採用從脂肪組織中提取的富含膠原的物質治療病人的系統和方法

2023-08-03 06:32:46

專利名稱：：採用從脂肪組織中提取的富含膠原的物質治療病人的系統和方法相關申請的相互參考本申請要求2001年12月20遞交的名稱為「來源於脂肪組織的含膠原物質的提取、存儲和應用」的美國臨時申請6O/342,91O的優先權，其全部內容在此併入參考。
背景技術：
：1.發明領域本發明一般涉及來源於脂肪組織的結締組織物質，更特別地涉及來源於脂肪的富含膠原的物質，使用來源於脂肪的富含膠原的物質的方法，含有來源於脂肪的富含膠原的物質的組合物，以及製備和使用來源於脂肪的富含膠原的物質的系統。2.相關領域描述膠原是人類身體的基本結構蛋白之一(Bergeon1967)。它提供了骨骼、結締軟組織、和皮膚的核心支架(Uitto1971；Liu，Yangetal.1995)。膠原被逐漸地應用於醫療器材，尤其是軟組織修復和增殖領域(KamerChurukian1984；Klein2001SclafaniRomo2001)。這包括用在止血海綿中(PurnaBabu2000)，用在藥物給藥中，作為基質用於基於細胞的產物(SilverPins1992；ScherberichandBeretz2OOO)，皮膚修復，聲帶修復(Ford，Staskowskietal.1995；Remacle，Lawsonetal.1999)，眼睛敷劑(Hamel，Shaarawyetal.2001)，和用在軟組織增殖中(皺紋填充劑或其他載體功能)(KamerChurukian1984)。儘管近來開發出了重組的膠原(Bulleid，Johnetal.2000；Myllyharju20OO)，然而用於這類應用的大多數膠原仍傳統地為牛來源(Aragona，D′Ursoetal.1998)。由於牛來源的膠原大多存在外源性因子(Aragona，D′Ursoetal.1998)，從而誘導免疫應答，而重組的膠原仍為一未證實的實體，因此這兩種來源均存在潛在的問題。天然人膠原和提取自人皮膚(Sclafani，Romoetal.2002)和筋膜(Shore2000；Burres2001)的富含膠原的物質也已被用於美容性應用，然而這些組織來源不能在病人的病床邊迅速地依照「實時」加工成為可用的產物，同時目前的商業化局限於其中將來源於單個個體，幾乎總是來源於屍體的組織配製用於注射入受者個體內的應用。這種途徑面臨著將外源性生物體，如肝炎病毒或HIV導入的風險。FDA文獻中包括了由於該原因導致的至少一例產品的產品召回(2001年1月16日，Alloderm；LifeCellInc.)——引自FDA網站。牛或豬膠原的這種應用受到由變應性應答(Boerner1988；Mullins，Richardsetal.1996)和免疫系統介導的植入物的快速降解(Aragona，D′Ursoetal.1998)造成的美容性和治療性應用中的有限的持續性應答(Groutz，Blaivasetal.2000；Yokoyama，Yoshimuraetal.2001；Block，Cooperetal.2003)的問題的困擾。通過採用具有與異種的(來源於另一物種)或同種異體的(來源於同一物種的另一個體)膠原相同特性的自體固有(自身來源)產物，可以改善這類缺陷。一些研究者試圖採用整個或破碎的脂肪組織作為軟組織填充物質的來源用於通常應用牛膠原的許多應用中(BoeringandHuffstadt1967；Asken1990；Koufman1991；Coleman，Lawrenceetal.1993；Carpaneda1994；Haab，Zimmemetal.1997；Hsiung，Wooetal.2000；Coleman2001；Lee，Kungetal.2001)。然而，在這些應用中可能存在與針對植入脂肪的炎症和纖維化應答相關的問題，其中由於缺乏血管供應和在脂肪肥大部位偶然產生的反相應答常常導致發生壞死，並觀察到由該問題造成的矯正過度(Bartynski，Marionetal.1990；Nguyen，Pasyketal.1990；Latoni，Marshalletal.2000；MillerandPopp2002)。在該領域仍存在對加工脂肪組織從而便宜和可靠地高產率地提供富含膠原的物質的新方法和裝置的需求，從而當對病人給藥時不誘導顯著的炎症和/或免疫應答，如果存在任何誘導的話。發明簡述本發明涉及使用來源於脂肪組織，且與促進、產生或支持治療性的、結構性、或美容性的效果所必須的添加劑一起直接置於受者體內的富含膠原的物質的組合物、方法和系統。所述組合物可從單一手術操作過程中獲得，並可在脂肪組織被從病人中除去後，例如在被從病人中吸出後的幾小時或幾天之內，立即對病人給藥。在一實施方式中，脂肪組織加工發生於一保持封閉、無菌的液體/組織通路的系統中。這可通過使用允許閉合通路中的組織和液體元素運輸的一組預先裝配、聯接的封閉、無菌的容器和管道來實現。該加工組可與一系列插入可控制試劑的添加、溫度和加工時間的裝置中的加工試劑(如鹽、去垢劑等)相聯，從而減輕操作者的手動操作的需要。在一優選的實施方式中，從組織提取到加工和置於受者體內的全過程均在同一設備中完成，甚至在實施該操作的病人的同一房間內完成。根據本發明的一個方面，未加工的脂肪組織被加工從而大體上除去細胞組分從而獲得富含膠原且適合置於受者體內的由不同成分形成的結締組織基質物質。富含膠原的物質可與細胞、組織、組織碎片、或其他的細胞生長和/或分化的刺激因子一起置於受者體內。在一優選的實施方式中，所述的物質與上述任一添加劑一起被置於通過單一手術步驟從其中得到該物質的個體體內，從而達到使受者產生治療性、結構性或美容性療效的目的。在一實施方式中，一種治療病人的方法包括如下步驟a)提供一種組織除去系統；b)採用組織除去系統從病人中除去脂肪組織，所述脂肪組織包含一定濃度的富含膠原的物質；c)加工至少一部分脂肪組織從而獲得一定濃度的不同於加工前脂肪組織中的膠原濃度的膠原；和d)將富含膠原的物質給藥至病人，並且在對病人給藥前無須從組織除去系統中移出該富含膠原的物質。