G6PC2編碼的β細胞表面標籤的製作方法

2023-07-05 09:05:11

專利名稱：G6PC2編碼的β細胞表面標籤的製作方法
技術領域：
本發明涉及選擇性細胞表面標記，其是由G6PC2編碼的胰島特異性葡糖-6-磷酸催化亞基相關蛋白(IGRP)的胞外部分，並且可供選擇和定量測定包含完全分化的胰腺內分泌β細胞表型的細胞的獨特亞群。在一個實施方案中，G6PC2編碼的β細胞表面標籤是剪接變體。還包括其序列、組合物、細胞培養物和完全分化的β細胞的細胞群體以及產生完全分化的β細胞和檢測完全分化的β細胞的方法。
背景技術：
β細胞移植對改進1型糖尿病的治療有著巨大前景，但是首先需要克服許多障礙。其中之一是缺乏可利用的供體胰島。胚胎幹(EQ細胞衍生的β細胞基本上可以供應無數的β細胞用於移植，但是還未開發出用於產生完整功能的β細胞的可靠方案。對於小鼠和人 ES 細胞兩者，在例如 WO 2005/116073,WO 2005/063971 和 US 2006/0148081 中報導了由胚胎幹細胞形成的定型內胚層(DE)細胞。由例如DE細胞有效地形成胰內胚層(PE) 細胞對形成用於治療糖尿病的產胰島素β細胞是有利的。在培養完全分化的胰島細胞的嘗試中，目標一直是分離胰細胞，包括能夠分化成胰β細胞或胰島的胰內分泌先祖細胞。從外分泌譜系分離胰內分泌譜系的一個重要步驟可能是鑑定可識別的對胰內分泌先祖細胞和/或其子代有特異性的細胞標記，特別是對成熟的產胰島素的β細胞有特異性的標記。為此對胞內和胞外標記兩者進行了研究。已經對胞內標記，特別是對在發育成完全分化的胰島細胞的胚胎胰細胞中檢出的轉錄因子作為祖代標記進行了廣泛的研究。例如，對PdX-l、Ngn3、I^X6和Isl-I等轉錄因子進行了研究。 它們在胚胎發育成胰內分泌細胞期間進行編程的細胞中表達。然而，這些胞內標記提供比胞外標記少的實用價值，因為分析這些標記的表達需要殺死細胞或將報導基因經遺傳工程改造至細胞中而對細胞進行永久修飾。一經鑑定，胞外標記可提供優勢，使得表達標記的細胞可在無菌條件下進行分選並繼續生存。已對作為胰島祖代標記的上皮細胞黏著分子(例如Ep-CAM和整聯蛋白)進行了研究。附圖簡述

圖1表示全長人G6PC2編碼的肽的整體組構一表示跨膜序列段以及5個ER腔結構域和5個胞質結構域。外顯子-外顯子間的邊界用灰色圓圈和箭頭標註。預測包含活性中心的胺基酸殘基用實心黑色圓圈標註。殘基92-94上的Asn-聯糖基化位點用作寡糖的接納體。圖2表示小鼠和人G6PC2編碼的肽的全長ClustalW比對。在人和小鼠蛋白質序列間的行中，相同殘基用胺基酸的一字母代碼標註，保守取代用「 + 」標註，非保守取代用「」 標註，即空白。發明概述在一個實施方案中，本發明涉及由G6PC2編碼的分離肽，其中所述肽包含i)胞外部分和ii)G6PC2的一個或多個外顯子的缺失，前提條件是所述肽不是MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYTFLNFMSNVGDPRNIFFIYFPLCFQFNQTVGTKMIWVAVIGDWLNLIFKWKSIffPCNGRILCLVCHGNRCPE PHCLffDG0在一個實施方案中，本發明涉及由G6PC2編碼的分離肽，其中所述肽包含i)胞外部分，和ii)G6PC2的一個或多個外顯子的缺失以及編碼所述肽的分離核苷酸和表達所述肽的分離細胞。在一個實施方案中，本發明涉及鑑定完全分化的β細胞的方法，所述方法包括使包含胰細胞的細胞群體與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑接觸。在一個實施方案中，本發明涉及獲得完全分化的β細胞的培養物的方法，所述方法包括使包含胰細胞的細胞群體與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑接觸，並且將對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞流分中的與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑結合的細胞從不與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑結合的細胞中分離出來。在一個實施方案中，本發明涉及向在其至少一種胰腺激素產生中有缺陷的哺乳動物提供胰內分泌功能的方法，其中細胞通過本文限定的方法獲得，所述方法還包括以下步驟將所獲得的細胞以足以在哺乳動物中產生可測量的至少一種胰腺激素的量植入哺乳動物。在一個實施方案中，所述至少一種胰腺激素是胰島素。在一個實施方案中，哺乳動物是人。在一個實施方案中，本發明涉及通過以下步驟定量測定對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的包含胰細胞的細胞的方法a)使細胞與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑接觸；和b)測定展示作為細胞表面標記的G6PC2編碼的β細胞表面標籤的細胞 (對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞)的量。在一個實施方案中，本發明涉及用於體外方案優化的方法，其中定期監測表達 G6PC2編碼的β細胞表面標籤的細胞(對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞) 的數目。在一個實施方案中，本發明涉及通過本文限定的方法獲得的分離的完全分化的β 細胞。在一個實施方案中，本發明涉及包含通過本文限定的方法獲得的分離的完全分化的β細胞的組合物。在一個實施方案中，本發明涉及結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑在鑑定或選擇表達作為細胞表面標記的G6PC2編碼的β細胞表面標籤的細胞中的用途。在一個實施方案中，本發明涉及作為細胞表面標記的G6PC2編碼的β細胞表面標籤在獲得胰內分泌細胞的培養物中的用途。在一個實施方案中，同時或序貫使用一種或多種另外的細胞表面標記以獲得胰內分泌細胞的培養物。在一個實施方案中，另外的細胞表面標記選自DNER 蛋白、DDRl蛋白、膜突結合蛋白(prominin) 1 (亦稱CD133)和CD49f。在一個實施方案中， 另外的細胞表面標記是DNER蛋白或DDRl蛋白。在一個實施方案中，G6PC2編碼的β細胞表面標籤是全長IGRP的一部分。在一個實施方案中，本發明涉及與G6PC2編碼的β細胞表面標籤特異性結合的抗體。在一個實施方案中，本發明所述G6PC2編碼的β細胞表面標籤如本文中定義。發明詳述出乎意料的發現，G6PC2編碼的表位，任選其剪接變體，提供對完全分化的β細胞有用的標記。在一個實施方案中，G6PC2編碼的全長肽和/或其片段提供對完全分化的β 細胞有用的標記。在一個實施方案中，G6PC2編碼的非全長肽和任選其剪接變體提供對完全分化的β細胞有用的標記。在一個實施方案中，非全長G6PC2編碼的肽偏移到這類細胞的表面。在一個實施方案中，本文定義的G6PC2的特定剪接變體的N端序列偏移到這類細胞的表面。在一個實施方案中，所有已知的G6PC2的剪接變體與正常朝向ER(內質網)腔定位的全長變體有著共同的N端胺基酸序列。在一個實施方案中，非全長剪接變體不保留在ER中，而終止於細胞表面質膜，其中N端序列因此用作β細胞的純化標籤。在一個實施方案中，分離肽存在於細胞的外表面和/或在細胞的外表面上可檢出。在一個實施方案中，本文描述的方法，例如鑑定方法，可用於測定是否存在於細胞的外表面上和/或在細胞的外表面上可檢出。G6PC2本文使用的「G6PC2編碼的肽」、「胰島特異性葡糖-6-磷酸催化亞基相關蛋白」或 「IGRP」是指所有哺乳動物形式的IGRP，包括人和小鼠。在一個實施方案中，G6PC2是編碼 IGRP的人基因。IGRP具有十分有限的內分泌β-胰島表達。IGRP還以低水平在胸腺中表達。全長IGPR由5個外顯子編碼，是一種複雜的內質網(ER)的膜蛋白，具有9個跨膜序列段，導致5個蛋白質結構域定位於ER腔，5個結構域定位於胞質，參見圖1。小鼠G6PC2的胺基酸序列(SEQ ID NO 2)見圖2。人G6PC2的胺基酸序列(SEQ ID NO 1)如下，其中有下劃線的胺基酸表示外顯子接點。1 MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYTFLNFMSNVGDPRNIFFIYFPLCFQFNQTVGTKMIWV61 AVI⑶WLNLIFKIILFGHRPYWWVQETQIYPNHSSPCLEQFPTTCETGPGSPSGHAMGAS121 CVWYVMVTAALSHTVCGMDKFSITLHRLTWSFLffSVFWLIQISVCISRVFIATHFPHQVI181 LGVIGGMLVAEAFEHTPGIQTASLGTYLKTNLFLFLFAVGFYLLLRVLNIDLLWSVPIAK241 KffCANPDWIHIDTTPFAGLVRNLGVLFGLGFAINSEMFLLSCRGGNNYTLSFRLLCALTS301 LTILQLYHFLQIPTHEEHLFYVLSFCKSASIPLTVVAFIPYSVHMLMKQSGKKSQ作為內質網(ER)膜蛋白的G6PC2編碼的蛋白質由於其胞內定位而不被視為細胞表面標記的候選標記。然而，替代性mRNA加工很可能導致ER滯留信號(與作為ER滯留信號的典型的C端KDEL序列相比，其可能具有不明確的特徵)丟失，且這類剪接變體然後可偏移到表面上。本文公開的新數據表明，鑑定出在胰島中表達的迄今未知的G6PC2編碼的剪接變體。這些變體中的一些與導致表位中新的胺基酸序列段的移碼以及縮短的蛋白質偏移到細胞表面有關，在此它們用作胰島β細胞的獨特標記。在一個實施方案中，剪接變體保持完整N端。若干剪接變體表現出相當的結構改變，包括特定結構域由胞質暴露轉變為胞外暴露，而且包括丟失ER滯留信號並在細胞表面膜上蓄積。本發明的發明人發現，N端表位以及β細胞選擇性剪接變體產生的IGRP表位是成熟產胰島素細胞的新的表面標籤。在一個實施方案中，所述表位(亦稱標籤或表面標籤) 可用於例如抗體介導的來源於細胞製備物的成熟β細胞的細胞純化(例如由分化的hESC 產生的人β細胞)以及使用這類標籤作為β細胞群體體外和體內定量或成像的靶標。在一個實施方案中，針對G6PC2編碼的β細胞表面標籤產生的抗體可用來從混合細胞群體中純化出成熟β細胞。在一個實施方案中，混合細胞群體來源於胰腺組織和/或
