genebank+EMBL)，將無同源性或同源性低於95％的序列視為新基因建立資料庫。
5．基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎上，進行cDNA全長克隆，分兩階段進行(1)「電子克隆」(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針搜尋dbEST資料庫，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達序列標籤(Expressed Sequence Tag，簡稱「EST」)序列認為同一序列(consensus sequence)，取出並用AUTOASSEMBLER軟體進行拼接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟體分析被延伸的序列是否具有完整的開放閱讀框架(Open Reading Frame,ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和胺基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長完整性如何。通過電子克隆的方法，通常可獲取基因的全長序列。
(2)cDNA末端快速擴增(Rapid Amplificat ion of cDNA Ends,RACE)如果通過「電子克隆」方法仍未得到完整的cDNA全長，則在已有序列的5′或3′端設計引物，在人類腎上腺Marathon-Ready cDNA文庫(Clontech Lab,Inc,USA)中進行長距離PCR反應。然後對PCR產物克隆、測序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟體分析被延長的序列有無完整的ORF，如無，重複上述過程直至獲得全長。
(3)RT-PCR對於5′和3′端已知的序列，如果中間尚有一段間隙(gap)無法從已有的公共資料庫或自身資料庫獲得，可考慮採用RT-PCR的方法。在序列5′端設計引物，3′端引物採用Oligo-dT，在腎上腺總RNA庫中進行擴增。然後對產物進行克隆、測序。最後拼接並獲得全長。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的人hCR蛋白的全長編碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎上，進一步設計引物R1:5′-GACATGGAGCTGTTCCTCGC-3′(SEQ ID NO.4)為正向引物，寡核苷酸R2:5′-GGATTGGGGGTAGGATGAGC-3′(SEQ ID NO.5)為反向引物，以腎上腺組織的總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，R1/R2的PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃ 30秒、59℃ 30秒和72℃ 1分鐘進行35個循環，最後以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴增產物，獲得擴增片段長度為790bp。然後按常規方法以PCR擴增產物進行克隆、測序，獲得SEQ ID NO.6所示的序列。
實施例2人hCR基因的序列信息與同源性分析本發明新的人hCR全長cDNA(GenBank Accession No.AF113123。因申請保密，故在本申請之前未對公眾公開)的長度為790bp，詳細序列見SEQ ID NO.6，其中開放讀框位於4-738位核苷酸。根據全長cDNA推導出人hCR的胺基酸序列，共244個胺基酸殘基，分子量25913.06道爾頓，pI為8.33。詳細序列見SEQ IDNO.7。
將人hCR的全長cDNA序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR資料庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現它與家豬的CR基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它與家豬CR基因的mRNA全編碼序列(GenBank Accession No.D16511)的6-744位鹼基有73.8％的相同性(圖1)，在胺基酸水平上，它與家豬CR蛋白(SwissProt Accession No.Q29529)的第1-243位胺基酸殘基有69.5％的相同性和90.1％的相似性(圖2)。由上可見，人hCR基因與家豬CR基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，屬於同一家族並且兩者在功能上也有很高相似性。
本發明的人hCR除了可作為該家族一員用於進一步的功能研究，還可用於與其他蛋白一起產生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產生融合蛋白。此外，本發明的人hCR還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產生新的蛋白。例如將本發明的人hCR蛋白的N端與家豬CR蛋白的N端進行交換，以產生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發明人hCR的抗體，用於篩選該家族的其他成員，或者用於親和純化相關蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發明人hCR核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人hCR的表達水平或者抑制人hCR的過度表達。本發明的人hCR蛋白或其活性多肽片段可以施用於病人，以治療或減輕因人hCR缺失、無功能或異常而導致的有關病症。此外，還可以用基於本發明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預後判斷。
