生產生物活性多肽重組體的方法

2023-08-03 14:48:11 2

專利名稱：生產生物活性多肽重組體的方法
本申請是1992年6月3日提交的PCT/US92/04614的後續申請，該PCT/US92/04614又是1991年6月3日提交的709375的後續申請，而該709375號申請則是1990年6月4日提交的流水號533889申請之後續申請。
本發明的領域本發明涉及可抑制針對抗原的人類免疫反應的人的糖基化抑制因子(GIF)和編碼GIF的多核苷酸序列。
背景技術：
描述雖然常見到免疫反應是有益的，但在某些情況下，對抗原的免疫反應實際上對發生此免疫反應的動物來說是有害的。免疫反應的產生使宿主患有嚴重的病理後遺症症狀的例子是引起自身免疫疾病如紅斑狼瘡。在紅斑狼瘡中，常存在與宿主的甲狀腺、紅細胞、DNA和血小板中的決定簇反應的抗體。
另外述及的抑制免疫反應的例子是治療過敏反應。已經確定的是，抗致敏原的IgE抗體引起枯草熱，並與其它過敏性疾病，如外源性哮喘有關。在該過敏性疾病中IgE抗體起的決定性作用，提示了這樣的可能性即調整和抑制抗致敏原的IgE抗體的形成將成為對過敏性疾病的基本治療手段之一。比如，在因豚草過敏原過敏的枯草熱患者的血清中，總是檢測到抗該致敏原的IgE抗體。花粉季節到後該IgE抗體值上升，然後在該年的其餘時期中略有下降。由於IgE在血清中的半衰期僅為2或3天，所以IgE抗體滴度的這種持續，表明了即使並無過敏原影響，仍能由患者的淋巴細胞持續合成該抗體。
在過去的整個20年中，人們作了一些不同的嘗試來控制實驗動物的IgE抗體反應。這些方法之一是改進經典的免疫學治療或脫敏治療，按此法，過敏患者接受微劑量抗原的反覆注射。業已表明，這種脫敏治療可改善某些患者的臨床症狀。然而，在該治療後，枯草熱患者血清中的IgE抗體滴度並不下降。該治療的主要免疫效應是IgG抗體形成增強和花粉季節過後抑制IgE抗體滴度增加。
脫敏或免疫抑制治療中的限制在於，由於副作用，患者不能承受大劑量的抗原。為克服這種困難，嘗試使用化學修飾的抗原，如，脲-變性抗原或該抗原的聚1，2-亞乙基二醇共軛物來進行治療。由於該經修飾的抗原不與抗該天然抗原的抗體結合，所以注射劑是可相當大而不至引起過敏症狀。然而，這種經修飾的抗原可刺激抗原特異性T細胞。得到的證據是，向小鼠靜脈注射此種經修飾的抗原，導致了抗原特異性抑制T-細胞的產生，該細胞是抑制針對天然抗原反應的原發IgE抗體的。然而，如果在該抗體值達到最大值之後開始這種治療，則該治療對進行性IgE抗體形成的效果最小(Takatsu and Ishizaka，J.Immunol.，1171211，1976)。與對小鼠的觀察一致，在枯草熱患者中的聚1，2-亞乙基二醇-共軛致敏原臨床試驗顯示出該治療對減少IgE抗體滴度無效。反覆注射此經修飾的抗原來抑制進行性IgE抗體形成的失敗可能是由於在該過敏患者中有相當大量的抗原特異性輔助T-細胞的緣故。由於此經修飾的抗原不僅誘發抗原特異性抑制T-細胞的產生，還增加協助T-細胞的數量，該治療的後一效果可能抵消了抑制T-細胞的作用。這種解釋為這樣的事實所支持將特異性抑制T細胞抗原移植於經免疫的小鼠體中，則可導致對進行性IgE抗體形成的抑制(Takatsu and Ishizaka，J.Immunol.，1171211，1976)。該結果總的來說說明了如果能產生抗原特異性抑制T-細胞而不增加協助T-細胞數量，則可抑制枯草熱患者中的持續IgE抗體形成。
自1980年以來，本發明人一直研究各種方法，這些方法以免疫球蛋白同種特異性方式選擇性地調節IgE的合成。作為這一研究的結果，已發現兩類具有IgE親和性及選擇性調節IgE合成的T-細胞因子。IgE結合因子(IgE-BF)之一選擇性地增強IgE反應，而其它類型的IgE-BF則選擇性地抑制此反應。該IgE增強性因子和IgE抑制性因子間的主要區別看來在於該分子的碳水化合物部分。該IgE增強性因子與小扁豆植物凝血素和伴刀豆球蛋白A結合，而該IgE抑制性因子不與其結合(Yodoi，et al.，J.Immunol.，128289，1982)。對IgE增強性因子或對IgE抑制性因子選擇性形成，以及對該因子的基因克隆的細胞機制分析表明IgE增強性因子和IgE抑制性因子共有一種共同的結構基因，而且這些因子的碳水化合物部分的性質和生物活性是在轉譯後糖基化過程中確立的(Martens，et al，Proc.Nat′l Acad，Sci.，U.S.A.，84809，1987)。在生理學條件下，此糖基化過程受兩種T-細胞因子的控制，它們或增強，或抑制此過程。這些因子被命名為糖基化抑制因子(GIF)和糖基化增強因子(GEF)。
GIF的獨特性能是其生物化學活性。這種淋巴因子與抗脂調節素(lipomodulin)的單克隆抗體(一種磷脂酶抑制蛋白)結合，而且看來是一種磷脂酶抑制蛋白的磷酸化衍生物(Vede，et al.，J.Immunol.，130878，1983)。在小鼠中也發現，GIF的主要來源是抗原特異性抑制T-細胞(Ts)(Jadieu，et al.，J.Immunol.，1333266，1984)。隨後的對卵清蛋白(OVA)特異性抑制T-細胞雜交瘤的實驗表明用抗原(OVA)激發的同源巨噬細胞對雜交瘤細胞的刺激導致了對OVA有親和力的GIF(結合抗原的GIF)的形成。然而，同樣的雜交瘤卻基本上分泌對OVA沒有親和性的GIF(非特異性GIF)。對非特異性GIF和結合OVA的GIF間的關係的研究表明該結合抗原的GIF是由一種與抗原結合的多肽鏈和一種非特異性GIF構成的(Jardieu，and Ishizaka，in Immune Regulation ByCharacterized Polypeptides，Goldstein，et al.，eds.，AlanR.Liss，Inc.，N.Y.，p595，1987)。還發現，該結合抗原的GIF和其它研究者所述的抗原特異性抑制T-細胞因子(TsF)共享共同的抗原決定簇，而且以抗原(載體)特異性方式抑制該抗體反應。此外，不僅結合抗原的GIF而且其它研究者所述的抗原特異性TsF都與和單克隆抗一脂調節素(lipomodulin)(141-139)結合的免疫吸附劑相結合，而且通過將該免疫吸附劑在酸性pH值下洗脫而回收。
儘管在治療過敏時對脫敏有這種主要限制，但此技術仍將是繼續選用的方法。因而對該技術提出非常重要的要求，即該技術應是抗原特異性的，但卻無現存的脫敏治療的副作用。
為防止宿主對移植物(HVG)的排斥和移植物對宿主(GVH)的排斥，抑制免疫反應是至關重要的。遺憾的是，在自身免疫病以及HVG和GVH的情況下，抑制免疫反應用的是一種高毒性的藥劑，它們效果有限，而且是系統性地而不是特異性起作用。這類治療的嚴重局限性，導致對毒性較小而特異性較大的免疫抑制劑的需求。
一種改進人體中抑制抗原免疫反應的方法是施用免疫抑制有效量的，可與該抗原特異性結合的GIF。這樣處理時，可望T抑制因子濃度較高，結果對該抗原的免疫反應減小。本發明提供了達到這種結果的手段。
本發明的概要本發明提供了基本純的人抗原特異性GIF和抗原非特異性GIE，以及編碼GIF的核苷酸序列。還提供一種生物活性多肽的重組體生產的通用方法。
附圖的簡要描述

圖1所示是鼠GIF的cDNA克隆的核苷酸序列及推斷出的胺基酸序列。
圖2所示是人GIF的cDNA克隆的核苷酸序列及推斷出的胺基酸序列。
圖3所示是pST811載體圖。
圖4所示是pTMK-hGIF載體圖。
圖5所示是SRα-hGIF載體圖。
圖6所示為SRα-hcGIF載體圖。
圖7所示為融合表達載體，pMEproCT圖。
本發明的詳細說明本發明涉及基本純的、對不希望的免疫反應相關聯的抗原有特異性的人抗原特異性GIF。這種人的抗原特異性GIF，對以抗原特異性方式免疫抑制不希望的免疫反應是極為有用的。
本發明優選可特異性地與致敏原結合的人抗原特異性GIF。在本發明的一個特別優選實施方案中，公開了一種人抗原特異性GIF，它能與蜂毒磷脂酶A2(PLA2)上的抗原決定簇，即蜜蜂毒素中的主要致敏原結合。這種特異性能使此抗原特異性GIF和類似的，有同樣特異性的抗原特異性GIF，被用於抑制對PLA2的人免疫反應。在本發明的另一特別優選實施方案中，公開了一種人抗原特異性GIF，它可與日本杉花粉上的抗原決定簇結合，能用於抑制對這種抗原的人的免疫反應。
這種有關生產對蜂毒PLA2有抗原特異性的GIF的論述很容易由本技術領域中的普通技術人員推廣到其它的抗原，以便製備和提純對那些其它的抗原有抗原特異性的其它的GIF分子而無需作過多的實驗。因此，本發明的廣泛的開創性特點能用來製備針對其它過敏原的人的抗原特異性GIF，用來抑制自身免疫病和過敏之類的免疫反應介導的疾患。在不希望的免疫反應的抗原已知的情況下，如大多數的過敏和各種自身免疫病等，生產各種人抗原特異性GIF是特別有利的。
本發明的人PLA2特異性GIF得自於從ACTT寄存號HB10473的細胞系AC5獲取的抗原特異性GIF，或者說與該抗原特異性GIF有相同識別特徵。本發明的人日本杉花粉特異性GIF得自於從細胞系31E9(ACTT HB11052)獲取的抗原特異性GIF，或者說與該抗原特異性GIF有相同識別特徵。
產生雜交瘤及其特徵描述的方法用於產生雜交瘤的通用方法是公知的(Kohler，et al.，European J.Imm.，6292，1976)。簡言之，將得自對蜜蜂毒素過敏的人的外周血單核細胞(PBMC)，在有化學修飾的PLA2存在下加以培養，回收非附著的細胞，然後在與成淋巴細胞樣細胞系BUC融合之前用IL-2和脂皮質素(lipocoptin)-1進行培養。將雜交瘤篩選出以便產生對PLA2特異性的人GIF。
更一般地說來，本發明針對生產產生人抗原特異性GIF的連續雜交瘤細胞系的方法，該方法包括(a)獲得被抗原激活的人抗原引發T-細胞，而然後在IL-2和磷脂酶A2抑制因子存在下培養；和(b)將該激活的T細胞與融合配偶體細胞繫結合而產生能產生人抗原特異性GIF的雜交瘤。
該抗原引發T-細胞可從任何樣品獲得，包括外周血的單核細胞級分。然後該抗原引發T細胞可在有該抗原存在時加以培養而被激活(對抗該抗原而T細胞被引發)，接著在有白細胞介素-2(IL-2)和磷脂酶A2抑制因子存在下擴展此被激活的T-細胞。為此目的而特別有用的磷脂酶A2抑制因子是脂皮質素。換言之，有PLA2抑制活性的合成的化合物，如2-(p-戊基肉桂醯基)-氨基-4-氯苯甲酸(ONO-RS-082，ONO Pharmaceutical Co)可被使用。
在某些情況下，如原生的抗原對該T-細胞有毒性的場合下，可望以化學修飾此抗原。對這類修飾有用的試劑包括胍HCl化物，和氰的溴化物，但本技術領域中的普通技術人員無需作過多的實驗就很容易地找出類似的試劑。總的來說，優選使用不破壞該抗原外部結構的試劑，因為認為這樣的外部結構對抑制T-細胞表位識別該抗原是重要的。然而，該論點對大多數抗原，如很多非細胞毒性的致敏原來說，並不明顯相符。因而，在典型的致敏原存在下，天然的分子可用於刺激T細胞。
本發明的目的在於產生抗原特異性人T-細胞和T-細胞雜交瘤，它們能產生抗原特異性GIF，它們與欲被免疫抑制的免疫反應相關抗原有特異反應活性。用為確定研究中的人抗原特異性GIF的基本反應模式的常規篩選技術，可完成能產生具有本發明人抗原特異性GIF抗原特異性的人抗原特異性GIF的T-細胞雜交瘤的分離。因此，比如對PLA2特異性的人GIF情況下，如果被測試的人抗原特異性GIF能抑制得自對PLA2過敏患者的細胞的免疫反應，那麼，該被測試的人抗原特異性GIF和由本發明雜交瘤所產生的該對PLA2具特異性的人GIF是等同的。
還有另一種確定一種人抗原特異性GIF是否具有本發明人抗原特異性GIF的特異性的方法，是用抗原預培育本發明的人抗原特異性GIF，所述抗原與原有正常反應活性(比如蜂毒PLA2)並確定該被測試的人抗原特異性GIF是否在其結合該抗原的能力方面受到抑制。如果該被測試的人抗原特異性GIF被抑制，那麼，十有八九，它具有與本發明的人抗原特異性GIF相同的抗原決定簇特異性。
本發明中所用的術語「抗原決定簇」(epitope)的意義是包括能與本發明的人抗原特異性GIF或單克隆抗體相互反應的任何決定簇。表位的決定簇由諸如胺基酸或糖側鏈的化學活性分子基團構成，而且通常具有獨特的三維結構特徵和獨特的電荷特徵。
另一方面，本發明涉及生產基本純的人抗原特異性GIF的方法，它包括(a)培養能產生人抗原特異性GIF的連續雜交瘤細胞系，從而該細胞系產生人抗原特異性GIF；以及(b)將基本純的人抗原特異性GIF從培養物中分離出來。
所用連續雜交瘤細胞系本身可如上所述製得。此外，在培育該雜交瘤細胞系過程中，最好通過將該雜交瘤細胞暴露於同源巨噬細胞中而刺激產生人抗原特異性GIF，該同源巨噬細胞已被用與抗原特異性GIF結合的抗原激發，或用抗CD3或T細胞受體的抗體所激發。
可用各種技術從該培養物中分離和基本提純此人抗原特異性GIF。一種特別有用的技術是採用能與該抗原特異性GIF結合的抗原，比如，將其偶聯於固相上而進行的所謂親和提純法。如果必要，該技術的一種改型是採用兩個親和性吸附步驟來基本上提純此人抗原特異性GIF。按此法，分離基本上純的人抗原特異性GIF的步驟包括(ⅰ)使雜交瘤細胞系與具有對人GIF特異活性的單克隆抗體反應；(ⅱ)從該單克隆抗體中將人GIF洗脫；(ⅲ)使該洗脫的GIF與和人抗原特異性GIF結合的抗原反應；(ⅳ)從該抗原中將此人抗原特異性GIF洗脫；(ⅴ)回收此人抗原特異性GIF。
