枯草芽孢桿菌菌株及其應用的製作方法

2023-07-31 18:53:46

枯草芽孢桿菌菌株及其應用的製作方法
【專利摘要】一株枯草芽孢桿菌，其分類命名為枯草芽孢桿菌G-34（Bacillus?subtilis?G-34），於2014年1月6日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏登記號為CCTCC?NO：M2014003。該菌株由分離於勝利油田汙染土壤中的枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）菌株誘變選育得到，能夠快速利用僅以甘油為唯一碳源的培養基高產脂肽類生物表面活性劑surfactin。以粗甘油為底物，經該菌發酵轉化、離心除菌、酸沉澱、冷凍乾燥、甲醇萃取可得surfactin純品。
【專利說明】枯草芽孢桿菌菌株及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】,涉及枯草芽孢桿菌G-34 (,Bacillus subtil is G_34),特別涉及利用該菌株轉化甘油發酵生產脂肽類生物表面活性劑的方法。
【背景技術】
[0002]脂肽是由親水的肽鏈和親油的脂肪烴鏈組成的一類化合物。其含有7-10個胺基酸組成的肽鏈和β_羥基脂肪酸鏈或β_胺基脂肪酸鏈，其中脂肪酸鏈上的羥基或胺基與肽鏈胺基酸上的羧基結合形成內酯鍵或醯胺鍵，使肽鏈閉合形成環狀脂肽。由於脂肽具有特殊的化學組成與兩親型分子結構，因此在醫藥、食品、化妝品及微生物採油等領域有廣闊的應用前景，成為研究的熱點。
[0003]1968年，Arima等首次發現枯草芽胞桿菌能產生脂肽類表面活性劑，呈晶狀，商品名為表面活性素(surfactin)。此後，研究人員通過不同的分離技術和結構鑑定手段，發現了多種脂肽表面活性劑Surfactin的結構類似物。研究表明，自被發現以來，表面活性素的表面活性一直最強，是迄今報導的效果最好的生物表面活性劑之一(食品工業科技，2008，29(11):296-298)。
[0004]脂肽類表面活性劑主要是通過微生物發酵方法製備，其生產菌一般是革蘭氏陽性芽孢桿菌。一般的脂肽類表面活性劑產生菌的產量較低，其產量均小於1.0g/L，少的甚至在0.lg/L以下，要能達到有較好的利用價值，通常需要對產生菌進行高產突變株的誘變選育和發酵工藝優化，目前，國內外研究者在誘變育種、培養基優化及發酵調控等方面開展了大量研究。
[0005]為降低其生產成本，科學工作者嘗試了多種廉價發酵原料，目前，發酵生產Surfactin報導的碳源有葡萄糖、蔗糖、甘蔗糖蜜、大豆油、甘露醇、甘油等。在上述發酵原料中，甘油作為原料尤其引人注意。在生物柴油的生產過程中，每生產I噸生物柴油就會副產IOOkg甘油。同時生物柴油產業得到了各國政策上的支持，隨著生物柴油產業的大力發展已出現甘油過剩現象，副產甘油價格低廉，是極具應用前景的發酵原料。
[0006]許多科技工作者嘗試了使用甘油生產表面活性劑，Nitschke等(Nitschke M,Costa SGVAj Contiero J.Rhamnolipid surfactants: an update on the generalaspects of these remarkable biomolecules.BiotechnolProg，2005，21:1593 - 600.)發現銅綠假單胞菌可以利用甘油作為唯一碳源合成鼠李糖脂，但是產量比使用疏水性碳源低。Rahman 等(Rahman KSM, Rahman TJ, McClean S，Marchant R, Bannat IM.Rhamnolipidbiosurfactant production by strains of Pseudomonas aeruginosa usinglow-cost raw materials.Biotechnol.Prog，2002，18:1277 - 81)發現銅綠假單胞菌DS10-129可利用唯一碳源甘油合成鼠李糖脂，濃度為1.77g/L，遠低於使用油脂作為底物合成鼠李糖脂的產量。Reis等人嘗試了包括甘油在內的蔗糖、糖蜜多種廉價原料，認為蔗糖為最佳發酵底物，甘油在其考察體系中不是最佳原料。現有surfactin發酵體系中,存在發酵遲滯期長，發酵周期長，產量低(泡沫中surfactin濃度僅230mg/L)等不足,難以進行工業應用。
