一種從百合組織中同時提取dna和rna的方法

2023-07-05 09:29:06 1

專利名稱：一種從百合組織中同時提取dna和rna的方法
技術領域：
本發明屬於植物分子生物學技術領域，具體涉及從百合組織中同時提取DNA和RNA的方法，尤其是從百合鱗片中同時提取DNA和RNA的方法。
背景技術：
提取較高質量的DNA和RNA是分子生物學實驗研究的一項最基本工作，使用一種簡便、高效的核酸提取方法對提高實驗效率很有必要。目前，植物組織DNA的提取方法主要有CTAB法、SDS法、高鹽低滲法等，RNA提取的主要方法有異硫氰酸胍-酚-氯仿法(一步法)、CTAB法、SDS法和熱硼酸法等。這些提取方法的步驟基本相似，首先充分破碎植物細胞的細胞壁，接著使核蛋白複合體中的蛋白充分變性，實現核蛋白與核酸的分離；同時抑制內源和外源核酸酶的活性，防止核酸汙染被降解，然後將DNA和RNA與多糖、多酚等雜質分離，得到純淨的DNA或RNA，最後進行質量檢測。目前，常規的核酸提取方法或使用的試劑盒大都是針對單獨的DNA或RNA進行提取，較少有用一種方法同時提取植物組織中的DNA和RNA。百合等植物中富含大量的多糖類物質和酚類化合物，同時還含有較多的成分確定或不確定的次生代謝物。酚類化合物在勻漿和提取過程中極易被氧化成醌類物質，與核酸發生不可逆結合，嚴重影響核酸的分離純化。多糖的許多理化性質與核酸相似，在提取過程中與核酸共沉澱，很難將它們分尚。在植物生長發育過程中，包括DNase和RNase在內的各種水解酶大量積累，同時各種次生代謝物質大量積累，給植物組織中核酸的提取帶來極大的困難。近年來，有關從富含多糖多酚及次生代謝物質的植物組織中提取DNA或RNA的方法已有較多報導。葛曉萍等利用CTAB-LiCl法從蘋果和草莓的一些組織中提取到總RNA (一種適合多糖、多酚植物的RNA提取方法。青島科技大學學報，2007，28 :6-8)。郭書巧等也利用CTAB-LiCl法從甜葉菊中成功的分離了甜葉菊的總RNA (甜葉菊RNA分離方法研究。基因組學與應用生物學，2009，28 :101-104)。賈晉等確定了 SDS法為提取鹽爪爪核酸的最佳方法，同時增加了 LiCl和無水乙醇特異沉澱步驟，用於RNA的提取(鹽爪爪核酸提取方法研究。中國農學通報，2010，26:49-52)。陳肅等通過無水乙醇對植物材料的預處理，用CTAB-LiCl-無水乙醇法從一些木本植物組織中得到了質量合格的RNA (—種快捷有效的提取樹木RNA方法。遼寧林業科技，2008，05:25-27)。尹慧等採用改進了的CTAB從百合葉片中成功的提取了總RNA (百合葉片總RNA提取方法比較及優化。中國農業大學學報，2008，13:41-45)。杜中軍等採用改進的SDS法，結合使用無水乙醇和醋酸鉀除去多糖，從富含多糖的芒果組織中提取到完整的總RNA (—種改進的富含多糖的芒果組織中完整總RNA的提取方法。植物生理學通訊，2005, 41:202-204)。楊秀梅等採用CTAB法提取百合鱗片基因組DNA，用去多糖緩衝液除去多糖，得到了高質量的基因組DNA (百合鱗片DNA的提取及RGA-PCR體系的優化。西南農業學報，2011，24:266-269)。侯思名等利用加入了抗氧化劑和高鹽溶液的CTAB法成功提取了薴麻組織的DNA (薴麻總DNA提取的CTAB法優化方案。西北植物學報，2005，25:2193-2197)。佔亞光等採用改良的CTAB法從白樺成熟葉片中提取了質量較好的DNA (富含多糖的白樺成熟葉片DNA的提取方法。東北林業大學學報，2005，33:24-25)。對於同時從一種植物組織中提取DNA和RNA的方法，一些文獻也有所報導。黃真池等利用鈣鹽分級沉澱法從尾葉桉葉片中得到了完整的DNA和RNA (—種木本植物RNA和DNA的簡捷提取方法。湖北農業科學，2010，49:773-774)。