5來源於衍生自分化幹細胞的內分泌培養物。本文使用的「G6PC2編碼的β細胞表面標籤」、「G6PC2編碼的表位」、「G6PC2編碼的 β細胞表面標記」或「G6PC2剪接變體編碼的β細胞表面標籤」是指由G6PC2編碼的IGRP 的胞外序列或其剪接變體。在一個實施方案中，本發明的分離肽可用作G6PC2編碼的β細胞表面標籤。在一個實施方案中，G6PC2編碼的β細胞表面標籤包含在本發明的分離肽中。在一個實施方案中，G6PC2編碼的β細胞表面標籤是本發明的分離肽。在一個實施方案中，本發明涉及由G6PC2編碼的分離肽，其中所述肽包含i)胞外部分，和ii)G6PC2的一個或多個外顯子的缺失。在一個實施方案中，所述肽包含胞外部分。 在一個實施方案中，所述肽由胞外部分組成。在一個實施方案中，所述胞外部分包含表位。 在一個實施方案中，所述分離肽包含選自G6PC2的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4 和外顯子5的一個或多個外顯子中所包含的序列。在一個實施方案中，所述分離肽是選自 G6PC2的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4和外顯子5的一個外顯子或若干鄰接外顯子中所包含的序列片段。在一個實施方案中，所述分離肽包含選自一個或多個選自G6PC2 的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4和外顯子5的序列的缺失。在一個實施方案中，所述分離肽包含N端的G6PC2編碼的剪接變體部分的連續序列並且在C端截短。在一個實施方案中，所述分離肽包含選自以下的序列及其變體MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYT(SEQ ID NO 3), MLVAEAFEHTPGIQ(SEQ ID NO :8)、 LLSCRGGNNY(SEQ ID NO :5)和 HMLMKQSGKKSQ(SEQ ID NO :6)。在一個實施方案中，所述分離肽包含序列MLVAEAFEHTPGIQTASLGT(SEQ ID NO 4)或其變體。在一個實施方案中， 所述分離肽由選自以下的序列及其變體組成MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYT(SEQ ID NO
3)、MLVAEAFEHTPGIQ(SEQID NO 8)、LLSCRGGNNY(SEQ ID NO :5)和 HMLMKQSGKKSQ(SEQ ID NO 6) ο在一個實施方案中，所述分離肽由序列MLVAEAFEHTPGIQTASLGT(SEQ ID NO:
4)或其變體組成。在一個實施方案中，G6PC2剪接變體編碼的β細胞表面標籤包含在G6PC2的外顯子1中。在一個實施方案中，N端G6PC2編碼的β細胞表面標籤是 MDFLHRNGVLI IQHLQKDYRAYYT (SEQ ID NO :3)。在一個實施方案中，G6PC2 剪接變體編碼的 β細胞表面標籤來源於G6PC2的外顯子1、2和5。在一個實施方案中，G6PC2剪接變體編碼的 β 細胞表面標籤選自 MLVAEAFEHTPGIQ (SEQ ID NO 8) ,LLSCRGGNNY (SEQ ID NO :5)和 HMLMKQSGKKSQ (SEQ ID NO :6)。在一個實施方案中，G6PC2剪接變體編碼的β細胞表面標籤是 MLVAEAFEHTPGIQTASLGT(SEQ ID NO :4)。在一個實施方案中，所述分離肽包含與選自以下的胺基酸序列有至少80%，例如至少90%或至少96%同一性的天然存在的胺基酸序列MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYT(SEQ ID NO 3) , MLVAEAFEHTPGIQ (SEQ ID NO 8)、LLSCRGGNNY (SEQ ID NO :5)禾口 HMLMKQSGKKSQ (SEQ ID NO :6)。在一個實施方案中，所述分離肽包含與胺基酸序列 MLVAEAFEHTPGIQTASLGT (SEQ ID NO 4)有至少80%，例如至少90%或至少96%同一性的天然存在的胺基酸序列。在一個實施方案中，G6PC2剪接變體編碼的β細胞表面標籤由至少 4個，例如至少6、8、10、12、14或16個胺基酸組成。在一個實施方案中，G6PC2編碼的β細胞表面標籤是全長IGRP的一部分。在一個實施方案中，G6PC2編碼的β細胞表面標籤是IGRP的非全長剪接變體的一部分。在一個實施方案中，G6PC2編碼的β細胞表面標籤是IGRP的非全長剪接變體。在一個實施方案中，G6PC2編碼的β細胞表面標籤是選自G6PC2的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子 4和外顯子5的一個外顯子或若干鄰接外顯子中所包含的序列片段。在一個實施方案中，本發明涉及編碼本文限定的肽的分離核苷酸。在一個實施方案中，本發明涉及表達本文限定的肽的分離細胞。在一個實施方案中，G6PC2編碼的β細胞表面標籤包含胞外序列。在一個實施方案中，G6PC2編碼的β細胞表面標籤由胞外序列組成。在一個實施方案中，G6PC2編碼的β細胞表面標籤是本文限定的分離肽的片段。 在一個實施方案中，G6PC2編碼的β細胞表面標籤是全長IGRP的一部分。在一個實施方案中，本發明涉及編碼本文限定的G6PC2編碼的β細胞表面標籤的分離核苷酸。在一個實施方案中，本發明涉及表達本文限定的G6PC2編碼的β細胞表面標籤的分離細胞。本文使用的「剪接變體」是指RNA剪接變異機制，其中主要基因轉錄物pre-mRNA 的外顯子被分離並重新連接以產生替代性核糖核苷酸排列。這些線性組合然後進行翻譯加工，其中限定了具體而獨特的胺基酸序列，導致同工型蛋白。本文使用的「……的片段」是指比所提及的序列短的序列。本文使用的「……的部分」或「非全長」是指包含在所提及的較大序列中的序列。在一個實施方案中，術語「肽」和「胺基酸序列」是指寡肽、肽、多肽或蛋白質序列， 或者這些當中任一個的片段。在一個實施方案中，術語「胺基酸」和「胺基酸序列」是指寡肽、肽、多肽或蛋白質序列，或者這些當中任一個的片段，以及天然存在的或合成的分子。其中所列舉的「胺基酸序列」是指天然存在的蛋白質分子的序列，「胺基酸序列」等術語並不把胺基酸序列限於與所引述的蛋白質分子有關的完全天然的胺基酸序列。在一個實施方案中，特定核酸序列的「變體」定義為與一個核酸序列某一長度內的特定核酸序列有至少40%序列同一性的核酸序列。在一個實施方案中，特定核酸序列的「變體」定義為應用具有「BLAST 2序列」工具2. 0. 9版(1999年5月7日)、設置為默認參數的 blastn,與一個核酸序列某一長度內的特定核酸序列有至少40 %序列同一性的核酸序列。 這類核酸對在某一限定長度內可具有例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%，或至少99%或更大的序列同一性。剪接變體可能與參比分子有顯著同一性，但是由於mRNA加工期間的可變剪接，一般可具有較多或較少的多核苷酸數目。相應的多肽可具有額外功能結構域或缺乏存在於參比分子中的結構域。在一個實施方案中，特定多肽序列的「變體」定義為與一個多肽序列某一長度內的特定多肽序列有至少40%序列同一性或序列相似性的多肽序列。在一個實施方案中，特定多肽序列的「變體」定義為應用具有「BLAST 2序列」工具2. 0. 9版(1999年5月7日)、設置為默認參數的blastp,與一個多肽序列某一長度內的特定多肽序列有至少40 %序列同一性或序列相似性的多肽序列。這類多肽對可在一個多肽某一限定長度內具有例如至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、 至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%或更大的序列同一性或序列相似性。在一個實施方案中，「同一性」或」序列同一性」在與其相比較的整個長度的序列 (即參比序列)內進行測定。以測定兩個序列之間的序列同一性的測定方法為例，對QBCDE和ABCDE進行比對。將經過比對的相同的殘基數減去不同的殘基數，除以ABCDE中殘基的總數，得到QB⑶E相對於AB⑶E的序列同一性。因此，所述實例的序列同一性為(5-1)/5。在一個實施方案中，用於多肽序列的表述「百分比同一性」和「％同一性」是指應用標準化算法比對的至少兩個多肽序列之間相同殘基匹配的百分比。多肽序列比對的方法是眾所周知的。一些比對方法考慮了保守胺基酸取代。這類保守取代一般維持取代位點上的電荷和疏水性，因此維持多肽的結構(及其功能)。在一個實施方案中，用於多肽序列的表述「百分比相似性」和「 ％相似性」是指應用標準化算法比對的至少兩個多肽序列之間殘基匹配的百分比，包括相同的殘基匹配和保守取代。相比之下，在計算多肽序列之間的百分比同一性時不包括保守取代。在一個實施方案中，當併入MEGALIGN 3. 12e版序列比對程序時，可採用CLUSTAL V算法的默認參數，來計算多肽序列之間的百分比同一性，例如序列同一性。對於應用 CLUSTAL V的多肽序列的兩兩比對，默認參數設置如下Ktuple = 1，空位罰分=3，窗=5， "diagonals saved」= 5。選擇PAM250矩陣作為默認殘基權重表。在一個實施方案中，NCBI BLAST軟體套件可用於測定百分比同一性，例如序列同一性。例如，對於兩個多肽序列的兩兩比較，可以應用具有設置為默認參數blastp的「BLAST 2序列」工具2.0. 12 (2000年4 月 21 日)；這類默認參數可以是例如:Matrix :BL0SUM62 ；Open Gap :11，Extension Gap 1 penalties ；Gap χ drop-off。—50 ；Expect :10 ；Word Size :3 ；Filter :on。在一個實施方案中，百分比同一性，例如序列同一性，可以在整個限定的多肽序列長度內測定，例如由具體SEQ ID編號限定，或者可在較短長度內測定，例如在取自較大的限定多肽序列的片段長度內，例如至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少 150個連續殘基的片段。這些長度只是示例性的，要理解的是，由在表格、附圖或序列表中所示序列支持的任何片段長度，都可用來描述可在其間測定百分比同一性的長度。在一個實施方案中，本發明不涉及MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYTFLNFMSNVGDPRNIFF IYFPLCFQFNQTVGTKMIWVAVI⑶WLNLIFKWKSIWPCNGRILCLVCHGNRCPEPHCLWDG 或 W02004001008 定義的 SEQ ID No. 38。胰內分泌細胞及其祖代在胰腺中，可存在若干不同類型的胰細胞。這些細胞包括例如多能胰祖細胞、導管 /內分泌祖細胞、內分泌前祖細胞、內分泌祖細胞、早期內分泌細胞、完全分化的內分泌細胞和/或完全分化的β細胞。在本文中可互換使用的「胰內分泌細胞」或「胰腺激素表達細胞」是指能夠表達至少一種以下激素的細胞胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素、胰多肽和生長素釋放肽。