此外，與抗該抗原特異性GIF的單克隆抗體如110BH3相連的免疫吸附劑可用來取代抗原偶聯的免疫吸附劑。此分離基本純的人抗原特異性GIF的步驟包括(ⅰ)使該雜交瘤細胞系培養物與和人抗原特異性GIF結合的單克隆抗體反應；(ⅱ)從此單克隆抗體中將此人GIF洗脫；(ⅲ)將被洗脫的GIF與具有對人GIF特異反應活性的單克隆抗體反應；(ⅳ)從該單克隆抗體中將此人抗原特異性GIF洗脫；以及(ⅴ)回收此人抗原特異性GIF。
通過將該雜交瘤細胞調到無血清培養基，如ABC來提純人抗原特異性GIF是很方便的。在用抗-CD3進行亞克隆處理後，接著在Protein A塗覆的組織培養皿中培養此雜交瘤細胞系，培養物上清液中的結合抗原的GIF可用上述的離子交換色譜法提純。在這樣的條件下，分離基本純的人抗原特異性GIF工藝包括(ⅰ)使此雜交瘤細胞系培養物上清液與一種陰離子交換基質接觸；(ⅱ)從該基質上將此人GIF洗脫；
(ⅲ)使此被洗脫的GIF與具有對人GIF特異活性的單克隆抗體反應，或與和人抗原特異性GIF結合的抗原反應，或與此二者反應；(ⅳ)洗脫此人抗原特異性GIF；以及(ⅴ)回收此人抗原特異性GIF。
這樣，離子交換層析提純法可與親和性提純法相結合使用，比如，如上所述，通過利用與該抗原特異性GIF結合的抗原，或利用具有對人GIF特異反應活性的一種抗體，或用此二者，來分離人抗原特異性GIF 。
按該優選實施方案，DEAE(二乙氨基乙基)Sepharose是用於提純人抗原特異性GIF的基質。其它可用的離子交換材料包括任何市售的陰離子交換瓊脂糖或纖維素，如多硫酸化瓊脂糖，特別包括(但不限於)QAE(季胺)衍生物，Ecteola(表氯醇三乙醇胺)，TEAE(三乙氨乙基)衍生物和AE(氨乙基)纖維素。與這些不同的離子交換材料結合和從其上洗脫的特定參數是本技術領域中的普通技術人員熟知的，或不經過多的實驗而可容易得知的。
當該雜交瘤細胞系上清液被加到用約20mM的鹽，如NaCl所平衡的陰離子交換基質上時，大量的GIF將通過該柱，而殘餘物用濃度最高為約60mM的鹽洗脫。就從DEAE洗脫而言，優選於10mM Tris中約含20mM-約60mM的NaCl濃度中進行。
在親和提純法中，特別有用的單克隆抗體是用細胞系388F1產生的單克隆抗體，或是用與細胞系388F1所產生的單克隆抗體具相同特異性的單克隆抗體，和由細胞系110BH3產生的單克隆抗體，或具有相同特異性的單克隆抗體。人抗原特異性和抗原非特異性的GIF的治療用途術語「抑制性的」指的是能減少接受治療的人中的不希望的免疫反應的有害影響。術語「免疫抑制有效的」是指所用的人抗原特異性的或非特異性的GIF的量，該是足以抑制由不希望的免疫反應引起的疾病或症狀。
施用本發明的人GIF的劑量範圍是足以產生所需效果的範圍，所述所需效果要使免疫反應的症狀顯示出某種程度的抑制。該劑量不應大到引起不利的副作用，如不希望的交叉反應、過敏反應等等。一般說來，該劑量應隨患者的年齡、症狀、性別和病的程度而變，而且可由本領域中的普通技術人員決定。且該劑量可由各內科醫生根據禁忌症情況調節。劑量可從約0.001mg/kg/劑到約2mg/kg/劑，優選約0.001mg/kg/劑-約0.2mg/kg/劑範圍內改變，每天施用1或多劑，施用1或幾天。
本發明的人GIF可通過注射或在一段時間內輸注而經腸胃外施用。本發明的人GIF可經靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、腔內或透皮施用。
用於腸胃外施用的製劑包括無菌水或非水溶液，懸浮液及乳液。非水溶劑的例子有丙二醇、聚乙二醇，植物油，如橄欖油，以及可注射的有機酯類，如油酸乙酯。含水載體包括水，乙醇/水溶液、乳液或懸浮液，其中包括鹽和緩衝基質。腸胃外用載體包括氯化鈉溶液，林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸化的林格氏液或固定油。靜脈內注射載體包括流態的和營養補足劑、電解質補足劑(如以林格氏葡萄糖為基礎的補足劑)等。還可有防腐劑和其它輔助劑，諸如，比如抗菌素、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體等。
本發明還涉及製備含本發明的人抗原特異的或抗原非特異的GIF的藥物的或藥用成份，該藥物是被用來治療對抗原的不希望的免疫反應的，其中該抗原是能夠與本發明的人GIF結合的。
本發明的目的還在於單克隆抗體及產生該抗體的B-細胞雜交瘤，該抗體可特異性地與人GIF反應。此外，本發明提供可特異性地與抗原特異性GIF反應而不與非特異性GIF反應的單克隆抗體(以及B-細胞雜交瘤)。這種類型的代表性的單克隆抗體是110BH3。
如上所述，產生雜交瘤的技術是為本領域中普通技術人員所熟知的。簡言之，本發明的B-細胞雜交瘤是通過用親和提純的人GIF給BALB/c小鼠免疫接種，隨後再數次加強接種來製備的。最後一次免疫接種後的兩周，從該動物獲得脾細胞，將其轉移於已被致死量輻照過的同源BALB/c小鼠體中。該同源受體用提純的人GIF免疫接種兩次，而在最後一次接種後兩周，將該脾細胞與SP2/0-14AG骨髓瘤細胞系融合。為產生針對人GIF的單克隆抗體將雜交瘤進行篩選。
分離產生具有本發明的單克隆抗體反應活性的單克隆抗體的雜交瘤，可用確定所研究的該單克隆抗體的基本反應模式的常規篩分技術來完成。因此，如果被測試的單克隆抗體與人GIF反應，而不與小鼠GIF反應，那麼該被測試的抗體和用本發明的雜交瘤所產生的抗體是等同的。
產生具有單克隆抗體388F1特異性的單克隆抗體或本發明的任意其它單克隆抗體的雜交瘤的分離可由本領域中普通技術人員，通過產生抗遺傳型抗體來完成(Herlyn，et al.，Science.232100，1986)。抗獨特型抗體是這樣的抗體它能識別存在於該討論中的雜交瘤產生的該單克隆抗體上的獨特決定簇。這些決定簇位於該抗體的超變區中。它是與給定的表面決定簇結合的區，因此是反應該抗體的特異性的區。該抗獨特型抗體可通過用討論中的該單克隆抗體給一種動物免疫接種而製得。該經接種的動物將通過產生一種抗該獨特型決定簇的抗體來辯識和應答這些接種抗體的獨特型決定簇。將單一雜交瘤產生的單克隆抗體用於免疫第二動物，使第二動物產生對該單克隆抗體特異的抗獨特型抗體。使用該抗獨特型抗體，使鑑定具有與用於免疫的雜交瘤抗體相同獨特型的其它克隆成為可能。從而大為簡化，並減少為找到能產生具有本發明的單克隆抗體特異性的單克隆抗體的其它雜交瘤所需的篩選工作量。
兩種雜交瘤的單克隆抗體間獨特型的一致性證明，該兩種單克隆抗體就其識別同樣表位決定簇而言，是相同的。因此，通過採用抗單克隆抗體上的表位決定簇的抗體，就可能鑑別表達該相同抗原決定簇特異性的單克隆抗體的其它雜交瘤。
此外，無需過多的實驗就可能評價一種單克隆抗體，確定它是否有與本發明的單克隆抗體相同的特異性，即通過確定該被測試單克隆抗體是否能防止本發明的單克隆抗體與一種特殊的抗體，比如人GIF(388F1與之有正常反應活性)相結合即可。如果該被檢測單克隆抗體與388F1競爭，比如，所示388F1的結合下降，那麼很可能這兩種單克隆抗體均與相同抗原決定簇結合。類似的檢測可用於單克隆抗體110BH3。
另一種確定一單克隆抗體是否具有本發明單克隆抗體(如388F1)的特異性的方法，是用一種抗原比如，人GIF預培育388F1(所述抗原與其有正常反應活性)，然後確定該被檢測的單克隆抗體是否在其與該抗原結合的能力方面被抑制，如果該被檢測的單克隆抗體被抑制，那麼，十有八九，它具有與本發明的單克隆抗體相同的抗原決定簇特異性。
在一定的情況下，一種同型單克隆抗體就其診斷和治療效果而言要遠優於其它的單克隆抗體。單克隆抗體的特定同型物或可通過從該起始融合體中選擇而直接製備，或通過採用同胞選擇技術來分離分級轉換變體用產生不同同型體單克隆抗體的親本雜交瘤間接地製備(Steplewski，et al.，Proceedings of National Academy ofSciences，USA，82888653，1985，Spira，et al.，Joumal ofImmunological Methods，74307，1984)。因此，本發明的單克隆抗體可包括具有單克隆抗體388F1(由ATCCHB10472所產生)特異性的分級-轉換變體。該HB10472細胞系在Rockyille Maryland的美國典型培養保藏中心(ATCC)於1990年6月4日之前已保藏了30年。
本發明所用的術語「抗體」的含義包括完整的分子及其斷片，比如能結合該表位決定簇的Fab和F(ab′)2。
本發明的單克隆抗體還可被用在為提純本文所述不同類型的人GIF的免疫親和層析中。一種可使這類免疫親和層析得以應用的方法是，比如，將本發明的單克隆抗體與(NBr-Sepharose-4B，Affigel(BioRad)，或Tresyl-activated Sepharose(Pharmacia)結合。這些同固相結合的單克隆抗體則可從其它蛋白質混合物中特異結合人GIF，使其能分離和提純出來。該被結合GIF可用本領域普通技術人員所知的技術如，用離液序列高的試劑，低pH，或用脲從該親和層析材料上洗脫。
在另一實施方案中，本發明提供一種基本上純的融合多肽R1-[X1-X2-X1-X2-Lys-Arg]-R2，其中R1是載體肽，R2是由結構基因編碼的一種多肽，X1是Lys或Arg，而X2是任何胺基酸。該「載體肽」或信號序列位於該融合肽序列的氨基末端。在真核生物的情況下，該載體肽被認為起著穿過內質網傳輸該融合肽的功能。分泌蛋白質則經高爾基體轉送進分泌囊中，並進入細胞外間隙，或更好是進入外部環境中。可按本發明選用載體肽，包括含蛋白水解酶識別位點的前一原肽。可接受的載體肽包括降鈣素或其它激素的氨基末端前區，該載體肽經受了側面二元位點的分裂。以識別Lys-Arg分裂位點的激素原轉化酶處理原降鈣素。然而，應注意的是，本發明不限於用此肽作載體。有類似於本文所述的原降鈣素性能的其它載體肽是為本領域中普通技術人員熟知的，或無需作過多的實驗便可確定的。
在本發明的一個實施方案中，一種作為信號序列的載體肽被包括在表達載體中，具體位於鄰近載體蛋白N-末端之處。此信號序列可使該融合蛋白被導向內質網。一般來說，該信號序列由約16-約29個胺基酸的前導序列組成，以兩或三個極性殘基開始，接著是高含量疏水性胺基酸，除此而外並無明顯已知序列的保留。儘管用於本發明的實施例中的該載體利用了降鈣素的前區，但其它能將該融合肽輸至該內質網，然後輸入外部環境中的信號序列在本發明中將同樣有效。這類信號序列是為本領域中的普通技術人員熟知的。
本發明的載體肽包含具有二元改型(Lys-Arg)的蛋白水解酶識別位點，該二元改型(Lys-Arg)在P4和P6位含有附加的Arg/Lys殘基。分裂識別位點的不同，意味著存在具蛋白水解特異性的不同的加工酶。優選分裂位點是有序列為X1-X2-X1-X2-Lys-Arg的約6個胺基酸，其中X1是Lys或Arg，而X2是任何胺基酸。此識別位點可產生，由結構基因編碼的未所預料的高水平活性蛋白。
識別水解蛋白位點的加工酶的實例包括哺乳動物的酶、毛皮素、酵母前肽加工酶Kex2的同系物和其它的前激素轉換酶(PCs)。優選本發明載體肽在該前體的分裂位點處含有一種有編碼Arg/Lys-X2-Arg/Lys-X2-Lys-Arg的多核苷酸序列的蛋白水解酶識別位點。
本發明的融合多肽包括由一種結構基因編碼的多肽，優選在該融合多肽的羧基末端進行。任何結構基因與該載體和分裂位點一起表達。在表達媒體中結構基因按可操作方式同載體和分裂位點連接，從而使該融合多肽作為單個單元表達。GIF是可被用來產生本發明融合多肽的結構基因的一個例子。
本發明提供一種基本純的多肽。所謂「基本純」指的是基本上不含其它蛋白、脂類、碳水化合物或其它隨其天然產生的物質的多肽。本領域中技術人員可用標準的蛋白質提純技術，如採用與該多肽的抗原決定簇結合的單克隆抗體的親和層析法來提純此多肽。該基本純的多肽在聚丙烯醯胺凝膠上產生一條單一的主帶。該多肽的純度也可用氨基末端胺基酸序列分析來確定。只要該多肽的活性保持，則該多肽即包括其功能性斷片。含有該多肽生物活性的較小的肽也包括在本發明中。
本發明還提供了編碼該融合多肽的多核苷酸。這些多核苷酸包括DNA、cDNA和RNA序列。應理解為，編碼全部或部分該融合多肽的所有多核苷酸。只要能編碼其裂解產物具生物活性的多肽均可包括在本發明中。這類多核苷酸包括天然產生的，合成的和特意改變的多核苷酸。比如，該多核苷酸可經過指定位點的突變。該多核苷酸序列還包括反意序列和由於基因密碼而退化的序列。有20種天然胺基酸它們大部分是由一個以上的密碼子編碼的。因此，所有的退化核苷酸序列都被包括在本發明中，只要該核苷酸序列編碼的融合多肽的胺基酸序列功能不改變均可。
本發明還提供與本發明核苷酸序列互補的多核苷酸。「互補的」核苷酸序列將在能使該互補序列雜交的條件下與特異性的核苷酸序列雜交。這些條件包括溫度、pH值、緩衝劑和核苷酸組成。比如，雙鏈DNA分子的正鏈和負鏈是互補的核苷酸序列。本發明的多核苷酸包括長度至少為15個(一般為18個或更多的)鹼基的片段，該片段選擇性地與編碼討論中的多肽的基因組DNA雜交。選擇性雜交表示選定某些條件(如溫度、pH、緩衝劑)，這些條件可避免核苷酸序列與為其互補體的靶DNA非特異性結合。
可通過幾種方法得到本發明的DNA序列。比如，可用本領域中普通技術人員熟知的雜交程序分離該DNA。這包括(但不限於)1)將探針與基因組文庫或cDNA文庫雜交來測定共有核苷酸序列；2)表達文庫的抗體篩選來測定共有的結構特性；3)通過聚合酶鏈反應(PCR)來合成。