由於本發明的人hCR蛋白具有源自人的天然胺基酸序列，因此，與來源於其他物種(如人)的同族蛋白相比，預計在施用於人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內的免疫原性更低或沒有)。
實施例3人hCR蛋白的結構和功能研究1．將人hCR蛋白的胺基酸序列在PROSITE資料庫(網址為http://www.motif.genome.ad.jp/)中檢索基序(motif)，得到以下結果1 MELFLAGRRV LVTGAGKGIG RGTVQALHAT GARVVAVSRT QADLDSLVRE51 CPGIEPVCVD LGDWEATERA LGSVGPVDLL VNNAAVALLQ PFLEVTKEAF101 DRSFEVNLRA VIQVSQIVAR GLIARGVPGA IVNVSSQCSQ RAVTNHSVYC151 STKGALDMLT KVMALELGPH KIRVNAVNPT VVMTSMGQAT WSDPHKAKTM201 LNRIPLGKFA EVEHVVNAIL FLLSDRSGMT TGSTLPVEGG FWAC(1)在胺基酸序列中，存在以下功能基序(ⅰ)陰影區(133-136,145-148)N-糖基化位點(N-glycosylation site)(ⅱ)黑體區(67-69,139-141,151-153,224-226)蛋白激酶C磷酸化位點(Proteinkinase C phosphorylation site)(ⅲ)斜體區(40-43,190-193)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(Casein kinase Ⅱphosphorylation site)(ⅳ)下劃線區(14-19,18-23,22-27,126-131,129-134,228-233,239-244)N-豆蔻醯化位點(N-myristoylation site)(v)波浪線區(6-9)氨基化位點(Amidation site)(ⅵ)著重號區(136-164)短鏈脫氫酶/還原酶家族成員特異性標籤(Short-chaindehydrogenases/reductases family signature)(2)功能分析N-豆蔻醯化位點、N-糖基化位點、氨基化位點、蛋白激酶C磷酸化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點均與翻譯後修飾(post-translational modifications)有關；短鏈脫氫酶/還原酶家族成員特異性標籤序列的存在則表明，本發明的hCR蛋白在結構上的有短鏈脫氫酶/還原酶家族成員特徵性的結構，並提示hCR蛋白有相關功能。
2．將人hCR蛋白的胺基酸序列在blocks資料庫(網址為http://www.blocks.fhcrc.org)中檢索結構域，得到以下結果1 MELFLAGRRV LVTGAGKGIG RGTVQALHAT GARVVAVSRT QADLDSLVRE51 CPGIEPVCVD LGDWEATERA LGSVGPVDLL VNNAAVALLQ PFLEVTKEAF101 DRSFEVNLRA VIQVSQIVAR GLIARGVPGA IVNVSSQCSQ RAVTNHSVYC151 STKGALDMLT KVMALELGPH KIRVNAVNPT VVMTSMGQAT WSDPHKAKTM201 LNRIPLGKFA EVEHVVNAIL FLLSDRSGMT TGSTLPVEGG FWAC(1)在胺基酸序列中，存在以下結構域區(ⅰ)下劃線區(75-85,129-166,171-1 80)短鏈脫氫酶/還原酶家族蛋白模塊(Short-chain dehydrogenases/reductases family proteins)。
(2)功能分析在hCR蛋白的胺基酸序列中存在短鏈脫氫酶/還原酶家族蛋白模塊，因而可預見其的確具有這類酶的功能。
綜上所述，從人hCR蛋白的結構和理化特性進一步證實了該基因與家豬CR蛋白的相似性。由於蛋白質結構決定了功能特異性的生物化學原理，因此本發明的人hCR具有家豬CR相似或相同的功能。
實施例4人hCR基因的組織表達譜1．電子Northern表達譜。按Ton C.等人的方法(Ton C et al.,BiochemBiophys Res Commun 1997 Dec 18；241(2)589-594；Hwang DM,et al.,Circulation 1997 Dec 16；96(12):4146-4203)，將人hCR cDNA序列在GCG軟體包中的humanEST資料庫中做BLAST檢索，在得到的人類EST中，概率值10e-10、相同性95％的EST有上百個，可視為該基因在組織中的轉錄表達本，由此得出表達該基因的組織譜，發現其在卵巢、腎上腺、胎盤、孕婦子宮、嬰兒心臟、黑色素細胞、滑膜肉瘤、睪丸、前列腺、結腸黏膜、腦等等組織中有廣泛表達，表明它在人體這些組織器官中發揮著重要作用。
實施例5人hCR多肽的製備和提純在該實施例中，將全長的人hCR編碼序列或片段構建入商品化的蛋白質融合表達載體之中，以表達和提純重組蛋白。