魏利斌等採用CTAB法同步提取了芝麻中的DNA和RNA (芝麻DNA和RNA同步提取方法。分子植物育種，2008，06:1025-1030)。劉勝洪等利用高鹽低pH的緩衝液提取核酸，再用LiCl選擇性沉澱RNA,從獼猴桃組織中分離得到了 DNA和RNA (—種高效提取獼猴桃DNA和RNA的方法。生物技術通報，2011，09:171-175)。王伶平等利用CTAB法提取山藥總核酸，然後總核酸溶液一分為二，一份用於分離RNA，另一份用於分離DNA (—種同時提取植物DNA和RNA的方法。CN101486747B)。許多植物組織中富含多糖、多酚及次生代謝物質，使得核酸提取困難。目前，對這些植物組織核酸的提取一般只針對單一的DNA或RNA，很少採用一種方法同時提取DNA和RNA。當植物組織有限或較稀少時，單一的提取DNA或RNA很難滿足實驗的需要。百合組織 中富含多糖多酚及次生代謝物質，特別是百合鱗片中多糖含量極高，給百合組織核酸的提取帶來極大的困難。現有的同步提取植物DNA和RNA的方法存在耗時長、操作複雜、分離效率低等不足，而且對於百合組織DNA和RNA的提取效果並不好。因此，發展一種應用廣、耗時少、操作簡便的同步提取百合組織中DNA和RNA的方法十分必要。

發明內容
本發明提供了一種從百合組織中同時提取DNA和RNA的方法，尤其是從多糖含量很高的百合鱗片中同時提取DNA和RNA的方法。本發明共分為三步，第一步利用異硫氰酸胍法結合高濃度醋酸鉀去除多糖得到總核酸粗提沉澱；第二步採用DEPC處理過的ddH20溶解核酸沉澱，並用鹼性的Tris平衡酚和氯仿純化總核酸，得到總核酸溶液；第三步利用氯化鋰和無水乙醇選擇性沉澱RNA，之後用醋酸鈉以及異丙醇沉澱DNA，最終依次獲得了 RNA和DNA。本發明包括以下具體步驟
(1)取0.5-lg百合植物組織，加入液氮研磨成粉末，按每克組織材料添加12-15ml的異硫氰酸胍提取緩衝液的比例加入預冷的異硫氰酸胍提取液，充分震蕩混勻，冰浴10_15min，再加入提取液1/10體積3mol L—1醋酸鈉(pH4. 5-5. 5)，顛倒混勻；其中異硫氰酸胍提取緩衝液成分為4. 5mol L—1異硫氰酸胍，25mmol L—1朽1檬酸鈉,0. 5% (w/v)十二燒基肌氨酸鈉，3% (w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮，使用前每IOOmL提取緩衝液加入ImL ^ -巰基乙醇；
(2)在步驟(I)得到的混合液中加入與提取液等體積的氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min後於4°C 12000g離心IOmin,取上清置於新的離心管中，重複此步驟一次；
(3)向步驟(2)中得到的上清液中加入1/3提取液體積的8molL—1醋酸鉀(pH4. 5-5. 5，預冷)，顛倒混勻，冰上放置lOmin，4°C 12000g離心lOmin，取上清置於新的離心管中，重複此步驟一次；
(4)向步驟(3)得到的上清液中加入與提取液等體積的異丙醇，混勻後-20°C放置30min,接著4°C 12000g離心lOmin,得到核酸粗提沉澱物；(5)用75%的乙醇清洗沉澱兩次，室溫下乾燥20min，用0.5-lmL DEPC處理過的ddH20徹底溶解沉澱；
(6)在步驟(5)得到的總核酸溶液中加入0.5-lmLTris飽和酚/氯仿混合液，Tris飽和酚/氯仿混合液中Tris飽和酚與氯仿的體積比為1:1，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，於40C 12000g離心lOmin，取上清置於新的離心管中；
(7)向步驟(6)的上清液中加入0.5-lmL氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，4°C12000g離心lOmin，取上清置於新的離心管中；