採用標記的混合合成寡核苷酸探針進行的雜交法對篩選重組體克隆是有用的，其中每個探針與該雜交樣品中的特異DNA序列能完全互補，而所述雜交樣品包括變性雙鏈DNA的異源混合物。對這類篩選而言，雜交優選在單鏈DNA或變性雙鏈DNA上進行。雜交在測定下述來源衍生的cDNA克隆方面特別有用，該源即存在與討論中的多肽相關的極少量mRNA序列之源。換言之，通過採用旨在避免非特異結合的嚴格的雜交條件，就可能，比如，通過靶DNA與混合物中作為其完整互補體的單個探針的雜交，而進行特異性cDNA克隆的放射自顯影觀察(Wallace et al.，Nucleic Acid Research，9879，1981)。
例如，可通過將各種cDNA注射入卵母細胞，使cDNA基因產物有足夠的時間表達，並且通過使用抗原非特異性GIF多肽的特異性抗體或使用GIF活性的功能分析來檢測是否有所需的cDNA表達產物存在，從而對含抗原非特異性GIF的cDNA文庫進行篩選。此外，可用抗原非特異性IgE多肽的特異性抗體從cDNA文庫中間接篩選具有至少一個抗原決定簇的抗原非特異性GIF多肽。這類抗體可多克隆地或單克隆地產生，並可用於測定象徵抗原非特異性GIF cDNA存在的表達產物。
只要能找到合適的探針，那麼依賴於核酸雜交的篩選法，來自任何有機體的任何基因序列都能分離出來。與編碼所討論蛋白序列相應的寡核苷酸探針可化學合成。這要求必須知道胺基酸序列的短的，寡肽的延伸方式。編碼蛋白的DNA序列可從基因密碼推斷出，然而必需考慮該密碼的簡併度。當簡併該序列時，可能進行混合加成反應。這包括變性雙鏈DNA的異源混合物。
產生編碼多肽的特異DNA序列可通過1)從基因組DNA中分離出雙鏈DNA序列；2)化學製備一種能為討論中的多肽提供所需密碼子的DNA序列；3)通過從真核供體細胞分離出的mRNA的逆轉錄來體外合成雙鏈DNA序列。在後一情況下，最終形成一種mRNA的雙鏈DNA互補體，此雙鏈DNA互補體一般稱為cDNA。該三種產生用於重組過程的特異性DNA序列的方法中基因組DNA分離法最少普遍採用，尤其當希望得到哺乳動物多肽的微生物表達時由於存在內含子，則更是如此。
當所需的多肽產物的胺基酸殘基的整個序列已知時，DNA序列的合成是常被選擇的方法。當所需多肽的胺基酸殘基的整個序列未知時，不可能直接合成DNA序列，而所選的方法是合成cDNA序列。分離討論中的cDNA序列的標準程序是形成由質粒或噬菌體攜帶的cDNA文庫，該文庫是由富含具有高水平基因表達供體細胞的mRNA逆轉錄而生成的。當與聚合酶鏈反應技術相結合使用時，甚至極少的表達產物也能被克隆。在該多肽的胺基酸序列的主要部分已知的情況下，複製推定存在於該靶cDNA中序列的標記單鏈或雙鏈DNA或RNA探針的產生，可被用於在已變性為單鏈形式的cDNA克隆拷貝物上進行的DNA/DNA雜交法中(Jay et al.，Nucl.Acid Res.112325，1983)。
用對該多肽特異性的抗體，可從一種cDNA表達文庫，如λgt11中，間接篩選人表達具有至少一個抗原決定簇的多肽。這類抗體可多克隆地，或單克隆地產生，並用於測定象徵由cDNA編碼的蛋白存在的表達產物。
編碼本發明該融合多肽的DNA序列，可通過DNA轉移進適當宿主細胞中來體外表達。「宿主細胞」是載體可於其中增殖而其DNA可被表達的細胞。該術語也包括該主題宿主細胞的任何後代。應理解所有的後代可能與親體細胞不相同，因為可能有在複製過程出現的突變。然而，在使用術語「宿主細胞」時，則包括這類後代。穩定轉移法，即外源DNA持續地保持於該宿主中，是本領域中已知的。
按照本發明，該多核苷酸序列可被插入重組體表達載體中。術語「重組體表達載體」指的是質粒、病毒或其它本技術領域所知的載體，但這些載體是通過插入或摻入抗原非特異性GIF和載體肽之類的基因序列加以改變過的。這類表達載體含有促進該宿主插入基因序列有效轉錄的啟動子序列。一般，該表達載體含有複製起點，啟動子以及可使該轉化細胞的表型選擇進行的特異基因。適用於本發明的載體包括(但不限於)，在細菌中表達的T7基礎表達載體(Rosenberg etal.，Gene56125，1987)，在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J.Boil.Chem，2633521，1988)及杆狀病毒衍生的在昆蟲細胞中表達的載體。該DNA片段可存在於按可操作方式連接於調節因子，如啟動子(如T7，金屬硫因，或多親徵雜種啟動子)的載體中。
編碼本發明多肽的多核苷酸序列在原核生物或真核生物中表達。宿主可包括微生物、酵母、昆蟲和哺乳動物有機體。本發明優選的宿主是真核生物。在原核生物中表達具有真核或病毒序列的DNA序列的方法在本領域中是公知的。能在宿主中表達和複製的生物學上有功能的病毒和質粒DNA載體在本領域中也是已知的。這類載體被用來摻合本發明的DNA序列。優選本發明的宿主細胞自然地編碼識別融合蛋白的分裂位點的酶。然而，如果表達所需融合多肽的該宿主細胞本來不具有識別該分裂位點的酶，那麼編碼這類酶的基因序列可隨同該融合蛋白的多核苷酸序列一起被共同轉染到該宿主細胞中。
帶有重組體DNA的宿主細胞的轉化可通過本領域中普通技術人員熟知的常規技術進行。在宿主是原核細胞，如E.coli的情況下，可用本領域中公知的方法在指數生長期後收穫細胞，再用CaCl2處理，製備具有DNA攝取能力的適宜細胞。另外，也可使用MgCl2或RbCl。轉化也可在形成該宿主細胞的原生質體後，或用電穿孔完成。
當該宿主是真核細胞時，磷酸鈣共沉積之類的DNA轉染法，常規的機械法(如微注射)，電穿孔包在脂質體中的質粒插入或病毒載體都可用。真核細胞可被編碼本發明融合多肽的DNA序列，和編碼可選擇性表型，如單純泡疹胸腺嘧啶激酶基因的第二異源DNA分子共同轉染。其它的方法是採用一種真核病毒載體，如猿猴病毒40(SV40)或牛乳頭狀瘤病毒瞬時感染或轉化真核細胞並表達該蛋白(EukapryoticViral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman ed.，1982)。
分離和提純微生物或真核細菌表達的本發明多肽的技術，可以是通過任何常規手段，如製備層析分離和免疫學分離(如那些涉及利用單克隆或多克隆抗體的)來進行的技術。
上述公開內容一般性地描述了本發明。參考下面特定實施例將能得到更完整的理解，但這些實施例僅出於說明的目的，而並不以此限制本發明的範圍。
實施例1製備產生人抗原特異性糖基化抑制因子(GIF)的雜交癌細胞系及提純技術A.抗原冷凍乾燥的，來源於蜂毒的磷脂酶A2(PLA2)購自SigmaChemical Co(St Louis，Mo)。用King等人所述的方法(Arch.Biochem and Biophys.，172661，1976)製備變性PLA2(-PLA2)及溴化氰處理PLA2。為製備D-PLA2，將5mg PLA2溶於0.1M的Tris HCl緩衝液中(pH8.6)，然後在有5mg/ml二硫蘇糖醇存在時，於6M胍HCl化物中變性處理。在室溫下18小時後，用碘乙酸將巰基羧甲基化。將該變性蛋白以0.02M的乙酸滲析，然後在-40℃下保存直至使用。為分裂PLA2中的蛋氨酸鍵，將10mg蜂毒PLA2溶於0.4ml蒸餾水中，然後加1.2ml含100mg CNBr的甲酸。在室溫下2小時後，用H2O將此混合物稀釋2倍，然後於Speed Vac中冷凍乾燥。按製造商推薦的程序將天然PLA2與Tresyl活化的Sepharose(Pharmacia)偶聯。除另有規定，一般是1mg蛋白與1mlSepharose偶聯。B.抗體提純的人E骨髓瘤蛋白PS，得自雜交瘤H-1 DNP-E-26的單克隆鼠IgE(Liu，et al.，J.Immunol.，1242728，1980)及抗-CD3單克隆抗體(OKT3)是先前發表的文章(Carini et al.，J.Immunol，Methods，127221，1990)所述的相同製品。Dr.J.DeVries(DNAX Instituet of Molecular and Cellular Biology，Palo Alto.CA)善意提供含單克隆抗T-細胞受體αβ，WT31C(Spits，et al.，J.Immunol.，1351922，1985)的腹水。抗兔脂調節素14189(Iwata，et al.，J.Immunol.，1321286，1984)的小鼠單克隆抗體是與先前發表的文章(Askasaki，et al.，J.Immunol.，1313172，1986)中所述的同樣製品。專門提純的抗小鼠IgG的，含有抗重(γ)鏈和抗輕鏈的山羊抗體先前已被陳述(Suemura，et al.J.Immunol，125，148，1980)。螢光素處理過的山羊抗小鼠IgG抗體購自Cappel。人IgG和抗脂調節素抗體(141B9)與CL-Sepharose 4B偶聯；約5mg蛋白與1ml Sepharose偶聯。C.細胞系在富含10％胎牛血清，2mM L-穀氨醯胺，50μM2-巰基乙醇和抗生素的RPMI1640培養基中培養RPMI8866成淋巴樣細胞。小鼠T-細胞雜交瘤12H5細胞(Iwata等人，J.Immunol，14025341988)被保持於前文(Huff，et al.，Proc，Natl.Acad.Sci.，USA，129509，1982)所述的高葡糖Dulbecco改良的Eagle′s培養基(DMEM)中。一種人成淋巴樣細胞系CEM(BUC)細胞的次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺乏突變體從前已敘述過(Huff Ishizaka，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，811514，1984)。D.細胞培養及雜交瘤的構建。
從對蜜蜂毒素過敏的患者中得到外周血，然後在Ficoll-Paque(Pharmacia)上離心分離得到該血的單核細胞(PBMC)。為激活抗原引發T-細胞，將PBMC懸浮於RPMI1640培養基中，濃度為3×106成核細胞/ml，然後在有10μg/ml D-PLA2或CNBr處理的PLA2存在時培養3天。回收非附著細胞，再懸浮於新鮮的培養基中(2×105細胞/ml)，然後用60單位/ml提純的IL-2層析提純的人IL-2，Electro-nucleonics，Silver Spring，MD)在有由Dr.J.Browning and B.Pepinsky(Biogen)善意提供的3μg/ml重組體人脂皮質素存在時培養4天。
為構建T-細胞雜交瘤，將用IL-2繁殖的1.2×107T-細胞與兩倍數的BUC細胞(CEM的亞系)相混合。將被混合的細胞一起製成小球，然後通過聚乙二醇(1300-1600MW，Sigma)而融合。細胞融合的詳細程序在先已被描述過(Huff.et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.811514，1984)。在含次嘌呤/氨喋呤/胸苷(HAT)的DMEM中使細胞重懸浮，然後在96井板的每個井中接種5×104個細胞。雜交克隆以一周兩次傳代培養保持於完全DMEM中。為了刺激該T-細胞雜交瘤，細胞用8μg/ml OKT3在0℃處理40分鐘，然後將該抗體處理的細胞(1×106/ml)接種於Limbro組織培養小井中(Flow Labs，McLean，VA)，該井已塗覆以10μg/ml抗-MGG3。經24小時培養後得到培養物上清液。E.測定CD3和TcR於0℃，將雜交瘤細胞(1×106/樣品)與8μg/ml OKT3或含抗-TcRαβ(WT31)，用含5％FCS和10μM NaN3的RPMI1640培養基按1∶1000稀釋過的腹水一起保溫40分鐘。作為對照物，用同樣濃度的小鼠IgG2a(Becton-Dickinson，同型對照物)處理相同細胞的等分試樣。用含5％FCS的PBS將此細胞洗兩次，然後用螢光素處理的抗小鼠IgG培養40分鐘。洗滌後，用得自BectonDickinson的FACScan分析帶有螢光的細胞。
利用包被有抗小鼠IgG的牛紅細胞進行玫瑰花結試驗鑑別CD3+雜交瘤細胞。用Wilhelm等人的方法(J.Immunol，Methods，9089，1986)將抗體與紅細胞偶聯。簡言之，用鹽水將0.5ml裝入的牛紅細胞洗4次，然後重懸浮於0.75ml的0.5μg/ml提純抗-MGG中；25μl的CrCl3(16.5mg CrCl3溶於5ml鹽水)在輕柔的混合條件下被加至該細胞的懸浮液中，然後在30℃將該細胞懸浮液培育1小時。用鹽水將此抗MGG結合的紅細胞洗4次，然後再懸浮於5ml FCS中(約1×109紅細胞/ml)。為測定CD3+細胞，將106雜交瘤的小球懸浮於含5％FCS和8μg/ml OKT3的80μl DPBS中。在0℃下45分鐘後，將該細胞洗2次，再懸浮於80μl DPBS-5％FCS中，，然後將20μl抗MGG-包被的紅細胞懸浮液和龍膽紫加至該懸浮液中。該混合物在200g條件下離心處理5分鐘，然後將該離心管在0℃下培育2小時。將管中沉澱慢慢再懸浮，然後在顯微鏡下檢測玫瑰花狀細胞。F.CD3+細胞的富集將用8μg/ml OKT3處理過的雜交瘤細胞(1.5×105細胞)與抗MGG結合的紅細胞(約4×106紅細胞)混合，通過上述方法形成玫瑰花狀。將沉澱重懸浮，並施加於由60％和50％Percoll層構成的Percoll梯度的頂端。以1200RPM(700g)於室溫將試管離心處理20分鐘。用培養基將沉澱細胞洗兩次，然後用0.83％NH4Cl緩衝液於0℃處理1分鐘而將紅細胞溶解。用DME培養基洗此細胞並將其重懸浮於該DME培養基中，然後培養以擴大該細胞種群。