[0007]微生物對甘油的攝取和代謝機制已有所解析。甘油和其他無電荷小分子一樣，可以通過被動擴散通過細胞質膜進入細胞；但是細胞在低濃度時，會限制被動擴散中對細胞生長不利的物質吸收，甘油即屬於這一類物質。一些可以利用甘油的菌體，在細胞膜中存在甘油協助蛋白(Glycerol facilitator, GlpF)協助甘油進入細胞。甘油進入胞內後,有兩條代謝途徑，一是通過甘油激酶(Glycerol kinase, GlpK)催化轉化為甘油_3_磷酸進入EMP途徑,另一條是通過甘油脫氫酶(Glycerol dehydrogenase)催化轉化為3_羥基丙醒，再轉化為1，3-丙二醇。但是，大部分微生物不具有三種關鍵酶或酶活較低，無法正常代謝甘油。另外，不經過處理的生物柴油副產物粗甘油中甘油含量只有40-50%，甲醇和脂肪酸皂的含量高達30-40%，另外一些游離鹼、鹽對微生物生長都具有明顯抑制作用。
[0008]綜上，獲得能夠代謝利用粗甘油並高產surfactin的菌株成為其工業化應用的關鍵點。

【發明內容】
[0009]針對現有枯草芽孢桿菌菌株不能利用甘油，特別是生物柴油副產物粗甘油生產脂肽類生物表面活性劑surfactin的缺陷，因此，本發明從勝利油田汙染土壤中分離純化出一株代謝生產脂肽類生物表面活性劑的枯草芽孢桿菌，經過常壓室溫等離子體(ARTP)誘變篩選，得到可以利用甘油作為唯一碳源代謝產生脂肽類生物表面活性劑surfactin的枯草芽孢桿菌菌株。
[0010]本發明的技術目的之一為提供一株枯草芽孢桿菌，其分類命名為枯草芽孢桿菌G-34 {Bacillus subtil is G-34)，於2014年I月6日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏登記號為CCTCC NO:M2014003，該菌可利用甘油作為唯一碳源且可利用粗甘油作為發酵碳源生產脂肽類生物表面活性劑surfactin。
[0011]本發明的另一技術目的之一為提供一種生產脂肽類生物表面活性劑的方法，在生產過程中，需要使用subtil is G-34菌株。
[0012]為了達到發明目的，本發明的技術方案為:
一株枯草芽孢桿菌，其分類命名為枯草芽孢桿菌G-34 {Bacillus subtil is G-34)，於2014年I月6日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏登記號為CCTCC NO:M2014003。
[0013]生產脂肽類表面活性劑的方法，利用權利要求1所述的枯草芽孢桿菌G-34{Bacillus subtil is G-34)菌株進行發酵得到脂肽類表面活性劑產品,其特徵在於,菌株可利用甘油作為唯一碳源的培養基。
[0014]本發明所述的方法，其特徵在於，發酵過程的具體步驟為:
a)取誘變後篩選獲得的原始菌株，使用LB斜面培養基進行活化；
b)取步驟a獲得的菌體接種於種子培養基中，種子培養條件為3(T45°C、pH7.0-8.0，培養時間為12-24h;
c)按照2%-10%(v/v)的接種量將步驟b獲得菌體接種於發酵培養基中，培養條件為30~45°C、pH 7.0~8.0，培養條時間為36_48h;
本發明所述的方法，其特徵在於，所述種子培養基或發酵培養基含有甘油、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱莖杆汁或木質纖維素原料酶解液中的一種或幾種做為碳源，含有黃豆餅粉、玉米餅粉、玉米漿、魚粉、酵母膏、酵母浸粉、蛋白腖、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、氨水、尿素中的一種或幾種做為氮源；並且含有、無機鹽、胺基酸、微量元素。
[0015]對於本發明的中的培養基，應理解為含有葡萄糖等單糖的常規複雜培養基，以及含有各種氮元素的培養基均可作為該菌的培養基發酵生產脂肽類生物表面活性劑surfactin的培養基。
[0016]本發明所述的方法，其特徵在於，所述無機鹽選自磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二銨中的一種或幾種，優選為磷酸二氫鉀和/或磷酸氫二銨。
