一種染色體22q11.2區微缺失、微重複的測定方法

2023-08-04 03:44:31

專利名稱：：一種染色體22q11.2區微缺失、微重複的測定方法
技術領域：
：本發明屬於生物工程領域，涉及一種染色體22qll.2區微缺失、微重複的測定方法。
背景技術：
：22qll微缺失人群發生率為約1/4000，是最常見的基因組異常症候群，臨床表現以先天性心臟缺陷(CHD)為最常見，其他臨床表現有面部畸形、免疫缺陷、高鈣血症、骨骼異常、泌尿系畸形、輕度學習障礙等。而CHD以主動脈弓中斷、法樂氏四聯徵、室間隔缺損、永存動脈乾等最為常見。對CHD進行22qir微缺失分析不僅可對CHD的分子機理進行探討，對臨床診斷、遺傳諮詢和產前診斷都有幫助。雖然國外對22qll孩i缺失和先心病關係的探索已歷十餘年，取得了一些*，如已將缺失片段定位於染色體22qll區段的1.5-3Mb區間，對其間的一些基因進行了定位，製備了一些區域探針和篩選了一些STRP標記用於遺傳學診斷，不幸的是對部分染色體拷貝數變化比較困難，包括微缺失、微重複等。對於染色體微缺失、微重複的檢測，目前主要採用三種技術(1)染色體螢光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)。這是利用克隆獲得目標染色體位點DM序列製備探針，在焚光標記的條件下，與患者體細胞染色體雜交，確定目標染色體位點是否存在檢測片段的缺失。FISH技術具有分子雜交的特異性和敏感性，結果直觀，染色體微缺失分析中，一直為多數實驗室所採用。但FISH檢測成本較高，操作繁雜，難以同時分析多個染色體區帶。FISH技術受到探針雜交片段的限制，分析染色體位點內的微小缺失容易出現漏診。(2)短串聯重複序列多態性(shorttandemrepeatpolymorphsm,STRP)分析。這一技術利用人類基因組中廣泛存在的微衛星DNA多態性，在目標染色體區帶內選擇多條微衛星DNA靶序列。結合患者及其親本基因組DM的分析，確定目標染色體位點是否存在靶序列的雜合型缺失。STRP分析方法簡便，可以確定缺失染色體的親本起源。但判定結果通常依賴於雜合條帶，同時需結合雙親基因型綜合分析。另一方面，FISH技術和STRP對於分析片段難以定量，因此對於目標染色體區帶的DNA微複製也難以檢出。(3)多重連接探針擴增技術(MultiplexLigation-dependentProbeAmplification,MLPA)，由荷蘭的Dr.Schouten所帶領的研發團隊於2002年發表，這是利用針對染色體不同區域的上下遊對同一條DNA單鏈設計的多對帶冗餘共同序列的探針，用連接酶連接這些上下遊探針以採集這些探針結合區域的DNA模板的數量信息，其探針數量為模板數量。這些多個在不同結合區域所生成的探針可由同一對引物擴增，其定量較為準確，且於單一反應管內最多可同時檢測40個不同的核苷酸序列的拷貝數變化。但作為一種半定量的方法，其假陽性率不可避免。並且其檢測成本較高，難以大規模推廣。以上各種檢驗染色體拷貝數變化的方法共同的缺點是結果的不確定性。FISH技術受到探針雜交片段的限制，分析染色體位點內的微小缺失容易出現漏診，STRP分析的判定結果通常依賴於雜合條帶，且受到分析靶序列雜合度和雙親樣本分析結果的影響，其陽性率不能完全滿意，而MLPA作為一種半定量的方法，其假陽性率不可避免。這些方法的不確定性已成為制約大規模推廣臨床診斷的重要障礙，因此，開發一種新的、能大規模精確而又經濟的確定染色體拷貝數變化的方法並制定相關的技術標準就變得非常重要。
發明內容本發明的目的是提供一種染色體22q11.2區微缺失、微重複的測定方法。本發明的目的是通過下列技術措施實現的一種染色體22qll.2區微缺失、微重複的測定方法，該方法包括下列步驟a.抽提基因組DNA;b.多重螢光定量PCR複合擴增複合擴增體系中包括了5個STR標記D22S873,22D-5畫1,22D丄5,22D-4—4，22D—4—3和一個內參G6PDH;進行PCR擴增；c.取PCR擴增產物變性使雙鏈產物轉化為可為毛細管電泳分析的單鏈，採用毛細管電泳對上述變性產物進行產物長度和產物量分析；d.結果分析1)根據下列公式計算量比值被檢測者STR位點峰面積/其內參的峰面積量比值=__正常對照STR位點峰面積/其內參的峰面積量比值0.7-1.3,為正常二倍體個體；量比值小於0.7，為存在微缺失的個體；量比值大於1.3，為存在微重複的個體；和/或2)根據峰的位置和數量進行判斷，微缺失為在相應位置缺少峰；微重複有三種情形相應位置出現峰高等於或接近1:1:1的三個峰、出現峰高等於或接近2:1的二個峰、出現峰高等於或接近l:2的二個峰；其中D22S873的上遊引物序列為SEQIDNO.1,下遊引物序列為SEQIDNO.2;22D_5—1的上遊引物序列為SEQIDNO.3,下遊引物序列為SEQIDNO.4;22D—4-5的上遊引物序列為SEQIDNO.5,下遊引物序列為SEQIDNO.6;22D-4—4的上遊引物序列為SEQIDN0.7，下遊引物序列為SEQIDNO.8;22D丄3的上遊引物序列為SEQIDNO.9,下遊引物序列為SEQIDNO.10;G6PDH的上遊引物序列為SEQIDNO.11，下遊引物序列為SEQIDNO.12。