一種如本發明所公開的系統，包括a)一個組織收集容器，其包括i)一個構造成用於收集從病人中除去的脂肪組織的組織收集入口；和ii)一個位於容器內部的過濾器，其被構造成用於保留從病人中除去的脂肪組織同時讓從病人中除去的非脂肪組織通過；b)一個與組織收集容器相連的用於收集來自於脂肪組織的富含膠原的物質，並且無須從組織除去系統中移出該富含膠原的物質的混合容器，其還包括一添加入口，用於將至少一種添加劑與容器中含有的富含膠原的物質混合給藥；和c)一個出口，其被構造成允許混合容器中的富含膠原的物質從組織收集系統中移出從而對病人進行給藥。本文描述的任何特徵或特徵的組合均落入本發明要求保護的範圍之內，條件是包括在任何這類組合中的特徵與本文上下文、本說明書和本領域普通技術人員的知識範圍不明顯的相互矛盾。如下的詳細描述將進一步闡明本發明的另外的優點和方面。附圖簡述圖1描述了一種用於加工脂肪組織從而從脂肪組織中提取富含膠原的物質的組織除去系統；和圖2描述了一用於自動操作如圖1所示的組織除去系統的處理裝置。本發明的優選的實施方式的詳細描述現在詳細參考本發明目前的優選實施例，其例子示於附圖中。如果可能，在附圖和說明書中採用相同或類似的參考編號用於表示相同或類似的部分。應當注意所述附圖是以簡化形式表示，其不是按精確比例表示的。在參考本文說明書時，為了方便和清楚的目的，方向術語，例如頂部、底部、左、右、上、下、在上方、在上面、在下面、在下方、後面和前面均參考附圖來使用。這種方向術語不應當解釋為以任何方式限制本發明的範圍。雖然本文的說明書提到了特定的舉例說明的實施方式，但應當理解這些實施方式是以舉例子的形式，而不是以限制的形式呈現的。雖然論述了示範性的實施方式，然而下述詳細描述的目的應當被解釋為意圖覆蓋所有對實施方式的修改、替換和實施方式的等同替換，如所附權利要求所定義的那樣，其均落入本發明的範圍和主旨範圍中。本發明可結合本領域傳統採用的各種細胞或組織分離技術來實施，同時只有那些理解本發明所必須的常用的操作步驟才記載於本文中。本發明涉及存在於脂肪組織中的富含膠原的物質，以及將該富含膠原的物質給藥至人類或動物病體的系統和方法。脂肪組織的富含膠原的物質可被用作一種用於治療性和美容性應用的物質的來源。其中所述的物質可被用於再生性藥物，例如可採用再生細胞來治療疾病，其中富含膠原的物質作為再生或新生的組織或細胞的基底或支架。富含膠原的物質可與細胞添加劑或另外的結構組分，例如人工(塑料，金屬或其他複合物)植入物或載體、附加的或其他結締組織一起對病人給藥，或者所述富含膠原的物質可與如本文所討論的其他組織混合給藥。將本文所公開的富含膠原的物質優選地對提供所述物質來源的病人給藥。研究發現，脂肪組織是富含膠原的基質物質的豐富來源。這項發現可以至少部分地由於很容易除去脂肪組織中的主要細胞組分——脂肪細胞。因此，在人和動物研究中，加工過的無細胞脂質吸出物(一種典型的富含膠原的物質)為一種非水溶性的富含膠原的結締組織基質物質，其佔未處理的脂肪組織乾重的至少2％，更典型的多於5％。換句話說，當將提取的未處理的脂肪組織乾燥處理時，多於約5％的幹組織重量典型地是富含膠原的結締組織基質物質。如本文中的用法，「脂肪組織」是指含有包括脂肪細胞、網狀細胞、微血管細胞在內的多種細胞類型的組織。脂肪組織包括幹細胞和內皮前體細胞。相應地，脂肪組織是指包括用於儲存脂肪的結締組織的脂肪。如本文中的用法，「脂肪組織單位」是指脂肪組織的一離散或可測量的數量。一脂肪組織單位可以通過確定單位的重量和/或體積來測量。參考本文的公開說明書，一脂肪組織單位可以是指從一個病人中分離的脂肪組織的總量，或一少於從一個病人中分離的脂肪組織總量的量。因此，一脂肪組織單位可以與另一脂肪組織單位組合形成一重量或體積為單個單位之和的脂肪組織單位。一個「單位」的類似定義適用於術語，如「富含膠原的物質」和「加工過的無細胞脂質吸出物」，其中單位是這些物質的一個離散的量。如本文中的用法，「部分」是指一少於整體的物質的量。一較少部分是指一少於50％的量，同時一較大部分是指一多於50％的量。因此，一少於從病人中除去的脂肪組織總量的脂肪組織單位為分離的脂肪組織的一部分。如本文中的用法，「富含膠原的物質」是指採用除了最初的用無菌水漂洗從而從脂肪組織中除去至少一部分非膠原組分的步驟外的任何方式加工的脂肪組織。一方面，富含膠原的物質是指採用除了最初的用無菌水漂洗從而從結締脂肪組織中除去至少一部分細胞組分的步驟外的任何方式加工的脂肪組織。如本文中的用法，「加工過的無細胞脂質吸出物」是指採用除了最初的用無菌水漂洗從而從脂肪組織中除去全部或大體上全部細胞組分(即細胞或細胞碎片)的步驟外的任何方式加工的脂肪組織。加工過的無細胞脂質吸出物可包括通過從脂肪組織中漂洗和分離結締組織而獲得的不溶於水的蛋白、蛋白多糖和其他結締組織元素(呈顆粒狀或重懸形式)。通過離心富含膠原的物質的懸浮液，從而使所述物質聚集在離心容器的底部來獲得加工過的脂質吸出物顆粒。還可進一步純化和提取加工過的無細胞脂質吸出物，從而產生一種特異性地富集一種或多種加工過的無細胞脂質吸出物的元素(例如膠原)的產物。類似地，加工過的無細胞脂質吸出物可與其他因子混合，通過化學反應添加或除去化學基團來修飾，從而改變加工過的無細胞脂質吸出物或其組分的溶解度或其他物理或生理學特性。在實施本文公開的方法的過程中，對病人給藥的物質來源於脂肪組織。脂肪組織可採用本領域熟練技術人員已知的任何方法來獲得。例如，脂肪組織可通過抽吸輔助的抽脂術、超聲波輔助的抽脂術和剪切脂肪切除術而從病人中分離。此外，該操作可包括這些操作的聯用，例如聯用剪切脂肪切除術和抽吸輔助的抽脂術。由於這些組織或其一些部分用於重新植入病人體內，因此應當採用能保持結締組織組分活力完整性，同時使潛在的感染生物體，如細菌和/或病毒對組織的汙染可能性最小化的方式來收集所述的脂肪組織。因此，組織提取應當以一消毒或無菌的方式來進行從而使汙染最小化。由於其與其他技術，例如超聲波輔助的抽脂術相比，抽吸輔助的抽脂術提供了一種伴隨最小可能的結締組織損傷的最小破壞性的組織收集方法，因此抽吸輔助的抽脂術可十分理想的用於從病人中除去脂肪組織。