[0017]本發明所述的方法，，其特徵在於，所述培養基包括銅、鈣、鐵、鋅、鉛、銀、鉻、錳、鎂、菸酸、吡哆酸、硫胺和/或泛酸鈣在內的多種微量元素。
[0018]對上述培養基中各種營養成分，應理解為常規碳源、氮源、無機鹽、微量元素以及其他成分的組合可以滿足枯草芽孢桿菌心subtilis G-34發酵生產脂肽類生物表面活性劑對營養的需求。通過對培養基進行優化，可以進一步提升脂肽類生物表面活性劑surfactin的產量。優選甘油或葡萄糖分別與酵母粉或蛋白腖、磷酸二氫鉀、硫酸銅進行組
入
口 ο
[0019]各營養成分的含量也會影響產物的產量，優選甘油濃度10-40 g/L進行發酵。
[0020]本發明所述的方法，其特徵在於，所述甘油除來源於化學法合成甘油外，還包括化學法、生物法或超臨界法生產生物柴油生產過程中的粗甘油。
`[0021]由於本發明通過誘變育種對產脂肽表面活性劑菌株的甘油代謝能力進行了強化，獲得了能利用甘油高產脂肽表面活性劑的菌株，所以可以有效利用化學法或者生物酶法生物柴油生產過程中產生的粗甘油。
[0022]本發明所述的菌株在發酵製備脂肽類表面活性劑中的應用。
[0023]本發明的有益效果在於:通過誘變育種對產脂肽表面活性劑菌株的甘油代謝能力進行了強化，獲得了能利用甘油高產脂肽表面活性劑的菌株，該工藝具有原料廉價、發酵周
期短、產量高等有益效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是實施例2中脂肽類生物表面活性劑的類一surfactin的紅外圖。
[0025]圖2是枯草芽孢桿菌G-34 {Bacillus subtilis G-34)發酵生產生物表面活性劑情況。
[0026]圖3_a、圖 3_b、圖 3_c、圖 3_d 是枯草芽抱桿菌 G-34 (.Bacillus subtilis G-34)產脂肽類生物表面活性劑的表面活性性能。
[0027]其中，圖3-a是臨界膠束濃度(CMC)的測量；圖3_b是溫度對表面活性的影響；圖3-c是酸鹼度對表面活性的影響；圖3-d是水體礦化度對表面活性的影響。
[0028]本發明所涉及的生物材料,其分類命名為枯草芽孢桿菌subtilisG-34)，於2014年I月6日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC，地址是中國.武漢.武漢大學)，保藏登記號為CCTCC NO:M2014003o
【具體實施方式】
[0029]實施例1本實施例說明獲得枯草芽孢桿菌G-34 (.Bacillus subtil is G_34)的方法。
[0030]包括以下步驟:
I)通過富集培養基獲得在石油汙染土壤中有生物表面活性菌株。
[0031]取勝利油田石油汙染土壤樣品，處理土壤樣品接種於富集培養基獲得富集培養液。利用生物表而活性劑能夠溶血的特性，將富集培養液用劃線和塗布分離方法接種於血平板上，37°C培養24-48h，獲得溶血圈大且透明的單個菌落。
[0032]富集培養基配方為:葡萄糖20 g/L，硫酸銨I g/L，硝酸鈉2 8/1，硫酸鎂0.3 g/L，磷酸二氫鉀I g/L，磷酸氫二鈉4 g/L，酵母粉2 g/L。
[0033]血平板培養基配方為:牛肉膏3 g/L，蛋白腖10 g/L，酵母粉I g/L，氯化鈉5 g/L,瓊脂粉23 g/L，綿羊血8% (v/v)0
[0034]2)鑑定菌株種屬並進行實驗室保藏。
[0035]挑取溶血圈最大的單菌落，經過劃線傳代純化培養後，對菌株進行16S rDNA鑑定，鑑定結果顯示菌株為枯草孢桿菌subtil is ,對其命名為枯草芽孢桿菌subtil is 602,並在實驗室用甘油管保藏法進行原始菌株的凍藏。
[0036]觀Bacillus subtil is 602菌株進行ARTP誘變篩選，獲得能夠將甘油作為唯一碳源的菌株。
[0037]常壓室溫等離子體方法(ARTP)誘變的條件為:氦氣作為工作氣體，在電源輸入功率為100 W、工作氣流量為1`0 L/min、等離子體發射源與樣品之間距離為2 mm的條件下進行ARTP誘變，誘變處理時間為180秒。
[0038]固體篩選培養基的組成為:甘油15 g/L, NH4NO3 2 g/L, KH2PO4 0.6 g/L,MgSO4*7H20 0.4 g/L, FeSO4 0.02 g/L，MnSO4.H2O 0.0017 g/L，瓊脂為 23 g /L。