本文使用的「胰腺激素分泌細胞」是指能夠分泌至少一種以下激素的胰內分泌細胞胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素、胰多肽和生長素釋放肽。本文使用的「胰內分泌前祖細胞」(亦稱「胰內分泌前祖代，，和「內分泌前祖代，，) 是這樣的細胞，其已失去其發育成胰導管和外分泌細胞的潛力，尚未表達Ngn3蛋白，且不表達激素，但是其具有分化成胰內分泌細胞或胰腺激素分泌細胞的能力，並且通常還享有這些細胞的至少部分表型特徵。本文使用的「胰內分泌祖細胞」(亦稱「胰內分泌祖代」和「內分泌祖代」)是這樣的細胞，其是Ngn3蛋白表達細胞卻不是激素表達細胞，但其具有分化成胰內分泌細胞或胰腺激素分泌細胞的潛力，並且通常還享有這些細胞的至少部分表型特徵。本文使用的「早期內分泌細胞」(亦稱「胰早期內分泌細胞」)是這樣的內分泌細胞，其已關閉Ngn3但不享有成體胰腺的胰島中存在的完全分化的胰內分泌細胞的全部特徵(例如對葡萄糖的響應性)。早期內分泌細胞可能對胰內分泌激素之一(胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素、胰多肽和生長素釋放肽)呈陰性或陽性。本文使用的「完全分化的內分泌細胞」(亦稱「胰成熟內分泌細胞」)是享有成體胰腺的胰島中存在的完全分化的胰內分泌細胞的全部特徵的細胞。「胰腺激素表達細胞」和 「胰腺激素分泌細胞」被視為範圍為早期表型到完全分化表型的「胰內分泌細胞」。本文使用的「完全分化的β細胞」(亦稱「成熟β細胞」)是葡萄糖敏感性產胰島素β細胞，以構成成體胰腺中胰島的主要細胞類型為特徵。本文使用的「 β細胞譜系」是指對於轉錄因子Pdx-I和至少一種以下轉錄因子具有陽性基因表達的細胞Ngn-3、Nkx2. 2、Nkx6. 1、NeuroD, IsI-U Hnf-3 β、MafA, Pax4 和 1^x6。表達β細胞譜系特有標記的細胞包括β細胞。本文使用的「導管/內分泌祖細胞」是這樣的細胞，其在早期胰腺發育中存在於中心部分並保持成為成熟導管細胞、完全分化的內分泌細胞或完全分化的β細胞的雙潛能。 此外，這些細胞表達轉錄因子Pdxl和Nkx6. 1，而不表達Ptf la。導管/內分泌祖細胞的實例可存在於小鼠約el2. 0的發育階段。本文使用的「多能胰祖細胞」是代表胰腺最早期細胞的細胞。這些細胞獨特的特徵在於以下3個關鍵轉錄因子的三陽性細胞PdXl+/NkX6. Γ/Ptfla+。本文使用的「標記」是在目標細胞中差異性表達的核酸或多肽分子。在這種情況下，差異性表達是指陽性標記的水平升高和陰性標記的水平降低。與其它細胞相比，目標細胞中的標記核酸或多肽的可檢測水平足夠高或低，使得可採用本領域已知各種方法中的任一種，鑑定目標細胞，並且將目標細胞與其它細胞區分開來。在一個實施方案中，通過本發明的方法獲得的胰內分泌細胞是產胰島素細胞，任選與分化成產胰高血糖素、促生長素抑制素、胰多肽和/或生長素釋放肽細胞的細胞一起。 本文使用的「產胰島素細胞」是指產生和貯存或分泌可檢出量的胰島素的細胞。「產胰島素細胞」可以是單個細胞或細胞集合體。細胞的「傳代」通常是指接種的培養容器由部分匯合狀態到匯合狀態的轉變，屆時將其從培養容器中取出，並以較低密度重新接種在培養容器中。然而，細胞可在達到匯合前傳代。在細胞群體生長達到匯合的同時，傳代通常導致細胞群體增殖。細胞群體的增殖取決於最初的接種密度，但通常為1-10、1-5、1-3或1-2倍增殖。因此，傳代一般需要細胞在培養物中能夠進行大量的細胞分離。包含胰細胞的細胞群體本文使用的術語「包含胰細胞的細胞群體」是指包含一種或多種選自以下細胞類型的細胞群體腺泡和導管細胞、多能胰祖細胞、導管/內分泌祖細胞、胰內分泌前祖細胞、 胰內分泌祖細胞、早期胰內分泌細胞、胰內分泌細胞、胰β細胞、胰腺激素分泌細胞、胎胰細胞、成體胰細胞和其它非胰細胞。細胞的「群體」是指通過特殊分離的起始細胞或培養步驟所獲得的大量細胞。細胞群體的性質一般定義為具有特定性質的各細胞的百分比(例如特定標記染色呈陽性的細胞的百分比)或當測定整個群體時所述性質的總體平均值(例如由細胞群體製成的裂解物中mRNA的量或Ngn3、I^X6、胰島素或胰高血糖素等組織化學可檢測標記呈陽性的細胞的百分比)。在一個實施方案中，包含胰細胞的細胞群體由胰腺獲得。在一個實施方案中，包含胰細胞的細胞群體從胎胰腺或成體胰腺獲得。在一個實施方案中，胰腺從哺乳動物(例如人)獲得。在本發明的一個實施方案中，包含胰細胞的細胞群體由體細胞群體獲得。在本發明的一個實施方案中，體細胞群體被誘導去分化成胚胎樣幹(ES，例如多潛能)細胞。這類去分化的細胞亦稱誘導多潛能幹細胞(IPS)。在一個實施方案中，包含胰細胞的細胞群體由胚胎幹(ES，例如多潛能)細胞獲得。在一個實施方案中，包含胰細胞的細胞群體是多潛能細胞，例如ES細胞。在一個實施方案中，包含胰細胞的細胞群體是多潛能細胞，例如ES樣細胞。在一個實施方案中，包含胰細胞的細胞群體是胚胎分化型幹(ES或多潛能)細胞。 分化發生在胚胎樣小體和/或單層細胞培養物或其組合中。在一個實施方案中，包含胰細胞的細胞群體來源於哺乳動物。在一個實施方案中， 包含胰細胞的細胞群體來源於人。在本發明的一個實施方案中，細胞群體分化成胰內分泌譜系。在一個實施方案中，包含胰細胞的細胞群體由一個或多個捐贈胰腺獲得。本文描述的方法不依賴於捐贈胰腺的發育年齡。因此，可以使用從發育年齡範圍為胚胎至成人的捐贈者中分離出來的胰材料。—旦從捐贈者收穫胰腺，通常採用不同的方法加工產生單個細胞或小群細胞以進行培養。一種這樣的方法要求清洗和製備收穫的胰腺組織以進行酶消化。採用酶加工以消化結締組織，使得收穫組織的實質分解成較小單位的胰細胞材料。收穫的胰腺組織用一種或多種酶處理以從收穫器官的整體結構中分離出胰細胞材料、亞結構和單個胰細胞。可預期與本文公開的方法一起使用的包括膠原酶、DNA酶、Liberase製備物(參見美國專利號 5，830，741 和 5，753，485)和其它酶。可進一步加工分離的起始材料以富集一種或多種所需要的細胞群體。然而，未分級分離的胰腺組織，一旦從培養物中分離，便還可直接用於本發明的培養方法而無需進一步分離。在一個實施方案中，分離的胰細胞材料通過密度梯度(例如尼可登(Nycodenz)、菲可(Ficoll)或珀可(Percoll))經離心純化。例如，美國專利號5，739，033中披露的梯度方法，可用作富集加工的胰島中的胰材料的方法。由供體源收穫的細胞的混合物通常是異質的，因此含有α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、導管細胞、腺泡細胞、兼性祖細胞和其它胰細胞類型。典型的純化步驟導致分離的細胞材料分離成許多層或界面。通常形成兩個界面。 上界面富含胰島，懸液中通常含有10-100%胰島細胞。第二界面通常是混合的細胞群，含有胰島、腺泡和導管細胞。底層是在梯度底部形成的沉澱。該層通常主要含有腺泡細胞、一些截留胰島和一些導管細胞。可分別收集導管樹成分(Ductal tree component)用於進一步操作。選用於進一步操作的流分中的細胞組分將隨選擇的梯度的流分和每次分離的最終結果而變化。當胰島細胞是所需要的細胞類型時，分離流分中適當富集的胰島細胞群體可含有至少10% -100%胰島細胞。在富集後，還可收穫其它胰細胞類型和濃度。例如，本文描述的培養方法可用於自第二界面、沉澱或其它流分中分離的細胞，這取決於所採用的純化梯度。在一個實施方案中，從富含胰島(上部)的流分產生中間胰細胞培養物。然而，通常含有胰島、腺泡和導管細胞或導管樹組分、腺泡細胞和一些截留胰島細胞的混合細胞群體的更混雜的第二界面和底層流分另外也可分別用於培養。雖然兩層均含有能夠產生本文所述G6PC2陽性群體的細胞，但是各層對用於所公開的方法，都可具有特殊優勢。在一個實施方案中，從富含胰島的(上部)流分中產生G6PC2陽性胰細胞培養物。在一個實施方案中，細胞群體是幹細胞群體。在本發明的一個實施方案中，細胞群體是分化成胰內分泌譜系的幹細胞群體。幹細胞是由其以單細胞水平自我更新以及分化而產生子代細胞(包括自我更新祖代、非更新祖代和最終分化的細胞)的能力界定的未分化細胞。幹細胞的特徵還在於其體外從多胚層(內胚層、中胚層和外胚層)分化成各種細胞譜系的功能細胞、以及移植後產生多胚層的組織和注射至胚泡後實質上有助於大多數(如果不是全部的話)組織的能力。幹細胞因其發育潛力而分為(1)全能，是指能夠產生所有的胚胎和胚外細胞類型；( 多潛能(Pluripotent)，是指能夠產生所有的胚胎細胞類型；C3)多能 (multi-potent)，是指能夠產生細胞譜系亞群，但全都屬於特定的組織、器官或生理系統 (例如產生包括HSC (自我更新)、限於血細胞的寡能祖代及是血液正常組分的所有細胞類型和組分(例如血小板)在內的子代的造血幹細胞(HSC)) ； (4)寡能，是指能夠產生比多能幹細胞更局限的細胞譜系亞群；和( 單能，是指能夠產生單一細胞譜系(例如生精幹細胞)。由幹細胞獲得胰細胞的方案以D' Amour，K. A.等Q006)，Nat Biotechnol 24， 1392-401 Jiang, J.等(2007)，Stem Cells 25，1940-53 ；以及 Kroon，Ε.等(2008)，Nat Biotechnol，2008年2月20日[印刷版前的電子版]中描述的方案為例，但不限於此。由體細胞或誘導去分化成多潛能細胞(例如ES樣細胞)的體細胞獲得胰細胞的方案以Aoi，T.等0008)，kience，2008年2月14日，[印刷版前的電子版]；D' Amour, K. Α.等(2006)，Nat Biotechnol 24，1392-401 Jiang，J.等(2007)，Stem Cells 25， 1940-53 ； Kroon, Ε.等(2008), Nat Biotechnol，2008 年 2 月 20 日，[印刷版前的電子版]； Takahashi,K.等(2007)，Celll31，861-72 ；TakahashiX 和 Yamanaka，S. (2006)，Celll26， 663-76 ；以及Wernig，M.等(2007), Nature 448，318-24中描述的方案為例，但不限於此。分化是非特化(「非定型」)細胞或低特化細胞獲得特化細胞(例如神經細胞或肌肉細胞)的特徵的過程。分化細胞或分化誘導細胞是在細胞譜系內呈更特化(「定型」)位置的細胞。術語「定型」當應用於分化過程時，是指已進行分化途徑至某一點上的細胞，在此點上在正常情況下將繼續分化成特定細胞類型或細胞類型的亞型，以及在正常情況下不能分化成不同的細胞類型或恢復到較不分化細胞類型。去分化是指細胞恢復到細胞譜系內較不特化(或定型)位置上的過程。本文使用的細胞的譜系界定了細胞的遺傳，即它來源於哪些細胞並可產生什麼樣的細胞。細胞的譜系將細胞置於發育和分化的遺傳方案內。譜系特異性標記是指與目標譜系的細胞的表型明確關聯的特徵，並且可用來評價非定型細胞向目標譜系的分化。本文使用的「分化(differentiate/differentiation) 」是指其中細胞從未分化狀