1．將人hCR多肽以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進行原核表達。
原核表達載體的構建，以及轉化大腸桿菌根據人hCR的全長編碼序列(SEQ ID NO.6)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物(分別對應於編碼序列5′和3′端的約20個以上核苷酸)，並在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這根據選用的pGEX-2T載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增後，將人hCR基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia,Piscataway,NJ)。鑑定好的表達載體利用CaCl2方法轉入大腸桿菌DH5α，篩選鑑定得到含有pGEX-2T-hCR表達載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-hCR。
表達GST-hCR重組蛋白的工程菌的分離鑑定挑取單菌落的DH5α-pGEX-2T-hCR工程菌於3ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中振搖培養過夜，按1∶100的濃度吸取培養液於新的LB培養基(含100μg/ml氨苄青黴素)中培養約3小時，至OD600達0.5後，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續於37℃分別培養0,1,2,3小時。取培養時間不同的1ml菌液離心，在細菌沉澱物中加入裂解液(2×SDS上樣緩衝液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細菌沉澱，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色後觀察預期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達GST-hCR融合蛋白的工程菌。
GST-hCR融合蛋白的提取純化按上述方法誘導表達GST-hCR融合表達蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-hCR。誘導後的細菌離心沉澱，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細菌，超聲破碎細菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％穀胱苷肽Sepharose 4B,37℃振搖結合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉澱結合了GST-hCR的穀胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉澱加入100μlPBS的量清洗兩次，而後按每毫升超聲液所得沉澱加入10μl還原型穀胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重複洗脫兩次。洗脫的上清保存於-80℃，並進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在26kDa處的蛋白質條帶即為人hCR蛋白。
實施例6
人hCR蛋白或多肽在昆蟲細胞中進行真核細胞表達1．人hCR杆狀病毒表達載體的構建及轉染Sf9昆蟲細胞株根據人hCR的全長編碼序列(SEQ ID NO.6)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，並在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增後，將人hCRcDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pVL1392載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)。鑑定好的表達載體3μg，野生型線性杆狀病毒DNA(BaculoGoldTM ACMNPV DNA,Pharmingen,San Diego,CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL,NY)25μl，加入1ml無血清的昆蟲培養基中，振蕩15秒混勻，室溫孵育15分鐘備用。取1ml(2×106)Sf9昆蟲細胞懸液於60mm組織培養板中，貼壁1小時後換轉染培養基，室溫孵育15分鐘後棄培養基，加入前面製備好的DNA載體轉染混合物，Parafilm密封培養板，於室溫27℃振搖培養4小時，而後換完全培養基培養3天，收集上清備用。
2．轉入重組表達載體的昆蟲細胞株的篩選鑑定轉染3天後的昆蟲細胞用新鮮培養基製成細胞懸液(2×106/1ml)，取1ml細胞懸液置於60mm組織培養皿中，加入3ml培養基，100μl收集的培養上清，貼壁1小時，棄2ml培養基，繼續室溫培養1小時，棄去所有的培養基，加入預熱的含20μl 4％X-gal的3ml半固體培養基，培養5-7天後挑取白色細胞克隆於96孔培養板中培養3-5天，而後吸取上清感染Sf9昆蟲細胞。