對於抽吸輔助的抽脂術操作，通過向存在於病人中的脂肪組織堆積部位或附近插入一套管，並隨後將脂肪組織吸入一抽吸裝置來收集脂肪組織。在一具體實施方式中，小套管可與注射器相連，同時可通過手動力量來抽吸脂肪組織。採用注射器或其他類似的裝置可理想地從病人中分離相對適中量的脂肪組織(例如，從0.1ml到幾百毫升的脂肪組織)。採用這些相對小的裝置進行的操作的優點在於，與全身麻醉相比，所述操作可在僅局部麻醉的情況下進行。超出該範圍的較大體積的脂肪組織(例如，大於幾百毫升)將需要根據供體和實施收集操作的個體的判斷力進行全身麻醉。當希望除去較大體積的脂肪組織時，則在操作中採用相對較大的套管和自動抽吸裝置。剪切脂肪切除術包括但並不僅限於其中含有脂肪組織的組織(例如，皮膚)作為操作的一附帶部分被分離的操作；也就是，其中手術的首要目的是除去組織(例如肥胖病或美容外科手術中的皮膚)，同時其中脂肪組織是隨著主要感興趣的組織而被除去的。從病人中除去的脂肪組織被收集至一容器中用於進一步的處理。如本文中的論述，在一具體實施方式中，所述裝置被設計和用於實現收集組織的目的，從而用於製備得到加工過的包括膠原的脂肪組織的結締組織組分。在另一實施方式中，所述裝置可以是典型的用於通過主治醫師進行提取操作而進行組織收集的任何傳統裝置。其優點在於，所述裝置的元件可以以單次使用的元件的形式提供，從而所述裝置可以用後即棄，或者換句話說，其不能在其他病人的另外的操作中再次使用。根據本發明的一個方面公開的用後即棄的裝置可以避免與現存裝置相聯繫的對元件反覆滅菌的需要，從而可降低潛在的感染。此外，與其他裝置相比，本發明裝置的無菌程度和/或可靠性更容易保持，這是因為，至少是部分地因為，相對少量的元件與本發明的裝置相聯繫。作為相對少量的元件的另一結果，可用後即棄的裝置的全部或大體上全部，其成本、組裝時間、重量和/或物理體積都相對較小；同時，從另一方面來說，裝置的輕便性和/或可靠性相對較高。如本發明所述的裝置通過增加脂肪組織的特定組分的溶解性，從而允許將溶解性的組分與非溶解性的組分分離來加工脂肪組織從而獲得一個或多個單位的富含膠原的物質。該提取的脂肪組織的各種組分，如細胞和脂質組分的溶解性的增加，可提供相對較大的膠原產量。收集的組織的量將由許多變量來決定，其包括但不限於供體的身體質量指數、可接近的脂肪組織收穫位點的可用性、共存的和預先存在的藥物治療和情況(如抗凝劑治療)以及為了收集組織的臨床目的。採用牛膠原的經驗表明為了美容目的的典型植入物提供大約30mg膠原/每毫升植入物，典型的操作為在90mg的總移植物體積中包括2至3毫升的物質。在本發明的一特定實施方式中，可進行相當大量的收穫，從而病人可在收穫時接受一次注射並有剩餘的物質被保存，其可根據需要或願望用於以後的應用。類似地，也有實施小體積收穫(少於1毫升但多於0.1毫升)的病人，其只需少量的膠原或其可獲得較大產量的膠原。進行如本文所公開的治療的病人可接受與採用未處理的脂肪組織自體脂肪移植的其他治療相比不同濃度的富含膠原的物質(Coleman2001)。因此，根據本發明的一個方面，從病人中除去的脂肪組織可被加工以除去全部的、大體上全部的、大多數的或一部分的細胞組分，因此改變給藥至病人的膠原的量或濃度。在一實施方式中，加工所述的脂肪組織從而使所述富含膠原的物質包含少於約4％的細胞和細胞碎片。更優選，所述富含膠原的物質實質上不含細胞和細胞碎片。在另一實施方式中，富含膠原的物質包含少於約0.1％的原始存在於組織中的細胞和細胞碎片。這具有減弱或消除因細胞組分存在而造成的負面影響(其中包括壞死和肥大)的進一步的優點(Bartynski，Marionetal.1990；Latoni，Marshalletal.2000；MillerandPopp2002)。實際上，膠原物質中的細胞和細胞碎片的存在可不理想地導致局部的炎症應答和/或免疫應答。通過實施本文所公開的方法，可十分有利地降低對病人給藥富含膠原的物質而造成炎症和/或免疫應答的可能性。在一特定實施方式中，富含膠原的物質中的網狀細胞組分相對於富含膠原的物質中的細胞組分總量的百分比，少於或等於分離的脂肪組織中的網狀細胞組分相對於存在於分離的脂肪組織中的細胞組分總量的百分比。在一本發明的實施方式中，病人接受濃度高於典型的存在於脂肪組織移植物中的膠原濃度的膠原。這是由於，至少部分地由於本發明所述裝置和系統中使用的組織收集容器的類型和構造造成的。本發明的一種組合物包括一高於在同等單位的未處理脂肪組織中存在的膠原濃度的膠原濃度。在特定實施方式中，所述組合物具有一其中至少60％的物質(乾重)為膠原的膠原組分。較高濃度的膠原，例如至多100％，也包括在其他組合物中。含有膠原的組合物可與另外的組分一起給藥，所述組分不是原始存在於從病人中提取的脂肪組織之中的，如細胞、細胞分化因子、生長促進劑、免疫抑制劑或醫療器材，如本文所述。為了獲得組合物中主要含有膠原的特定組合物，任何用於分離存在於富含膠原的物質中的(例如加工過的無細胞脂質吸出物)不同蛋白類型的合適方法都可以採用，例如，採用在高鹽濃度中的溶解度差異或無水條件或其組合(DavisandMackle1981；Ooi，Lacyetal.1991)。富含膠原的物質的製備將需要除去脂肪組織中貯存成熟脂肪的脂肪細胞組分。此外，富含膠原的物質優選地需要除去脂肪組織中的網狀細胞組分。這可典型地通過一系列的洗滌和溶解作用步驟來實現，其中所述組織首先經漂洗從而降低游離脂質(裂解的脂肪細胞所釋放的)和外周血元素(在組織收穫過程中由血管開裂所釋放的)的存在，並隨後通過採用低滲裂解和/或去垢劑或高鹽漂洗來溶解細胞組分。漂洗是一任選的，但優選的步驟，其中將組織與溶液混合從而洗滌除去游離脂質和單個的細胞組分，例如那些存在於血液中的組分，留下完整的脂肪組織碎片。在一實施方式中，將所述的從病人中分離的脂肪組織與水、等滲鹽水溶液或其他生理溶液(例如，BaxterInc出品的Plasmalyte，AbbottLabs出品的Normosol)相混合。