(8)向步驟(7)的上清液中加入0.125-0. 25mL IOmol L—1氯化鋰，混勻後加入
0.25-0. 5mL無水乙醇，上下顛倒混勻後_20°C放置2h沉澱RNA，4°C 14000g離心15min，取上清液置於新的離心管中；
(9)用75%的乙醇清洗步驟(8)得到的RNA沉澱兩次，室溫下乾燥lOmin，用60-100y L DEPC處理過的ddH20溶解RNA沉澱，_80°C保存備用；
(10)向步驟(8)得到的上清液中加入0.875-1.75mL異丙醇和0.0875-0. 175mL 3molL-1醋酸鈉(pH4. 5-5. 5)，混勻後-20°C放置30min沉澱DNA,室溫下12000g離心15min，得到DNA沉澱，用75%乙醇清洗兩次，在室溫下乾燥lOmin，用60-100 u L TE緩衝液溶解，於-20°C保存備用。所用的植物材料為眠江百合{Lilium regale)的幼嫩鱗片、東方百合{LiIium"Oriental Hybrids")西伯利亞百合的幼嫩葉片、通江百合、Lilium sargentiae)的幼嫩根。本發明在傳統的異硫氰酸胍法提取RNA的基礎上，針對百合組織中富含多糖多酚及次生代謝物質的特點，特別是多糖含量極高的特點，做了以下改進
在細胞裂解後，不直接用酚抽提，而是採取氯仿抽提兩次，能有效的去除次生代謝物質。在異丙醇沉澱粗提核酸沉澱之前，兩次利用高濃度醋酸鉀沉澱多糖，能將有效去除溶液中的多糖。在沉澱RNA這一步,利用氯化鋰和無水乙醇協同選擇性沉澱RNA,使沉澱RNA的時間大大縮短，且RNA沉澱充分，接著利用異丙醇和醋酸鈉沉澱DNA，實驗結果表明本發明所得到的RNA沒有DNA的汙染，同時提取的DNA中也沒有RNA的殘留。本發明操作簡便，耗時較短，全部過程可在7小時內完成，較好的解決了從富含多糖多酚及次生代謝物質百合組織提取DNA和RNA過程中多糖和次生代謝物質幹擾的問題，且可以同時得到高質量的DNA和RNA，為後續的分子生物學實驗奠定了很好的基礎。


圖I為本發明中從岷江百合鱗片中同時提取基因組DNA和總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中泳道I為岷江百合鱗片基因組DNA ;泳道2為岷江百合鱗片總RNA。圖2為本發明中從西伯利亞百合葉片中同時提取的基因組DNA和總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中泳道I為西伯利亞百合葉片基因組DNA ;泳道2為西伯利亞百合葉片總RNA。圖3為本發明中從通江百合根中同時提取的基因組DNA和總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中泳道I為通江百合根基因組DNA ;泳道2為通江百合根總RNA。圖4為本發明中岷江百合鱗片基因組DNA酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中Marker 為分子量標準(DL2000 DNA Marker,由 2，OOObpU, 000bp、750bp、500bp、250bp 以及IOObp六條DNA片段組成);泳道I為岷江百合鱗片基因組DNA ;泳道2為岷江百合鱗片基因組DNA的&oRI酶切產物；泳道3為岷江百合鱗片基因組DNA的漢^sHI酶切產物。圖5為本發明中西伯利亞百合葉片基因組DNA酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中Marker為分子量標準(DL2000 DNA Marker);泳道I為西伯利亞百合葉片基因組DNA ；泳道2為西伯利亞百合葉片基因組DNA的及 oRI酶切產物；泳道3為西伯利亞百合葉片基因組DNA的酶切產物。