以β-環糊精為鍵合固定相的毛細管電色譜柱的製備方法及在手性藥物分離中的應用的製作方法
2023-08-03 19:47:51
專利名稱：以β-環糊精為鍵合固定相的毛細管電色譜柱的製備方法及在手性藥物分離中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分離技術，特別是一種以β-環糊精為鍵合固定相的毛細管電色譜柱的製備方法及在手性藥物分離中的應用。
背景技術：
毛細管電色譜目前是一種較新的分離技術，它主要是基於色譜分離機制進行的。在毛細管中填充、塗敷或鍵合固定相，使被分離組分在固定相中進行保留和分配。由於毛細管電色譜是基於液相色譜和毛細管電泳技術相結合的一種分離技術，所以它具有良好的選擇性和較高的分離效率。根據固定相不同的填充方法，毛細管電色譜可以分為3個亞型，即 毛細管開管柱(0TC-CEC)，毛細管填充柱(PC-CEC)和毛細管整體柱(MC-CEC)。填充毛細管電色譜是把固定相填充到毛細管中的一種電色譜技術，它是毛細管電色譜最常用的一種技術，因為它有分離效率高，固定相資源豐富等優點，所以應用範圍較廣。環糊精(CD)是一類研究很多的超分子化合物，由於環糊精中的各個葡萄糖基都不能繞糖苷鍵自由旋轉，因此環糊精的形狀呈錐體圓桶形。圓筒的內側是以糖苷氧原子連結C-H組成的環，呈現相對的疏水性，可以接受不同類型的客體化合物，尤其是那些非極性基團。環糊精空穴的外環為一級和二級羥基，使得環糊精外部呈親水性。CD有多個手性中心，其促使對映體分離的基本原理是在它們之間形成包合物，而不同包合物的穩定常數不同，從而實現分離。由於環糊精類手性選擇劑擁有很多手性中心、每個葡萄糖單元都是固定的椅式結構，使得環糊精具有很多結合部位，如β -環糊精有35個不同的結合部位，這種結構使得環糊精比相同的葡萄糖結構和數量的線性多糖擁有多得多的手性識別能力，可以分離更多的對映體。在α-⑶、β-⑶、Y-⑶這3種天然⑶中，α-⑶因空腔較小，Y -⑶因難於製備，價格昂貴，使其應用受到了一定的限制，而β-CD製備相對較容易，價格低廉；無毒，無環境汙染；其空腔能與大部分客體體積相匹配得到使其得到了廣泛應用，因此，本發明的研製成功具有統計學上的意義。
發明內容
針對上述情況，為解決現有技術之缺陷，本發明之目的就是提供一種以β -環糊精為鍵合固定相的毛細管電色譜柱的製備方法及在手性藥物分離中的應用，可有效解決毛細管電色譜柱的製備及手性藥物分離的問題。本發明解決的技術方案是，以β -環糊精為起始反應物，採用分步合成法，依次合成六位單取代的對甲苯磺醯-環糊精、六位單取代的氨化-環糊精、矽烷化矽膠以及環糊精鍵合矽膠手性固定相，將環糊精鍵合矽膠手性固定相裝填至毛細管柱中，製備成毛細管填充柱，其步驟包括有①.六位單取代的對甲苯磺醯環糊精的製備，②.六位單取代的氨化-β-環糊精的製備，③.矽烷化矽膠的製備，④.β-環糊精鍵合矽膠手性固定相的製備，⑤.毛細管填充柱的製備。本發明環糊精鍵合矽膠固定相的製備相對較容易，價格低廉，低毒，環境汙染低，此外，採用分步合成法能有效的控制產物的結構和純度，β-CD的空腔與大部分客體體積相匹配，是環糊精為鍵合固定相的毛細管電色譜柱的製備方法及在手性分離中的應用上的創新。
圖I為本發明鹽酸舍曲林在CEC模式下的拆分色譜圖。
圖2為本發明鹽酸克倫特羅在CEC模式下的拆分色譜圖。
具體實施例方式以下對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。本發明的具體製備過程如下