可通過本領域熟練技術人員已知的任何方法分離完整的脂肪組織碎片與游離的脂質和細胞，其包括但不限於，過濾、傾析、沉澱或離心技術。在本發明的示範性的實施方式中，如此處所述，通過採用置於組織收集容器中的過濾器將脂肪組織與非脂肪組織分離。在另外的實施方式中，通過採用應用傾析、沉澱和/或離心技術分離所述物質的組織收集容器來將脂肪組織與非脂肪組織分離。隨後，採用傳統的技術或方法使完整的組織碎片溶解，其包括低滲裂解、高鹽提取、採用去垢劑，例如Tween20、TritonX-100或十二烷基磺酸鈉(SDS)、有機溶劑，採用單一或組合的蛋白裂解酶例如膠原酶、胰蛋白酶、脂酶、如美國專利5952215所公開的釋放酶HI和胃蛋白酶進行酶消化。在可以是比如成本更高的，僅部分地採用一次性設備和/或在一非封閉系統中實施的改進實施方式中，可單獨採用切碎或剪切力或與上述傳統技術和方法中的一種或多種聯用來使完整的組織碎片溶解。例如，作為本發明所述方法的概述，可通過將脂肪組織與無菌水混合(低滲溶液裂解)，並隨後採用稀釋的去垢劑溶液漂洗(例如，0.1％Tween20)，並隨後採用水漂洗以除去大體上的全部去垢劑的步驟來溶解完整組織碎片的細胞組分。隨後可通過將所述物質與有機溶解例如乙醇或丙酮混合來除去剩餘的游離脂質。然後通過除去有機溶劑和將富含膠原的沉澱物(加工過的無細胞脂質吸出物)製備成能注射至病人體內的形式來製備所述物質。通過調節所加工組織的量，通過調節最後一次洗滌後富含膠原的物質的重懸體積，和/或通過調節給藥至病人的物質的量來控制對病人給藥的膠原的量和濃度。舉例來說，但非限定性地，在一需要特定高濃度的膠原的裝置中，可加工較大量的組織(例如＞50ml)，隨後加工富含膠原的物質，將大約1g的富含膠原的物質重懸於一小於常規量的體積中(例如1ml)，從而產生一非常高的膠原濃度(大約1g/ml)。這可通過採用機械分割富含膠原的物質纖維(也就是，加工過的無細胞脂質吸出物)來實現，其包括但不限於剪切力(例如，反覆使其通過較小體積腔通路)、通過快速旋轉的刀鋒使其勻化或超聲波作用。此外，富含膠原的物質可被重懸於鹽溶液中從而產生富含膠原的懸浮液。從而富含膠原的物質既不用乾燥也不用保存。在一優選實施方式中，加工的步驟在一一次性使用用後即棄的裝置中進行。所述的裝置包括一套具有允許從封閉系統中添加和從系統中移出物質的入口和出口孔的容器。這種方法可以消除一個樣品與來源於另一樣品的物質交叉感染的風險，同時可降低因子，如來源於組織加工的環境的細菌、真菌和病毒性病原的偶然導入。如下文中詳細討論的，具有該特徵的系統的一實施例如圖1所示。在另一實施方式中，加工步驟在一各種加工步驟被控制且可能自動控制的裝置中實施。一種該裝置的實施例示於圖2，並將在下文中更詳細地討論。通過採用高鹽緩衝液、低PH值，利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或其他蛋白水解酶的酶解消化來溶解非膠原組分來實現富含膠原的物質的進一步純化。這種方法的實施例記載於DavisMackle1981；SperanzaValentini1986；Takasaki，Fujiwaraetal.1995中，和美國專利5436135，4969912和4597762中。在另一示範性實施方式中，組織收集容器可以為一彈性袋，其被構造成置於一允許在組織加工混合步驟中攪動的裝置中(例如，手動或機器帶動)。在另一實施方式中則不採用彈性袋。在細胞組分溶解後，通過除去溶解的細胞組分，無細胞組分形成顆粒或形成團狀物。隨後，採用能溶解大體上無細胞的物質的各種組分的一種或多種添加的液體來重懸團狀物。可通過各種合適的途徑來提供溶解液。例如，可將液體注射入組織收集容器的口中。在一示範性實施方式中，採用50-600ml的無菌緩衝等滲鹽溶液來漂洗1至50毫升的脂肪組織，並將其與100-600ml的無菌蒸餾水在室溫下混合20分鐘。隨後，通過允許富含膠原的物質中的不溶解組分沉澱，和從容器中引導出溶解於水的可溶組分(例如，包含在混合物液相中的物質)來除去水分，例如，通過擠壓容器從而迫使可溶組分流出，或藉助抽吸裝置，例如注射器將可溶組分抽出。隨後，容器中的不溶解組分可與100-600ml的2.0％的TritonX-100去垢劑(SigmaChemicalCompany，St.Louis，MO)混合。將組織在室溫下(大約20℃)混合20分鐘。作為任選的步驟，可重複進行去垢劑漂洗。去垢劑漂洗增強了富含膠原的物質的細胞組分的溶解性。隨後，採用與除去水分類似的方法除去溶解組分和去垢劑的混合物。隨後採用100-600ml的無菌蒸餾水重懸所述物質兩次，從而除去殘留的去垢劑，其如上文所述被從容器中除去。然後，採用100％乙醇漂洗加工過的組織以除去殘留的游離脂質。如上文所述，可從容器中除去大部分的溶解脂質和乙醇，同時通過蒸發，例如通過溫和的加熱組織和乙醇混合物除去殘留的乙醇。隨後富含膠原的物質(加工過的無細胞脂質吸出物)被重懸於鹽溶液中，並通過18G針頭被抽至注射器中。為了將富含膠原的物質破碎成為足夠小的能通過18G針頭的顆粒，可能需要液體反覆地通過針頭。可採用更小尺寸的針來代替18G的針從而使加工過的無細胞脂質吸出物進一步破碎。在一優選實施方式中，通過採用較小的針來替代較大的針並重複該過程直至達到加工過的無細胞脂質吸出物能自由通過的足夠小的尺寸的點，從而逐級減小針的大小，進而可以容易地注射至敏感部位，如臉部。在其他實施方式中，可採用其他裝置，如超聲波儀來幫助破碎加工過的無細胞脂質吸出物的組分，使加工過的無細胞脂質吸出物勻化。採用封閉系統中的剪切力可以破碎膠原，其通過藉助18G針頭的注射器反覆抽取和重新插入所述物質進出容器，例如，通過插入注射器的針頭至含有富含膠原物質的容器中，並將該物質抽入注射器，在保持針頭插入容器中的情況下，擠壓注射器中的物質。一旦該物質能自由地流過注射器的18G針頭，則移開該注射器並用另一具有更小尺寸針頭的注射器替代，並再次重複抽取和重新插入所述物質的步驟。採用逐漸減小的針頭不斷重複該過程，直至所述物質自由的流過希望採用的大小的針頭。