收集感染的細胞進行Western鑑定。將細胞裂解後進行SDS-PAGE電泳，電泳後的膠於Pharmacia的Multiphor Ⅱ半乾電轉移儀中將蛋白質轉印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置於封閉液中封閉1小時，而後於抗人hCR的抗體溶液中封閉1小時，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，而後將膜置於生物素標記的抗人hCR一抗的第二抗體溶液中振搖1小時，TBS清洗，加入親和素-鹼性磷酸酶複合物反應30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配製的顯色液顯色觀察蛋白條帶。
挑取高表達人hCR的Sf9細胞克隆。
3．人hCR蛋白的提取純化用高表達人hCR的Sf9細胞克隆的上清大量感染Sf9細胞，感染48小時後收集細胞，PBS洗滌。每2×108細胞加入20ml細胞裂解液(0.5％Triton X-100,20mM Na3PO4(磷酸鈉，pH7.8),500mM NaCl,1mM Na3VO4(釩酸鈉),1mM Pefabloc,1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破細胞，12000×g離心20min去除細胞碎片，上清按每2×108的細胞加入2ml NTA-瓊脂糖(Qiagen,Germany),4℃吸附1小時。而後用含100nM咪唑的His緩衝液洗滌兩次，用含20mM N,N′-二哌嗪，500mM NaCl,300mM咪唑的緩衝液洗脫以得到純化的蛋白。洗脫液保存於4℃，並進行SDS-PAGE電泳檢測提取的人hCR蛋白的純度。在26kDa處的蛋白質條帶即為人hCR蛋白。
實施例7抗人hCR抗體的製備1．免疫小鼠和脾細胞的製備將實施例5中獲得的人hCR蛋白用層析法進行分離後備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，並用等體積的完全Freund′s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天後，用非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強免疫一次，3-5天後用於融合。其中，脾細胞製備見鄂徵主編，《組織培養和分子細胞學技術》，北京出版社，第210頁。
2．按《組織培養和分子細胞學技術》(同上)，第371頁中的方法，製備飼養細胞。
3．按《組織培養和分子細胞學技術》(同上)，第213頁中的方法，進行細胞融合。
4．抗體的檢測在細胞融合10-15天後，需逐孔進行檢查，一旦發現旺盛的雜交細胞集落生長，就應用人hCR蛋白做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫螢光試驗、發射免疫試驗(RIA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。檢查出抗體活性的孔後，立刻進行克隆培養，並分離出抗體。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人國家人類基因組南方研究中心(ⅱ)發明名稱人的羰基還原酶及其編碼序列(ⅲ )序列數目7(2)SEQ ID NO.1的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度50bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅸ)序列描述SEQ ID NO.1GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA ACTAGTCTCG AGTTTTTTTT TTTTTTTTTT50(2)SEQ ID NO.2的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度13bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅸ)序列描述SEQ ID NO.2AATTCGGCAC GAG13(2)SEQ ID NO.3的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度9bp(B)類型核苷酸
(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅸ)序列描述SEQ ID NO.3GCCGTGCTC(2)SEQ ID NO.4的信息(ⅰ)．序列特徵(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)．分子類型寡核苷酸(ⅸ)．序列描述SEQ ID NO.4GACATGGAGC TGTTCCTCGC20(2)SEQ ID NO.5的信息(ⅰ)．序列特徵(A) 長度20bp(B) 類型核苷酸(C) 鏈性單鏈(D) 拓撲結構線性(ⅱ)．分子類型寡核苷酸(ⅸ)．序列描述SEQ ID NO.5GGATTGGGGG TAGGATGAGC20(2)SEQ ID NO.6的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度790bp(B)類型核苷酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型核苷酸