所述的測定方法，該方法中PCR複合擴增體系為25pl體系包括35-80ng基因組DNA2.5ju110xSTRbuffer(promega)0.1D22S873引物0.2juM22D—5—1引物0.4juM22D丄5引物1.122D—4—4引物0.21juM22D-4—3引物0.085nMG6PDH引物1UTag酶(promega)。本發明的有益效果對22qll.2,我們建立了一種竟爭性多重焚光定量短串聯重複PCR檢測技術(CFMSA)。通過短串聯重複PCR標記物，CFMSA可以在同一試管中同時檢測該染色體的多態性和基因數量，也因此增加了敏感性。在IIO個正常對照的實驗中證實了高度多態性和基因數量的可靠性。476個符合美國心臟學會診斷標準的先天性心臟病患者中，正確鑑別出22qll.2區的17個微缺失和1個微重複。CFMSA有望取代目前對22qll.2區常規的大範圍篩查技術，成為廉價而有效的篩查22qll.2區微缺失和微重複的新方法。1、突破了傳統微缺失和微重複的篩查工具只能提供定量信息和多態性信息中的其中一種的限制，CFMSA同時提供這兩個互為印證的信息，極大的提高了傳統篩查工具的可靠性，將篩查結果的無效率從20%左右降低為0.02%以下，降低了IOOO倍。2、CFMSA不需要傳統的細胞培養，探針雜交技術，將整套流程的時間從數個工作曰降低為數個小時，並極大降低了工作量，每個FISH樣品所需要的人工為3個，該工具僅為0.01個。3、整個技術流程的大部分可以自動化操作，利於大規模臨床使用。且費用低廉，成本從l千多元降低為數十元。國內產前診斷由於成本高，規模小長期處於虧損狀態，該工具有望改變這一情況。圖1是實施例1樣本擴增產物用ABI3130基因分析儀進行毛細管電泳分析圖。圖2是實施例2樣本擴增產物用ABI3130基因分析儀進行毛細管電泳分析圖。圖中標*為先心病人樣本。具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。注本發明實施例涉及的生物工程技術未作詳細說明的均採用本領域技術人員公知的方法。用於產前診斷的基因組DNA可採用胎兒羊水進行抽提基因組DM。實施例1操作步驟1、抽提基因組DM:樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒(上海賽百盛技術公司)；先天性心臟病患者及正常人血液；按照試劑盒要求分別抽提基因組DNA。2、多重螢光定量PCR複合擴增複合擴增體系中包括了5個STR標記D22S873,22D—5—1，22D—4—5，22D—4—4,22D—4—3和一個內參G6PDH;引物序列見下表(在每個STR位點的前向引物F上加FAM螢光標記)tableseeoriginaldocumentpage7RGATGATTTATCTGCCCTGTCACCG6PDHFCAGCCCTCTGTCCGATTACTAC9246459-9246842RGCCAGCTTAGAGATCAGCTCCTpcr擴增25u1體系包括35-80ng基因組DNA2.5/a110xSTRbuffer(緩衝液)(promega)0.1mMd22s873引物0.2jjM22D丄1引物0.4juM22D一4一5引物1.1pM22D-4—4引物0.21pM22D—4一3引物0.085ijMG6PDH引物1UTag酶(promega);PCR反應條件95'C2min,94。Clmin60。Clmin-lOcycle75'C1.5min,90。Clmin-60。Clmin."cycle70°C1.5minj60。C30min3、取2|u1PCR產物，與7.8jj1HiDi甲醯胺(abi公司)，0.2y1Rox500標準分子量標記(ABI公司)相混合，95。C變性5分鐘，使PCR擴增產物由雙鏈產物轉化為可為毛細管電泳分析的單鏈。4、用abi3130基因分析儀對上述變性產物進行毛細管電泳分析，得出str位點及其內參的峰面積(見表l)及圖1:5、結果分析1)根據量比值進行分析表ltableseeoriginaldocumentpage8(18419+17156+16808+15507+37654)/92059量比值==0.601(27852+20354+18870+18110+45668)/6863結果此先心病人存在22qll.2微缺失。