在一示範性的實施方式中，一種溶解液體含有濃度為大約0.1％至大約5％的TritonX-100去垢劑，並與組織在大約18℃至大約38℃的溫度下培養大約20至60分鐘。這些參數將根據待消化的組織的量和任選的採用鹽溶液和/或蒸餾水預先漂洗的程度而變化，其可通過經驗研究來優化，從而驗證該系統在合適的時間段中能有效地提取到理想的基質物質。一特別優選的濃度、時間和溫度為在37℃下、採用2％TritonX-100溫育45分鐘。也可以採用可替換的去垢劑，如Tween20和十二烷基磺酸鈉。當細胞組分溶解後，可以漂洗/衝洗富含膠原的物質以除去殘留的去垢劑和/或溶解過程的副產物(例如，溶解的細胞組分和新釋放的游離脂質)。也可採用有機溶劑，如乙醇或丙酮來漂洗富含膠原的物質從而除去殘留的游離脂質。然後，其可通過離心或如上文所述的本領域技術人員已知的其他方法來濃縮。這些後加工漂洗/濃縮步驟可分開或連續地進行。除了上文所述的之外，還存在許多可用於進一步純化富含膠原的物質的後漂洗方法。這些包括高鹽濃度漂洗、採用不傷害膠原的蛋白水解酶，對物質進行化學修飾以改變物質的物理或生理學特性或其組合。在一實施方式中，可加入苯酚、乙酸和水的組合併與加工過的無細胞脂質吸出物混合，從而使加工過的無細胞脂質吸出物中含有的非膠原組分溶解(DavisandMackle1981)。在一可供選擇的實施方式中，可採用對完整膠原只有有限消化能力的蛋白水解酶來消化加工過的無細胞脂質吸出物(例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等)。加工的最終步驟包括將所述富含膠原的物質製成製劑形式，也就是將其破碎至足夠小的顆粒從而可通過小尺寸的針頭或通過小尺寸的針頭給藥。該步驟是所述物質植入特定敏感的身體部位，如嘴唇和鼻翼褶中應用所必須的。這可通過機械作用如剪切力(例如，通過小體積的孔)或超聲波作用來實現。在一例如可以是更昂貴的改進實施方式中，僅部分地使用一次性設備和/或在一非封閉系統中實施可採用快速旋轉的刀鋒(切碎)來破碎完整的組織碎片。可供選擇地，膠原可進行酯化修飾或採用稀釋的酸溶液進行處理以增加溶解性從而獲得可溶的膠原。在一特定實施方式中，將富含膠原的物質直接給藥至病人。換句話說，該物質可在無需從系統中移出或在對病人給藥前暴露於系統的外部環境中的情況下對病人給藥。閉合的系統可降低對病人給藥的物質被汙染可能性。因此，在閉合的系統中加工脂肪組織比現有的方法更有利，因為富含膠原的物質更容易被滅菌。在這樣的實施方式中，所述物質暴露於外部環境或從系統中移出的唯一時間是當所述物質被抽出至一施用裝置並被給藥至病人時的時間。在一實施方式中，所述的施用裝置也可以是閉合系統的一部分。如上文所述，濃縮的物質無需進一步處理就可給藥至病人，或在與其他組織或細胞混合後給藥至病人。例如，所述的其他組織可包括一個或多個單位的脂質吸出物、富含膠原的物質或加工過的無細胞脂質吸出物。在另一實施方式中，至少有一部分物質被儲存用於隨後的移植/輸入。加工過的無細胞脂質吸出物可被分成多於一等份或單位的分量，從而一部分物質被保留用於以後的應用，而一部分則立即施用至病人。在保存庫中中長期保存所有的或部分的物質也在本發明要求保護的範圍之內，如要求了已被正常轉讓的、2001年9月14日遞交的美國臨時專利申請60/322,070的優先權的，名稱為「來源於非造血組織的非胚胎細胞的保存」的申請號為10/242,094的美國專利申請中所公開的那樣，其內容也清楚地併入本文作為參考。在加工結束時，所述物質被裝入一輸入裝置，例如注射器中，用於通過皮下的、肌內的、腹膜內或尿道周的技術置於受者體內。換句話說，細胞可通過本領域熟練技術人員已知的任何方式導入病人體內，例如，其可被注射入組織(例如，骨骼肌)、皮膚(皮下的、面部應用)、組織間隙(例如，聲帶)、或組織中(如，尿道周圍的位置)或其他位置。優選實施方式包括採用針或導管，或通過直接手術移植與添加劑如一預先成型的基質一起導入。所述物質可單獨施用或與其他物質聯合施用，所述的其他物質包括細胞、組織、組織碎片、軟化的骨骼、生長因子如胰島素，或如thiaglitazone類的藥物、生物活性或惰性化合物、可吸收的整型支架、或用於增強群體的輸送、效力、相容性或功能的其他添加劑。為了實現美容、結構或治療目的的衍生作用，所述物質還可以以一種改變、增強或補充所述物質的功能的方式通過化學途徑進行修飾。例如，如美國專利4597762中所公開的那樣，可進行酯化和交聯反應從而修飾所述物質的溶解特性和/或植入後的穩定性。一方面，所述物質可被製成用於指導骨骼再生的三維結構(Schwartzmann2000)，或被製成用於三維組織工程的支架(ScherberichandBeretz2000)。所述物質也可基於美容目的而對病人進行給藥，例如通過增強或提高物理特徵，包括減少皺紋、增大器官體積及其類似的。一組織除去系統的組件的特定實施方式示於圖1和2中。用於從脂肪組織中除去富含膠原的物質的裝置10示於圖1中。裝置10包括通過導管14與組織收集容器16相連的眾多液體容器12A，12B，12C，和12D。圖解表明裝置10具有4個容器12A，12B，12C，和12D；然而根據從提取的脂肪組織中分離和溶解所述富含膠原的物質所需的試劑的數目，其可以包括更多或更少的液體容器。在一實施方式中，容器12A，12B，12C，和12D為彈性袋，而在另一實施方式中，容器12A，12B，12C，和12D為剛性容器。容器12A，12B，12C，和12D上分別包括至少一個用於添加和移出試劑的開口13A，13B，13C，和13D。僅具有一個開口的容器12A，12B，12C，和12D典型地被分別經開口13A，13B，13C，和13D輸送至容器12A，12B，12C，和12D中的試劑填充。在容器12A，12B，12C，和12D均容納了足夠體積的試劑後，每一開口13A，13B，13C，和13D均被連接至導管14，從而允許試劑被輸送至組織收集容器16。在示範性實施方式中，容器12A，12B，12C，和12D分別具有眾多的開口13A，15A，13B，15B，13C，15C，13D，15D。