通過細胞分揀進行進一步的CD3+細胞富集。將雜交瘤細胞用OKT3處理，再用螢光處理的抗-MGG染色。通過用FACSTAR(Becton-Dickinson)進行的細胞分揀選擇染色陽性的細胞。G.提純和測定IgE-BF將T細胞雜交瘤的培養上清液經Diaflo YM100膜(Amicon Corp.Lexington，MA)過濾，濾液用YM5膜超濾而被濃縮10倍。用已介紹過的程序(Isnikaza Sandberg，J.Immunol.，1261692，1981)，用IgE結合的Sepharose提純該濾液中的IgE-BF。按前述的方法(Kisaki，et al.，J.Immunol.，1383345，1987)通過用人IgE-包覆的牛紅細胞(E-IgE)對FcεR+B成淋巴樣細胞系，RPMI8866細胞的玫瑰花結形成的抑制作用，評估培養物濾液中，或得自IgE-Sepharose的酸性洗脫液級份中的IgE-BF的存在。玫瑰花結形成細胞(RFC)與300RPMI8866細胞的比例分三次測定並以平均值±SD表達。
除用兔IgE包覆的牛紅細胞作指示細胞外，通過同樣的程序測定由12H5細胞形成的齧齒動物IgE-BF，而且用Nipportronngylusbrasiliensis感染的Lewis種鼠的隔膜淋巴節細胞被用作FcεR+B細胞源(Yodo Ishizaka，J.Immunol.，1241322，1980)。H. GIF的檢測利用T-細胞雜交瘤12H5細胞檢測GIF(Iwata，et al.，J.Immunol.，1402534，1988)。將該雜交瘤細胞的懸浮液與等體積的檢測試樣混合，然後將該細胞懸浮液用10μg/ml鼠IgE培養24小時。經CF50A膜過濾培養物上清液，含IgE-BF的濾液在小扁豆植物凝血素Sepharose上分級(Yodoi，et al.，J.Immunol.，1251436，1980)。未結合的蛋白(流出物級分)和用0.2Mα甲基甘露糖苷洗脫的蛋白(洗脫物級分)均用玫瑰花結抑制技術評價IgE-BF的存在。當12H5細胞單用小鼠IgE培養時，通過該細胞形成的IgE-BF基本上全部與小扁豆植物凝血素Sepharose結合，然後用α基甘露糖苷洗脫而回收。這樣，流出物/洗脫物級分間的玫瑰花結抑制百分比小於0.2。若將足量的GIF和小鼠IgE一起加到該12H5細胞培養物中，則大多數由該細胞形成的IgE-BF缺乏對小扁豆植物凝血素的親和性，而都被回收到流出液級份中去(Iwata Ishizaka，J.Immunol.，1413270，1988)。因此，如果該流出物/洗脫物級分間的玫瑰花結抑制百分比為3.0或更高，則GIF記為(+)。I.GIF分級為了確定得自雜交瘤的GIF是否對蜂毒PLA2有親和性，將雜交瘤細胞的培養物濾液在抗原偶聯的Sepharose上分級。用OKT3抗體(8μg/ml)處理雜交瘤細胞並將處理過的或未處理過的抗體細胞懸浮液8ml等分試樣(1.5×106細胞/ml)在抗MGG塗覆的組織培養瓶中培養。將培養物懸浮液濃縮4倍，然後用0.4ml IgE-Sepharose吸附2ml試樣。將流出物級分與0.5ml PLA2-Sepharose混合過夜，並將免疫吸附劑充填到小柱中。回收流出物級分後，用DPBS洗此柱，再用10ml甘氨酸HCl緩衝液(pH3.0)洗脫。通過先前所述的程序(Akasaki，et al.，J.Immunol.，1363172，1987)在抗脂調節素(141B9)Sepharose上進行GIF部分提純。J.確定磷脂酶抑制活性按先前所述的程序(Uede，et al.，J.Immunol.，139898，1983)用鹼性磷酸酶處理親和性提純過的GIF。簡言之，將1ml該製品用Tris-HCl緩衝液透析(pH8.2)，然後於室溫與1單位不溶性鹼性磷酸酶(小牛腸的，Sigma)混合2小時。離心分離後，將該上清液用0.1M Tris-HCl緩衝液(pH8.0)透析。該經處理的鹼性磷酸酶試樣的磷脂酶A2抑制活性用以3H-油酸生物合成標記的E.coli和豬胰PLA2(Sigma)確定(Rothut，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，117878，1983)。詳細的方法載於Ohno等的文章中(Internat.Immunol.，1425，1989)。簡言之，豬胰PLA2(1×10-5單位)與GIF以150μl的總體積混合。於25℃，5分鐘後，添加50μl3H-標記的E.coli(5000cpm)懸浮液，而後將此混合物於25℃培育5分鐘。通過添加50μl2M HCl停止此反應，而後向該混合物中加50μl100mg/ml BSA。置於5500g條件下將此懸浮液離心分離1分鐘。用閃爍光譜測量250μl上清液中的放射性。K.離子交換柱層析法在無血清介質中的AC5細胞培養物上清液通過超濾被濃縮100倍。以10000rpm離心分離20分鐘後，用蒸餾水將上清液稀釋8倍，再用Tris調到pH8.0，而後立即於DEAE-Sepharose CL-6B(Pharmacia)柱上樣(體積3ml)(該柱用10mM Tris HCl緩衝液(pH8.0)平衡過)。回收流出物(經其流過的)級分後，用4柱體積的10mM Tris-HCl緩衝液(含20mM NaCl)洗此柱，而後將洗液與該流過級分合併。用4柱體積pH8.0的10mM Tris-HCl緩衝液(分別含50mM、75mM、100mM、150mM和200mM NaCl)依次洗脫與此柱結合的蛋白。將各洗脫液級分濃縮並用Dulbecco′s磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)透析。L.凝膠過濾將1ml於DBPS中的試樣於與HPLC(Beckman System Gold)相連的Superose12柱(1.6×50cm，Pharmacia)上樣。從該柱上用DPBS，以1ml/分的流量將蛋白洗脫，而後收集適宜的級分。該柱用人IgE(PS蛋白，MW185000)，牛血清清蛋白(BSA，MW67000)，卵蛋白(MW43000)，大豆胰蛋白酶抑制因子(MW20100)及細胞色素C(MW12500)標定，除IgE外，全部標準蛋白均得自Sigma。標準蛋白的滯溜時間分別為41.97，52.08，55.135，62.097和71.67分。M.GIF的親和性提純通過超濾將於完全DME培養基中的CL3克隆培養物上清液濃縮5倍，使該上清液經免疫吸附劑柱(5ml體積)循環過夜而將該上清液中的GIF吸附於141B9-Sepharose或抗-GIF Sepharose上(Iwata.，et al.，J.Immunol.，1413270，1988)。用20柱體積DPBS洗此免疫吸附劑，而與吸附劑珠粒結合的蛋白則用pH3.0的0.1M甘氨酸HCl緩衝液洗脫而回收。得自231F1細胞的鼠GIF利用14189-Sepharose以同樣方法提純。
為了分離無蛋白培養基中的AC5細胞培養物上清液中的GIF，用超濾液將此上清液濃縮50-100倍。將得自DEAE-Sepharose柱的合宜的該上清液的級分濃縮至5-6ml，而後和與單克隆抗GIF抗體偶聯的1.0-1.5ml Affigel10-免疫吸附劑，在4℃下混合過夜。該懸浮液被填充入小柱中，而該免疫吸附劑用40柱體積的DPBS洗滌。在某些實驗中，該免疫吸附劑用40柱體積DPBS和20柱體積的含0.5M NaCl的PBS洗滌。與該免疫吸附劑結合的蛋白用含0.15M NaCl，pH3.0-3.2的0.05M甘氨酸HCl緩衝劑洗脫。N.用SDS-PAGE檢測GIF將經親和性提純的GIF對溶於去離子水中的0.01％SDS透析，而後在Specd vac(Savant Instruments，Hicksville，NY)中冷凍乾燥。採用Laemmli系統(Laemmli，U.K.Nature，227680，1970)以15％聚丙烯醯胺凝膠板進行SDS凝膠電泳分析試樣。將凝膠固定，通過銀染色(Ochs，et al.，Electrophoresis，2304，1981)檢測蛋白帶。分子量標準物自Pharmacia獲得。O.ELISA分析為檢測單克隆抗GIF抗體，採用稍加改變的，Steele等人所述的方法(J.Immunol.，1422213，1989)。簡言之，用100μg，以0.1M碳酸鹽塗覆緩衝液(pH9.6)稀釋的經親和提純的GIF，將Immulon1板(Dynatech)塗覆過夜。用含0.05％吐溫20的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)在以下步驟的每一步之間將板洗3次。用PBS中的2％BSA將板封閉6-9小時。100微升每種試樣然後被加至板中各井中，在4℃將板保持過夜。用鹼性磷酸酶結合的山羊抗小鼠Ig(Zymed Lab，So.San Francisco.CA)及鹼性磷酸酶底物(Sigma)檢測小鼠Ig與該板的結合。加底物後，30分鐘，以410nm濾光器於微板閱讀器MR5000(Dynatech Lab)中讀到ELISA信號。用ELISA分析，採用小鼠mAb同型物藥盒(Zymed Lab)確定單克隆抗體的同型物。
為了測定親和性提純GIF製品級分中的GIF，一種生物素-抗生物素蛋白系統及放大法(Stanley et al.，J.Immunol.Methods，8389，1985)被用來提高靈敏度。Maxi-Sorp微滴板(Nunc.Copenhagen，Denmark)用50μl各級分塗覆。在37℃2小時培育後，用Tween/PBS洗板，再用2％BSA於4℃封閉過夜。洗滌後，將50μl生物素結合的mAb141B9(200ng/ml)加至板中各井中，而後將板於37℃培育2小時。洗此板，而後向各井加50μl抗生蛋白鏈菌素-鹼性磷酸酶共軛物的1∶1500稀釋液(Zymed Lab)。37℃1小時培養後，通過放大系統(Stanley，et al.，J.Immunol.Methods，8389，1985)(GIBCO-RBL，Bethesda，MD)測量與各井結合的鹼性磷酸酶的量。ELISA信號於490nm波長處測定。
實施例2產生人抗原特異性GIF的雜交瘤的特徵描述如上所述，在有10μg/ml D-PLA2存在時，將對蜜蜂毒素敏感患者的PBMC培養3天，而後將激活的T-細胞在有3μl/ml重組體脂皮質素存在時，通過IL-2繁殖4天。然後將T-細胞與BUC細胞融合以構建雜交瘤。在此實驗中，得到4個雜交瘤克隆。在完全DMEM中培養每個雜交瘤克隆，而後經YM100膜過濾培養物上清液。將濾液濃縮10倍，而後用12H5細胞估測GIF的存在。表1中所示的結果表明4個雜交瘤克隆的2個主要分泌GIF。
表I選擇產生GIF的雜交瘤3H-油酸釋放 cGIF活性a釋放 抑制雜交瘤流出物/洗脫液 (cpm) (％)Cl10/26(-) NO -Cl22/33(-) 390±274Cl329/0(+) 257±2537Cl727/5(+) 303±1726對照組 0/31b408±15-a每種克隆的培養物濾液被濃縮10倍。將1體積此濾液加至等體積的12H5細胞懸浮液中。然後該細胞在有10μg/ml小鼠IgE存在時培養24小時。該列中的數字代表小扁豆植物凝血素Sepharose的流出物/洗脫液級分的玫瑰花結抑制百分數。在不存在IgE-BF的情況下，IgE-RFC的比例為24.4±0.3(SD)％。b單獨用10μg/ml小鼠IgE培養12H5細胞，而後在小扁豆植物凝血素Sepharose上將該培養物濾液分級。c在141B9-Sepharose上將培養物濾液分級，而將得自該免疫吸附劑的酸性洗脫液濃縮至原培養物上清液體積的1％。該試樣用鹼性磷酸酶處理，而後測定脫磷酸物質而得出抑制胰磷脂酶A2的能力。
用螢光細胞測量法和玫瑰花結實驗技術估評CD3決定簇在該雜交瘤克隆CL3上的存在。該細胞用8μg/ml單克隆抗體OKT3處理，而後用螢光素化的山羊抗小鼠Ig染色。小於總細胞數10％的細胞被染色。還發現，僅有6-8％OKT3處理細胞同抗MGG結合的紅細胞形成玫瑰花結。因而用實施例1中所述的玫瑰花結試驗方法富集CD3+細胞。通過在Percoll層上的密度梯度離心作用將與抗MGG結合的紅細胞形成玫瑰花結的細胞與不形成玫瑰花結的細胞分離，而後在DMEM中培養而擴增。將同樣的程序重複3次，以富集CD3+細胞種群。用OKT3抗體處理最終細胞製品，隨後用抗MGG包覆的紅細胞培育表明80-90％的該細胞種群形成了玫瑰花結。約75％的該細胞被OKT3以細胞螢光測量法染色。然而，若培養該細胞兩周經四代繁殖導致CD3+細胞衰減至約52％(以細胞螢光測量法測定)，則通過細胞分揀和通過培養使該細胞擴增，而使CD3+細胞種群進一步富集。在重複細胞分揀兩次後，得到了穩定表達CD3的CL3種群。以OKT3和WT31(抗TcRαβ)進行該種群螢光染色表明，基本上100％的細胞表達CD3，而大部分細胞表達TcRαβ。將CD3+細胞種群和CD3-種群培養，利用12H5細胞估評培養物濾液中GIF的存在。GIF的活性在CD3+細胞培養物濾液中測得，而不能在CD3-種群的培養物濾液中測得。此結果表明GIF的來源是CD3+細胞。
由於小鼠GIF的特殊性能之一是，單克隆抗脂調節素(141B9)結合淋巴因子，所以決定應測定得自CL3細胞的人GIF是否被141B9結合的Sepharose吸附。培養CD3+、CL3克隆產生1升培養物上清液。經YM100膜過濾後，該濾液被濃縮至5ml，而後在1ml141-B9Sepharose上分級。回收該流出物級分後，用10柱體積DPBS洗此免疫吸附劑，而後用5柱體積pH3.0的甘氨酸-HCl緩衝液洗脫。對DPBS透析之後，利用12H5細胞來確定各級分中GIF活性物分布。表II所示的結果表明培養濾液中基本上全部GIF活性物都與141-B9Sepharose結合，而且可於酸性pH條件下洗脫而回收。
