一種脂質靶向超聲造影劑及其製備方法
2023-08-09 08:08:51 1
專利名稱：一種脂質靶向超聲造影劑及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種以合成磷脂、帶探針的棕櫚酸等為膜材料的靶向超聲造影劑及其製備方法。
背景技術：
超聲造影作為超聲醫學發展的第三次革命，正廣泛而深刻地影響著超聲醫學的應用和發 展，在佔位性病變的診斷中發揮了革命性的作用。使用超聲造影劑，極大的增加了醫生的診 斷信心，提高了臨床超聲診斷水平。為提高患者診斷準確率發揮重要作用。超聲造影劑是一 種血池微氣泡，粒徑較紅細胞稍小，約10um以下，其內包裹氣體，利用氣體對超聲波的強反 射機理，可以觀察組織臟器以及病變的微循環，提高超聲診斷的敏感性和特異性。
新一代超聲造影劑是以氟碳類惰性氣體為核心，以合成磷脂為主要材料的膜包裹而成的
微氣泡。理想的超聲造影劑應具有的特點1)粒徑適宜超聲波反射強度與微泡直徑6次方 呈正比，粒徑越大，反射的強度越強，越容易被觀察到；但若微泡粒徑過大， 一方面不能經 外周靜脈注射後通過肺循環到達全身，另一方面，非常容易幹擾血液的微循環血流動力學； 相反，粒徑過小，超聲波反射強度小，不利於超聲診斷儀的接收和顯示；因此，適宜的微泡 粒徑以小於10um，介於l 6um為宜。2)穩定性好超聲微泡需要經過心臟泵出輸送至全身 ，微泡需要有足夠強的穩定性耐受高壓力的動脈壓，維持微泡形態完整，保持對超聲波的反 射。3)安全性高微泡對人體無害，不影響正常生理機能。4)具有足夠的濃度經心臟泵
出隨機分布於全身後有足夠的超聲反射強度。
為製備理想的超聲造影劑，現在技術集中在膜材料和製備工藝兩方面的研究。
例如，中國專利CN1081467C公開了白蛋白為球壁材料的寒氣微泡混懸液，製備方法為超 聲法；中國專利CN1128638C公開了以表面活性劑司班、吐溫等包裹氣體而成的，以超聲法制 備的造影劑；中國專利CN1209167C公開了由脂質及高分子聚合物等為成模材料的，通過乳液 聚合法製備的超聲微泡造影劑；中國專利CN101062423A公開了以磷脂為膜材料的，通過超聲 振蕩或機械剪切作用製備的微泡混懸液。
已有的造影劑中，很多尚處於研究開發的各階段，白蛋白微球應用較早，已有產品上市 ，但其有免疫原性，可能引起機體變態免疫反應，在一定程度上限制了其應用；司盤、吐溫 類表面活性劑， 一般不用於靜脈注射液製劑中；磷脂為材料的微泡具有組織相容性好，微泡 彈性高等優點，已有成熟產品上市。但以往超聲微泡膜材料成分複雜，用料多。因此，需要對微泡壁材料進一步研究改進，選擇制膜材料及其配置比例，以製備出更節約、有效、安全 和易於製備的微泡。
理想的超聲造影劑，應具有粒徑均一、密度高、大小適宜的特點。以往超聲空化法、機 械制定法、冷凍乾燥法、反覆凍融法等，要麼製備工藝較複雜、要麼製備微泡粒徑及分布還 不夠理想，都需要進一步改進。
當然，上述微泡都是普通超聲造影劑，不能用於超聲分子成像，而將靶向探針結合在微 泡表面製備靶向超聲造影劑，靶向顯示組織器官分子水平的病理改變；並以靶向造影劑為載 體，實現藥物、基因定點釋放，在超聲靶向治療領域有廣泛的應用前景。
理想的耙向造影劑特性應包括①循環半衰期長(理想的超過30 60分鐘)；②在耙區 部位停留時間長；③敏感、特異性地連接於感興趣區抗原決定簇；④產生高的信噪比； 毒 性小；⑥易於生產和臨床使用；⑦能採用標準化、商業化的成像方式成像。