11態到分化狀態、從不成熟狀態到較不成熟狀態或者從不成熟狀態到成熟狀態發展的過程。 例如，早期未分化胚胎胰細胞能夠增殖和表達特徵標記，像Pdx-1、Nkx6. 1和Ptfla。成熟或分化的胰細胞不增殖，且的確分泌高水平的胰內分泌激素或消化酶。例如，完全分化的β 細胞在響應葡萄糖時分泌高水平的胰島素。當細胞損失未分化細胞的標記或獲得分化細胞的標記時，便發生細胞相互作用和成熟的變化。單一標記的損失或獲得可表明細胞已「成熟或完全分化」。術語「分化因子」是指加入胰細胞以提高其分化為還含有產胰島素β細胞的成熟內分泌細胞的化合物。示例性分化因子包括肝細胞生長因子、角質形成細胞生長因子、 毒蜥外泌肽_4、鹼性成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1、神經生長因子、表皮生長因子、血小板衍生生長因子和胰高血糖素樣肽1。在一個實施方案中，細胞的分化包括將細胞培養在包含一種或多種分化因子的培養基中。胰內分泌譜系的特有標記選自Ngn 3、NeuroD、胰島_1、Pdx-U Nkx6. 1、Nkx2. 2、 MafA, MafB, Arx, Brn4、Pax-4, Pax-6, Glut2、胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素、胰多肽 (PP)和生長素釋放肽。在一個實施方案中，胰內分泌細胞能夠表達至少一種以下激素胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素、PP和生長素釋放肽。適用於本發明的是表達至少一種胰內分泌譜系的特有標記的細胞。在本發明的一個實施方案中，表達胰內分泌譜系的特有標記的細胞是胰內分泌細胞。胰內分泌細胞可以是胰腺激素表達細胞。或者，胰內分泌細胞可以是胰腺激素分泌細胞。在本發明的一個實施方案中，胰內分泌細胞是表達β細胞譜系的特有標記的細胞。表達β細胞譜系的特有標記的細胞表達Pdxl和至少一種以下轉錄因子Ngn-3、 Nkx2. 2、Nkx6. 1、NeuroD、IsI-U Hnf-3 β、MafA, Pax4 和 Pax6。在本發明的一個實施方案中，表達β細胞譜系的特有標記的細胞是β細胞。在一個實施方案中，胰內分泌細胞是表達標記Nkx6. 1的細胞。在本發明的一個實施方案中，胰內分泌細胞是表達標記Pdxl的細胞。在本發明的一個實施方案中，胰內分泌細胞是表達標記Nkx6. 1和Pdxl的細胞。本文使用的「Pdx-1」是指涉及胰腺發育的同源域轉錄因子。本文使用的「I^x-4」 是β細胞特異性轉錄因子，本文使用的「I^ax-e」是胰島細胞(特異性)轉錄因子；兩者均涉及胰島發育。「Hnf-3 β 」屬於轉錄因子的肝核因子家族，其特徵在於高保守的DNA結合結構域和兩個短羧基端結構域。本文使用的「NeuroD」是涉及神經發生的鹼性螺旋-環-螺旋(bHLH)轉錄因子。本文使用的「Ngn-3」是鹼性環-螺旋-環轉錄因子的neurogenin家族的成員。本文使用的「Nkx-2.2」和「Nkx-6. 1」是Nkx轉錄因子家族的成員。本文使用的 「胰島-1」或「Isl-l」是轉錄因子的LIM/同源域家族的成員，並在發育的胰腺中表達。本文使用的「MafA」是在胰腺中表達的轉錄因子，並控制參與胰島素生物合成和分泌的基因的表達。Nkx6. 1和Pdx-I在可發育成存在於成體胰腺的所有細胞類型(例如腺泡、導管和內分泌細胞)的早期胰多能細胞中與Ptfla共表達。在該細胞群體中，發現也瞬時表達 Ngn3的細胞。一旦細胞表達或已經表達Ngn3，則將成為內分泌譜系的組成部分，產生後來將形成胰島的內分泌細胞(一種類型為產胰島素β細胞)。在不存在Ngn3時，在胰腺發育期間不形成內分泌細胞。當進行發育時，Nkx6. 1和Pdx-I在胰腺的更中心區內共表達， 胰腺此時變得缺乏Ptfla表達，並且Nkx6. 1和Pdx-I陽性細胞不再產生腺泡細胞。在這個 Nkx6. 1和Pdx-I陽性細胞群體內，可觀數目的細胞瞬時共表達Ngn3，使得它們像早期發育中的內分泌譜系。DNER本文使用的「DNER」、「Dner 」、"DNER蛋白」或「DNER蛋白」是指所有哺乳動物形式的DNER，包括人和小鼠。人形式的DNER亦稱「含有δ/notch樣EGF重複序列」，亦稱例如 「bet」和「UNQ26」。小鼠形式的DNER亦稱「 δ/notch樣EGF相關受體」，亦稱例如「BET」、 「Bret」、「MGC39059」和「A930026D19Rik」。DNER在其C端含有單一跨膜結構域，並推測為推定的細胞表面蛋白。它在其胞外結構域還含有大量EGF樣重複序列，並且其胞質羧基端結構域含有基於酪氨酸的分選基序。在人和小鼠兩者中，它長為737個胺基酸，小鼠與人之間的相似性為90%。已在小鼠中鑑定出一個家族成員。Dner在小鼠小腦中的貝格曼神經膠質(Bergmarm glia)細胞形態發生期間起Notch配體的作用。Dner在細胞-細胞間接觸時與Notchl結合，體外激活Notch信號轉導。DDRl本文使用的「DDR1蛋白」或「DDR1蛋白」是指DDR/TKT型蛋白質激酶，網柄菌凝素結構域受體家族成員1。當本文使用時，該術語可全部以大寫字母書寫「DDR1」，或僅首字母大寫「Ddrl」，且可指來源於任何哺乳動物(包括人和小鼠)的網柄菌凝素結構域受體家族成員1。DDRl被各種類型的膠原(包括I-IV型)激活。膠原與DDRl蛋白結合導致自身磷酸化和延遲但持續的酪氨酸激酶活化作用。DDRl可在細胞-細胞間的相互作用或識別中起作用。已經報導了人的至少3種mRNA變體，產生876、913和919個胺基酸的不同的蛋白質同工型。已報導了小鼠中分別為874和911個胺基酸的兩種同工型。已經證實，DDRl蛋白在人乳腺、卵巢、食道和兒科腦腫瘤中過量表達。該蛋白質具有胞內受體酪氨酸激酶活性， 並被各種類型的膠原激活。通過迄今已測試的所有膠原(I-VI和XI型)實現其自身磷酸化。鑑定方法在一個實施方案中，本發明涉及鑑定完全分化的β細胞的方法，所述方法包括使包含胰細胞的細胞群體與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑接觸。在一個實施方案中，可測定與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑結合的細胞(即對G6PC2編碼的 β細胞表面標籤呈陽性的細胞)的數目和/或比率。在一個實施方案中，本發明涉及通過下列步驟定量測定包含胰細胞的對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞的方法a)使細胞與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑接觸；和b)測定展示作為細胞表面標記的G6PC2編碼的β細胞表面標籤的細胞 (對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞)的量。本領域的技術人員應認識到，有許多檢測G6PC2編碼的β細胞表面標籤的方法。 例如，與G6PC2編碼的β細胞表面標籤特異性結合的抗體可用於檢測G6PC2編碼的β細胞表面標籤。G6PC2編碼的β細胞表面標籤的特異性抗體是本領域技術人員已知的，且市售可得自例如 R&D Systems ；Research Diagnostics，Inc. ；Abcam ；Ancell Immunology Research Products ；eBioscience ；the Developmental Studies Hybridoma Bank of the Univeristy of Iowa ；禾口 Zymed Laboratories，Inc. ；Abnova Corporation，-Affinity BioReagents BioLegend ；GeneTex Lifespan Biosciences ；MBL International Novus Biologicals ；Proteintech Group, Inc. ；Santa Cruz Biotechnology，Inc0 識另lj G6PC2 編碼的β細胞表面標籤的胞外部分的抗體可用於本發明以分選細胞。識別G6PC2編碼的β 細胞表面標籤的胞外部分的不同表位的不同抗體可單獨使用或聯用。在胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域中識別G6PC2編碼的β細胞表面標籤的任何部分的結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的任何試劑均可用於監測G6PC2編碼的β細胞表面標籤的表達。本領域的技術人員應當認識到，本文描述的G6PC2編碼的β細胞表面標籤的檢測也可適用於預期可用作本發明的標記的其它胞外蛋白。可得到許多不同的用於與抗體綴合的螢光分子，例如螢光素、cy2、cy3、cy5、ΡΕ、 Alexa488或羅丹明。技術人員知道，在某些情況下，使用與螢光分子綴合的不同抗體可檢測到不只一種胞外標記。在鑑定不只一種目標胞外標記的情況下，可進行FACS分析。在一個實施方案中，結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑是與G6PC2編碼的 β細胞表面標籤特異性結合的抗體。在一個實施方案中，本發明涉及與G6PC2編碼的β細胞表面標籤特異性結合的抗體。在一個實施方案中，G6PC2編碼的β細胞表面標籤是全長IGRP的一部分。「抗體」是指包含得自免疫球蛋白基因的構架區或其特異性結合和識別抗原的片段的多肽。抗體(亦稱免疫球蛋白)是存在於脊椎動物血液或其它體液中的蛋白質，並被免疫系統用來鑑定和中和外來物質，例如細菌和病毒。雖然所有抗體的總體結構非常相似， 但是蛋白質尖端的小區域十分不同，使得存在數百萬具有略微不同的尖端結構的抗體。該區稱為超變區。這些變體的每一個可與不同的稱為抗原的靶標結合。抗體的這種巨大的多樣性使得免疫系統識別同樣廣泛多樣性的抗原。抗體識別抗原的獨特部分稱為表位。這些表位以稱為誘導契合的高特異性相互作用與其抗體結合，使得抗體在構成生物體的數百萬不同分子之中僅識別並結合其獨特的抗原。評價培養細胞或分離細胞中蛋白質和/或mRNA的表達的方法是本領域的標準方法，包括定量反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR) ,RNA印跡法和原位雜交(參見例如Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等主編，2001增刊))和免疫測定法，例如切片材料的免疫組織化學分析、蛋白質印跡法及對於易進入完整細胞的標記的流式細胞術分析 (FACS)(參見例如 Harlow 禾口 Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, New York Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998))。