表II得自經抗脂調節素Sepharosea親和性層析提純的CL3克隆的人GIF得自141B9- GIF活性cSepharoseb的級份 稀釋度 流出物/洗脫液流出物 1∶10 0/31(-)洗脫液 1∶10 0/35(-)洗滌液 1∶10 42/0(+)1∶40 45/0(+)1∶80 39/0(+)培養基對照 - 0/34aCL3克隆的培養物上清液經YM100膜過濾，濾液被濃縮200倍。取5ml該濃縮濾液在1ml141B9-Sepharose上分級。b回收流出物級分後，該免疫吸附劑用5柱體積的DPBS洗滌，而後用5柱體積pH3.0的甘氨酸HCl緩衝液洗脫。c採用12H5細胞，以同於表I所述程序測定GIF活性，該列中的數字代表得自小扁豆植物凝血素Sepharose的流出物/洗脫液級分的玫瑰花結抑制百分比。不存在IgE-BF時，IgE-RFC的比例在此檢測中為22.9±0.6(SD)％。(+)表示存在GIF。
先前的實驗提供了證據鼠GIF是一種磷脂酶抑制蛋白的磷酸化衍生物(Uede，et al.，J.Immunol.，139898，1983)。因此，CL3克隆的培養物濾液中的GIF，可利用141B9-Sepharose提純。其它三個克隆CL1、CL2、CL7的培養物濾液在該141B9-Sepharose上以相似的方式分級。得自該免疫吸附劑的酸性洗脫液，用鹼性磷酸酶處理，然後評價抑制由胰磷脂酶A2生物合成標記E.coli釋放3H-油酸的能力(Rothut，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun，117878，1983)。表I中所包括的結果表明，得自CL3和CL7經親和性提純的GIF具有磷脂酶抑制活性，而得自CL1和CL2的相同餾分卻不能抑制磷脂酶A2。
實施例3GIF的抗原結合性能先前的實驗已表明用IL-2，在有脂皮質素存在時繁殖的抗原激活T細胞，基本上釋放出對蜂毒PLA2無親和性的GIF，但CD3在同樣細胞上的交聯則導致與抗原結合的Sepharose有親和性的GIF連同IgE-BF一起形成(carini.et al.，J.Immunol.Meth，127221，1990)。基於這種發現，決定測定該CL3克隆是否產生抗原結合的GIF和IgE-BF。用OKT3於0℃處理此細胞，並將此抗體處理過的細胞(1.5×106細胞/ml)在抗MGG塗覆的小井中培養。作為對照物，將未處理的CL3細胞在該抗-MGG塗覆的小井中培養。經YM100膜過濾培養物上清液，而後用超濾將其濃縮7倍。用1ml IgE-Sepharose吸附此濃縮培養物濾液過夜，而後將2ml洗液和未結合的蛋白級分合併。徹底洗滌此IgE-Sepharose，再用甘氨酸HCl緩衝液洗脫。採用RPMI8866細胞作FcεR+細胞源，對該從IgE-Sepharose洗脫的級分作IgE-BF存在分析。
表III得自CL3克隆的GIF不能與蜂毒PLA2結合PLA2-Sepharose中的GIF活性c處理aIgE-BFb流出物 洗液 洗脫物(％)OK3 2334/0(+)21/0(+)0/24(-)0 28/0(+)22/13(±) 0/26(-)a未處理的或CD3處理的細胞在抗MGG塗覆的井中培養。b30ml培養物上清液經YM100膜過濾，將濾液濃縮至4ml。用1.0mlIgE-Sepharose吸附此試樣。酸性洗脫物級分被調到4.0ml，而後通過玫瑰花結抑制試驗作IgE-BF測定。不存在IgE-BF時的IgE-RFC比例為37.7±1.0％。c1.0ml得自IgE-Sepharose的流出物級分在PLA2-Sepharose上分級。該流出物、洗液和酸性洗脫液級分被調到1.3ml，然後使用12H5細胞作GIF活性測定。該列中的數據表示小扁豆植物凝血素Sepharose上的流出物/洗脫物級分對玫瑰花結的抑制百分比。在無IgE-BF的情況下IgE-RFC的比例為21.7±0.6(SD)％。
表III所示的結果表明抗-CD3-處理細胞形成IgE-BF，而非處理細胞則不能產生可檢測量的IgE-BF。得自IgE-Sepharose的流出物級分被濃縮兩倍，而後將1ml試樣在0.25ml PLA2-Sepharose上分級該流出物，洗液和洗脫液級分被調到1.5ml，而後對樣品作GIF活性評價。如表III中所示。得自未刺激的和抗-CD3-處理細胞的GIF都不能與PLA2-Sepharose結合。
人們認為得自抗-CD3-處理CL3細胞的GIF不與PLA2結合，可能與使用D-PLA2激活T-細胞有關。為了研究這種可能性，構建更多的蜂毒敏感患者的PBMC的T-細胞雜交瘤。這些T-細胞雜交瘤構建的方法與上述方法相同，只不過PBMC是用10μg/ml CNBr處理的PLA2，而不是用D-PLA2來刺激。該實驗結果，得到22個雜交瘤克隆。對每個克隆培養物濾液的GIF分析表明，22個克隆中的10個都形成了GIF(結果未示出)。七個分泌GIF的克隆被用OKT3處理，而該抗體處理的細胞在抗-MGG塗覆的皿中培養。培養物濾液被濃縮4倍，然後用IgE-Sepharose吸附。
表IV以抗CD3處理的雜交瘤細胞a形成抗原結合的GIFPLA2-Sepharosec中的GIF活性克隆 IgE-BFb流出物 洗脫液(％)AC5 20 0/21(-) 31/0(+)AF10 36 19/0(+) 0/21(-)BA6 8 29/0(+) 0/24(-)BE12 65 0/31(-) 25/0(+)BF5 65 0/27(-) 20/0(+)CB7 64 0/28(-) 17/0(+)CE5 58 0/28(-) 35/0(+)a1.2×107細胞用OKT3處理。細胞被再懸浮於8ml培養基中，而後接種於抗MGG塗覆的瓶中。培養物上清液被濃縮4倍，然後用IgE-Sepharose吸附。得自IgE-Sepharose的流出物則在PLA2-Sepharose上分級，而後測定流出物和洗脫液級份中的GIF活性。b將得自IgE-Sepharose的酸性洗脫液級份進行IgE-BF存在分析。在無IgE-BG時，IgE-RFC的比例為26.3±0.6(SD)％。c使用12H5細胞確定GIF活性。數據代表流出物/洗脫液級分(得自小扁豆植物凝血素Sepharose)對玫瑰花結抑制的百分比。在無IgE-BF時，IgE-RFC的比例為26.0±0.7(SD)％。(+)表示存在GIF。
如表IV中所示，得自7個克隆中6個的IgE-Sepharose酸性洗脫液級份含可檢測量的IgE-BF，而後得自IgE-Sepharose的流出物級份在PLA2-Sepharose上分級，並將得自該免疫吸附劑的流出物和洗脫液級分作GIF活性測定。表IV中所示結果表明7個克隆中的5個的GIF大部分與PLA2-Sepharose結合，並於酸性pH值條件下洗脫回收。為了證實CD3的交聯對這些克隆產生抗原結合GIF是必要的，則將5個克隆在抗MGG包覆的細胞中培養而不用抗CD3處理。正如所預料的那樣，培養物上清液不含IgE-BF，而該上清液中的GIF不能與PLA2-Sepharose結合。
本發明提供一種技術，它可使源自對蜂毒PLA2過敏患者的PBMC的產生GIF T-細胞種群得以開發，而且從該T細胞構建產生GIF的雜交瘤。代表性的雜交瘤表達CD3決定簇和TCRαβ，這表明它們是T-細胞雜交瘤。此外，該雜交瘤上的TcR複合體看來是功能性的。親體T-細胞(Carini，et al.，J.Immunol.Methods，127221，1990)和該產生GIF的雜交瘤(表III、IV)在部份於基於CD3的交聯而產生IgE-BF。通過單克隆抗體WT31和抗MGG的TcRαβ或CL3和AC5克隆的交聯也導致了IgE-BF的形成(結果未示出)。代表性的CD3+雜交瘤的進一步檢測表明全部CL3、BE12、AC5及CB7克隆都表達CD4和CD8。由於用於構建該雜交瘤的BUC細胞是CD4+CD8-(來自Dr.J.Stobo的私人交流)，尚不清楚該雜交瘤的親體T-細胞是否共表達CD4和CD8。
本實驗表明由於CD3在細胞上的交聯，某些T-細胞雜交瘤產生結合抗原(PLA2)的GIF。此發現與這樣的事實相一致代表性的形成GIF的鼠雜交瘤，由於抗原激發的同源巨噬細胞的刺激，或細胞上的CD3交聯，形成了結合抗原的GIF(IwataIshizaka，J.Immunol.，1413270，1988，Iwata et al.，J.Immunol.，1433917，1989)，而且提示得自該兩個種類的結合抗原的GIF間具有相似性。在鼠體系中，得自該雜交瘤的結合抗原的GIF以載體(抗原)特異性方式抑制體內的抗體反應。還發現來自該雜交瘤的結合抗原的GIF由結合抗原的多肽鏈和非特異的GIF組成(Jardieu andIshizaka，in Immune Regulation by Characterized Polypeptides，G.Goldstein，et al.，ed.Alan.R.Liss，New York，p.595，1987)，而且該結合抗原的鏈與效應子型的抑制T-細胞因子(TseF)的該鏈共用-共同的抗原決定簇14-12(Iwata，et al.，ibid，1989)。分別所作實驗已表明，單克隆抗脂調節素抗體141-B9及抗-1-J抗體不僅結合GIF，而且還結合TseF和TsiF的非抗原結合鏈(I-J+鏈)(Jardieu，et al.，J.Immunol.，1381494，1986，Steele，et al.，J.Immunol.，1422213，1989)。這些發現綜合起來提示該結合抗原的GIF與TseF相同。代表性的鼠Ts雜交瘤71B4的親體T細胞是通過接觸過OVA的脾細胞，藉助同源抗原的刺激而獲得，接著在有GIF存在時，將該抗原激活的T細胞繁殖(IwataIshizaka，J.Immunol.，1413270，1988)。同樣的方法被用於在本實驗中獲取人T-細胞雜交瘤的親體細胞。實際上，得自人雜交瘤的非特異GIF和PLA2結合GIF都與141B9-Sepharose結合，先前的研究已表明，141B9-Sepharose也吸收鼠TsFs(Steele，et al.，J.Immunol.，1422213，1989)。可能是，得自人T-細胞雜交瘤的結合PLA2的GIF代表人抗原特異性TseF。然而，仍然可能的是，該結合抗原的GIF可能是鼠TsiF的一種配對物。我們實驗室的近期研究表明典型的鼠輔助T-細胞克隆D10.G4.1可產生結合抗原的GIF，如果該細胞在有磷脂酶A2抑制因子存在時，經預培養而後被抗原(伴清蛋白)激發的抗原呈遞細胞刺激的話(Ohno，et al.，Internat.Immunol.，2257，1990)。還發現，這種結合抗原的GIF與對TsiF特異性的單克隆抗體14-30結合，(Ferguson and Iverson J.Immunol.，1362896，1986)而不是與單克隆抗體14-12結合。Green等人(J.Mol.Cell Immunol，395，1987)還報導由於UV-輻照的抗原激發的巨噬細胞的刺激，D10.G4.1克隆產生結合抗原的TsF，並報導這種因子和附屬的分子一起誘發效應基因型抗原特異性Ts的產生。由於得自過敏患者的PBMC含有輔助T-細胞，所以仍有可能的是，得自人雜交瘤的該結合抗原的GIF代表TsiF，而不是TseF。
Takeuchi等人(J.Immunol.，1413010，1988)構建了得自已接觸抗原KLH的個體的PBMC的Ts克隆，該個體已接受了大劑量同源抗原的重複注射。Modulin等人(Nature，322459，1986)也構建了得自結節性麻瘋患者的侵蝕斑的Ts克隆。然而，在本發明之前，效應基因分子介導的，源自人Ts細胞的抑制活性物(TsT)尚未被鑑別出來。人GIF和鼠GIF間的相似性提示得自人T-細胞雜交瘤的結合PLA2的GIF可代表得自人抑制T細胞的TsF。產生結合抗原的GIF的該T-細胞雜交瘤將便於該分子的生物化學的特徵描繪。在小鼠中已反覆證明Ts以及TsF(結合抗原的GIF)在活體內抑制IgE抗體反應比抑制IgG抗體反應更有效(Ishizaka et al.，J.Immunol.，114110，1975)。如果得自人T-細胞雜交瘤的結合過敏原的GIF實際上代表TsF，則有理由期望該T-細胞因子可抑制親體T-細胞供體的IgE抗體反應。
實施例4製得產生杉樹花粉特異性GIF的雜交瘤細胞系在日本，日本杉花粉是主要的過敏原，它在人群中高比例地引起季節性的過敏性鼻炎和結膜炎。為進一步檢驗本發明的技術對其它抗原的通用性，將生成產生抗原特異性GIF的T-細胞和T-細胞雜交瘤的方法(如上所述)應用於取自對日本杉過敏原過敏患者的外周血單核細胞中。