為製備理想的靶向超聲造影劑，最新的技術集中在對靶向配體與微泡結合的研究上。例 如1.直接連接法又稱為共價的被動吸附、靜電吸附法。缺點是製備得到的靶向超聲造 影劑穩定性不強，極易受到溶液物理性質改變的影響，有研究表明體內尋靶效果不佳。2. 偶聯劑連接法，缺點是靶向片段結合率不高，且多功能試劑的選擇範圍有限。3.橋連劑結 合的方法:又稱共價結合法，此法產物靶向性穩定，化學基團選擇範圍非常廣泛易得，根據 自己需要引入不同的基團，製備過程同普通超聲造影劑等讓此法成為現今研究的熱點。4. 非吸附性非共價鍵鍵結的免疫化學固定法，例如生物素親和素(biotin — avidin system)法
發明內容
本發明的目的是提供一種以合成磷脂、帶探針的棕櫚酸等為膜材料的靶向超聲造影劑及 其製備方法。製備的超聲微泡大小適宜、粒徑分布均一、穩定、濃度適宜、耙向探針結合率 高；不需要添加造影劑製備原料以外的試劑材料用於連接配體，製備方法簡單，對微泡本身 特性幹擾小，有利於純化靶向造影劑。
本發明的目的是通過以下方式實現的。
一種脂質耙向超聲微泡造影劑，平均粒徑為1 4微米的微泡混懸液，球壁材料包括合成 磷脂、聚乙二醇、泊洛沙姆；包裹氣體為氟碳類組織相容性惰性氣體，溶液為去離子雙蒸餾 水，球壁材料中還含有結合探針多肽的棕櫚酸。
所述的探針多肽的序列為KGDS (賴氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸)或RGDS (精氨酸-甘 氨酸-天冬氨酸-絲氨酸)，探針多肽與棕櫚酸的結合比例為lmol: lmol。所述造影劑中結合多肽的棕櫚酸含量為造影劑的O. 1 0.2重量％，合成磷脂含量為造影 劑的0.02-0.9重量％，聚乙二醇含量為造影劑的0.01 0. 1重量％，泊洛沙姆含量為造影劑 的O. 01 0. 1重量％，
所述合成磷脂選自二棕櫚醯磷脂醯膽鹼和二棕櫚醯磷脂酸；所述的聚乙二醇為 PEG-4000;所述氣體為全氟丙烷C3Fs。
所述的脂質靶向超聲微泡造影劑的製備方法包括以下步驟
a) 將合成磷脂、泊洛沙姆加至去離子雙蒸餾水中，於40-5(TC條件下混勻，製得混懸液
A;
b) 將5-10mg結合探針多肽的棕櫚酸加至150-250y l有機溶劑無水乙醇中，於35-6(TC條 件下溶解完全，製得溶液B;
c) 將混懸液A應用探頭式超聲儀超聲處理，同時將溶液B逐滴加入其中，充分混勻，得 澄清溶液C;
d) 將PEG-4000加入澄清液C中，溶解完全；再將全氟丙烷氣體通入溶液C中，充分飽和 的同時，應用高速機械剪切設備處理，形成平均粒徑為1 4微米的微泡混懸液。
其中所述的超聲儀為頻率10 50KHz的探頭式超聲儀；混懸液A於探頭超聲儀中進行超聲 處理，工作3秒，暫停3秒，功率30%， 3分鐘，超聲處理次數為一次或兩次。
本發明根據自製造影劑的材料特點，特地選取棕櫚酸作為造影劑壁材料的主要原料之一 ，其不溶於水，在維護微泡穩定性發揮著重要作用，並且棕櫚酸能夠作為表面活性劑並形成 微泡外薄膜，微泡表面覆蓋一層薄的棕擱酸殼，其作用在於將氣液分開，減慢氣體溶解，也 增加了微泡的穩定性。
本發明關鍵還能以棕櫚酸作為橋連劑，將配體(探針多肽)穩定結合於微泡表面，而不 需要添加造影劑製備原料以外的試劑材料用於連接配體，因此製備方法簡單，對微泡本身特 性幹擾小，有利於純化靶向造影劑。
此外，配體(探針多肽)結合效率很高棕櫚酸是KGDS-TUCA(或RGDA-TUCA)微泡膜重要 的組成成份，而使用的KGDS-棕櫚酸化合物(或RGDS-棕櫚酸化合物)又是純度很高的原料(純 度>95%)，因此微泡膜上有棕櫚酸存在，就有配體KGDS (或配體RGDS)連接於表面。