還可使用內分泌細胞分化的常用組織化學標記。可將待通過免疫組織化學分析的細胞在玻璃室載玻片上培養用於顯微鏡觀察。或者，可通過手工、酶促方法或通過使用無酶細胞解離緩衝液從培養物中提取在常規組織培養物中生長的細胞，並包埋在石蠟或TissueTech中用於分選。細胞分化標記可不同，且可通過常規免疫組織化學檢測。一種普遍適用的方案如下。將室載玻片中的細胞輕輕地用PBS漂洗，在4%低聚甲醛溶液中固定45分鐘。細胞然後用PBS漂洗，並保存在+5°C下備用。在使用當天，使細胞通過等級系列的乙醇(以 70 %開始移至96 %，然後至99 %，然後再次至99 %，然後至96 %，最後至70 %，各濃度5分鐘溫育)透化，然後在含有正常血清或TNB (得自Perkin Elmer的TSA (Tyramide Signal Amplification)試劑盒)的封閉溶液中於室溫溫育。以適當的稀釋度製備第一抗體，並加到細胞中，在保溫室中在室溫(RT)下溫育過夜(0/N)。與第一抗體溫育後，將細胞在PBS中漂洗。將以適當稀釋度製備的螢光第二抗體加到細胞中，在暗中溫育。對於細胞核復染可包括第二抗體DAPI染料。然後漂洗細胞，除去過量液體，並除去載玻片的室部分，載玻片蓋上蓋玻片。將載玻片乾燥，並保存在暗中直到使用螢光顯微鏡(例如共焦顯微鏡)檢查。或者，可以製備細胞用於使用HRP(辣根過氧化物酶)方法的免疫細胞化學法。使用生物素偶聯抗體作為第二抗體。載玻片然後用PBS漂洗，並用抗生物素蛋白-HRP溫育。 再次漂洗載玻片，並用TSA試劑溫育以觀測第一抗體。裝上載玻片，使用常規光學顯微鏡目測。對於組織切片中的蛋白質鑑定，將組織在4% PFA(低聚甲醛)中固定過夜，然後在 30%蔗糖中進行低溫保護過夜後，包埋在TissueTech中。然後在切片機中切片，在PBS (磷酸緩衝鹽溶液)中漂洗，在0. OlM檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)中進行微波處理15分鐘以使表位復原。可採用上文或本文描述的方法將這類切片染色，但略去等級乙醇處理。在採用基於HRP的試驗的情況下，使用過氧化氫溶液抑制內源性過氧化物酶活性。對在Lillys固定劑中固定45分鐘的細胞進行分析型FACS分選。為了除去上清液，將細胞在2ml管中於室溫以1400rpm沉澱10分鐘。此後將細胞在PBS與0. BSA中洗滌，加入得自產生第二抗體的動物的血清達到10%血清(終濃度)而將細胞封閉，封閉1 小時。然後將細胞沉澱，棄去上清液。加入第一抗體溶液，在室溫下溫育過夜。次日，在ani 管(使用1. 8ml)中洗滌細胞3x 5分鐘。加入第二抗體，在室溫下溫育1小時。在PBS與 0.1%BSA(使用1.8ml)中洗滌細胞3x5分鐘。最後，通過FACS測定細胞。可通過將細胞群體與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑接觸並評價染色， 來完成完全分化的β細胞的鑑定。該分析可採用以下方法進行例如螢光激活細胞分選 (FACS)、磁性細胞分選(MACS)、免疫組織化學(IHC)、蛋白質印跡、PCR或ELISA。在一個實施方案中，本發明涉及通過本文限定的方法獲得的分離的完全分化的β 細胞。在一個實施方案中，本發明涉及結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑在鑑定或選擇表達作為細胞表面標記的G6PC2編碼的β細胞表面標籤的細胞中的用途。在一個實施方案中，本發明涉及作為細胞表面標記的G6PC2編碼的β細胞表面標籤在獲得胰內分泌細胞的培養物中的用途。在一個實施方案中，一種或多種另外的結合試劑與結合G6PC2 編碼的β細胞表面標籤的試劑同時或序貫使用。在一個實施方案中，所述另外的結合試劑選自DNER、DDR1、膜突結合蛋白1 (亦稱⑶133)和⑶49f結合試劑。在一個實施方案中，同時或序貫使用一種或多種另外的細胞表面標記以獲得胰內分泌細胞的培養物。在一個實施方案中，另外的細胞表面標記選自DNER蛋白、DDRl蛋白、膜突結合蛋白1 (亦稱CD133)和 ⑶49f。在一個實施方案中，另外的細胞表面標記是DNER蛋白或DDRl蛋白。分離方法在一個實施方案中，本發明涉及獲得完全分化的β細胞的培養物的方法，所述方法包括使包含胰細胞的細胞群體與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑接觸，在對 G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞的流分中，從不與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑結合的細胞中分離出與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑結合的細胞。在一個實施方案中，分離步驟通過螢光激活細胞分選(FACS)進行。在一個實施方案中，監測步驟通過FACS進行。在一個實施方案中，分離步驟通過淘選進行。在一個實施方案中，分離步驟通過MACS進行。
使用與G6PC2編碼的β細胞表面標籤特異性結合的螢光標記分子(最常見為抗體)，結合螢光激活細胞分選儀(FACS)，來選擇對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞。簡單地講，在一個實施方案中，將包含胰細胞的細胞群體與螢光標記的抗體一起溫育，在抗體結合後，通過FACS分析細胞。細胞分選儀供懸浮於經由螢光計的液體中的單細胞通過。測定螢光的量，選擇螢光水平可檢測地高於對照未標記細胞的細胞作為陽性細胞。磁性細胞分選(MACQ通過將與β細胞上的G6PC2結合的特異性抗體與鐵顆粒標記的第二抗體一起溫育，並使用磁體相繼分選來進行。在其中包含胰細胞的細胞群體由胰腺分離的實施方案中，首先將細胞培養一次或多次傳代，然後用G6PC2編碼的β細胞表面標籤的特異性抗體標記。細胞然後用FACS掃描，以從對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陰性的細胞中分離出對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞。雖然該實例論述了用標記的抗體進行FACS分析，但是還可使用特異性結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的其它分子，例如凝集素和膠原以及G6PC2編碼的 β細胞表面標籤的其它結合配偶體，例如上文或本文列舉的結合配偶體，來實施本發明。在一個實施方案中，從對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陰性的細胞中分離出對 G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞的方法是通過將對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞親和吸附在固體支持體上。還可以通過使用G6PC2編碼的β細胞表面標籤的特異性結合分子，從對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陰性的細胞中分離出對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞，其中結合分子與固體支持體連接。本領域的技術人員應認識到，G6PC2編碼的β細胞表面標籤的特異性分子可通過抗體結合分子(例如G蛋白或A蛋白)與固體支持體結合， 或者，可與固體支持體直接綴合。具有連接的抗G6PC2編碼的β細胞表面標籤抗體的固體支持體是市售的，例如StemS印和EasyS印TM磁珠，兩者均得自Stem Cell ^Technologies。還可通過淘選技術，從對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陰性的細胞中分離出對 G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞。用結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑包被固體表面，將表面上的胰細胞在適當條件下溫育適當的時間，來進行淘選。用結合 G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑包被平坦表面，例如培養皿。將胰細胞加到表面上，使之與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑結合。然後洗滌培養皿，從培養皿中棄去對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陰性的細胞。在一個實施方案中，使用G6PC2編碼的β細胞表面標籤的特異性抗體包被培養皿，在胰細胞群體中「淘選」對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞。在一個實施方案中，可在通過將細胞分離成為Ptprn/IA2陽性細胞和Ptprn陰性細胞，經G6PC2編碼的β細胞表面標籤進行選擇之前或之後純化細胞。在一個實施方案中， 可將細胞分離成為Abcc8/Surl陽性和Abcc8/Surl陰性細胞。在一個實施方案中，可將細胞分離成為SlC30a8/ZnT-8陽性和SlC30a8/ZnT-8陰性細胞。在一個實施方案中，可通過在G6PC2編碼的β細胞表面標籤與一個或多個另外的胞外標記(例如DNER蛋白或DDRl 蛋白)組合進行選擇之前或之後純化細胞。在一個實施方案中，包含胰細胞的細胞群體是 β細胞陽性流分。在一個實施方案中，包含胰細胞的細胞群體是Ptprn/IA2陽性流分。在一個實施方案中，包含胰細胞的細胞群體是AbccS/Surl陽性流分。在一個實施方案中，包含胰細胞的細胞群體是Slc30a8/aiT-8陽性流分。