圖6為本發明中通江百合根基因組DNA酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中Marker為分子量標準(DL2000 DNA Marker);泳道I為通江百合根基因組DNA ;泳道2為通 江百合根基因組DNA的&0RI酶切產物；泳道3為通江百合根基因組DNA的及酶切產物。圖7為本發明中岷江百合鱗片、西伯利亞百合葉片、通江百合根總RNA用於擴增3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的RT-PCR分析結果；其中Marker為分子量標準(DL2000 DNA Marker);泳道I為空白對照(ddH20為模板)；泳道2為岷江百合鱗片總RNA的RT-PCR產物；泳道3為西伯利亞百合葉片總RNA的RT-PCR產物；泳道4為通江百合根總RNA 的 RT-PCR 產物。圖8為本發明中岷江百合鱗片、西伯利亞百合葉片、通江百合根總RNA用於擴增肌動蛋白基因(Kifl)的RT-PCR分析結果；其中Marker為分子量標準(DL2000 DNAMarker);泳道I為空白對照(ddH20為模板);泳道2為岷江百合鱗片總RNA的RT-PCR產物；泳道3為西伯利亞百合葉片總RNA的RT-PCR產物；泳道4為通江百合根總RNA的RT-PCR產物。
具體實施例方式下面通過附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護範圍不局限於所述內容。實施例I :從岷江百合鱗片中同時提取RNA和DNA的方法，具體操作如下
(1)取液氮速凍的野生岷江百合幼嫩鱗片0.Sg，用液氮研磨成粉末，將樣品粉末迅速轉移到離心管中，加入12mL預冷的異硫氰酸胍提取緩衝液，充分震蕩混勻置於冰上12min，再加入1.2mL 3mol L—1醋酸鈉(pH5. 0)，顛倒混勻；其中異硫氰酸胍提取緩衝液成分為4. 5mol I71異硫氰酸胍，25mmol I/1朽1檬酸鈉,0. 5% (w/v)十二燒基肌氨酸鈉,3% (w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮，使用前每IOOmL提取緩衝液加入ImL ^ -巰基乙醇；
(2)在步驟(I)得到的樣品混合液中加入12mL氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min後於4°C 12000g離心lOmin，取上清置於新的離心管中，重複此步驟一次；
(3)向步驟(2)中得到的上清液中加入4mL8mol L—1醋酸鉀(pH5. 0,預冷)，顛倒混勻,冰上放置10min，4°C 12000g離心lOmin，取上清置於新的離心管中，重複此步驟一次；
(4)向步驟(3)得到的上清液中加入12mL異丙醇，混勻後_20°C放置30min，接著4°C12000g離心lOmin,得到核酸粗提沉澱物；(5)用75%的乙醇清洗沉澱兩次，室溫下乾燥20min，用0.8mL DEPC處理過的ddH20徹底溶解沉澱；
(6)在步驟(5)得到的總核酸溶液中加入0.8mL Tris飽和酹/氯仿混合液，Tris飽和酚/氯仿混合液中Tris飽和酚與氯仿的體積比為1: 1，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，於40C 12000g離心lOmin，取上清置於新的離心管中；
(7)向步驟(6)的上清液中加入0.8mL氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，4°C12000g離心lOmin，取上清置於新的離心管中；
(8)向步驟(7)的上清液中加入0.2mLIOmol L—1氯化鋰，混勻後加入0. 4mL無水乙醇，上下顛倒混勻後_20°C放置2h沉澱RNA，40C 14000g離 心15min，取上清液置於新的離心管中；