[0039]挑取能在該固體培養基上生長的枯草芽孢桿菌菌株單菌落，進行產生物表面活性劑實驗。
[0040]4)對誘變後的菌株進行生物表面活性篩選
利用步驟3)獲得菌株在血平板上進行塗板，培養12-24h，在血平板上分離獲得溶血圈大且透明的單個菌落，獲得枯草芽孢桿菌菌株subti I is G-34。
[0041]5)對菌株進行傳代穩定性考察，結果顯示菌株遺傳特性穩定，不存在菌株退化的現象。
[0042]實施例2
本實施例說明對枯草芽孢桿菌菌株subtilis G-34所產生物表面活性劑類型進行初步鑑定的結果。
[0043]認Bacillus subtilis G-34菌株為菌種，以甘油為碳源進行搖瓶發酵，對Bacillus subtilis G-34產生的生物表面活性劑提純，進行FT-1R分析。
[0044]分析結果見附圖1。在IR譜圖上，3303cm-l是由分子鏈間氫鍵引起的NH伸縮振動，1656cm-l及1550cm-l為酞胺譜帶I和II。上述特徵的吸收表表面活性劑分子的親水基是一肽鏈。譜圖2872-2960cm-l和1243-1402cm_l的兩處吸收是脂肪酸族的C-H伸縮振動表該表面活性劑分子的疏水基部分是一脂肪半分子，表明該表面活性劑是一種環狀脂肽類物質。
[0045]實施例3本實施例說明枯草芽孢桿菌subtilis G-34利用純甘油發酵生產脂肽類生物表面活性劑的步驟。
[0046](I)種子培養基配製:酵母浸粉5 g/L，蛋白腖10 g /L, NaCl 10 g/L。121 V滅菌20 min，冷卻待用。
[0047](2)發酵培養基配製:甘油 20 g/L, NH4NO3 2 g/L, KH2PO4 3 g/L, Na2HPO4 10 g/L,MgSO4*7H20 0.2 g/L, FeSO4.7Η20 0.02 g/L。
[0048]培養基用磷酸(lmol/L)調節pH為?.0，121°C滅菌20min，冷卻待用。
[0049](3)挑取一環feci77心subtilis G-34菌株，置於步驟(1)所獲得的培養基中；置於37°C，200rpm培養12h，獲得種子液。
[0050](4)取Iml步驟(3)所獲得Bacillus subtilis G-34種子液接種於50ml步驟(2)所獲得的發酵培養基中。置於37°C，200rpm培養。
[0051](5)實驗結果見附圖2,可以看出，subtilis G-34菌株,在發酵培養過程中，可以快速代謝甘油，高產脂肽類生物表面活性劑surfactin。
[0052]實施例4
本實施例說明枯草芽孢桿菌subtilis G-34利用工業級甘油(>80%)發酵生產脂肽類生物表面活性劑的有益效果。
[0053](I)種子培養基配製:酵母浸粉5 g/L，甘油2 Og/L。115 °C滅菌30 min，冷卻待用。
[0054](2)發酵培養基配製:甘油:20 g/L, NH4NO3 2g/L，KH2PO4 3g/L，Na2HPO4 10g/L，酵母浸粉 0.2g/L, MgSO4.7Η20 0.2g/L, FeSO4.7Η20 0.02g/L, MnS04.H20 0.0017g/L。用磷酸(lmol/L)調節pH為8.0。115°C滅菌30min。冷卻待用。
[0055](3)種子培養:在步驟(1)中所獲得培養基中接種一環枯草芽孢桿菌，於37°C，搖床轉速為200rpm，培養12小時，獲得菌種種子。
[0056](4)發酵培養:將上訴步驟(3)中所獲得種子液以10%的接種量接入步驟(2)所述的發酵培養基中，於37°C，搖床轉速200rpm，培養24小時，獲得脂肽類生物表面活性劑發酵液。
[0057](5)結果顯示，發酵液中脂肽類生物表面活性劑濃度487mg/L。
[0058]實施例5
本實施例說明枯草芽孢桿菌subtilis G-34利用生物柴油副產物生產脂肽類生物表面活性劑的方法步驟。
[0059](I)種子培養基配製:酵母浸粉5g/L，粗甘油15g/L。115°C滅菌30min，冷卻待用。
[0060](2)發酵培養基配製:粗甘油:30g/L，NH4NO3 2g/L，KH2P043g/L, Na2HPO4 10g/L,酵母浸粉 0.2g/L, MgSO4.7H20 0.2g/L, FeSO4.7H20 0.02g/L, MnSO4.H2O 0.0017g/L。用NaOH(lmol/L)調節 pH 為 6.0。115°C滅菌 30min。冷卻待用。