2)根據圖1中峰的位置和數量進行判斷說明由於染色體的DNA來自父母，在正常情況下，每對引物PCR擴增片斷的變性產物進行毛細管電泳分析顯示為相應位置出現峰高相同或接近的兩個峰(峰高比例可在0.7-1.3:l之間)，即兩個未重疊峰；如果這兩個峰重疊，則該位置出現峰高約為未重疊峰峰高2倍的單個重疊峰(重疊峰與未重疊峰的峰高比例可在1.6~2.4:1之間)圖1中引物D22S873對應位置的峰正常對照為峰高約為先心病人峰高2倍的一個峰，表明形成重疊，而先心病人只有一個未重疊的峰，缺少另一個峰高相近的峰；引物22D—5—1、引物22D-4—5、引物22D—4-4、引物22D-4—3對應位置的峰正常人分別在相應位置出現兩個未重疊的峰，而先心病人在相應位置只有一個未重疊的峰。結論此先心病人存在22q11.2微缺失。可以單獨採用量比值的方法或者採用峰的位置和數量的方法判斷是否存在微缺失，最好是兩種方法結合採用，以進一步提高分析的準確性。實施例2:操作步驟1、抽提基因組DNA:樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒(上海賽百盛技術公司)；另一先天性心臟病患者及正常人血液；按照試劑盒要求分別抽提基因組DNA。2、多重螢光定量PCR複合擴增複合擴增體系中包括了5個STR標記D22S873，22D—5-1,22D—4—5，22D一4一4，22D—4—3和一個內參G6PDH;引物序列見下表(在每個STR位點的前向引物F上加FAM螢光標記)STR標記引物序列染色體位置重複序列D22S873FAGTCTGTGTGACAGAGTGACAGCRGCTCCTCTGAGCACGTTTCT22D—5一1FGAGCAGCTTTTGTGGGTTTTRGACTCTGAAAGGTAGAGGTGAAGG22D—4—5FTGAAATTTGTATGTGAGCTGATTGRGAGCGACACTGTGAGACACCT22D丄4FGGCTTGGACTGAGTGTCTGAGRGTGAGACCCTATTTCAAAAACGM22D一4一3FTCCTGCTCCATTCCAGGTCRGATGATTTATCTGCCCTGTCACC18320444-1832061617860735-1786094117356116-1735637618028855-1802914817985302-17985630MATTA丌CTTCTTTCformulaseeoriginaldocumentpage10PCR擴增25ml體系包括35-80ng基因組DNA2.5ja110xSTRbuffer(promega)0.1mMd22s873引物0.2jjM22d—5—1引物0.4jnM22D—4—5引物1.1iuM22D—4_4引物0.21uM22D-4—3引物0.085iuMG6PDH引物1UTag酶(promega);PCR反應條件:95。C2min,94。Clmin、60。Clmin>10cycle75。C1.5min,90。Clmin-60'Clmin，14cycle70。C1.5min'60°C30min3、取2julPCR產物，與7.8nlHiDi甲醯胺(ABI公司)，0.2jj1Rox500標準分子量標記(ABI公司)相混合，95。C變性5分鐘，使PCR擴增產物由雙鏈產物轉化為可為毛細管電泳分析的單鏈。4、用ABI3130基因分析儀對上述變性產物進行毛細管電泳分析，得出STR位點及其內參的峰面積(見表2)及圖2:5、結果分析1)根據量比值進行分析表2D22S873(峰面積)22D—5-1(峰面積)22D丄5(峰面積)22丄4(峰面積)22D丄3(峰面積)G6PDH(峰面積)先心病人4934850186303424527812483685514正常人278522035418870181104566868631(49348+50186+30342+45278+124836)/85514量比值=-(27852+20354+1887Q+1S110+4566S)結果此先心病人存在22qll.2微重複。2)根據圖2中峰的位置和數量進行判斷:10引物D22S873對應位置的峰正常對照為峰高約為先心病人未重疊峰的峰高2倍的一個峰，表明形成重疊，而先心病人有3個峰高相近的未重疊峰，多出一個峰；引物22D-5—1、引物22D一4-5、引物22D—4—4對應位置的峰正常人分別在相應位置出現2個未重疊的峰，而先心病人在相應位置出現2個峰，但其中一個峰的峰高約為另一個峰的峰高2倍，表明此峰是重疊峰，即多出一個峰。引物22D-(3對應位置的峰正常人在相應位置出現兩個未重疊的峰，而先心病人在相應位置出現3個未重疊峰，多出一個峰。