圖例表明開口13A，13B，13C和13D與導管14相連，開口15A，15B，15C和15D用於允許向容器12A，12B，12C，和12D中添加一種或多種試劑。例如開口15A，15B，15C和15D均可包括一個可反覆密封的膜，其可允許針頭插入通過，從而分別進入相應的容器12A，12B，12C，和12D的內部。如上文所述，針頭可被用於添加一種或多種試劑，或用於從容器12A，12B，12C，和12D中移出液體。導管14優選地為閉合的無菌導管，或者換句話說，導管14不向裝置10的外部環境打開，因此在液體容器12A，12B，12C，和12D與組織收集容器16之間提供了一條閉合導管。導管14可採用任何可以滅菌的物質製成，同時如本文所述，其優選為腔大小可被一個或多個作用於導管的閥門所控制的彈性導管。在一實施方式中，導管和容器12，14和16由聚乙烯管制成。在另一實施方式中，導管14的腔直徑大於2mm，並優選地大於5mm。這些容器可為大約200ml至1L的體積。這樣的一個系統具有處理至多200ml脂肪組織並產生數克富含膠原的物質的能力。組織收集容器16包括一個或多個開口，例如被構造成具有能進入組織收集容器16內部的開口18和20。組織收集容器16是一用於收集和保留從病人中提取的脂肪組織的組織收集腔。更特別地，組織收集容器16包括一尺寸適合與一用於吸取脂肪組織的吸入裝置相連的開口18。開口18足夠大，從而允許相對較大體積的脂肪組織進入脂肪組織收集容器16。圖1所示的組織收集容器16還包括一用於向組織收集容器16內部添加一種或多種液體的第二開口20。此外，或可供選擇地，第二開口20也可被用於移出組織收集容器16中容納的物質。如本文所述，組織收集容器16優選地具有一可壓縮的腔體，例如，如本文所述的，允許攪拌組織收集容器16中的物質的腔體17。在一實施方式中，組織收集容器16為一由可被滅菌的材料製成的彈性袋。組織收集容器16還包括一個或多個開口，如允許容器12中的試劑被輸送至組織收集容器16內部的開口19。在示範性的實施方式中，組織收集容器16包括一通過導管14與全部的4個容器12A，12B，12C，和12D相連的開口19。裝置10還包括一個或多個元件(流量控制裝置)，用於控制試劑從容器12A，12B，12C，和12D流入組織收集容器16。在示範性的實施方式中，裝置10包括多個在組織收集容器16和容器12A，12B，12C，和12D之間呈直線排列的閥門22。換句話說，在容器12A，12B，12C，和12D的每一流出路線上都有一個閥門22。因此，通過獨立地調整閥門22，使用者可以選擇性地控制將一種或多種試劑添加至組織收集容器16中。優選閥門22的構造可以防止當那些容器的閥門閉合時，試劑倒流至另外的試劑容器中。例如，當容器12A內部的試劑被輸送至組織收集容器16中時，容器12A的閥門處於打開的位置，而容器12B，12C和12D的閥門則處於關閉的位置。作為替代，或除此之外，沿導管14也可布置一個或多個夾子從而選擇性地控制試劑流入組織收集容器16。因此，在示範性的實施方式中，裝置10是一種用於從病人中收集脂肪組織的裝置，其不是構造成用於再次使用的裝置；或者換句話說，其為一種一次性使用或用後即棄的系統。因此，每一元件，如容器12A，12B，12C，和12D，導管14，和組織收集容器16均可被預先滅菌，並在單個病人使用後扔棄。在本發明的一特定實施方式中，僅用於舉例說明而非限定，一容器12A中含有無菌蒸餾水，第二容器12B中含有2％TritonX-100(Sigma，St.Louis，MO)，第三容器12C中含有100％的醇，比如乙醇，第四容器12D中含有鹽水，如溶於水的0.9％NaCl。在該實施方式中，每一容器的尺寸均適合容納大約1L或更少的溶液。在使用過程中，將裝置10的組織收集容器16與一用於吸出脂質的吸入裝置相連。從病體中提取的脂肪被輸送至組織收集容器16，例如通過開口18的途徑。作為一任選的步驟，如上文所述，提取的組織(包括脂肪組織和非脂肪組織)可經過濾和/或漂洗以除去游離的脂質和外周血。例如，組織收集容器16中可帶有一過濾器。過濾器的一種實例包括許多尺寸相同或不同，大小為大約20μm至5mm的孔。在一優選實施方式中，所述過濾器為一醫藥品級的聚酯網，其大約為200μm厚，孔徑大小約為265μm，開口面積約佔47％。容納在組織收集容器16中的完整脂肪組織的細胞組分採用由容器12A提供的無菌水來提取。通過位於容器12A和組織收集容器16之間的導管上的開口閥門22，可選擇性地將水輸送至組織收集容器16。將水和完整的脂肪組織混合足夠長的一段時間從而提取脂肪組織的細胞組分。該最初步驟將除去大部分，優選大於80％的脂肪組織中的細胞組分。隨後擠壓組織收集容器16以便從容器中移出溶解的組分、游離的脂質(由脂肪細胞裂解產生)和水。通過經開口，如開口20吸出溶有可溶性組分的水，可以從容器中移出水分、脂質和脂肪組織中的可溶組分。或者，通過經導管14將其擠壓回容器12A來從容器中移出水分、脂質和可溶組分。因此，導管14在溶解液體的容器12A，12B，12C，和12D與組織收集容器16之間提供了一種雙向的液體流動路徑。隨後採用來源於容器12B的含有TritonX-100的溶液重懸沉澱物從而使脂肪組織的細胞組分進一步溶解。該去垢劑漂洗步驟將降低殘留的細胞組分，優選至少再去除80％。獲得的上清液也採用上述方法以類似的方式除去。隨後通過將富含膠原的物質與容器12C中的乙醇混合來溶解所獲得的沉澱中的游離脂質組分(典型地，少於脂肪組織原始脂質含量的1％)。然後，如上文所述，不溶解的組分與可溶解的組分分離，同時任何殘留的乙醇通過蒸發被除去。最後，在採用容器12D提供的等滲鹽溶液中重懸所沉澱得到的富含膠原的物質。隨後將針或其它類似的抽取裝置插入組織收集容器16中，例如通過開口20輸入，從而移出重懸的富含膠原的物質。典型的膠原產量將佔原始組織乾重的2-10％，其在很大程度上依賴於供體的身體質量指數(越超重的供體其每克組織將具有更多的脂肪，因此由於稀釋效應則具有更少的膠原)。隨後，可以將富含膠原的物質直接給藥至病人，或可以經進一步加工以提供更精細的富含膠原的物質的懸浮液。