①.六位單取代的對甲苯磺醯-β -環糊精(β -⑶-6-OTs)的製備
a.環糊精重結晶，室溫18-25 °C下，β-環糊精(β_⑶)在水中的溶解度為18.8 mg/g，在80°C為196.6 mg/g，β -環糊精與純水按質量比1:5進行重結晶，在500ml燒杯中加入200 ml蒸懼水,加熱至微沸,稱取40g3 -環糊精,攪拌加入至溶解,趁熱快速抽濾，濾液於冰箱中放置12h，β -環糊精結晶析出，抽濾，得重結晶後的β -環糊精，按上述步驟將β -環糊精重結晶3次，將所得經3次重結晶的β -環糊精置於真空乾燥箱中80°C乾燥12h，備用；
b.對甲苯磺醯氯重結晶及其乙腈溶液的製備，稱取對甲苯磺醯氯10g，加入30ml石油醚，置於加熱套中加熱至60 90°C使之溶解，放置室溫18-25°C，並於4 °C冷藏12 h，抽濾，得重結晶的對甲苯磺醯氯，按上述步驟重結晶3次，再置真空乾燥箱中25 °C乾燥4h，得3次重結晶的對甲苯磺醯氯，稱取5. 04g 3次重結晶的對甲苯磺醯氯溶於15ml乙腈中，成對甲苯磺醯氯乙腈溶液，備用；
c.六位單取代的對甲苯磺醯-環糊精合成方法，稱取30g步驟a中3次重結晶後的環糊精於三頸燒瓶中，加入250ml蒸餾水，室溫18-25°C下，逐滴加入濃度為O. 335g/ml氫氧化鈉溶液10ml，攪拌lh，冰浴中在45_55min內逐滴加入步驟b中製備的對甲苯磺醯氯乙腈溶液15ml,繼續攪拌20min,抽濾,濾液用質量濃度為10%的鹽酸調至pH=8,4°C冷藏12h，過濾，得固體物，固體物在真空乾燥箱中50°C乾燥12h，成磺醯化反應粗產物，稱取25g的磺醯化反應粗產物，置於加熱套中加水加熱，至其完全溶解，再冷卻至室溫18-25°C，冷藏12h，抽濾，得重結晶產物，按上述步驟重結晶3次，得3次重結晶的產物六位單取代的對甲苯磺醯-β-環糊精，再置於真空乾燥箱中，在50°C下乾燥12h，用NMR及TLC驗證六位單取代的對甲苯磺醯-β -環糊精的純度，放於乾燥器中，備用；d. NMR驗證β -CD-6-OTs的純度以 DMSO 為溶劑，測試了 β -CD、β -CdKTs1H-NMR 圖譜
I) β-CD 的1H-NMR 圖譜，1H NMR (400 MHz, DMS0)，δ 5. 69 (dd, J = 21. 9, 4.3Hz, 4H), 4.81 (d, /=2.7 Hz, 2H)，4.45 (t, /=5.3 Hz, 2H)，3.95 - 3. 27 (m,19H), 3. 25 (s, 1H), 2.48 (d, /=1.5 Hz, 1H)
2) β-CD-6-OTs 的1H-NMR 圖譜，1H-NMR (400 MHz, DMSO)，δ 7. 73 (d, J = 8. 2Hz, 2H), 7. 41 (d, J = 8. 2 Hz, 2H)，5. 70 (s, 20H)，4. 89 - 4. 74 (m, 8H)，4. 5 -3. 3 (m, 47H)，2. 42 (s, 3H)
從β -⑶1H-NMR圖譜中分析可以得到δ 5. 8 ppm和δ 5. 7 ppm分別是β -⑶C2位和C3位羥基上氫的信號峰，δ 4. 8 ppm是β -⑶Hl氫的信號峰，然而δ 4. 5 ppm是β -⑶C6位羥基上氫的信號峰，化學位移在3. 7 3. 2 ppm是β -⑶Η2 - Η6氫的信號峰。β -⑶-6-0TS的1H-NMR圖譜中分析可以得到，有新的信號峰出現，化學位移在7. 41 7. 72 ppm之間的峰為苯環上氫的信號峰；同時在δ 4. 