(9)用75%的乙醇清洗步驟(8)得到的RNA沉澱兩次，室溫下乾燥lOmin，用80ii LDEPC處理過的ddH20溶解RNA沉澱，_80°C保存備用；
(10)向步驟(8)得到的上清液中加入1.4mL異丙醇和0.14mL 3mol L—1醋酸鈉(pH5. 0)，混勻後-20°C放置30min沉澱DNA，室溫下12000g離心15min，得到DNA沉澱，用75%乙醇清洗兩次，在室溫下乾燥lOmin，用80 y L TE緩衝液溶解，於_20°C保存備用。應用本發明的方法，從0. 8g野生岷江百合鱗片中提取了總RNA 63呢，總DNA76Pg，RNA和DNA的得率分別為78. 75Pg/g和95Pg/g。核酸質量檢測經瓊脂糖凝膠電泳結果(見圖I)表明從岷江百合鱗片中提取的DNA、RNA完整性好。在紫外分光光度計上測定260nm和280nm吸光度比值A260ZA280分別為I. 76和I. 95，而DNA和RNA純品的A26(l/A28(l分別為I. 8和2. O，可見利用本發明的方法從岷江百合鱗片中同時提取的RNA和DNA純度很高，完全滿足分子生物學實驗的要求。
實施例2 :從西伯利亞百合葉片中同時提取RNA和DNA的方法，具體操作如下
(1)取液氮速凍的東方百合品種西伯利亞幼嫩葉片lg，用液氮研磨成粉末，將樣品粉末迅速轉移到離心管中，加入12mL預冷的異硫氰酸胍提取緩衝液，充分震蕩混勻置於冰上15min,再加入I. 2mL 3mol L—1醋酸鈉(pH4. 5),顛倒混勻；其中異硫氰酸胍提取緩衝液成分為4. 5mol I71異硫氰酸胍，25mmol I/1朽1檬酸鈉,0. 5% (w/v)十二燒基肌氨酸鈉,3% (w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮，使用前每IOOmL提取緩衝液加入ImL ^ -巰基乙醇；
(2)在步驟(I)得到的樣品混合液中加入12mL氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min後於4°C 12000g離心lOmin，取上清置於新的離心管中，重複此步驟一次；
(3)向步驟(2)中得到的上清液中加入4mL8mol L—1醋酸鉀(pH4. 5,預冷)，顛倒混勻,冰上放置10min，4°C 12000g離心lOmin，取上清置於新的離心管中，重複此步驟一次；
(4)向步驟(3)得到的上清液中加入12mL異丙醇，混勻後_20°C放置30min，接著4°C12000g離心lOmin,得到核酸粗提沉澱物；
(5)用75%的乙醇清洗沉澱兩次，室溫下乾燥20min，用ImLDEPC處理過的ddH20徹底溶解沉澱；
(6)在步驟(5)得到的總核酸溶液中加入ImLTris飽和酹/氯仿混合液,Tris飽和酹/氯仿混合液中Tris飽和酚與氯仿的體積比為1:1，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，於4°C12000g離心lOmin，取上清置於新的離心管中；(7)向步驟(6)的上清液中加入ImL氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，4°C12000g離心lOmin，取上清置於新的離心管中；
(8)向步驟(7)的上清液中加入0.25mLIOmol L—1氯化鋰，混勻後加入0. 5mL無水乙醇，上下顛倒混勻後_20°C放置2h沉澱RNA，40C 14000g離心15min，取上清液置於新的離心管中；
(9)用75%的乙醇清洗步驟(8)得到的RNA沉澱兩次，室溫下乾燥lOmin，用100y LDEPC處理過的ddH20溶解RNA沉澱，_80°C保存備用；