[0061](3)種子培養:在步驟(1)中所獲得培養基中接種一環枯草芽孢桿菌，於37°C，搖床轉速為200rpm，培養12小時，獲得菌種種子。
[0062](4)發酵培養:將上訴步驟(3)中所獲得種子液以2%的接種量接入步驟(2)所述的發酵培養基中，於37°C，搖床轉速200rpm，培養24小時，獲得脂肽類生物表面活性劑發酵液。[0063](5)結果顯示，發酵液中脂肽類生物表面活性劑濃度450mg/L。
[0064]實施例6
本實施例說明利用枯草芽孢桿菌subtilis G-34代謝粗甘油發酵生產脂肽類生物表面活性劑的中試實驗過程。
[0065](I)搖瓶種子培養:將在步驟(1)中所獲得培養基中接種一環枯草芽孢桿菌，於37°C，攪拌轉速為200rpm，培養12小時，獲得搖瓶種子液。
[0066](2) 一級種子培養:將步驟(5)所獲得種子接種到步驟(2)所獲得的培養基中，接種量為5%，於37°C，攪拌轉速為200rpm，溶氧為20%，培養12小時，獲得一級菌種種子。
[0067](3) 二級種子培養:將步驟(6)所獲得種子接種到步驟(3)所獲得的培養基中，接種量為5%，於37°C，攪拌轉速為200rpm，溶氧為20%，培養12小時，獲得二級菌種種子。
[0068](4)發酵培養:將步驟(7)所獲得種子接種到步驟(4)所獲得的培養基中，接種量為6%，於37°C，攪拌轉速為350rpm，通氣量為1VVM，pH7.5，發酵24小時。
[0069]其中
搖瓶種子罐培養基為:酵母浸粉5 g/L，蛋白腖10 g/L，氯化鈉10 g/L。121 °C滅菌20 min。冷卻待用。
[0070]一級種子罐培養基:酵母浸粉I g/L，甘油10 g/L, KH2PO4 I g/L。121 °C滅菌20min。
[0071]二級種子罐培養基:酵母浸粉0.5g/L，粗甘油10g/L，KH2P041g/L, NH4N03 2g/LMgS04*7H20 0.2g/L, FeS04*7H20 0.02g/L, MnS04*H20 0.0017g/L。
`[0072]發酵培養基:粗甘油20 g/L, NH4NO3 2 g/L, KH2PO4 3 g/L, Na2HPO4 3 g/L，酵母浸粉 0.2 g/L，MgSO4.7Η20 0.2 g/L，FeS04.7H20 0.02 g/L,MnSO4^H2O 0.0017 g/L。121 V滅菌 20 min。
[0073]結果顯示，發酵液中脂肽類生物表面活性劑濃度755mg/L。
[0074]實施例7
本實施案例說明subtilis G-34的發酵液的優秀的表面活性功能,及耐酸鹼、耐高溫、耐高礦化度的性能。
[0075](I) Surfactin提純:發酵液在10000 rpm離心10 min,上清用濃鹽酸調節pH至2.0，在4 °C靜置過夜。溶液在10000 rpm下離心10 min，棄上清，用少量蒸餾水重懸沉澱，I mo I/L NaOH調節pH至7.0，樣品在_20°C放置3個小時，凍結後，在真空條件下冷凍乾燥24 h。所得即為表面活性劑粗品，稱重後用無水甲醇超聲溶解，在14 100 rpm離心10 min，上清溶液在40°C下進行旋轉蒸發，得到表面活性劑純品，用於後續樣品性質的各種檢測分析。
[0076](2)臨界膠束濃度(CMC)測定:表面活性劑純品溶於水，配製0-500 mg/L的溶液測定其表面面張力繪製濃度-表面張力曲線圖，計算發酵所得生物表面活性劑的CMC。
[0077](3)理化性質的測定:使用純水配製表面活性劑的濃度為40mg/L.考察其在pH1-13 ;溫度30-120 V ;礦化度:在5 Og/L的氯化鈉溶液中，氯化鈣濃度0-130 g/L等範圍內的表面張力。
[0078](4)乳化性能的測定:取發酵液2 ml加入含有2 ml煤油的試管中，震蕩5 min，靜置24小時，測定其乳化指數。同時3 g/L的SDS溶液作為對照。[0079](5)實驗結果:通過附圖3的a-d圖，可以看出其CMC為20mg/L，遠低於化學類表面活性劑。並且其在酸鹼、高溫、高礦化度方面性能優越。
[0080](6)乳化指數測定結果:發酵液與煤油的乳化指數為:64% ；3g/L的SDS與煤油的乳化指數為:37%。結果表明在surfactin在較低濃度下其乳化效果強於常用表面活性劑。
[0081]實施例8-12