本發明製備超聲造影劑，優選少數幾種膜材料及其比例，首先將靶向探針結合在棕櫚酸 上並純化，製備工藝採用超聲勻化、高速剪切機剪切生成微泡的方法，具有製備原料少，制 備工藝簡單、方便，製備的超聲微泡大小適宜、粒徑分布均一、靶向探針結合率高等特點。 由於棕櫚酸不溶於水，溶於乙醇等有機溶劑，而合成磷脂易溶於水，為使棕櫚酸與合成磷脂充分混勻，本發明採用超聲勻化的方法，既可起到脫氣作用，又可使膜材料充分、均勻地以 分子態分散在溶液中，為進一步高速剪切法製備微泡打下良好的基礎(與以往超聲振蕩法制 備超聲造影劑時使用超聲的目的不同，超聲振蕩法中使用超聲目的是直接產生微泡)；在得 到膜材料充分、均勻混合的溶液後，再根據需要調節高速剪切速度和時間，即可製備粒徑、 濃度適宜的靶向超聲造影劑。
本發明血栓耙向超聲造影劑及其製備方法屬於分子影像學(molecular imaging, MI)的 研究範疇，應用超聲影像學的方法對活體狀態下的生物過程進行細胞和分子水平的定性和定 量研究。 一方面，可以特異地顯像以及增強顯像活體內血栓，特別是微血栓的形成，對血栓 的形成做到早發現、早診斷、早治療；另一方面，為進一步合成其他多種以多肽為探針的耙 向超聲造影劑提供了一種簡單、方便、合成效率高的方法。
圖l為普通造影劑經流式細胞儀檢測的螢光結果圖； 圖2為本發明靶向造影劑經流式細胞儀檢測的螢光結果圖； 圖3為螢光顯微鏡觀察本發明靶向超聲造影劑螢光圖； 圖4為本發明靶向造影劑靶向顯示血栓的超聲圖5為結合本發明靶向造影劑的血栓經無氣水洗滌後的超聲圖； 圖6為普通造影劑顯示血栓的超聲圖7為靶向拮抗抑制實驗顯示血栓的超聲圖。
具體實施例方式
下面結合實施例具體說明本發明，而不是限制本發明。
實施例l:探頭超聲時的功率、時間對製備微泡的影響
將40mgDSPC、 4mgDPPA、 5mg泊洛沙姆，40-50。C充分混懸於5ml雙蒸水中，製成混懸液A ;再將5mg FITC-KGDS-Palm (帶螢光的結合多肽的棕櫚酸)溶於200 y l無水乙醇中，於40。C 條件下溶解完全，製成溶液B;混懸液A於探頭超聲儀中進行超聲處理(工作3秒，暫停3秒， 功率30%， 3分鐘)，超聲次數為一次或兩次，在超聲過程中逐滴加入溶液B，觀察所製得溶 液的澄清度。結果見下表。
超聲次數(次)溶液澄清度
1稍貌濁，欠澄涪
2完全澄清
溶液c的澄清度直接影響製備的微泡濃度、粒徑大小。溶液越澄清，說明脂質成分以分子態分散於溶液中的程度越高，高速剪切時形成的微泡粒徑越均勻，微泡密度越大。 實施例2:
將40mgDSPC、 4mgDPPA、 5mg泊洛沙姆，40-50。C充分混懸於5ml雙蒸水中，製成混懸液A ;再將8mg FITC-KGDS-Palm溶於250y l無水乙醇中，於6(TC條件下溶解完全，製成溶液B; 混懸液A於探頭超聲儀中進行超聲處理(工作3秒，暫停3秒，功率30%， 3分鐘)，超聲次數 為一次或兩次，在超聲過程中逐滴加入溶液B，觀察所製得的溶液均澄清。
探針多肽是KGDS或RGDS，設計並採用9-芴甲氧羰基(fluorenylmethoxycarbony， Fmoc) 固相合成法合成了多肽配體棕櫚酸直接聯結物，高效液相色譜純化，純度>95%，質譜鑑定 分子結構正確，探針多肽與棕櫚酸的結合比例為lmol: lmol。探針多肽合成及其棕櫚酸化由 北京中科亞光生物有限公司特約合成。
實施例3:高速剪切速度對微泡產率和粒徑的影響