例如，可以讓富含膠原的物質的懸浮液反覆地通過一系列不同大小的針，或通過各種孔徑大小的過濾器從而使懸浮液中的顆粒裂解。修辭的問題在上文中，哪些步驟為真實閉合系統的一部分，而那些不是。非修辭的問題是否存在任何方式使其更加成為一閉合系統裝置？在一其中所有的溶液被預先裝載至容器12A-D中的實施方式中，系統中唯一的非閉合部分是脂肪組織的加入和富含膠原的物質的移出。在本發明的一特定實施方式中，處理脂肪組織的一個或多個步驟可被自動控制。例如，如圖2所示，裝置10可被插入處理系統40中。如圖所示，處理系統40包括一個基託44和一個帶有一個或多個支架58的支架組件42。如目前具體描述的，支架組件42具有4個支架58，其被構造成用於支持裝置10的容器12A，12B，12C，和12D。如圖所示，處理系統40的基託44包括一前表面46。許多裝置48位於前表面46上，其相互之間被位於裝置48之間的混合元件50分隔開。裝置48被構造成用於保持裝置10的組織收集容器16。路徑52被限定在裝置48之間，從而使混合元件50可沿路徑52運動而將組織收集容器16中的物質混合。在示範性的實施方式中，混合元件50為一種可沿路徑52上下移動的滾筒棒，當其運動時擠壓組織收集容器16的一個區域。這種運動和對組織收集容器16的擠壓可導致對組織收集容器16中的物質的攪拌或混合。裝置10的導管14被置於處理系統40中，從而可通過泵54和閥門56來控制經過導管14的液體流動。雖然如圖所示的系統顯示具有4個閥門56和一個泵54，但如上文所述可提供更多或更少數目的閥門或泵。例如，可為4個容器12A，12B，12C，和12D中的每一個提供4個泵54。類似地，可提供更多或更少的裝置48用於將組織收集容器16保持於基託44上。如上文所示，在本發明的特定實施方式中，該方法可通過添加一個或多個能自動實施本發明的步驟的附加裝置來實現自動控制。在這樣的實施方式中，處理裝置(例如，微處理器或個人計算機)為如上文所述的能部分地或完全地使步驟自動化的裝置。適用於這種自動操作的步驟的例子包括但不僅限於，通過控制系統或處理裝置中的泵和閥門來控制液體和組織沿特定導管路徑的流入和流出；採用壓力傳感器來檢測堵塞；混合的機構，根據體積測定機構來測量沿特定路徑運動的組織和/或液體的量；採用熱控制裝置保持各種組分的溫度；漂洗富含膠原的材料，採用定時和軟體原理整合該過程。在一種實施方式中，軟體可以控制過程參數從而允許根據特定操作定義的參數來生產富含膠原的物質。因此，自動裝置或多個裝置提高了操作性能，同時實現了脂肪組織的自動收穫和用於對病人給藥的脂肪組織的自動處理。當脂肪收集容器位於裝置內部時或在放入裝置中之前，可以將脂肪組織收集至脂肪收集容器。在一進一步的實施方式中，合併到控制器中的軟體將在必要的步驟中提示使用者向裝置中正確地插入導管和其他元件。軟體也會啟動自動測試，以證實導管的正確插入、不存在堵塞等等。在該裝置中進行的處理的一般步驟將採用與那些在本說明書其他部分公開描述的用於手工組織處理的參數相同的參數。對於本領域技術人員來說，用於組織處理的分步機制的許多其他的形式是顯而易見的，本說明書僅作為一種實施例的情況包括在內。例如，在漂洗和溶解過程中組織和鹽水溶液的混合可如本實施例所述通過攪拌或通過液體再循環而發生。如本文所述，組織的漂洗可通過運動的棒狀機械，或通過搖動或其他機構來實現。實現上述功能的機構可被整合至如圖2中所示的裝置中或合併在一獨立的裝置中。在本發明的一優選實施方式中，組織除去系統和加工設備被放置在接受治療的病人的附近，比如操作室或門診病人處理室(在病人身邊十分有效)。這有利於快速、有效地收穫組織和加工，減少發生樣品處理/標記錯誤的機率，因此允許在單一的手術程序中完成整個過程。參考文獻Aragona，F.，L.D′Urso等(1998).「Immunologicaspectsofbovineinjectablecollageninhumans.Areview.」EurUrol33(2)129-33.Asken，S.(1990).「Microliposuctionandautologousfattransplantationforaestheticenhancementoftheagingface.」JDermatolSurgOncol16(10)965-72.Bartynski，J.，M.S.Marion等(1990).「Histopathologicevaluationofadiposeautograftsinarabbitearmodel.」OtolaryngolHeadNeckSurg102(4)314-21.Bergeonn，M.T.(1967).「Collagenareview.」JOklaStateMedAssoc60(6)330-2.Block，C.A.，C.S.Cooper等(2003).「Long-TermEfficacyofPeriurethralCollagenInjectionfortheTreatmentofUrinaryIncontinenceSecondarytoMyelomeningocele.」JUrol169(1)327-329.Boering，G.A.J.Huffstadt(1967).「Theuseofderma-fatgraftsintheface.」BrJPlastSurg20(2)172-8.Boerner，C.F.(1988).「AllergicresOponsetoaporcinecollagencornealshield.Casereport.」ArchPphthalmol106(2)171.Bulleid，N.J.，D.C.John等(2000).「Recombinantexpressionsystemsfortheproductionofcollagen.」BiochemSocTrans28(4)350-3.Burres，S.(2001).「Soft-tissueaugmentationwithFascian.」ClinPlastSurg28(1)101-10.Carpaneda，C.A.