結論此先心病人存在22qlL2」微重複。可以單獨採用量比值的方法或者採用峰的位置和數量的方法判斷是否存在微重複，最好是兩種方法結合採用，以進一步提高分析的準確性。南京市婦幼{呆健院〈120〉一種染色體22q11.2區微缺失、微重複的測定方法12123DNA人工序列〈223〉STR標記D22S873上遊引物1agtctgtgtgacagagtgacage23220腿人工序列〈223〉STR標記D22S873下遊引物2gctcctctgagcacgtUct20320<212〉DNA人工序列<220〉〈223〉STR標記22D—5-l上遊引物3gagcagcttttgtgggtut204<211〉24DNA<213〉人工序列〈223〉STR標記22D—5-l下遊引物<400〉4gactctgaaaggtagaggtgaagg24524腿人工序列〈223〉STR標i己22D—4-5上遊引物5tgaaatttgtatgtgagctgattg24621艦人工序列〈223〉STR標i己22D-4-5下遊引物6gagcgacactgtgagacacct21721DNA人工序列〈223〉STR標記22D-4-4上遊引物7ggcttggactgagtgtctgag21824腿<213〉人工序列<220〉〈223〉STR標記22D-4-4下遊引物8gtgagaccctatttcaaaaacgaa24919DM<213〉人工序列<220〉〈223〉STR標記22D-4-3上遊引物9tcctgctccattccaggtc191024難人工序列〈223〉STR標記22D—4-3下遊引物10gatgatttatctgccctgtcacc24<210〉1122DNA<213〉人工序列<220〉〈223〉G6PDH上遊引物<400〉11cagccctctgtccgattactac22<210〉1222廳人工序列〈223〉G6PDH上遊引物12gccagcttagagatcagctcct2權利要求1、一種染色體22q11.2區微缺失、微重複的測定方法，其特徵在於該方法包括下列步驟a.抽提基因組DNA；b.多重螢光定量PCR複合擴增複合擴增體系中包括了5個STR標記D22S873，22D_5_1，22D_4_5，22D_4_4，22D_4_3和一個內參G6PDH；進行PCR擴增；c.取PCR擴增產物變性使雙鏈產物轉化為可為毛細管電泳分析的單鏈，採用毛細管電泳對上述變性產物進行產物長度和產物量分析；d.結果分析1)根據下列公式計算量比值量比值0.7～1.3為正常二倍體個體；量比值小於0.7為存在微缺失的個體；量比值大於1.3為存在微重複的個體；和/或2)根據峰的位置和數量進行判斷，微缺失為在相應位置缺少峰；微重複有三種情形相應位置出現峰高等於或接近1∶1∶1的三個峰、出現峰高等於或接近2∶1的二個峰、出現峰高等於或接近1∶2的二個峰；其中D22S873的上遊引物序列為SEQIDNO.1，下遊引物序列為SEQIDNO.2；22D_5_1的上遊引物序列為SEQIDNO.3，下遊引物序列為SEQIDNO.4；22D_4_5的上遊引物序列為SEQIDNO.5，下遊引物序列為SEQIDNO.6；22D_4_4的上遊引物序列為SEQIDNO.7，下遊引物序列為SEQIDNO.8；22D_4_3的上遊引物序列為SEQIDNO.9，下遊引物序列為SEQIDNO.10；G6PDH的上遊引物序列為SEQIDNO.11，下遊引物序列為SEQIDNO.12。2、根據權利要求1所述的測定方法，其特徵在於該方法中PCR複合擴增體系為25(jl體系包括35-80ng基因組DNA`2.5jj110xstr緩衝液0.1juMD22S873引物0.2juM22D-5—1引物0.4juM22D—4-5引物1.1|uM22D—4—4引物0.21jaM22D—4一3引物0.085uMG6PDH引物1UTag酶。全文摘要本發明屬於生物工程領域，公開了一種染色體22q11.2區微缺失、微重複的測定方法。該方法的步驟包括抽提基因組DNA；進行多重螢光定量PCR複合擴增，複合擴增體系中包括了5個STR標記D22S873，22D_5_1，22D_4_5，2D_4_4，22D_4_3和一個內參G6PDH；取PCR擴增產物變性使雙鏈產物轉化為可為毛細管電泳分析的單鏈，採用毛細管電泳對上述變性產物進行產物長度和產物量分析；採用量比值分析的方法和/或採用峰的位置及數量分析的方法判斷是否為正常、微缺失或微重複。該方法可提高檢測的可靠性，縮短檢測時間，降低檢測成本，便於臨床大規模使用。文檔編號C12Q1/68GK101555528SQ20091011894公開日2009年10月14日申請日期2009年3月9日優先權日2008年9月28日發明者龍易,許爭峰申請人:南京市婦幼保健院