在日本杉(Sugi，Cryptomeria japonica)中的主要過敏原是稱為cryj-1的40KDa糖蛋白(Yasueda，et al.，Allergy and Clin.Immunol.，7177，1983)。為了這些研究，將該過敏原從杉花粉提取物中，以稍加改動的該方法分離出來。簡言之，花粉用乙醚脫油，然後用0.125M的碳酸氫銨萃取3次。萃取物中的碳水化合物用溴化十六烷基三甲銨去除。該提取物中的蛋白用80％的飽和硫酸銨沉澱，然後將此沉澱物溶於0.05M pH7.8的Tris-HCl緩衝液中。在徹底用Tris-HCl緩衝液透析後，將此蛋白部分於DEAE纖維素柱(DE-52，Whatman)上樣，然後得到流過物級分。該級分經濃縮，以0.01M，pH5.0的乙酸鹽緩衝液透析，然後於CM纖維素柱(CM-52，Whatman)上樣，該柱是已用該緩衝液平衡過的。用該緩衝液洗此柱，而保留在柱中的蛋白用0.1M含0.3M氯化鈉的磷酸鹽緩衝液洗脫。該洗脫液中的蛋白通過Sephacryl S-200HR柱的凝膠過濾分級而得到含cryj-1的主要蛋白級分。在此餾分中的主要蛋白是42KDa，這是由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳而確定的，而且該蛋白的N-末端胺基酸序列與cryj-1的序列相同。該蛋白以1.5mg/ml凝膠的量與Affigel10結合。
一種合成的磷脂酶A2抑制因子，2-(P-戊基肉桂醯基)-氨基-4-氯苯甲酸(ONO-RS-082，ONO Pharmaceutical Co.)被用來代替重組體人脂皮質素。先前的實驗已表明ONO-RS-82是磷脂酶A2的特異抑制因子，而且有利於在小鼠脾細胞培養中生成產生GIF的細胞(Ohno，et al.，International Immunology，1425，1989)。當已接觸過卵請蛋白的小鼠脾細胞被卵清蛋白刺激，而且抗原激活的T-細胞用IL-2在有2μM ONO-RS-82，或3μg/ml重組體人脂皮質素存在下繁殖時，則產生GIF的，抗原特異性T-細胞生成。抗原刺激的T-細胞和T-細胞雜交瘤的構建，除了將提純的cryj-1被用作抗原和ONO-RS-82用作磷脂酶抑制因子外，其餘基本上與上述方法相同。這樣，從對日本杉花粉過敏患者的外周血中獲得單核細胞，並被懸浮於含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養基中。該單核細胞懸浮液(3×106細胞/ml)在有10μg/mlcryj-1存在時培養3天。非附著細胞被回收，並重懸浮於含10％FCS的RPMI培養基中(3×105細胞/ml)，而後在有60單位/ml人IL-2和2μM ONO-RS-82存在時培養4天。然後將按該法繁殖的細胞回收並與BUC細胞融合構建雜交瘤。
雜交瘤用該單克隆抗CD3抗體SPB-T26(Spits，et al.，Hybridoma2423，1983)處理，而CD3在該細胞上的存在用免疫螢光法檢測。通過有限稀釋只有CD3+雜交瘤被亞克隆。
該CD3+雜交瘤克隆被保持於含10％FCS的完全DME培養基中，每種克隆的培養物上清液用12H5細胞作GIF存在分析。表V顯示得自一個患者的各雜交瘤所得的結果。在三個雜交瘤31E9、31B7和32B4的培養物上清液中，檢測出GIF活性。其它兩雜交瘤31H6和31H3的上清液看來GIF活性較弱。這樣，用抗CD3抗體，接著再用抗小鼠免疫球蛋白處理該產生GIF的雜交瘤，並將該細胞培養24小時。培養物上清液在cryj-1偶聯的免疫吸附劑上分級。用12H5細胞測定免疫吸附劑流過物級分中GIF活性和酸性洗脫液級分中GIF活性。包括在表V中的結果表明得自31E9細胞的GIF與cryj-1-Affigel結合，並可在酸性pH時洗脫而回收，而得自31B7細胞的GIF卻不能與抗原偶聯的免疫吸附劑結合。此結果表明在抗CD3刺激下，31E9細胞產生具有對cryj-1親和性的GIF。
表V產生人的杉過敏原特異性雜交瘤a雜交瘤克隆％玫瑰花結抑制bcryj-1 Sepharose中的GIF活性c(流出物/洗脫液) 未結合 已結合無 0/230/29 -31H6 20/13(±) 5/20(-) 12/10(±)31A110/25(-) ND -31E9 28/5(+) 0/22(-) 20/0(+)31H3 23/12(±) 0/34(-) 38/16(±)31B7 32/5(+) 20/5(+) 4/24(-)31F7 0/26(-) ND -3284 22/0(+) 22/14(±)38/22(±)a表中的雜交瘤產生於兩個分別的實驗。b未受刺激雜交瘤培養物上清液針對GIF的存在而篩分。12H5細胞的等分試樣與各雜交瘤的培養物上清液一起，在有小鼠IgE存在時培育。12H5細胞培養物上清液經CF50A過濾以去除IgE，然後濾液在小扁豆植物凝血素Sepharose上分級。流出物和洗脫液級份中的IgE-BF用玫瑰花結抑制試驗測定。列中的數字代表得自小扁豆植物凝血素Sepharose的流出物/洗脫物級分引起的玫瑰花結抑制百分比。(+)、(-)號分別表示有無GIF。c代表性的雜交瘤用抗-CD3抗體檢測，而培養物上清液用cryj-1偶聯的Affigel分級。在流過物級分(未結合)和酸性洗脫液(結合)級分中GIF活性物的存在用12H5細胞確定。12H5細胞培養物濾液在小扁豆植物凝血素Sepharose上分級。數字代表得自小扁豆植物凝血素Sepharose的流出物/洗脫液級分產生的該玫瑰花結抑制百分比。得自31E9細胞的GIF與cryj-1-Affigel結合，而且通過酸性pH洗脫被回收，而得自31B7細胞的GIF不能在該cryj-1-Affigel柱中存留。
實施例5產生對人GIF特異性的單克隆抗體的雜交瘤細胞系的製備及特徵描述A.雜交瘤的構建和篩選T-細胞雜交瘤CL3的培養物上清液中的人GIF，用抗-脂調節素(141-B9)-Sepharose提純。經親和性提純的GIF在完全弗氏佐劑中混合，而BALB/c小鼠通過進行3次間隔兩周的經腹膜內注射該抗原而被免疫接種。在最後一次免疫注射後兩周，獲取該經免疫小鼠的脾細胞，將1×107脾細胞移入已用625Rr射線照射過的同源BALB/c小鼠中。在細胞移入後即刻，及兩周後用提純的在不完全弗氏佐劑中的GIF免疫接種。加強注射後一周，它們的脾細胞與缺乏HPRT的B細胞系SP2/0-14AG融合。該細胞與作為餵養層的BALB/c巨噬細胞一起在HAT培養基中培養。在該培養物中得到的102個雜交瘤克隆進行選擇，形成鼠免疫球蛋白者，並用ELISA分析接著利用12H5細胞的生物分析對形成Ig-的雜交瘤進行挑選，選擇產生抗-GIF抗體者。
在ELISA檢測中，Immunol I板被塗覆以親和性提純的GIF。對照井充以DPBS。在用2％BSA封閉井後，將培養物上清液加在每井上，然後採用鹼性磷酸酶偶聯的抗小鼠Ig抗體測定鼠Ig與該井的結合。如表VI所示，11個雜交瘤克隆的培養物上清液給出很強的信號。
表VI產生抗GIF雜交瘤的選擇a雜交瘤Ig ELISA GIF活性c克隆 同型物信號/對照物b流出物/洗脫液無 -0/029/1 (+)334FIgM 0.195/0.00333/1(+)355CIgM 0.388/0.01228/0(+)338HIgM 0.316/0.0500/29(-)318HIgM 0.149/0.0460/31(-)388F1IgG2a0.892/0.1000/28(-)476BIgM 0.100/0.0200/20(-)489GIgM 0.174/0.00 7/15(？)481FIgM 0.460/0.09218/0(+)335CIgM 0.203/0.0730/27(-)419AIgM 0.542/0.15 27/1(+)312FIgM 0.533/0.02914/8(±)培養基對照 -0/00/31a在ELISA檢測中為陽性的培養物上清液，被進行與得自CL3克隆的GIF結合能力的測定。b在雜交瘤培養物上清液中的鼠Ig與GIF塗覆的井的結合，與同樣上清液中的Ig與BSA塗過的井的非特異性結合的比較。光密度為410mμ。c將提純的GIF和雜交瘤的培養物上清液的混合物經YM100膜過濾，然後濾液作GIF活性測定。12H5細胞與小鼠IgE在有該濾液存在時一同培養。該細胞所形成的IgE-BF在小扁豆植物凝血素Sepharose上分級，而得自此小扁豆植物凝血素偶聯Sepharose的流出物和洗脫液級分中的IgE-BF進行玫瑰花結抑制評估。數字代表流出物-洗脫液級分的玫瑰花結抑制百分比，GIF改變由該細胞形成的IgE-BG的特性(頂柱對底柱)。(+)表示存在GIF。
用12H5細胞確定在11個雜交瘤克隆中的培養物上清液中抗-GIF的存在(Iwata，et al.，J.Immunol.，1402534，1988)。用50％飽和硫酸銨沉澱，獲得來自各克隆的培養物上清液和球蛋白因子。在以磷酸鹽緩衝鹽水透析後，該級分被調到原培養物上清液體積的1/5。用141B9Sepharose由CL3克隆製備親和提純的GIF等分試樣。這些等分試樣與同體積的得自各克隆的該球蛋白級分混合，然後於4℃將此混合物培育過夜。而後該混合物經YM100膜過濾，並測定GIF在該濾液中的存在。該12H5細胞的懸浮液等分試樣與等體積的濾液混合，而將該細胞懸浮液在有10μg/ml小鼠IgE存在時培養24小時。通過CF50A膜過濾此培養物上清液以去除IgE，而該濾液中的IgE結合因子在小扁豆植物凝血素Sepharose上分級。包括在表VI中的該實驗的結果表明GIF已被338H，318H，388F1，467B和335C克隆的培養物上清液去除，這表明，這些雜交瘤產生抗GIF。B.提純帶有單克隆抗GIF的人GIF在產生對GIF的單克隆抗體的6個雜交瘤克隆中，僅388F1產生IgG抗體。該雜交瘤被亞克隆而後在含5％FCS的高葡萄糖Dulbecco培養基中培養。通過超濾將培養物上清液濃縮，而後利用Protein A-Sepharose去除該上清液中的IgG。將該單克隆抗體與Tresyl-激活的Sepharose偶聯以製備免疫吸附劑。為確定該單克隆抗體是否能與結合抗脂調節素(14189)-Sepharose的相同分子結合，用該141-B9-Sepharose吸附培養物上清液中的GIF，而後通過酸性pH洗脫回收。然後將該親和提純製品用抗GIF(388F1)偶聯Sepharose分級。獲得該流出物級分後，用10柱體積Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)洗此免疫吸附劑柱，然後用甘氨酸HCl緩衝液(pH3.0)洗脫。系列稀釋的流出物和洗脫液級分用12H5細胞測定GIF活性。表VII中所示結果表明得自141B9-Sepharose的酸性洗脫物中的GIF與該抗GIF(388F1)-Sepharose結合，然後再用酸性pH洗脫回收。該結果表明抗脂調節素和抗GIF均結合人GIF。
表VII部分提純的人GIF在抗GIF(388F1)偶聯的Sepharose上分級a得自388F1- GIF活性bSepharose的級分稀釋度 流出物/洗脫液流出物 1∶10 0/35(-)1∶20 0/29(-)洗脫物 1∶20 39/0(+)1∶40 26/0(+)未分級 1∶40 27/0(+)培養基對照0/27aCL-3克隆的培養物上清液中的GIF用抗脂調節素Sepharose提純。親和性提純的GIF(1.5ml)在0.75ml388F1-偶聯的Sepharose上分級。回收流出物級分後，用10柱體積的DPBS洗此柱，然後用3柱體積pH3.0的甘氨酸HCl洗脫。b利用12H5細胞，以表IV中所述的相同方法評估GIF活性。該列中的數字表示得自小扁豆植物凝血素Sepharose的流出物/洗脫物引起玫瑰花結抑制的百分比。(+)表示存在GIF。
為確定抗人GIF是否能結合小鼠GIF，利用141B9-Sepharose提純得自Ts雜交瘤、231F1細胞的小鼠GIF，然後該提純的鼠GIF等分試樣在141B9-Sepharose或388F1-Sepharose上分級。得到流出物級分後，用3柱體積DPBS洗該免疫吸附劑，再用3柱體積pH3.0的甘氨酸HCl緩衝液洗脫。如所期望的那樣，全部GIF活性物被吸附於141B9Sepharose上，而後用酸性pH洗脫回收。流出物或洗液級分都不含GIF活性物。當同樣的GIF製品在388F1-Sepharose上分級時，該流出物級分中測到微弱GIF活性。在用DPBS洗滌的洗液中測到大部份活性物，但該酸性洗脫液級分中不含可檢測量的GIF活性物。這似乎是，小鼠GIF與抗人GIF結合親和性極低，而且通過中性pH值洗滌即與此免疫吸附劑分離。這些結果表明，該單克隆抗體388F1對人GIF是特異的。C.通過離子交換層析提純人GIF。
通過有限稀釋使AC5細胞亞克隆，而且得到CD3+克隆。而後將這些細胞調到無血清ABC培養基中。CD3在此培養基中培養的亞克隆上的表達，通過螢光細胞計數被證實。將CD3+亞克隆培養物上清液濃縮10-30倍，測定該製品的系列稀釋液中的GIF活性。基於這些結果，選擇亞克隆(AC5-23)，因為這種亞克隆的10倍濃縮上清液的1∶3稀釋液，便可使12H5細胞從形成糖基化IgE-BF轉變成形成非糖基化的IgE-BF。
作過一些研究以便確定人GIF是否可用離子交換柱層析法提純。將ABC培養基中的AC5亞克隆培養物上清液濃縮25倍。該濃縮培養物上清液10ml等分試樣，被用Tris調到pH8.0，用蒸餾水稀釋8倍，然後在DEAE-Sepharose柱上樣。與其結合的蛋白用10mM Tris緩衝液洗脫，該緩衝液逐步提高NaCl濃度。每個級分被濃縮到10ml，然後作GIF活性分析。
表VIIIGIF活性物在DEAE-Sepharose級分中的分布級分 NTis HCl+蛋白含量NaCl(mM)a(μg)bGIF活性c120 65.521/0(+)250 35.020/6(+)375 42.57/20(-)4100 38.53/19(-)5150 41.50/21(-)6200 42.00/20(-)培養基對照0/22(-)aAC5細胞的濃縮培養物上清液用蒸餾水稀釋8倍，而後於DEAE-Sepharose柱上樣。級分1代表通過物級分與用10mM Tris HClpH8.0(含20mM NaCl)洗滌的洗液合併的級分。該柱用含逐步增高NaCl濃度的10mM Tris HCl洗脫。b各級分濃縮後回收的蛋白總量。在用含200mM NaCl的Tris HCl洗脫後，大量蛋白仍遺留在該柱中。c用12H5細胞測GIF活性。數字代表得自小扁豆植物凝血素Sepharose的流出物/洗脫物級分產生的玫瑰花結抑制百分比。在無IgE-BF的情況下，RFC的比例是22.6±0.7(SD)％。(+)(-)表示有無GIF。