在一個實施方案中，在β細胞陽性流分中進一步分離通過本文所述方法獲得的胰內分泌細胞的培養物。在一個實施方案中，在ptprn/IA2陽性流分中進一步分離通過本文所述方法獲得的胰內分泌細胞的培養物。在一個實施方案中，在AbccS/Surl陽性流分中進一步分離通過本文所述方法獲得的胰內分泌細胞的培養物。在一個實施方案中， 在SlC30a8/ZnT-8陽性流分中進一步分離通過本文所述方法獲得的胰內分泌細胞的培養物。在一個實施方案中，包含胰細胞的細胞群體是β細胞陽性流分，包括Ptprn陽性流分、 AbccS陽性流分和/或Slc30a8陽性流分。同樣，在β細胞陽性/陰性流分中可進一步分離通過本文描述的任何方法獲得的胰內分泌細胞的培養物，包括Ptprn陽性/陰性流分、 Abcb9陽性/陰性流分和/或Slc30a8陽性/陰性流分。本領域技術人員應當認識到，本文所有詳細資料或上述有關分離方法的部分，儘管明確指明G6PC2編碼的β細胞表面標籤，但均可適用於其它胞外蛋白。這類胞外蛋白包括選自DNER、DDR1、膜突結合蛋白1 (亦稱⑶13 和⑶49f的蛋白質。具體地講，這類胞外蛋白可是以DNER或DDRl。在胚胎幹(EQ細胞分化成β細胞期間，預期還將產生其它細胞類型，例如神經細胞和非胰內胚層。ES細胞可通過活化素A分化成內胚層細胞，然後分化成胰細胞。一旦取得胰腺命運，便可分離出所需要的細胞。在一個實施方案中，結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑可與胰腺的完全分化的β細胞特異性結合。在一個實施方案中，使用作為標記的G6PC2編碼的β細胞表面標籤可提供具有低比率的其它細胞類型的包含完全分化的 β細胞的細胞群體，例如小於20%、小於15%、小於10%、小於5%、小於2%或無其它細胞類型，例如內胚層細胞而不是胰細胞。在一個實施方案中，使用結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑和一種或多種另外的結合試劑進行雙重分選。在一個實施方案中，可以產生包含胰內分泌細胞而基本上無其它細胞類型的組合物。在一個實施方案中，可以產生包含完全分化的β細胞而基本上無其它細胞類型的組合物。在一個實施方案中，表述「基本上無」對於細胞培養物或細胞群體而言，應理解為相對於細胞總數，包含比完全分化的β細胞少20%以下的其它細胞類型的細胞培養物或細胞群體。在一個實施方案中，本發明涉及其中所得細胞群體由至少30 %，例如至少40 %、 至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%完全分化的β細胞組成的方法。在一個實施方案中，本發明涉及其中起始細胞群體是內胚層源且所得細胞群體由至少30%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少 95%完全分化的β細胞組成的方法。在一個實施方案中，另外的結合試劑選自Kir6.2和Surl。在一個實施方案中，另外的結合試劑選自DNER、DDR1、膜突結合蛋白1 (亦稱⑶133)和⑶49f結合試劑。在本發明的實施方案中，另外的結合試劑是DNER或Ddrl結合試劑。在一個實施方案中，本發明涉及通過本文限定的任何方法獲得的選自完全分化的 β細胞的分離細胞。在一個實施方案中，本發明涉及包含通過本文限定的方法獲得的分離的完全分化的β細胞的組合物。細胞分化標記
有多種可用來鑑定胰細胞群體的細胞標記。分離和培養的供體細胞開始顯示分化胰細胞的各種表型和基因型跡象。表型和基因型跡象的實例包括存在於受調節(例如上調或下調)的兼性祖細胞群體中的各種分子標記。這些分子標記包括CK-19或Pdxl/Nkx6. 1/ Ptfla三陽性細胞，其被假定為胰兼性幹細胞(即多能胰幹細胞)的標記。哺乳動物幹細胞通常在它們成熟為其最後的發育終點時，經歷了許多發育階段。 常常可通過鑑定發育細胞中標記的存在或不存在來確定發育階段。因為人內分泌細胞以相似方式發育，所以當細胞從幹細胞樣表型轉化成假胰島表型時，可使用各種標記鑑定細胞。通過本發明的方法誘導增殖或分化的細胞中標記的表達與正常人胰腺發育中標記表達的順序具有某種相似性。在發育較早期，原始上皮細胞表達Pdx-Ι，一種早期細胞標記，這是同源域核因子。當細胞發育時，它們開始萌發形成導管。這些細胞表達細胞角蛋白 19，一種上皮導管細胞的標記，並瞬時表達Ngn-3，導致發育成內分泌細胞。當這些細胞繼續向內分泌細胞發育時，它們獲得表達胰島素、促生長素抑制素、胰高血糖素、生長素釋放肽或胰多肽的能力。最終分化的細胞只能夠表達一種，並成為α細胞(胰高血糖素)、β細胞(胰島素)、S細胞(促生長素抑制素)、ε細胞(生長素釋放肽)和PP細胞。可使用其它蛋白質，例如ptprn/IA2、Abcc8/Surl和Slc30a8/aiT_8，來鑑定、富集和/或分離完全分化的β細胞。目標標記是在胰腺中以時間特異性和組織特異性方式表達的分子(參見 Hollingsworth,Ann N YAcad Sci 880:38-49(1999))。將這些分子標記分成大致三類轉錄因子、notch途徑標記和中間絲標記。轉錄因子標記的實例包括Pdx-I、NeuroD、Nkx-6. 1、 Isl-U Pax-6、Pax-4、Ngn-3 和 HES-1。notch 途徑標記的實例包括 Notchl、Notch2、Notch3、Notch4、Jaggedl、Jagged2、 Dili和RBPjk。中間絲標記的實例包括CK19和神經表皮幹蛋白。胰β細胞前體的標記的實例包括Pdx-1、I^ax-4、Ngn-3和Hb9。完全分化的胰β細胞的標記的實例包括胰島素、 ptprn/IA2、Abcc8/Surl 和 Slc30a8/ZnT_8。胰島素mRNA表達可用來表徵胰細胞特徵、分化或成熟的一個標記是胰島素mRNA的水平。例如，本發明的中間細胞群體顯示在限定範圍內表達胰島素mRNA。用於定量測定胰島素mRNA的方法包括RNA印跡法、核酸酶保護和引物延伸。在一個實施方案中，RNA由培養的細胞群體中提取，胰島素原的信息量通過定量反轉錄PCR測定。在反轉錄後，使用與胰島素cDNA序列雜交的引物和擴增條件由樣品特異性和定量地擴增胰島素cDNA，擴增條件下擴增產物的量與樣品中存在的mRNA的量有關(參見例如Zhou等，J Biol Chem 272:25648-51(1997))。由於精確性優選動態定量方法，由其可測定起始mRNA水平。通常將胰島素mRNA的量歸一化至組成型表達的mRNA，例如使用肌動蛋白特異性引物由同一 RNA樣品特異性擴增的肌動蛋白。因此，胰島素mRNA的表達水平可用胰島素 mRNA擴增產物與肌動蛋白mRNA擴增產物的比率或僅胰島素肌動蛋白mRNA比率報導。可通過同樣的方法定量測定編碼其它胰腺激素(例如促生長素抑制素或胰高血糖素)的mRNA 的表達。胰島素和肌動蛋白mRNA水平還可通過原位雜交測定，然後用來測定胰島素肌動蛋白mRNA比率。原位雜交方法為本領域技術人員所知。
增殖方法在一個實施方案中，本發明涉及多種完全分化的β細胞增殖的方法，所述方法包括獲得按照上文或本文描述的方法純化的細胞，然後隨即在有利於完全分化的β細胞增殖的條件下培養所獲得的細胞。用於來源於胚胎/成體組織的胰細胞以及幹細胞增殖的方案以Heimberg，H.等 (2000),Diabetes 49,571-9 ；Heremans,Y.等(2002),JCell Biol 159,303-12 ；Miralles, F.等(1998)，Development 125，1017-24 ；以及 Miralles，F.等(1999)，Dev Dyn 214， 116-26中描述的方法為例，但不限於此。功能測定法β細胞的一個重要功能是其根據葡萄糖水平調節其胰島素分泌。通常，可對擴增的貼壁胰細胞進行靜態葡萄糖刺激(SGQ測定法以鑑定它們是否能夠在響應不同的葡萄糖水平時分泌胰島素。一般將細胞在合適的基質上培養直到幾乎匯合。在SGS測定前三天， 將培養基更換為類似性質但缺乏胰島素且只含lg/L葡萄糖的培養基。每天更換培養基達三天，在第四天進行SGS測定。測定前，可收集培養基用於葡萄糖和胰島素分析。為了製備用於該測定的細胞，細胞用Dulbecco磷酸緩衝鹽溶液(DPBS)+0. 5% BSA洗滌兩次，每次洗滌的同時溫育5分鐘， 然後只用DPBS洗滌一次，同樣溫育5分鐘。洗滌後，將細胞用IOml (在IOOmm培養皿中)或 5ml (在 60mm 培養皿中)的 Krebs-Ringers SGS 溶液與 60mg/dl 葡萄糖(KRB-60)在 37°C 培養箱中溫育30分鐘。然後重複此溫育。為了進行SGS測定，將細胞在:3ml (100mm培養皿)或細1075培養瓶)或^il (60mm 培養皿)KRB-60中於37°C溫育20分鐘。吸出培養基並離心，收集用於胰島素測定作為 LG-I (低葡萄糖刺激步驟)。然後加入與上述體積相同的KRB-450+theo (KRB與450mg/dl葡萄糖和IOmM茶鹼)，將細胞在與上述條件相同的條件下培養。收集上清液用於胰島素測定作為HG (高葡萄糖刺激)。再次將細胞與KRB-60 —起溫育，收集培養基作為LG-2，下一次作為LG-3。收集培養基用於胰島素分析，並保存在-20°C下直到通過放射免疫測定法(RIA) 或其它合適的測定法測定胰島素含量。SGS測定的結果常常用定義為HG胰島素值除以LG-I胰島素值的刺激指數表示。在 SGS測定法中，約2或更大的刺激指數一般視為陽性結果，儘管可以使用其它值(例如1. 5， 2. 5，3. 0，3. 5等)來界定特定的細胞群體。處理方法在一個實施方案中，本發明涉及向在其至少一種胰腺激素產生中有缺陷的哺乳動物提供胰內分泌功能的方法，其中細胞通過上文或本文所述的任何方法獲得，所述方法還包括以下步驟將所獲得的細胞以足以在哺乳動物中產生可測量的至少一種胰腺激素的量植入哺乳動物。本領域的技術人員應認識到，使用G6PC2編碼的β細胞表面標籤選出的細胞或進一步培養的細胞在哺乳動物中提供用於植入和恢復胰功能的可再生資源。如果用戶需要，可在植入前將對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞進行囊化。在植入哺乳動物前，胰細胞的分化可達到選自以下的分化階段完全分化的內分泌細胞和完全分化的β細胞，包括葡萄糖響應性產胰島素β細胞，即等同於分離胰島的β 細胞。採用所謂的Edmonton方案植入分離胰島的實例可參見Siapiro AM(2000), N Engl J Med. ；343 (4) :230_8。對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞進行囊化導致在囊中形成細胞聚集體。囊化可供將胰細胞移植入1型糖尿病宿主中，同時使宿主動物的免疫應答最小化。可以選擇囊化膜的孔隙率以供生物材料(像胰島素)從囊中分泌出來，同時限制宿主免疫系統接近外源細胞。囊化方法是本領域已知的，可參見下列參考文獻van kheIfgaarde和de Vos, J. Mol. Med. 77 :199-205 (1999) ,Uludag 等，Adv. DrugDel Rev. 42 :29-64(2000)及美國專利號 5，762，959,5, 550，178 和 5，578，314。囊化方法詳細記載於申請PCT/US02/41616中；通過引用結合到本文中。