將5mg PEG-4000加入實施例1和2製備的澄清液C中，溶解完全；通入全氟丙烷氣體充分 飽和澄清液C，同時以不同剪切速度、不同剪切時間對溶液C進行處理，製備的微泡混懸液粒 徑及濃度如下
剪切速度(r/mm) X時間(mm)微泡濃度(1 t)。/ml) 嫩包平均直徑(u m) 5000 Xlmm 0.73 3.8 5,X2mm0.93 3.4 1CI[I00X1腿 1.2 2.0 1Cl[l00X2腿 1.5 1.5
實施例l中結合多肽的棕櫚酸含量為造影劑的O. 1重量％，合成磷脂含量為造影劑的0.9 重量％， PEG-4000含量為造影劑的0. 1重量％，泊洛沙姆含量為造影劑的O. 1重量％。
實施例2中結合多肽的棕櫚酸含量為造影劑的0. 16重量％，合成磷脂含量為造影劑的 0.9重量％， PEG-4000含量為造影劑的0. 1重量％，泊洛沙姆含量為造影劑的O. 1重量％。
實施例4:本發明KGDS —超聲造影劑配體結合效率的實驗
隨機計數50， OOO個微泡，以未結合KGDS的自製普通超聲造影劑與純化後KGDS耙向造影劑 作對照，檢測其螢光度的差別，判斷帶有螢光FITC的KGDS與微泡結合效率。二者對比，KGDS -TUCA有90.04X的微泡螢光不同，因此配體KGDS與微泡的結合效率約為90.04X。見圖l和 2
實施例5:本發明KGDS —超聲造影劑體外耙向成像血栓的實驗1) 探針KGDS多肽帶有FITC螢光，螢光顯微鏡觀察KGDS-TUCA，可見密集分布的表面呈綠 色光環的微泡，其濃度密集，大小均一，形態規整(見圖3)，證實配體KGDS連於微泡表面
2) 體外靶向性實驗結果
製備血凝塊採集5名健康成人手肘靜脈血各10ml置於不加任何抗凝劑的試管中，37 °C 恆溫水箱孵化1.5h，最後得到15塊面積約為0. 5cmX0. 5 cm的新鮮全血細胞凝塊(即紅色血 栓)。
實驗儀器AL0KA alO彩色超聲診斷儀，淺表5412探頭，頻率3. 75腿z、聲場深度4cm、 MIO. 11，實驗過程中維持增益、取樣深度、TGC、聚集範圍不變。
含100ml無氣水的水槽中加入血凝塊、造影劑，採用超聲造影模式觀察血凝塊增強情況
A組(靶向組)血凝塊與KGDS-TUCA共孵育後，其表面呈環狀高回聲增強(如圖4)， 採用無氣水反覆漂洗三次，依然呈環狀強回聲(如圖5)。
B組(對照組)血凝塊與普通造影劑共孵育後，血凝塊無增強，回聲呈"充盈缺損" 聲像(如圖6)。
C組(拮抗劑阻斷組)血凝塊與KGDS充分共孵育後，再加入KGDS-TUCA，血凝塊表面無 增強，回聲呈"充盈缺損"聲像(如圖7)。序 歹lj 表
〈110> 王，維 高，峰 丁，燕飛
〈120> —種脂質靶向超聲造影劑及其製備方法 〈130> 無 〈160> 2
〈170> Patentln version 3.3
〈210> 1
〈211> 4
〈212> PRT
〈213> Artificial
〈220>
〈223> 人工序列 〈400> 1
Lys Gly Asp Ser 1
〈210> 2
〈211> 4
〈212> PRT
〈213> Artificial
〈220>
〈223> 人工序列 〈400> 2
Arg Gly Asp Ser 權利要求
1.一種脂質靶向超聲微泡造影劑，平均粒徑為1～4微米的微泡混懸液，球壁材料包括合成磷脂、聚乙二醇、泊洛沙姆；包裹氣體為氟碳類組織相容性惰性氣體，溶液為去離子雙蒸餾水，其特徵在於球壁材料中還含有結合探針多肽的棕櫚酸。