(10)向步驟(8)得到的上清液中加入1.75mL異丙醇和0.175mL 3mol L—1醋酸鈉(pH4. 5)，混勻後-20°C放置30min沉澱DNA，室溫下12000g離心15min，得到DNA沉澱，用75%乙醇清洗兩次，在室溫下乾燥lOmin，用100 y L TE緩衝液溶解，於_20°C保存備用。應用本發明所述的方法，從Ig西伯利亞百合葉片中同時提取獲得了 102呢總RNA，135吒總DNA ；RNA和DNA的得率分別為102l^g/g和135Pg/g。 質量檢測經瓊脂糖凝膠電泳結果(見圖2)表明本發明提取的西伯利亞葉片的RNA、DNA完整性很好，在紫外分光光度計上測定260nm和280nm吸光度比值A260ZA280分別為
I.77和I. 96，而DNA和RNA純品的A26(l/A28(l分別為I. 8和2. O，可見利用本發明的方法從西伯利亞百合葉片中同時提取的RNA和DNA純度很高，完全滿足分子生物學實驗的要求。實施例3 :從通江百合根中同時提取RNA和DNA的方法，具體操作如下
(1)取液氮速凍的通江百合幼嫩根0.5g，用液氮研磨成粉末，將樣品粉末迅速轉移到離心管中，加入6. 5mL預冷的異硫氰酸胍提取液，充分震蕩混勻置於冰上lOmin，再加入0. 65mL 3mol L—1醋酸鈉(pH5. 5)，顛倒混勻；其中異硫氰酸胍提取緩衝液成分為4. 5molL—1異硫氰酸胍，25mmol L—1檸檬酸鈉，0. 5% (w/v)十二烷基肌氨酸鈉，3% (w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮，使用前每IOOmL提取緩衝液加入ImL ^ -巰基乙醇；
(2)在步驟(I)得到的樣品混合液中加入6.5 mL氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min後於4°C 12000g離心lOmin,取上清置於新的離心管中，重複此步驟一次；
(3)向步驟(2)中得到的上清液中加入2.17mL 8mol L—1醋酸鉀(pH5. 5，預冷)，顛倒混勻，冰上放置10min，4°C 12000g離心lOmin，取上清置於新的離心管中，重複此步驟一次；
(4)向步驟(3)得到的上清液中加入6.5mL異丙醇，混勻後_20°C放置30min，接著4°C12000g離心lOmin,得到核酸粗提沉澱物；
(5)用75%的乙醇清洗沉澱兩次，室溫下乾燥20min，用0.5mL DEPC處理過的ddH20徹底溶解沉澱；
(6)在步驟(5)得到的總核酸溶液中加入0.5mL Tris飽和酚/氯仿混合液，Tris飽和酚/氯仿混合液中Tris飽和酚與氯仿的體積比為1: 1，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，於40C 12000g離心lOmin，取上清置於新的離心管中；
(7)向步驟(6)的上清液中加入0.5mL氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，4°C12000g離心lOmin，取上清置於新的離心管中；
(8)向步驟(7)的上清液中加入0.125mL IOmol L^1氯化鋰，混勻後加入0. 25mL無水乙醇，上下顛倒混勻後_20°C放置2h沉澱RNA，40C 14000g離心15min，取上清液置於新的離心管中；(9)用75%的乙醇清洗步驟(8)得到的RNA沉澱兩次，室溫下乾燥lOmin，用60ii LDEPC處理過的ddH20溶解RNA沉澱，_80°C保存備用；