植入或移植到哺乳動物及隨後監測內分泌功能可按照通常應用於胰島移植的方法進行；參見例如 Ryan 等，Diabetes 50 :710-19 (2001) ；Peck 等，Ann Med 33 186-92(2001) ；Shapiro 等，N Engl J Med 343(4) :230-8(2000) ；Carlsson 等，Ups J Med Sci 105(2) :107-23(2000) 1 Kuhtreiber, WM, Cell Encapsulation Technology and Therapeutics, Birkhauser, Boston, 1999。優選的植入部位包括腹膜腔、肝和腎囊。本領域技術人員應當認識到，在使用包含不成熟胰細胞的胰細胞進行移植的情況下，β細胞功能的測定，例如胰腺激素和血液葡萄糖水平的測定在移植後應進行至少2周， 例如至少4周、至少6周或至少8周。相比之下，當使用分化胰細胞進行移植時，β細胞功能的測定，例如胰腺激素和血液葡萄糖水平的測定應正好在移植後進行，例如移植後12小時前、24小時前或36小時前。本領域的技術人員能夠確定用於預期接受者的多種完全分化的β細胞或微囊劑的適當劑量。劑量將取決於接受者的胰島素需要量。可用免疫學的方法或通過生物活性的量來測定由限定數目的β細胞或微囊劑分泌的胰島素水平。當確定劑量時還可考慮接受者的體重。如有需要，在監測接受者對(任選囊化)細胞的反應時，可以進行一次以上的植入。因此，對植入的反應可以用作(任選囊化)細胞劑量的指導(Ryan等，Diabetes 50: 710-19(2001)) ο可以通過監測接受者對葡萄糖的反應來測定接受者中(任選囊化)細胞的功能。 (任選囊化)細胞的植入可產生對血液葡萄糖水平的控制。另外，胰內分泌激素、胰島素、C 肽、胰高血糖素和促生長素抑制素水平升高的證據可表明移植(任選囊化)細胞的功能。本領域的技術人員應認識到，可以不同的方法控制血液葡萄糖。例如，可直接測定血液葡萄糖，像可以測定體重和胰島素需要量一樣。還可進行口服葡萄糖耐量試驗。也可測定腎功能，正如可測定其它代謝參數一樣(Soon-Shiong，P.等，PNAS USA 90 5843-5847(1993) ；Soon-Shiong, P.等，La71cet 343:950-951(1994))。本文使用的術語「產胰島素內分泌胰細胞」是指以血液葡萄糖依賴性方式產生胰島素和分泌胰島素的細胞。在一個實施方案中，從培養源分離包含胰細胞的細胞群體(本發明)。然後將分離細胞用於例如進一步培養或按照美國專利號5，762，959的微囊化方法進行微囊化。術語「向需要這類功能的哺乳動物提供胰功能」是指在自身不能產生這類激素的哺乳動物機體內產生胰腺激素的方法。在一個實施方案中，胰腺激素選自胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素、胰多肽和生長素釋放肽。在一個實施方案中，在糖尿病哺乳動物機體內產生胰島素。通過將用本公開的方法產生的產胰島素胰細胞植入或移植到哺乳動物中而產生胰功能。植入的聚集體的數目是在哺乳動物中足以產生可測量的胰島素的量。可通過 Elisa測定法或放射免疫測定法或通過本領域技術人員已知的其它檢測方法測定胰島素， 包括胰島素功能測定法，例如血液葡萄糖水平的維持。胰島素與C肽以等摩爾量共分泌。因此，還可通過檢測血液中的C肽來測定胰島素的分泌活性。在一個實施方案中，提供的胰功能足以降低或消除哺乳動物對機體外產生的胰島素的依賴。「囊化」是指用生物相容性細胞材料(如藻酸鈉和聚賴氨酸)將細胞包封的方法。 可從囊化細胞周圍環境優選吸收小分子(諸如糖和低分子量蛋白質)或優選將小分子分泌到囊化細胞周圍環境中。同時，較大分子和免疫細胞對囊化細胞的接近受到限制。「植入」是將細胞移植或安排到接受者中。它包括囊化細胞和非囊化細胞。細胞可通過本領域已知方法經皮下、肌內、門靜脈內或腹膜內安置。在一個實施方案中，分離步驟通過螢光激活細胞分選進行。在一個實施方案中，分離步驟通過淘選進行。在一個實施方案中，分離步驟通過液化床進行。在一個實施方案中，本發明涉及結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑在鑑定或選擇表達作為細胞表面標記的G6PC2編碼的β細胞表面標籤的細胞中的用途。在一個實施方案中，本發明涉及與一種或多種另外的結合試劑同時或序貫使用結合G6PC2編碼的 β細胞表面標籤的試劑以鑑定或選擇表達作為細胞表面標記的G6PC2編碼的β細胞表面標籤的細胞，對其進行與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑一樣的分析步驟。在一個實施方案中，另外的結合試劑選自Kir6.2和Surl。在一個實施方案中，另外的結合試劑選自DNER、DDR1、膜突結合蛋白1 (亦稱⑶133)和⑶49f結合試劑。在一個實施方案中，另外的結合試劑是DNER或DDRl結合試劑。在本發明的一個實施方案中，另外的結合試劑選自Ptprn/IA2、Abcc8/Surl和 Slc30a8/ZnT-8結合試劑，其可用來分離早期和完全分化的內分泌細胞。在一個實施方案中，本發明涉及通過向需要這類功能的哺乳動物提供胰功能而治療I型糖尿病的方法。本發明的實施方案1. 一種由G6PC2編碼的分離肽，其中所述肽包含i)胞外部分，和ii)G6PC2的一個或多個外顯子的缺失,前提條件是所述肽不是MDFLHRNGVLIIQUQKDYRAYYTFLNFMSNVGDPRNI FFIYFPLCFQFNQTVGTKMIWVAVI⑶WLNLIFKWKSIWPCNGRILCLVCHGNRCPEPHCLWDG。2.前述實施方案中任一項的分離肽，其中所述肽由胞外部分組成。3.前述實施方案中任一項的分離肽，其包含選自G6PC2的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4和外顯子5的一個或多個外顯子中所包含的序列。4.前述實施方案中任一項的分離肽，其包含選自一個或多個選自G6PC2的外顯子 1、外顯子2、外顯子3、外顯子4和外顯子5的序列的缺失。5.前述實施方案中任一項的分離肽，其中所述肽包含選自以下的序列及其變體MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYT(SEQ ID NO 3), MLVAEAFEHTPGIQTASLGT(SEQ ID NO :4)、
21LLSCRGGNNY (SEQ ID NO :5)、HMLMKQSGKKSQ (SEQ ID NO :6)、MLVAEAFEHTPGIQ (SEQ ID NO: 8)。6.前述實施方案中任一項的分離肽，其中所述肽由選自以下的序列及其變體組成MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYT(SEQ ID NO 3), MLVAEAFEHTPGIQTASLGT(SEQ ID NO :4)、 LLSCRGGNNY(SEQ ID NO :5)、HMLMKQSGKKSQ(SEQ ID NO :6)、MLVAEAFEHTPGIQ(SEQ ID NO 8)。7.前述實施方案中任一項的分離肽，其中所述肽包含與選自以下的胺基酸序列有至少80%，例如至少90%或至少96%同一性的天然存在的胺基酸序列 MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYT (SEQ ID NO 3)、MLVAEAFEHTPGIQTASLGT(SEQ ID NO :4)、 LLSCRGGNNY (SEQ ID NO :5)、HMLMKQSGKKSQ (SEQ ID NO :6)、MLVAEAFEHTPGIQ (SEQ ID NO 8)。8.前述實施方案中任一項的分離肽，其中所述肽是實施方案1-7中限定的分離肽的片段或全長IGRP的一部分。9. 一種編碼實施方案1-8中任一項限定的肽的分離核苷酸。10. 一種表達實施方案1-8中任一項限定的肽的分離細胞。11. 一種鑑定完全分化的β細胞的方法，所述方法包括使包含胰細胞的細胞群體與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑接觸，其中G6PC2編碼的β細胞表面標籤任選如實施方案1-8中任一項的定義。12. 一種獲得完全分化的β細胞的培養物的方法，所述方法包括使包含胰細胞的細胞群體與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑接觸，並且將對G6PC2編碼的β 細胞表面標籤呈陽性的細胞流分中的與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑結合的細胞從不與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑結合的細胞中分離出來，其中G6PC2 編碼的β細胞表面標籤任選如實施方案1-87中任一項的定義。13. 一種向在其至少一種胰腺激素產生中有缺陷的哺乳動物提供胰內分泌功能的方法，其中所述細胞通過實施方案11-12中任一項的方法獲得，所述方法還包括以下步驟 將所獲得的細胞以足以在哺乳動物中產生可測量的至少一種胰腺激素的量植入哺乳動物。14.實施方案11-13中任一項的方法，其中所述至少一種胰腺激素選自胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素、胰多肽和生長素釋放肽。15. 一種通過以下步驟定量測定對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的包含胰細胞的細胞的方法a)使細胞與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑接觸；和b)測定展示作為細胞表面標記的G6PC2編碼的β細胞表面標籤的細胞(對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞)的量，其中G6PC2編碼的β細胞表面標籤任選如實施方案1-8 中任一項的定義。16. 一種用於體外方案優化的方法，其中定期監測表達G6PC2編碼的β細胞表面標籤的細胞(對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞)的數目，其中G6PC2編碼的 β細胞表面標籤任選如實施方案1-8中任一項的定義。17.實施方案11-16中任一項的方法，其中一種或多種另外的結合試劑與結合 G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑同時或序貫使用。18.實施方案17的方法，其中另外的結合試劑選自DNER、DDR1、膜突結合蛋白1 (亦稱CD133)和CD49f結合試劑。19.實施方案17的方法，其中另外的結合試劑是DNER或DDRl結合試劑。20.實施方案11-19中任一項的方法，其中所述包含胰細胞的細胞群體獲自胰腺。21.