本實施例說明枯草芽孢桿菌subtilis G-34利用其它碳源和氮源以及營養成分代謝生產生物表面活性劑的情況。
[0082]培養方法採取實施例5所用的方法進行培養。
[0083]種子培養基中碳源取用毒性較大的10g/L的粗甘油，採用lg/L的酵母粉作為氮源。
[0084]實施例8-12中，發酵培養基中碳源分別選取粗甘油、葡萄糖、玉米糖化醪、甜高粱莖杆汁以及纖維素酶解液作為碳源。其相應濃度為甘油20 g/L;葡萄糖200 g/L;玉米糖化醪和甜高粱莖杆汁按比例稀釋至其葡萄糖濃度為20-40 g/L的濃度範圍；纖維素酶解液按需要將固含量稀釋至30 %以下。
[0085]實施例8-12中，對照碳源的選擇，其對應的氮源選用玉米漿、魚粉、酵母膏、氨水、尿素其濃度分別為 4 g/L、10 g/L、l g/L、0.5 g/L、2 g/L。
[0086]實施例8-12中，分別加入2 g/L的磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二銨作為磷源。
[0087]發酵結束後，測定脂肽類生物表面活性劑的濃度。
[0088]測定結果如表1所示: _
【權利要求】
1.一株枯草芽孢桿菌，其分類命名為枯草芽孢桿菌G-34(feci77心subtil is G_34)，於2014年I月6日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏登記號為CCTCC NO:M2014003。
2.—種生產脂肽類生物表面活性劑的方法，利用權利要求1所述的枯草芽孢桿菌G-34{Bacillus subtil is G-34)菌株進行發酵得到脂肽類生物表面活性劑產品,其特徵在於，菌株在發酵過程中，可利用甘油作為唯一碳源。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，發酵過程的具體步驟為: a)取誘變後篩選獲得的原始菌株，使用LB斜面培養基進行活化； b)取步驟a獲得的菌體用於擴大培養，擴大培養條件為3(T45°C、pH7.0-8.0，培養時間為12-24h，擴大培養級數為1-3級； c)按照體積百分比29TlO%的接種量將步驟b獲得菌體接種於發酵培養基中，培養條件為30~45°C、pH 7.0~8.0，培養條時間為24_36h。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述擴大培養基或發酵培養基含有甘油、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱莖杆汁或木質纖維素原料酶解液中的一種或幾種做為碳源，含有黃豆餅粉、玉米餅粉、玉米漿、魚粉、酵母膏、酵母浸粉、蛋白腖、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、氨水、尿素中的一種或幾種做為氮源；並且含有、無機鹽、胺基酸、微量元素。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述無機鹽選自磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二銨中的一種或幾種，優選為磷酸二氫鉀和/或磷酸氫二銨。
6.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述培養基包括銅、鈣、鐵、鋅、鉛、銀、鉻、錳、鎂、菸酸、吡哆酸、硫胺和/或泛酸鈣在內的多種微量元素。
7.根據權利4所述的培養基，其特徵在於，所選碳源濃度以培養基中的葡萄糖計，其含量為1-200 g/L，優選40-80g/L ;所選氮源濃度為0.5-20 g/L，優選2-10 g/L。
8.根據上述任一權利要求所述的方法，其特徵在於，所述甘油除來源於化學法合成甘油外，還包括化學法、生物法或超臨界法生產生物柴油生產過程中的粗甘油。
9.權利要求1所述的菌株在發酵製備脂肽類表面活性劑中的應用。
【文檔編號】C12R1/125GK103865855SQ201410111740
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月25日 優先權日:2014年3月25日
【發明者】李霜, 劉強, 黃和, 江凌 申請人:南京工業大學