8 ppm旁邊也有新的信號峰出現，它是環糊精取代位置氫的信號峰；化學位移在4. 6 4. 2 ppm是β -OTKTs C6位羥基上氫的信號峰；化學位移在3. 7 3. 5 ppm和3. 4 3. 2 ppm分別是環糊精H6，H3，H5和H4，H2氫的信號峰；並且在δ2.4 ppm也出現了新的信號峰，它是β -⑶-6_0Ts取代 基團-CH3上氫的信號峰。β -⑶-6-OTs和β -⑶的核磁共振氫譜相比較，有很多新的信號峰出現，可以看到β_⑶-6-OTs中苯環的特徵峰δ7. 41和δ7. 72。1H-NMR圖譜表明，對甲苯磺醯氯成功修飾了環糊精上羥基，成功合成了 β -CD-6-OTs，表明本發明研製成功。e. TLC 驗證 β-CD-6-OTs 的純度
以矽膠板為固定相，丁酮一甲醇一水比例為8:1:4 (ν/ν/ν)做為展開劑，以β-⑶為參照物，研究了磺醯化反應產物經純化後，製備的β -⑶-6-OTs和未反應完全的β -⑶的分離。結果表明，製備的β_⑶-6-OTs經過重結晶純化後，在β_⑶相應的位置沒有斑點，表明得到較純的β -⑶-6-OTs。β -⑶-6-OTs和β -⑶的相對比移值為I. 5。試驗中，六位單取代的對甲苯磺醯環糊精合成反應常用氫氧化鈉水溶液和無水吡啶為反應溶劑，但對兩種方法進行對比，發現採用氫氧化鈉水溶液作為反應溶劑時，反應條件容易、毒性較小、環境汙染小。所以本發明選用以氫氧化鈉水溶液為反應溶劑，進行磺醯化反應。②.六位單取代的氨化-β -環糊精的製備
稱取步驟①的c步驟中製備的六位單取代的對甲苯磺醯-β -環糊精3. 0g，溶於45ml乙二胺，均勻混合後，於80°C下反應4h，反應結束後，旋蒸除去未反應的過量乙二胺，再將剩餘的混合物均勻分散在-10 °C的冰丙酮中，沉澱析出粗產物，粗產物用體積濃度為10%的甲醇溶液溶解，再用丙酮沉出，如此反覆3-5次，得沉出物，真空乾燥後，得白色產物，SP為六位單取代的氨化-β -環糊精，用核磁共振氫譜表徵製備的六位單取代氨化-環糊
不目；
用核磁共振氫譜表徵製備的六位單取代氨化-β -環糊精以DMSO為溶劑，測試了六位單取代的氨化-β-環糊精1H-NMR圖譜。1HNMR (400 MHz, DMS0) δ 5. 69 (s, 14HC2 - 0H，C3 - 0H)，4. 81 (s, 7H Cl - H), 4. 45 (s, 6H C6 - 0H)，3. 81 - 3. 19 (m, 42H,C3 - H, C5 - H, C6 - H, C2 - H, C4 - H)，2. 08 - I. 81 (m, 4H, NH2 - CH2CH2 - NH - ) ·
化學位移在2. I ppm處的峰為烷基上氫的信號。1H-NMR圖譜表明，乙二胺成功地將醯氯基團取代，修飾成氨化環糊精。氨化環糊精和醯氯化環糊精核磁共振氫譜相比較，可以看到氨化環糊精中苯環的特徵峰消失。說明第二步反應成功且得到較純的氨化環糊精。③.矽烷化矽膠的製備本發明用Y-(2，3-環氧丙氧)丙基三甲氧基矽烷(ΚΗ-560)作為擔體，ΚΗ-560的乙氧基與矽膠表面的矽羥基反應，製備得到矽烷化矽膠，即矽膠ΚΗ-560。本發明通過-Si-O-Si-鍵將ΚΗ-560鍵合到矽膠表面。由於空間位阻效應，不可能ΚΗ-560的三個甲氧基都與矽醇基反應，而甲氧基在含水的條件下可以水解成羥基。所以本反應必須在無水條件下進行。a試劑與器皿的處理