如表VIII中所示，在流過物級分中和在用5mM NaCl洗脫的級分中，而不在其它級分中檢測出GIF活性。滴定開始兩種級分的系列稀釋液表明該流過物級分的GIF活性比該50mM洗脫級分的高。
用各種培養物上清液所作的重複實驗證明培養物上清液中的GIF的大部分可從DEAE-Sepharose柱回收，條件是AC5細胞的培養物上清液被濃縮100倍，用蒸餾水稀釋3倍，而後通過此柱。將流過物級分和用含50mM NaCl的10mM Tris緩衝液洗滌的洗液合併，然後濃縮至原有體積再於DEAE-Sepharose上樣。滴定濃縮培養物上清液的系列稀釋液和該流過物級分(50mM NaCl)中的GIF表明兩種試樣的1∶30稀釋液都可使12H5細胞從形成糖基化IgE-BF轉換為形成未糖基化IgE-BF。還發現，該培養物上清液中75-80％的蛋白可通過DEAE-Sepharose而去除。
為了估計GIF的分子量，將0.5ml得自DEAE-Sepharose的濃縮流出物級分於Superose-12柱上樣，而蛋白以1ml/分的流量洗脫。在此實驗中，收集5ml各級分，而後用12H5細胞作各級分的GIF活性測定。在70-75分鐘間回收的第9級分中測得GIF活性。由於第6和第8級分也有弱的活性，則第6、8、9級分的稀釋液中均進行GIF活性測定。在1∶10的第9級分稀釋液中檢測出GIF，而其它級分的1∶2稀釋液中卻未檢測出。這些結果說明人GIF主要種的分子量在11KDa-18KDa範圍內。為了更好地估計GIF分子大小，以相同的方式重複Superose-12上的凝膠過濾，不同之處只在於收集1ml級分或2.5ml級分。三個分別的實驗表明在68-72分鐘間回收了大部分GIF。當用凝膠過濾法估測時GIF分子約為12-18KDa。
也作過通過SDS PAGA法鑑定GIF的研究。將2升ABC培養基中的雜交瘤培養物上清液濃縮100倍，而後在DEAE-Sepharose柱上分級。根據上述實驗用去離子水將該濃縮的上清液稀釋3倍，而後通過DEAE-Sepharose。將流出物級分濃縮，用人IgG-偶聯的Sepharose預吸附，而後將該級分中的GIF在388F1-偶聯的Affigel上通過親和性層析法提純。在某些實驗中，得自免疫吸附劑的酸性洗脫液級分被調到pH8.0，而後重複用388F1-Affigel進行親和性提純。以SDSPAGE進行的親和性提純GIF製品分析在還原或非還原條件下完成。在還原條件下，該親和性提純物的主帶有14KDa的分子量，而在非還原條件下則為15KDa。此外，還經常看到67KDa的帶。部分親和提純製品以DPBS透析，然後滴定該製品中的GIF活性。假設在透析和冷凍乾燥過程中100％地回收GIF，則施於SDS-PAGE上的試樣應有1∶250的GIF效價。
進行過一些實驗來測定14KDa蛋白和GIF間的關係。通過DEAE-Sepharose層析法，接著再用388F1-Affigel親和性提純法來提純2升AC5克隆培養物上清液中的GIF。得自該免疫吸附劑的酸性洗脫液被調到pH8.0，而後通過超濾而濃縮到1ml並在Sepharose12柱上分級。用12H5細胞將每2.5ml洗脫液測定活性。在此實驗中，在67.5-70分鐘之間的洗脫級分中測得大部分GIF活性。利用生物素偶聯的mAb141-B9所作ELISA分析證實該級分中GIF的存在。因為ELISA信號很弱，僅含GIF的級分給出ELISA信號。將1ml含GIF的級分冷凍乾燥，再用SDS PAGE分析，結果證實，14KDa肽存在於該含GIF的級分中。
實施例6提純小鼠GIF及胺基酸序列測定從產生GIF的小鼠T細胞雜交瘤231F1細胞，用抗脂調節素單克隆抗體141B9提純小鼠GIF(Iwata et al.，J.Immunol.，1321286，1984)。利用FAST-r柱，從注射了雜交瘤141B9的BALB/c鼠的腹水中提純該單克隆抗體141B9。將約10ml該製品中的IgG1與1ml Affgel10株粒偶聯。為獲得GIF，將231F1細胞在含10％Nu-血清的高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培養基(CollaborativeResearch)中培養。該培養物中的231F1細胞數達到1-2×106後，回收此細胞，重懸浮於無血清的DMEM中，其濃度為1.5×106細胞/ml，並培養48小時。通過超濾將該細胞培養物上清液濃縮1000倍，然後將10ml該濃縮培養物上清液與2ml141B9-偶聯的Affigel，於4℃混合6-12小時。用含50mM NaCl的10mM磷酸鹽緩衝液徹底地洗此免疫吸附劑，再用含500mM NaCl的同樣的緩衝劑洗滌。用0.1M，pH3.0的乙酸鈉緩衝液洗脫保留於該免疫吸附劑中的蛋白。親和性提純的GIF與1/10體積的100％(重量/體積)三氯乙酸混合。該混合物於-20℃下保持15分，以15000×g離心分離5分鐘回收沉澱。該沉澱中的蛋白在15％聚丙烯醯胺/SDS凝膠中，在還原條件下電泳，然後以偏二氟乙烯(PVDF)膜(於10mM CAPS緩衝液中，pH11.0)進行電印跡試驗。用Coomassie Brilliant Blue(CBB)染色的蛋白帶顯現後，切下14KDa帶以便確定胺基酸序列。
將該PVDF固定的蛋白還原而後原位被S-羧甲基化，然後於30℃用含8％乙腈的90mM Tris緩衝液(pH9.0)中的1pmol無色桿菌屬蛋白酶I(Wako Pure Chemicals)消化20小時。利用5μC8-300A柱(Waters)(用0.05％三氟乙酸水溶液作為流動相平衡過)通過反相HPLC分離已消化的肽。用0.02％三氟乙酸的2-丙醇液/乙腈(7∶3)的線性梯度液(2-50％)洗脫該肽。將顯示214nm波長吸附的主肽峰收集，然後用氣相序列分析儀(AppliedBiosgstems Model470A)，以經修改適於微測序的程序(Iwamatsu，et al.，J.Biochem，11051-158，1991)進行該肽胺基酸序列分析。該被分離肽的胺基酸序列如下所示肽 序列AP-1 (K)-I-G-G-A-Q-N-R-N-Y-S-K(SEQ ID NO1)AP-23(K)-L-L-C-G-L-L-S-D-R-L-H-I-S-P-D-R-V-Y-I-N(SEQ ID NO2)無色桿菌屬蛋白酶I消化後，PVDF-保留的肽片段用100mM碳酸氫銨(pH7.8，含8％乙腈)中的2pmol內切蛋白酶ASP-N(Boehriger Mannheim)於30℃亞消化16小時。此消化之後，通過HPLC收集4種主要肽，然後按上述方法定序。每種肽的胺基酸序列如下肽 序列AN-4 D-M-N-A-A-N-V-G-X-N-G-S-T-F-A(SEQ ID NO3)AN-5 D-P-C-A-L-C-S-L-H-S-I-G-K(SEQ ID NO4)AN-7 D-R-L-H-I-S-P-D-R-V-Y-I-N-Y-Y(SEQ ID NO5)在AN-4中X表示未測到。
在內切蛋白酶ASP-N消化之後，保留在該膜上的肽用1pmol胰蛋白酶-TPCK(Worthington Biochemicol)，於含8％乙腈的100mM碳酸氫銨(pH7.8)溶液中，於30℃亞消化20小時。一種主要肽(T-1)被收集和測序。肽序列T-1P-M-F-I-V-N-T-N-V-P-R(SEQ ID NO6)該N-末端胺基酸序列通過注射小片PVDF固定蛋白於定序器(Shimazu PSQ-1)直接測序。N-末端(M)-P-M-F-I-V-N-T-N-V-P-R-A-S-V(SEQ ID NO7)約85％的被分析肽顯示N-末端蛋氨酸殘基缺失。
實施例7cDNA克隆和鼠GIF序列測定根據上述N-末端胺基酸序列和其它肽(AN-5)序列，合成寡核苷酸。曾嘗試通過聚合酶鏈反應來放大部分cDNA，然後用所得的cDNA探測鼠cDNA文庫。用於此PCR的合成引物是5』-ATGCCGATGTTCATCGTAAACACCAACGTGCCCCGC-3』(SEQID NO8)5』-GCCGATGCTGTGCAGGCTGCAGAGCGCGCACGGCTC-3』(SEQ ID NO9)胞質RNA與產生GIF的鼠T雜交瘤231F1分離。用寡(dT)-纖維素提純mRNA後，單鏈cDNA在mRNA模板上由231F1RNA模板上的dT15啟動的逆轉錄而合成。在標準條件下進行PCR。簡言之，於94℃使該模板DNA變性1分鐘，用上述的引物於約59℃退火1分鐘，接著在72℃延展45秒。將在PCR中放大的0.2Kb片段連接在pCR1000載體(Invitrogen，La Jolla，CA)上，以便後續的克隆和DNA序列測定。在確定該片段的核苷酸序列後，該插入段因EcoRI消化而被切割，以便篩選鼠T細胞雜交瘤231F1細胞的cDNA文庫，該雜交瘤是用Uni-ZAP cDNA合成藥盒(Stratagene，La Jolla California)構建的。EcoRI識別位點與雙鏈cDNA相接(而後它被XhoI消化)，並將cDNA連接於Uni-ZAP XR載體中。該cDNA文庫通過與上述0.2Kb DNA雜交而被篩選。在篩選50萬獨立的克隆後，分離出7個克隆。所有7個克隆的限制性圖譜表明它們是單一形式的。
通過標準雙脫氧法，挑選出最長的克隆(0.65Kb)來進行DNA序列測定。鼠GIF的核苷酸序列及推斷出的胺基酸序列示於圖1中。下標線表示提純鼠GIF的Edman降解中的被鑑別肽的位置。估計的GIF蛋白大小是13KDa，這與自T雜交瘤231F1細胞提純的GIF大小相符。第一蛋氨酸密碼子側面的核苷酸序列有利於轉譯起始規則。該插入段長度為0.65Kb。鼠T-細胞和組織RNA的Northern印跡分析表明有0.65-0.70Kb單種mRNA存在，提示所得的cDNA是全長度的。還發現，該鼠GIF蛋白缺少信號肽，因為在核苷酸82的5′上遊未發現蛋氨酸殘基(圖1)。
實施例8分離編碼人GIF的cDNA用抗CD3抗體將人T細胞雜交瘤AC5染色。而產生GIF的CD3+亞克隆被用作mRNA的來源。重複在寡(dT)纖維素上的分級以分離mRNA，該mRNA隨後被用作用ZAP-cDNA合成藥盒合成cDNA的模板。連接EcoRI識別部位後，用XhoI消化雙鏈cDNA，經Sepharyl S-400迴旋柱過濾選擇其大小。該cDNA然後被連接到Uni-ZAP XR載體中，以構建重組噬菌體文庫。在該文庫中，含一插入段的噬菌體比例是總噬菌體的88-96％。通過與編碼鼠GIF的cDNA片段雜交，篩選此cDNA文庫。用含鼠GIF-cDNA的噬菌粒培養E.coli XL1，然後提取該細菌中的DNA。質粒用離心法提純，並用BamHI和XhoI消化。在瓊脂糖上電泳後，提取500bp帶，然後用Gene cleanII藥盒(BIO101)提純。該cDNA用購自Stratagene的Prime-It gold藥盒以α-32P-ATP標記。
E.coli PLK-F用含5×104pfn的此文庫培養，而噬菌體則被轉到已塗覆有E.coli的尼龍膜(Duralose，Stratagene)上。將該膜置於LB底板上，並於37℃保溫過夜。用0.5M NaOH處理後，用Tris中和，並用2×SSC洗滌，將此膜於80℃乾燥，以固定DNA於該膜上。
為了篩選該cDNA文庫，該膜用聲處理鮭魚精液DNA作預處理，然後用已於100℃加熱5分鐘的32P-標記小鼠GIF cDNA，於60℃培育過夜。該膜被洗2次，各次用含0.1％ SDS和0.1×SSC加0.1％SDS的6×SSC洗滌，而後於放射自顯影照像底片上暴光。從陽性克隆中提取噬菌體，然後將篩選重複兩次，以便分離陽性克隆。在篩選的200000個噬菌體中，分離了27個陽性克隆。為了證實該陽性噬菌體確實含與鼠GIF cDNA同源的cDNA，從每種陽性噬菌體克隆中獲得噬菌粒DNA，在1％瓊脂糖凝膠中電泳，在Zeta-探針膜中作印跡分析，然後與32P-標記的小鼠GIF cDNA雜交。
為確定人GIF cDNA的核苷酸序列，將得自各噬菌體克隆的噬菌粒用EcoRI及XhoI消化，然後電泳以得到該插入段。在27個克隆中，某些有0.5Kb插入段的克隆用雙脫氧法定序。該插入段用SacI，PstI及SmaI消化，而片段在pUC19或pBluescript SK-載體中進行亞克隆。質粒DNA用鹼性SDS法提純，而克隆用序列Ver2(USB)定序。全長度cDNA(PNY106)的整個核苷酸序列示於圖2。除了GIFcDNA中得自核苷酸390-392的密碼是AAT(天冬醯胺)，而MIFcDNA有AGT(絲氨酸)密碼子外，該序列與目的人MIF cDNA同源(Weiser et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.867522-7526，1989)。另一個區別在於5′端非編碼區(在pYN106中)是40鹼基，這比MIF的長。
在幾個雜交瘤中進行RNA酶保護分析，以確定用GIF cDNA檢測的mRNA的結構中是否有重複。