(10)向步驟(8)得到的上清液中加入0.875mL異丙醇和0.0875mL3mol L—1醋酸鈉(pH5. 5)，混勻後-20°C放置30min沉澱DNA，室溫下12000g離心15min，得到DNA沉澱，用75%乙醇清洗兩次，在室溫下乾燥lOmin，用60 y L TE緩衝液溶解，於_20°C保存備用。應用本發明的方法，從0. 5g通江百合根中同時提取了總RNA 53呢，總DNA67Pg，RNA和DNA的得率分別為106Pg/g和134Pg/g。質量檢測瓊脂糖凝膠電泳結果(見圖3)表明從通江百合根中同時提取的RNA、DNA完整性很好，在紫外分光光度計上測定260nm和280nm吸光度比值A26(l/A28(l分別為I. 76和I. 97，而DNA和RNA純品的A26(l/A28(l分別為I. 8和2. O，可見利用本發明的方法從通江百合根中同時提取的RNA和DNA純度很高，完全滿足分子生物學實驗的要求。實施例4 :從岷江百合鱗片、西伯利亞百合葉片以及通江百合根中提取基因組DNA 的酶切檢測
對上述實施例中應用本發明的方法分別提取的岷江百合鱗片、西伯利亞百合葉片以及通江百合根基因組DNA進行限制性內切酶處理，進一步檢驗所提取DNA的質量。酶切反應體系為基因組DNA 4吒；限制性內切酶15U (.EcoRl或漢); 10XTango Buffer 2ML ;補充ddH20至終體積為20ML。酶切反應時間為12h，酶切結束後取8ML用於瓊脂糖凝膠電泳，結果分別如附圖4、5、6所示。表明本發明從岷江百合鱗片、西伯利亞百合葉片以及通江百合根中提取基因組DNA均能被&0RI或完全酶切，可見所提取的DNA質量高，能滿足分子生物學實驗所需。實施例5 :從岷江百合鱗片、西伯利亞百合葉片以及通江百合根中提取總RNA的RT-PCR分析
根據上述實施例中測定的RNA濃度，分別將岷江百合鱗片、西伯利亞葉片以及通江百合根總RNA樣品稀釋至0. 5Pg/ML。採用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA逆轉錄成第一鏈cDNA，反應體系和操作過程如下分別取總RNA 5u g,加入oligo (dT) 2 u L,加入DEPC處理過的ddH20定容至14 u L0混勻後，70°C加熱變性5 min後迅速在冰上冷卻
2min,然後加入下列成分5XFirst_stand buffer 4 u L> dNTP (IOmM each) 0. 5 u L>RNasin (40U) 0. 5 u L, M-MLV (200U) I u L0 混勻短時離心後，42°C溫浴 I. 5h，取出後95°C加熱5min終止反應。cDNA第一鏈合成後置於_20°C保存備用。RT-PCR共分析了兩個基因，百合3-磷酸甘油醛脫氫酶基因iGAPDH、以及肌動蛋白基因Udi/ )，引物序列、擴增產物長度以及引物退火溫度見表I。PCR反應體系如下所示模板(第一鏈 cDNA) 0. 2u L, IOXBuffer 2 u L, dNTP (IOmM each) 0.5iiL，上遊引物(IOuM) 0.2iiL，下遊引物(IOiiM) 0.2 U L, Taq DNA polymerase (5U) 0.2 U L, ddH2016. 7 u L0 PCR 反應條件為 94°C 3 min ；94°C 30s，59°C或 63°C 30s, 72°C 50s，30 個循環；72°C 5min。PCR結束後，取8 u L PCR產物在I. 2%TAE瓊脂糖凝膠中進行電泳。結果分別見圖7和圖8，從岷江百合鱗片、西伯利亞百合葉片以及通江百合根中提取總RNA逆轉錄的cDNA均能成功擴增出看家基因GAPDH、Actin的特異片段，兩個基因片段的大小均與預期值相符，表明本發明所提取的RNA質量高，適合進行RT-PCR及其他分子生物學實驗。表I :RT-PCR引物序列
權利要求