分子篩(分子篩是結晶態的矽酸鹽或矽鋁酸鹽，由矽氧四面體或鋁氧四面體通過氧橋鍵相連而形成，分子尺寸大小通常為O. 3-2. Onm的孔道和空腔體系，從而具有篩分分子的特性)置於馬弗爐中，在400°C下活化4h，然後置於玻璃器皿中，冷卻後迅速倒入甲苯中，除去甲苯中的微量水分子，得到無水甲苯，反應所需的玻璃器皿反應前均在115-125 (最好為120°C)乾燥；
b.矽膠活化·
矽膠活化的目的是將矽膠表面的金屬離子除去，使矽膠表面的矽醇基裸露的更多，從而使更多的環糊精可以鍵合到矽膠的表面，以提高鍵合量；
稱取l.Og高效液相色譜矽膠(3 ym),加到三口燒瓶內，用7. 5ml質量濃度為20%的鹽酸溶液，110°C加熱攪拌回流6 h，在室溫18-25°C下過濾，以超純水洗滌濾餅，直至pH呈中性，在真空乾燥箱中120°C下乾燥12h，得活化後的矽膠，置於乾燥器中備用；
c.娃膠KH-560合成
稱取上述活化後的矽膠O. 5g於三頸瓶中，加入5ml無水甲苯和30 μ I三乙胺，形成混懸液，在氮氣保護下加入250 μ I ΚΗ-560，100 120 1攪拌回流10 h，反應完成後，抽濾，依次用無水甲苯，無水乙醚，丙酮，甲醇各洗滌3次，80°C真空乾燥12 h，得到矽烷化矽膠，即矽膠KH-560 ；
將矽膠KH-560進行元素分析，元素分析實測的結果為N 0% ；C 5. 9% ；H1. 1% ;碳元素含量的增加表明KH-560成功地鍵合到了矽膠表面。④.β -環糊精鍵合矽膠手性固定相的製備
固定相鍵合通常有兩種不同的方法(1)先將環糊精接到空間臂一端，再把空間臂另一端鍵合到矽膠表面上；(2)先將矽膠鍵合到空間臂一端，再將環糊精接到空間臂另一端。這兩種方法，無論採用哪一種都要將固定相鍵合到矽膠的表面，所以鍵合這一步反應非常關鍵，直接關係到整個合成實驗的成敗。本發明採用先將矽膠鍵合到空間臂一端，再將環糊精接到空間臂另一端的方法。將步驟③的步驟c中製備的矽膠ΚΗ-560置於真空乾燥箱120°C真空乾燥12h，稱取O. 2g乾燥後的矽膠KH-560和步驟②中製備的六位單取代氨化-β -環糊精I. Og,置於單口燒瓶中，再加入IOml無水甲苯，氮氣保護，110°C加熱攪拌回流10h，反應完成後，抽濾，用甲醇、丙酮和水洗滌3-5次，60°C於真空乾燥箱中乾燥12h，得β-環糊精鍵合矽膠手性固定相；鍵合固定相的元素分析，元素分析實測的結果為N 0. 27 % ；C 13. 4 % ；H 2. I %，氮元素的增加證明環糊精鍵合固定相鍵合成功。研製中，採用矽膠與矽烷化試劑在無水甲苯體系中，氮氣保護，70 80°C加熱回流進行反應，生成-Si-0-Si-，這樣就把矽烷化試劑鍵合到矽膠表面。同時也有文獻報導，矽膠與矽烷化試劑在DMF體系中，進行反應。文獻報導，也有先製成環糊精衍生物，再將環糊精衍生物與KH-560在DMF體系中，氮氣保護下80°C反應4h，相當於先在環糊精上接上適當長度的空間臂，之後再與矽膠在DMF體系中，氮氣保護下110°C反應24h，即再將空間臂另一端鍵合到矽膠上。也有採用矽膠與矽烷化試劑在DMF體系中，80 90°C加熱回流反應，生成-Si-0-Si-，把矽烷化試劑鍵合到矽膠表面。本發明採用將矽膠與KH-560先發生矽烷化反應，先將矽膠鍵合到空間臂一端，得到矽膠KH-560，再將其與氨化環糊精在無水甲苯體系中，氮氣保護，110°C反應10h，成功而且簡便地得到β-環糊精鍵合矽膠手性固定相，簡單、效果好。⑤.毛細管填充柱的製備
將上述β-環糊精鍵合矽膠手性固定相按已申請專利的方法填充到毛細管柱中，並燒制柱塞，製備成毛細管填充柱；(此步驟已申請專利，申請公開號為CN102512849A)
⑥.毛細管電色譜拆分色譜柱在採用毛細管電色譜模式對手性藥物進行拆分中的應用。應用實例