2 根據權利要求l所述的造影劑，其特徵在於，所述的探針多肽的序 列為賴氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸，探針多肽與棕 櫚酸的結合比例為lmol: lmol。
3 根據權利要求l所述的造影劑，其特徵在於，結合多肽的棕櫚酸含 量為造影劑的O. 1 0. 2重量％。
4 根據權利要求l所述的造影劑，其特徵在於，合成磷脂含量為造影 劑的0.02-0.9重量％，聚乙二醇含量為造影劑的0.01 0. 1重量％，泊洛沙姆含量為造影劑 的O. 01 0. 1重量％。
5 根據權利要求l的所述的造影劑，其特徵在於，所述合成磷脂選自 二棕櫚酸磷脂醯膽鹼DSPC和二棕櫚醯磷脂酸DPPA;所述的聚乙二醇為PEG-4000;所述氣體為 全氟丙烷C3F8。
6 權利要求l所述的脂質靶向超聲微泡造影劑的製備方法，其特徵在 於，包括以下步驟a) 將合成磷脂、泊洛沙姆加至去離子雙蒸餾水中，於40-5(TC條件下混勻，製得混懸液A;b) 將5-10mg結合探針多肽的棕櫚酸加至150-250y l有機溶劑無水乙醇中，於35-6(TC 條件下溶解完全，製得溶液B;c) 將混懸液A應用探頭式超聲儀超聲處理，同時將溶液B逐滴加入其中，充分混勻，得 澄清溶液C;d) 將PEG-4000加入澄清液C中，溶解完全；再將全氟丙烷氣體通入溶液C中，充分飽和 的同時，應用高速機械剪切設備處理，形成平均粒徑為1 4微米的微泡混懸液。
7.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述的探針多肽的 序列為賴氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸，探針多肽與棕櫚酸的結合比例為lmol: lmol。
8.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，合成磷脂含量為造 影劑的0.02-0.9重量％， PEG-4000含量為造影劑的0.01 0. 1重量％，泊洛沙姆含量為造影 劑的O. 01 0. 1重量％，
9.根據權利要求6或8的所述的製備方法，其特徵在於，所述合成磷 脂選自二棕櫚酸磷脂醯膽鹼DSPC和二棕櫚醯磷脂酸DPPA。
10.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，其中所述的超聲 儀為頻率10 50KHz的探頭式超聲儀；混懸液A於探頭超聲儀中進行超聲處理，工作3秒，暫 停3秒，功率30%， 3分鐘，超聲次數為一次或兩次。
全文摘要
本發明涉及一種脂質靶向超聲造影劑及其製備方法。該造影劑是將合成磷脂、泊洛沙姆加至去離子雙蒸餾水中混勻，製得混懸液A；再將結合探針多肽的棕櫚酸加至有機溶劑無水乙醇中溶解，製得溶液B；將混懸液A超聲處理，同時將溶液B逐滴加入其中，混勻得澄清溶液C；將PEG-4000加入澄清液C中溶解；再將全氟丙烷氣體通入溶液C中，充分飽和的同時，應用高速機械剪切設備處理，形成平均粒徑為1～4微米的微泡混懸液。製備的超聲微泡大小適宜、粒徑分布均一、穩定、濃度適宜、靶向探針結合率高；不需要添加造影劑製備原料以外的試劑材料用於連接配體，製備方法簡單，對微泡本身特性幹擾小，有利於純化靶向造影劑。
文檔編號A61K49/22GK101637613SQ20091030581
公開日2010年2月3日 申請日期2009年8月19日 優先權日2009年8月19日
發明者丁燕飛, 維 王, 盛小茜, 羅卓瓊, 峰 高 申請人:王 維;高 峰;丁燕飛