1.ー種從百合組織中同時提取DNA和RNA的方法，其特徵在於它包括以下步驟 (1)取0.5-lg百合植物組織，加入液氮研磨成粉末，按每克組織材料添加12-15ml的異硫氰酸胍提取緩衝液的比例加入預冷的異硫氰酸胍提取液，充分震蕩混勻，冰浴10_15min，再加入提取液1/10體積的pH4. 5-5. 5、3molじ1醋酸鈉，顛倒混勻；其中異硫氰酸胍提取緩衝液成分為4. 5molじ1異硫氰酸胍，25mmolじ1朽1檬酸鈉,0. 5% (w/v)十二燒基肌氨酸鈉，3% (w/v)可溶性聚こ烯吡咯烷酮，使用前每IOOmL提取緩衝液加入ImL ^ -巰基こ醇； (2)在步驟(I)得到的混合液中加入與提取液等體積的氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min後於4°C 12000g離心IOmin,取上清置於新的離心管中，重複此步驟一次； (3)向步驟(2)中得到的上清液中加入1/3提取液體積的pH4.5-5. 5、8molじ1預冷醋酸鉀，顛倒混勻，冰上放置lOmin，4°C 12000g離心lOmin，取上清置於新的離心管中，重複此步驟一次； (4)向步驟(3)得到的上清液中加入與提取液等體積的異丙醇，混勻後-20°C放置30min,接著4°C 12000g離心lOmin,得到核酸粗提沉澱物； (5)用75%的こ醇清洗沉澱兩次，室溫下乾燥20min，用0.5-lmL DEPC處理過的ddH20徹底溶解沉澱； (6)在步驟(5)得到的總核酸溶液中加入0.5-lmLTris飽和酚/氯仿混合液，Tris飽和酚/氯仿混合液中Tris飽和酚與氯仿的體積比為1:1，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，於40C 12000g離心lOmin，取上清置於新的離心管中； (7)向步驟(6)的上清液中加入0.5-lmL氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，4°C12000g離心lOmin，取上清置於新的離心管中； (8)向步驟(7)的上清液中加入0.125-0. 25mL IOmolじ1氯化鋰，混勻後加入0. 25-0. 5mL無水こ醇，上下顛倒混勻後_20°C放置2h沉澱RNA，4°C 14000g離心15min，取上清液置於新的離心管中； (9)用75%的こ醇清洗步驟(8)得到的RNA沉澱兩次，室溫下乾燥lOmin，用60-100y LDEPC處理過的ddH20溶解RNA沉澱，_80°C保存備用； (10)向步驟(8)得到的上清液中加入0.875-1. 75mL異丙醇和0. 0875-0. 175mLpH4. 5-5. 5的3molじ1醋酸鈉，混勻後-20°C放置30min沉澱DNA，室溫下12000g離心15min，得到DNA沉澱，用75%こ醇清洗兩次，在室溫下乾燥lOmin，用60-100 u L TE緩衝液溶解，於-20°C保存備用。
2.如權利要求I所述的從百合組織中同時提取DNA和RNA的方法，其特徵在於百合植物組織為野生岷江百合幼嫩鱗片、東方百合品種西伯利亞幼嫩葉片、通江百合的幼嫩根中的ー種。
全文摘要
本發明公開了一種同時提取百合組織中DNA和RNA的方法，該方法是利用百合組織樣品經過相同的步驟粗提和純化，得到總核酸溶液，再依次選擇性沉澱RNA和DNA，得到高質量的DNA和RNA；本發明方法優點在於所用時間短、經濟快速、穩定性好，並且提取的核酸質量高；其特點在於兩次利用高濃度醋酸鉀沉澱多糖，能有效地去除百合樣品中的多糖；在DNA和RNA分離過程中，先用氯化鋰和無水乙醇協同作用選擇性沉澱RNA，然後利用醋酸鈉和異丙醇沉澱DNA，DNA和RNA分離效率高，核酸損失小，且沉澱時間大大縮短。該方法適用於從富含多糖及其他次生代謝物質的百合組織中同時提取DNA和RNA。
文檔編號C12N15/10GK102776174SQ20121029646
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月21日 優先權日2012年8月21日
發明者劉亞龍, 劉迪秋, 李紅麗, 葛鋒, 陳朝銀, 饒健 申請人:昆明理工大學