下面採用本發明製得的β-環糊精鍵合矽膠手性固定相填充的毛細管柱，對鹽酸舍曲林和鹽酸克倫特羅進行手性拆分。毛細管電色譜模式拆分手性藥物的圖譜見圖I和圖2，從圖I中可以看出鹽酸舍曲林可以達到基線分離，而圖2鹽酸克倫特羅只能達到部分分離。證明了本發明製得的β_環糊精鍵合矽膠手性固定相填充的毛細管柱，並且應用毛細管電色譜模式拆分手性藥物具有可行性，也為環糊精衍生物手性固定相應用到毛細管電色譜中奠定了基礎。鹽酸舍曲林和鹽酸克倫特羅參數對比
—I流動相I毛細管柱
鹽酸舍曲林乙腈/磷酸鹽=20:80 40αηΧ100μιη ·(1 (填充長度15cm)_
亙酸克倫特羅I磷酸鹽緩衝溶液|40αηΧ100μιη ·(1 (填充長度15cm)
本發明成功製備了毛細管填充柱β -環糊精鍵合矽膠固定相，相比目前其他合成
方法，採用分步合成法能有效的控制了產物的結構和純度，並且選用了毒性較小的反應物，
此外，本發明使用此固定相成功拆分了藥物，為毛細管填充柱的研究起到推動作用，使毛細
管電色譜能得以更廣泛的應用。
權利要求
1.一種以β-環糊精為鍵合固定相的毛細管電色譜柱的製備方法，其特徵在於，以β -環糊精為起始反應物，採用分步合成法，依次合成六位單取代的對甲苯磺醯-β -環糊精、六位單取代的氨化-β -環糊精、矽烷化矽膠以及β -環糊精鍵合矽膠手性固定相，將β -環糊精鍵合矽膠手性固定相裝填至毛細管柱中，製備成毛細管填充柱。
2.根據權利要求I所述的以β_環糊精為鍵合固定相的毛細管電色譜柱的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟 ①.六位單取代的對甲苯磺醯環糊精的製備 a.在燒杯中加入200ml蒸餾水，加熱至微沸，稱取40gβ -環糊精，攪拌加入至溶解，趁熱快速抽濾，濾液於冰箱中放置12h，β -環糊精結晶析出，抽濾，得重結晶後的β -環糊精，按上述步驟β -環糊精重結晶3次，將所得3次重結晶的β -環糊精置於真空乾燥箱中80°C乾燥12 h，備用； b.對甲苯磺醯氯重結晶及其乙腈溶液的製備，稱取對甲苯磺醯氯10g，加入30ml石油醚，置於加熱套中加熱至60 90°C使之溶解，放置室溫18-25°C，並於4°C冷藏12h，抽濾，得重結晶的對甲苯磺醯氯，按上述步驟重結晶3次，再置真空乾燥箱中25°C乾燥4h，得3次重結晶的對甲苯磺醯氯，稱取5. 04g 3次重結晶的對甲苯磺醯氯溶於15ml乙腈中，成對甲苯磺醯氯乙腈溶液，備用； c.六位單取代的對甲苯磺醯-環糊精合成方法，稱取30g步驟a中3次重結晶後的β -環糊精於三頸燒瓶中，加入250ml蒸餾水，室溫18-25°C下，逐滴加入濃度為O. 335g/ml氫氧化鈉溶液IOml,攪拌Ih,冰浴中在45_55min內逐滴加入步驟b中製備的對甲苯磺醯氯乙腈溶液15ml,繼續攪拌20min,抽濾,濾液用質量濃度為10%的鹽酸調至pH=8,4°C冷藏12h，過濾，得固體物，固體物在真空乾燥箱中50°C乾燥12h，成磺醯化反應粗產物，稱取25g的磺醯化反應粗產物，置於加熱套中加水加熱，至其完全溶解，再冷卻至室溫18_25°C，冷藏12h，抽濾，得重結晶產物，按上述步驟重結晶3次，得3次重結晶的產物六位單取代的對甲苯磺醯-β -環糊精，再置於真空乾燥箱中，在50°C下乾燥12h，用NMR及TLC驗證六位單取代的對甲苯磺醯-β -環糊精的純度，放於乾燥器中，備用； ②.六位單取代的氨化-β-環糊精的製備 稱取步驟①的c步驟中製備的六位單取代的對甲苯磺醯-β -環糊精3. 