(ⅸ)序列描述SEQ ID NO.6GACATGGAGC TGTTCCTCGC GGGCCGCCGG GTGCTGGTCA CCGGGGCAGG CAAAGGTATA 60GGGCGCGGCA CGGTCCAGGC GCTGCACGCG ACGGGCGCGC GGGTGGTGGC TGTGAGCCGG 120ACTCAGGCGG ATCTTGACAG CCTTGTCCGC GAGTGCCCGG GGATAGAACC CGTGTGCGTG 180GACCTGGGTG ACTGGGAGGC CACCGAGCGG GCGCTGGGCA GCGTGGGCCC CGTGGACCTG 240CTGGTGAACA ACGCCGCTGT CGCCCTGCTG CAGCCCTTCC TGGAGGTCAC CAAGGAGGCC 300TTTGACAGAT CCTTTGAGGT GAACCTGCGT GCGGTCATCC AGGTGTCGCA GATTGTGGCC 360AGGGGCTTAA TAGCCCGGGG AGTCCCAGGG GCCATCGTGA ATGTCTCCAG CCAGTGCTCC 420CAGCGGGCAG TAACTAACCA TAGCGTCTAC TGCTCCACCA AGGGTGCCCT GGACATGCTG 480ACCAAGGTGA TGGCCCTAGA GCTCGGGCCC CACAAGATCC GAGTGAATGC AGTAAACCCC 540ACAGTGGTGA TGACGTCCAT GGGCCAGGCC ACCTGGAGTG ACCCCCACAA GGCCAAGACT 600ATGCTGAACC GAATCCCACT TGGCAAGTTT GCTGAGGTAG AGCACGTGGT GAACGCCATC 660CTCTTTCTGC TGAGTGACCG AAGTGGCATG ACCACGGGTT CCACTTTGCC GGTGGAAGGG 720GGCTTCTGGG CCTGCTGAGC TCCCTCCACA CACCTCAAGC CCCATGCCGT GCTCATCCTA 780CCCCCAATCC 790(2)SEQ ID NO.7的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度244胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅸ)序列描述SEQ ID NO.7:MELFLAGRRV LVTGAGKGIG RGTVQALHAT GARVVAVSRT QADLDSLVRE CPGIEPVCVD 60LGDWEATERA LGSVGPVDLL VNNAAVALLQ PFLEVTKEAF DRSFEVNLRA VIQVSQIVAR 120GLIARGVPGA IVNVSSQCSQ RAVTNHSVYC STKGALDMLT KVMALELGPH KIRVNAVNPT 180VVMTSMGQAT WSDPHKAKTM LNRIPLGKFA EVEHVVNAIL FLLSDRSGMT TGSTLPVEGG 240FWAC 24權利要求
1．一種分離出的DNA分子，其特徵在於，它包括編碼具有人hCR蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第4-738位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第4-738位的核苷酸序列雜交。
2．如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，所述的序列編碼具有SEQ IDNO.7所示的序列的多肽。
3．如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，該序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第4-738位的核苷酸序列。
4．一種分離出的人hCR蛋白多肽，其特徵在於，它包括具有SEQ ID NO.7胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5．如權利要求4所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
6．一種載體，其特徵在於，它包含權利要求1所述的DNA。
7．一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8．一種產生具有人hCR蛋白質活性的多肽的方法，其特徵在於，該方法包括(1)將編碼具有人hCR蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成人hCR蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第4-738位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人hCR蛋白的重組細胞；(3)在適合表達人hCR蛋白多肽的條件下，培養步驟(2)中的重組細胞；(4)分離出具有人hCR蛋白活性的多肽。
9．一種能與權利要求7所述的人hCR蛋白多肽特異性結合的抗體。
10．一種核酸分子，其特徵在於，它包含權利要求1所述的DNA分子中8-100個連續核苷酸。
全文摘要
本發明提供了一種在人體正常腎上腺組織中表達的新的人hCR蛋白及其編碼序列,本發明還提供了該蛋白和核酸序列的製備方法和用途,以及在樣品中檢測人hCR核酸序列和多肽的方法。
文檔編號C12N15/63GK1301868SQ9912703
公開日2001年7月4日 申請日期1999年12月29日 優先權日1999年12月29日
發明者錢斌治, 李能幹, 顧健, 彭永德, 陳竺, 韓澤廣 申請人:國家人類基因組南方研究中心