(1994).「Collagenalterationsinadiposeautografts.」AestheticPlastSurg18(1)11-5.Coleman，S.R.(2001).「Structuralfatgraftstheidealfiller？」ClinPlastSurg28(1)111-9.Coleman，W.P.，第三版，N.Lawrence等(1993).「Autologouscollagen？Lipocyticdermalaugmentation.Ahistopathologicstudy.」JDermatolSurgOncol19(11)1032-40.Davis，P.F.Z.M.Mackle(1981).「Asimpleprocedurefortheseparationofinsolublecollagenandelastin.」AnalBiochem115(1)11-7.Ford，C.N.，P.A.Staskowski等(1995).「Autologouscollagenvocalfoldinjectionapreliminaryclinicalstudy.」Laryngoscope105(9Pt1)944-8.Groutz，A.，J.G.Blaivas等(2000).「Outcomeresultsoftransurethralcollageninjectionforfemalestressincontinenceassessmentbyurinaryincontinencescore.」JUrol164(6)2006-9.Haab，F.，P.E.Zimmern等(1997).「Urinarystressincontinenceduetointrinsicsphinctericdeficiencyexperiencewithfatandcollagenperiurethralinjections.」Jurol157(4)1283-6Hamel，M.，T.Shaarawy等(2001).「Deepsclerectomywithcollagenimplantinpatientswithglaucomaandhighmyopoa.」JCataractRefractSurg27(9)1410-7.Hsiung，M.W.，P.Woo等(2000).「Fataugmentationforglotticinsufficiency.」Laryngoscope110(6)1026-33.Kamer，F.M.M.M.Churukian(1984).「Clinicaluseofinjectablecollagen.Athree-yearretrospectivereview.」ArchOtolaryngol110(2)93-8.Klein，A.W.(2001).「Skinfilling.Collagenandotherinjectablesoftheskin.」DermatolClin19(3)491-508，ix.Koufman，J.A.(1991).「Lipoinjectionforvocalcordparalysis.」Laryngoscope101(12Pt1)1385Latoni，J.D.，D.M.Marshall等(2000).「Overgrowthoffatautotransplantedforcorrectionoflocalizedsteroid-inducedatrophy.」PlastReconstrSurg106(7)1566-9.Lee，P.E.，R.C.Kung等(2001).「Periurethralautologousfatinjectionastreatmentforfemalestressurinaryincontinencearandomizeddouble-blindcontrolledtrial.」JUrol165(1)153-8.Liu，S.H.，R.S.Yang等(1995).「Collagenintendon，ligament，andbonehealing.Acurrentreview.」ClinOrthop(318)265-78.Miller，J.J.J.C.Popp(2002).「Fathypertrophyafterautologousfattransfer.」OphthalPlastReconstrSurg18(3)228-31Mullins，R.J.，C.Richards等(1996).「Allergicreactionstooral，surgicalandtopicalbovinecollagen.Anaphylacticriskforsurgeons.」AustNZJOphthalmol24(3)257-60.Myllyharju，J.(2000).「recombinantcollagentrimetsfrominscetcellsandyeast.」MethodsMolBiol13939-48.Nguyen，A.，K.A.Pasyk等(1990).「Comparativestudyofsurvivalofautologousadiposetissuetakenandtranspla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沿組織收集容器移動的滾筒棒，用於攪拌組織收集容器中的內容物。全文摘要本發明公開了使用來源於脂肪組織，且與促進、產生或支持治療性的、結構性、或美容性的效果所必須的添加劑一起直接置於受者體內的富含膠原的物質的組合物、方法和系統。所述組合物可從單一手術操作過程中獲得，並可在脂肪組織被從病人中除去後，例如在被從病人中吸出後的幾小時或幾天之內，立即對病人給藥。文檔編號A61K38/39GK1620306SQ02828237公開日2005年5月25日申請日期2002年12月20日優先權日2001年12月20日發明者J·K·弗拉賽爾,M·H·赫德裡克,R·盧爾申請人:馬克羅珀爾公司