0g，溶於45ml乙二胺，均勻混合後，於80°C下反應4h，反應結束後，旋蒸除去未反應的過量乙二胺，再將剩餘的混合物均勻分散在-10°C的冰丙酮中，沉澱析出粗產物，粗產物用體積濃度為10%的甲醇溶液溶解，再用丙酮沉出，如此反覆3-5次，得沉出物，真空乾燥後，得白色產物，即為六位單取代的氨化-β -環糊精，用核磁共振氫譜表徵製備的六位單取代氨化-β -環糊不目； ③.矽烷化矽膠的製備 用Y-(2, 3_環氧丙氧)丙基二甲氧基娃燒，即ΚΗ-560作為擔體,利用ΚΗ-560的乙氧基與矽膠表面的矽羥基反應，製備得到矽烷化矽膠，即矽膠ΚΗ-560，方法是 a.矽膠活化 將矽膠表面的金屬離子除去，使矽膠表面的矽醇基裸露的更多，從而使更多的環糊精可以鍵合到矽膠的表面，以提高鍵合量，方法是稱取I. Og高效液相色譜矽膠，加到三口燒瓶內，用7. 5ml質量濃度為20%的鹽酸溶液，110°C加熱攪拌回流6h，在室溫18-25°C下過濾，以超純水洗滌濾餅，直至pH呈中性，在真空乾燥箱中120°C下乾燥12h，得活化後的矽膠，置於乾燥器中備用； b.矽膠KH-560合成 稱取上述活化後的矽膠O. 5g於三頸瓶中，加入5ml無水甲苯和30 μ I三乙胺，形成混懸液，在氮氣保護下加入250 μ I ΚΗ-560,100 120°C攪拌回流10h，反應完成後，抽濾，依次用無水甲苯，無水乙醚，丙酮，甲醇各洗滌3次，80°C真空乾燥12h，得矽烷化矽膠，即矽膠KH-560 ； ④.β-環糊精鍵合矽膠手性固定相的製備 將步驟③的b步驟中製備的矽膠ΚΗ-560置於真空乾燥箱120°C真空乾燥12h，稱取O.2g乾燥後的矽膠KH-560和步驟②中製備的六位單取代氨化-β -環糊精I. Og,置於單口燒瓶中，再加入IOml無水甲苯，氮氣保護，110°C加熱攪拌回流10h，反應完成後，抽濾，用甲醇、丙酮和水洗滌3-5次，60°C於真空乾燥箱中乾燥12 h，得β-環糊精鍵合矽膠手性固定相； ⑤.毛細管填充柱的製備 將β -環糊精鍵合矽膠手性固定相按申請公開號為CN102512849A的方法，填充到毛細管柱中，並燒制柱塞，製備成毛細管填充柱，即可。
3.根據權利要求2所述的以β_環糊精為鍵合固定相的毛細管電色譜柱的製備方法，其特徵在於，所述的無水甲苯是將分子篩置於馬弗爐中，在400°C下活化4h，然後置於玻璃器皿中，冷卻後迅速倒入甲苯中，除去甲苯中的微量水分子，得到無水甲苯，反應所需的玻璃器皿反應前均在115-125°C乾燥。
4.權利要求I或2所述方法製備成的以β_環糊精為鍵合固定相的毛細管電色譜柱，在採用毛細管電色譜模式對手性藥物進行拆分中的應用。
全文摘要
本發明涉及以β-環糊精為鍵合固定相的毛細管電色譜柱的製備方法及在手性藥物分離中的應用，可有效解決毛細管電色譜柱的製備及手性藥物分離的問題，其解決的技術方案是，包括有以下步驟①六位單取代的對甲苯磺醯-β-環糊精的製備，②六位單取代的氨化-β-環糊精的製備，③矽烷化矽膠的製備，④β-環糊精鍵合矽膠手性固定相的製備，⑤毛細管填充柱的製備，本發明價格低廉，低毒，環境汙染低，是β-環糊精為鍵合固定相的毛細管電色譜柱的製備方法及在手性分離中的應用上的創新。
文檔編號C07B57/00GK102921193SQ201210452390
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月13日 優先權日2012年11月13日
發明者周婕, 張振中, 劉倩, 鄭旭霞, 葉凡 申請人:鄭州大學