實施方案11-19中任一項的方法，其中所述包含胰細胞的細胞群體獲自體細胞群體。22.實施方案11-19中任一項的方法，其中所述包含胰細胞的細胞群體獲自多潛能細胞，例如ES細胞。23.實施方案11-22中任一項的方法，其中所述包含胰細胞的細胞群體是是源於哺乳動物的細胞群體。24.實施方案11-23中任一項的方法，其中所述包含胰細胞的細胞群體是源於人的細胞群體。25.實施方案Il-M中任一項的方法，其中所述包含胰細胞的細胞群體是β細胞陽性流分。26.實施方案Il-M中任一項的方法，其中所述包含胰細胞的細胞群體是ptprn/ IA2陽性流分。27.實施方案Il-M中任一項的方法，其中所述包含胰細胞的細胞群體是AbccS/ Surl陽性流分。28.實施方案Il-M中任一項的方法，其中所述包含胰細胞的細胞群體是 Slc30a8/ZnT-8 陽性流分。29.實施方案Il-M中任一項的方法，其中在β細胞陽性流分中進一步分離通過前述實施方案中任一項的方法獲得的胰內分泌細胞的培養物。30.實施方案1114中任一項的方法，其中在ptprn/IA2陽性流分中進一步分離通過前述實施方案中任一項的方法獲得的胰內分泌細胞的培養物。31.實施方案Il-M中任一項的方法，其中在Abcc8/Surl陽性流分中進一步分離通過前述實施方案中任一項的方法獲得的胰內分泌細胞的培養物。32.實施方案Il-M中任一項的方法，其中在Slc30a8/aiT-8陽性流分中進一步分離通過前述實施方案中任一項的方法獲得的胰內分泌細胞的培養物。33.實施方案11-32中任一項的方法，其中結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑是與G6PC2編碼的β細胞表面標籤特異性結合的抗體。34.實施方案11-33中任一項的方法，其中分離或監測的步驟通過螢光激活細胞分選進行。35.實施方案中任一項的方法11-34，其中分離步驟通過淘選進行。36.實施方案13的方法，其中所述至少一種胰腺激素是胰島素。37.實施方案11-37的方法，其中哺乳動物是人。38.實施方案11-37中任一項的方法，其中細胞是完全分化的β細胞。39.實施方案11-38中任一項的方法，其中G6PC2編碼的β細胞表面標籤如實施方案1-8中任一項的定義。40.實施方案11-38中任一項的方法，其中G6PC2編碼的β細胞表面標籤是全長 IGRP的一部分。
41. 一種通過實施方案11-40中任一項限定的方法獲得的分離的完全分化的內分泌β細胞。42. 一種通過實施方案11-40中任一項限定的方法獲得的包含分離的完全分化的 β細胞的組合物。43.結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑在鑑定或選擇表達作為細胞表面標記的G6PC2編碼的β細胞表面標籤的細胞中的用途，其中G6PC2編碼的β細胞表面標籤任選如實施方案1-8中任一項的定義。44.作為細胞表面標記的G6PC2編碼的β細胞表面標籤在獲得胰內分泌細胞的培養物中的用途，其中G6PC2編碼的β細胞表面標籤任選如實施方案1-8中任一項的定義。45.實施方案44的用途，其中同時或序貫使用一種或多種另外的細胞表面標記以獲得胰內分泌細胞的培養物。46.實施方案45的用途，其中另外的細胞表面標記選自DNER蛋白、DDRl蛋白、膜突結合蛋白1 (亦稱⑶133)和⑶49f。47.實施方案45的用途，其中另外的細胞表面標記是DNER蛋白或DDRl蛋白。48.實施方案43-47中任一項的用途，其中G6PC2編碼的β細胞表面標籤如實施方案1-8中任一項的定義。49.實施方案43-48中任一項的用途，其中G6PC2編碼的β細胞表面標籤是全長 IGRP的一部分。50. 一種與G6PC2編碼的β細胞表面標籤特異性結合的抗體，其中G6PC2編碼的 β細胞表面標籤任選如實施方案1-8中任一項的定義。51.實施方案50的抗體，其中G6PC2編碼的β細胞表面標籤如實施方案1_8中任一項的定義。52.實施方案50的抗體，其中G6PC2編碼的β細胞表面標籤是全長IGRP的一部分。53.前述實施方案中任一項的分離肽，其中所述肽存在於細胞的外表面和/或在細胞的外表面上可檢出。
實施例實施例1 胰島素表達和G6PC2的共定位收穫成人胰腺組織，並在4%低聚甲醛(PFA)的PBS溶液中固定過夜(0/Ν)。將組織在30 %蔗糖的PBS溶液中平衡，並包埋在TissueTech中。切取8 μ m切片，保存於-80°C。將切片在室溫(RT)下融化，在PBS中洗滌，在0.01M檸檬酸鹽緩衝液進行微波處理後，用1 % H2O2的PBS溶液溫育30分鐘，隨後用0. 5 % TNB封閉試劑(得自 Perkin-Elmer)封閉。在兔中產生抗通過C端半胱氨酸與KLH(匙孔血藍蛋白)偶聯的 MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYTFC 的抗 G6PC2。然後加入兔抗 G6PC2 (Rb 抗 G6PC2) 1 9000、豚鼠抗胰島素(Gp抗 150，在室溫下溫育過夜。次日，將切片在PBS中洗滌，加入生物素化驢抗兔和驢抗豚鼠_cy2抗體，溫育45分鐘。在PBS中洗滌細胞後，加入鏈黴抗生物素蛋白-HRP，溫育15分鐘。隨後，將細胞在PBS中洗滌。最後，加入tyramid-Cy3顯現染色。結果表明，G6PC2在胰島中強表達。在胰島外還觀察到較弱的表達。在胰島中，G6PC2信號與胰島素共定位，這就表明了 G6PC2在β細胞中表達。實施例2 體外方案優化在一個實施方案中，定期監測包含胰細胞的體外培養物的G6PC2編碼的β細胞表面標籤的表達。在一個實施方案中，一種或多種另外的標記可與G6PC2編碼的β細胞表面標籤同時或序貫使用。在一個實施方案中，另外的標記選自DNER、膜突結合蛋白1(亦稱CD13;3)、CD49f、DISP2、LRP11、SLC30A8和SEZ6L2。在一個實施方案中，另外的標記選自 DNER、DDRl蛋白、膜突結合蛋白1 (亦稱⑶13 和⑶49f。在一個實施方案中，另外的標記是DNER或DDRl蛋白。為了有效優化胚胎幹細胞的分化，非常重要的是具有識別胰細胞向完全分化的內分泌細胞和/或完全分化的β細胞的不同發育階段的標記。可使用G6PC2編碼的表面標籤準確定位細胞分化的重要且特定的階段，迄今為止使用其它標記仍無法檢出此階段。G6PC2 編碼的表面標籤可與一種或多種另外的標記聯用。可採用本文所述方法，例如FACS、淘選、MACS，來鑑定、富集和/或分離表達G6PC2 編碼的β細胞表面標籤的細胞。本文引用的所有參考資料，包括出版物、專利申請和專利，都通過引用其整體結合到本文中，其程度與每個參考文獻單獨而具體指明通過引用結合到本文中並以其整體列舉在本文中一樣(至法律允許的最大程度)。所有標題和副標題在本文中僅出於方便而使用，不應解釋為以任何方式限制本發明。本文提供的任何和全部實例或示例性語言(諸如「例如」)的使用，僅僅是為了更好地說明本發明，並非對本發明的範圍提出限制，除非另有要求。本說明書中的任何語言都不應解釋為表示任何非要求保護的要素是實施本發明必需的。本文對專利文件的引用和結合只是出於方便，並不反映對這類專利文件的有效性、專利性和/或可實施性有任何觀點。本發明包括適用法律所允許的隨附權利要求書中所述主題的所有修改和等同內容。
權利要求
1.一種鑑定完全分化的β細胞的方法，所述方法包括使包含胰細胞的細胞群體與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑接觸。
2.一種獲得完全分化的β細胞的培養物的方法，所述方法包括使包含胰細胞的細胞群體與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑接觸，並且將對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞流分中的與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑結合的細胞從不與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑結合的細胞中分離出來。
3.一種向在其至少一種胰腺激素產生中有缺陷的哺乳動物提供胰內分泌功能的方法， 其中所述細胞通過權利要求1-2中任一項的方法獲得，所述方法還包括以下步驟將所獲得的細胞以足以在哺乳動物中產生可測量的至少一種胰腺激素的量植入哺乳動物。
4.前述權利要求中任一項的方法，其中所述至少一種胰腺激素選自胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素、胰多肽和生長素釋放肽。
5.一種通過以下步驟定量測定對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的包含胰細胞的細胞的方法a)使細胞與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑接觸；和b)測定展示作為細胞表面標記的G6PC2編碼的β細胞表面標籤的細胞(對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞)的量。
6.一種用於體外方案優化的方法，其中定期監測表達G6PC2編碼的β細胞表面標籤的細胞(對G6PC2編碼的β細胞表面標籤呈陽性的細胞)的數目。
7.前述權利要求中任一項的方法，其中一種或多種另外的結合試劑與結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑同時或序貫使用。
8.權利要求7的方法，其中另外的結合試劑選自DNER、DDR1、膜突結合蛋白1(亦稱 CD133)和CD49f結合試劑。
9.前述權利要求中任一項的方法，其中所述細胞是完全分化的β細胞。
10.前述權利要求中任一項的方法，其中所述G6PC2編碼的β細胞表面標籤是全長 IGRP的一部分。
11.一種通過權利要求1-10中任一項限定的方法獲得的分離的完全分化的內分泌β 細胞。
12.一種包含通過權利要求1-10中任一項限定的方法獲得的分離的完全分化的β細胞的組合物。
13.結合G6PC2編碼的β細胞表面標籤的試劑在鑑定或選擇表達作為細胞表面標記的 G6PC2編碼的β細胞表面標籤的細胞中的用途。
14.作為細胞表面標記的G6PC2編碼的β細胞表面標籤在獲得胰內分泌細胞的培養物中的用途。
15.一種與G6PC2編碼的β細胞表面標籤特異性結合的抗體。
全文摘要
本發明涉及G6PC2編碼的β細胞表面標記、鑑定和獲得包含完全分化的β細胞的培養細胞的方法。本發明還包括分選這類細胞、其分離細胞及組合物的方法。
文檔編號C07K14/705GK102171242SQ200980139608
公開日2011年8月31日 申請日期2009年9月30日 優先權日2008年9月30日
發明者B·羅普, J·哈爾德, O·D·馬德森 申請人:諾沃-諾迪斯克有限公司