實施例9在E.COLI中表達重組體GIFA.構建細菌表達體系此實施例涉及人和鼠GIF多肽在E.coli中的表達。於EcoRI和XhoI位點插入BlueScript的人GIF cDNA用寡核苷酸引物退火。該引物為5』-AACCTTAAGAAAAACCAAGGAGGTAATAAATAATGCCGATGTTCATCGTAAACACCAACG-3』(SEO ID NO10)3』-CACCCGACCTTGTTGAGGTGGAAGCGGATTATCCCTAGGCAA-5』(SEQ ID NO11)用氨基磷酸酯法合成這些引物(McBride，et al.，TetrahedronLett.，24245-248，1983)。該5′-端引物含Shine-Dalgano序列以便更好的表達細菌(Scherer，et al.，Nucl.Acids.Res.，83895-3950，1980)，而每種引物分別含AfIII及BamHI位點。
用聚合酶鏈反應(PCR)將人GIF cDNA放大(Mullis，et al.，Method in Enzymol，155335-350，1987)。除另有注釋外，各PCR循環中的變性步驟定為94℃1分鐘，而延伸步驟在72℃2分鐘。退火溫度和時間隨各種反應而有所不同，通常是根據同時進行的幾種不同PCR所需溫度時間加以估計得出的均衡值。
從瓊脂糖凝膠分離的，經放大的cDNA片段用AfIII及BamHI消化，將連接物在獨特AfIII及BamHI位點插入載帶Trp啟動子和TrpA終止子的pST811載體中(圖3，日本專利公開63-269983)。這種被稱為pTMK-hGIF(圖4)的新質粒被轉化進合宜的RR1E.coli宿主細胞。根據氨苄青黴素的抗藥性選擇含質粒的細胞(承載於pST811載體上的標記基因)。合成的寡核苷酸及整個人GIF基因的DNA序列由質粒DNA的DNA序列測定所證實。
用與人GIF相同的方法，從插入BlueScript的小鼠GIF cDNA構建小鼠GIF的細菌表達體系。使用PCR在鼠GIF cDNA兩端產生AfIII和BamHI位點的引物是5』-AACCTTAAGAAAAACCAAGGAGGTAATAAATAATGCCTATGTTCATCGTGAACACCAATG-3』(SEQ ID NO12)3』-GCACCCGACCTTGCCAAGGTGGAAGCGAACTATCCCTAGGCAA-5』(SEQ ID NO13)在pST811載體中的含小鼠GIF cDNA的質粒被標為pTMK-mGIF。
另外，人或鼠編碼序列可從pTMK-hGIF或pTMK-mGIF中通過用AfIII和BamHI酶切而回收，然後插入任何所需的，具有PL.lac，tac或OmpF啟動子的細菌載體中，所用方法根據Molecular CloningA Laboratory Manual(Maniatis，et al.，1982)一書所載，這些例舉的載體，和本領域已知的其它細菌載體，可被轉化入細菌宿主，和進行GIF表達。B.培養產生GIF的E.coli載帶質粒pTMK-hGIF或pTMK-mGIF的RR1E.coli於含50μg/ml氨苄青黴素的20ml Luria液體培養基中培養，而後於37℃生長過夜。該接種物培養物被無菌轉移入1升由0.8％葡萄糖、0.4％酪蛋白胺基酸，10mg/升硫胺素及50mg/升氨苄青黴素組成的M9液體培養基中，而後於37℃培養3小時。最初培育結束時，加入40mg吲哚基丙烯酸，而後該培養物在37℃再培養5小時。
實施例10提純在E.coli中表達的重組體GIF產物將約5g溼重的收穫細胞懸浮於體積為30ml的水中，而後通過French-Press打碎(8000psi，重複4次)。在4℃，以15000×g離心處理10分鐘分離出上清液和破碎的細胞沉澱。用水將此細胞沉澱洗2次。採用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析，明顯表明大部分沉澱是人GIF蛋白。該上清液還含可溶性人GIF蛋白。可溶與不可溶的GIF之比約為1∶3。A.提純可溶性GIF可溶的GIF級分於-80℃冷凍過夜，而後慢慢地在室溫下熔化。通過15000×g，15分鐘的離心分離去除不可溶物。此步驟中，大部分細菌汙染物可被去除。加50mM乙酸鈉緩衝液(pH5.0)將該上清液調到pH6.0，而後將其於4℃下用20mM乙酸鈉緩衝液(pH6.0)平衡過的CM-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)柱(5×18cm)上樣。以2ml/分的流量，用20mM乙酸鈉緩衝液(pH6.0)洗此柱，而後通過NaCl分步梯度液將蛋白洗脫。用20mM乙酸鈉緩衝液(pH6.0)的0.5NaCl液洗脫GIF。人GIF的純度用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳估計並確定為高於95％。B.不可溶GIF的提純和再合併含不可溶人GIF的沉澱部份被懸浮於含6M胍HCl及25mM EDTA的10ml0.2M Tris-HCl緩衝液中(pH8.0)，然後通過輕柔的混合於室溫下培育3小時使人GIF增溶。殘留的不溶物通過15分鐘15000g的離心處理去除。
可溶的GIF部份於用6M胍-HCl，25mN EDTA及0.2M Tris緩衝液(pH8.0)平衡過的Sephacryl S-200Super Fine(Pharmacia)柱(5×100cm)上樣，然後在室溫下以2ml/分的流量洗脫。當無效體積被洗脫後，按每級分10ml收集洗脫物，然後用Western印跡染色進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳作GIF分析。用YM5微孔超濾膜將約120ml GIF陽性級分濃縮至5ml。
為了再合併增溶的GIF，於室溫下，隨慢慢攪拌，將該試樣慢慢加至2升20mM Tris緩衝液(pH8.0)中。24小時後，用YM5膜將該混合物濃縮10倍。
為去除剩餘的E.coli沾染物，將試樣於用20mM Tris緩衝液(pH8.0)平衡的TSK DEAE-5PWD(Toyo Soda)柱(7.5×75cm)上樣。上樣後，用同樣緩衝液洗此柱，而後於室溫，以0.5ml/分的流量，用柱緩衝液中0-0.1M NaCl梯度液將GIF洗脫。含GIF的級分(如Western印跡確定的)用YM5膜濃縮。人GIF純度用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳估測，並被測定純度在95％以上。用上述同樣方法提純重組體鼠GIF。
實施例11胺基酸序列測定及重組體GIF分析A.重組體人GIF的胺基酸序列測定經提純的得自DEAE柱的重組體人GIF經受SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，再於PVDF膜上進行印跡分析。該膜用Ponceau S染色，而後從該膜上切下GIF帶。用Shimazu PSQ-1蛋白定序儀確定該N-末端胺基酸序列。約60％重組體人GIF於N-末端有下列10個胺基酸1Met-2Pro-3Met-4Phe-5Ile-6Val-7Asn-8Thr-9Asn-10Val-該序列與自人GIF的cDNA推導出的序列相同。約40％GIF缺失N-端基1Met殘基。B.重組體鼠GIF的胺基酸分析。
將得自DEAE柱的提純重組體鼠GIF，於含0.2％酚的2次蒸餾的5.7M HCl中，在110℃下，於真空管中水解24小時。此水解後試樣被懸浮於0.02M HCl中，然後確定胺基酸組成(HITACHI835S胺基酸分析儀)。所得結果分析(表IX)總的看出獲得的Cys，Thr，Met及Trp殘基數量比自cDNA序列推導出的要低，因為在水解過程中發生了降解作用。對His殘基而言，較低值可能是由於從NH3分離不充分。在該胺基酸組成分析中，應用已知量的內部標準物如Leu，可將樣本中的蛋白質定量於280nm波長處，重組體鼠GIF的消光係數為1.89。
表IXE.coli產生的mGIF的定量胺基酸組成每摩爾蛋白的氨每個分子預計基酸組成摩爾數的殘基胺基酸分子 組1 組2 組3ASP＋ASN 10.1910.1210.31 14GLU＋GLN 6.98 6.97 7.93 8CYS0.96 0.59 1.08 3SER9.11 9.03 9.12 9GLY8.98 8.97 8.78 9HIS0.0001.70 1.86 3ARG5.07 4.81 4.84 4THR3.85 3.78 3.82 6ALA10.3710.4310.30 10PRO8.42 8.17 8.19 7TYR4.63 4.60 4.55 5VAL7.47 7.49 7.57 8MET3.13 3.03 3.05 4ILE6.14 6.09 6.10 6LEU11.0011.0011.00 11PHE4.28 4.02 4.35 4TRP0.00 0.00 0.00 1LYS2.92 2.95 2.87 3實施例12產生抗GIF的多克隆抗體將三隻兔每2-3周皮下注射於弗氏不完全佐劑中的100μg同樣的GIF試樣。114天後，收集該兔血清，然後用蛋白A親和性層析法(Prosep-A，BioProcessing)提純IgG。自25ml血清中得到約150mg IgG。該抗體識別鼠GIF和人GIF，並可用於Western印跡和提純GIF。
實施例13在哺乳動物細胞中表達重組體GIFA.構建哺乳動物細胞直接表達的表達系統此例涉及人GIF多肽在哺乳動物細胞中的表達。於EcoRI和XhoI位點插入BlueScript的人GIF cDNA用寡核苷酸引物退火5』-CCCAGATCTAAGCGGATGCCGATGTTCATCGTAAACACC-3』(SEQ ID NO14)3』-CCTTGTTGAGGTGGAAGCGGATTCCATGGCAA-5』(SEQ ID NO15)每種引物都含BgIII或KpnI位點。用PCR法將此人GIF cDNA放大，從瓊脂糖凝膠中分離，用BgIII和KpnI消化。通過連接將片段插入經修飾的SRα載體(Takabe，et al.，Mol.Cell.Biol.，8466-472，1988)，該載體在PstI位點後有BgIII位點。該質粒，稱為SRα-hGIF(圖5)，被轉化進適宜的DH5E.coli細胞。以被載於SRα載體上的Amp′基因為基礎選擇含質粒的細胞。將質粒DNA與被培養的細胞分離，而整個人GIF基因的核苷酸序列用DNA序列測定證實。B.具有附加信號序列的哺乳動物表達系統的構建。
根據DNA結構分析，GIF看來不具有信號序列，所以構建另外的表達體系以便將信號序列引入GIF，從而可從此轉染細胞經基本分泌途徑，分泌該GIF多肽。很多分泌蛋白，包括多肽激素、生長因子及質粒蛋白作為前體而合成，並經受翻譯後蛋白水解過程，該過程為其生物活性物質分泌和表達所必需。比如，人降鈣素是由甲狀腺的內分泌C細胞合成大前體分子前降鈣素(Craig，et al.，Nature，295345-347，1982)。前降鈣素是由N-末端前區、降鈣素及C-末端前區構成，在測二元位點處進行蛋白水解過程，便產生該降鈣素肽(Burns，et al.，Mol，Endocrinol.，3140-147，1989)。因此，據推測該前降鈣素通過神經內分泌源的蛋白轉化酶而裂解(Smeekens，et al.，J.Biol.Chem.2652997-3000，1990；Proc.Natl.Acad.of Sci.，88340-344，1991)。此外，人前降鈣素的N-末端前區在-4位處有附加的Arg殘基，而且在羧基末端處有Arg-Ser-Lys-Arg序列，該羧基末端是可被加工酶，毛皮素識別的分裂型主(Fuller，et al.，Science，246482-486，1989)。
在本實施例中，人GIF cDNA在構架中與編碼人降鈣素前體N-末端前區的基因的3′端融合，並插入SRα載體中。人毛皮素cDNA也被克隆，而且插入SRα載體中。二載體均被轉染為導致分泌成熟的人GIF的COS-1細胞(ATCC CRL1650)。1.cDNA的克隆編碼人前-降鈣素(pro-CT)信號肽和N-末端前區的cDNA片段(Steerbergh，et al.，FASEB Letter，20794，1986)用人降鈣素cDNA作模板經PCR而擴增。mRNA從人甲狀腺癌TT細胞(ATCCCRL1803)分離出來。而後逆轉錄成被用作PCR模板的cDNA。
如下所示有PstI位點的寡核苷酸引物被合成，而且人降鈣素前體基因被放大。
5』AACTGCAGATGGGCTTCCAAAAGTTC-3』(SEQ ID NO16)3』-GACCTGTCGGGGTCTAGATTCGCCGACGTCCA-5』(SEC ID NO17)該被放大基因克隆進PstI消化的SRα載體。插入BlueScript的人GIF cDNA用下面的寡核苷酸引物退火。
5』-CCAGGATCTAAGCGGATGCCGATGTTCATCGTAAACACC-3』(SEQ ID NO14)3』-CCTTGTTGAGGTGGAAGCGGATTCCATGGCAA-5』(SEQ ID NO15)該引物分別有BgIII位點和KpnI位點。該放大基因編碼Arg-Ser-Lys-Arg序列，接著再編碼hGIF序列。然後該基因連接而插入BgIII和KpnI消化的SRα中，如前所述，該SRα具有人降鈣素前體基因。這種新的質粒，標為SRα-hcGIF(圖6)被轉化進DH5E.coli細胞。將質粒DNA從被培養細胞中分離出，而整個人降鈣素前體和人GIF基團的DNA序列通過DNA序列測定證實。
以同樣的PCR擴增使人毛皮素cDNA克隆。多聚(A)+mRNA從人膀胱癌細胞系HT1376(ATCC，CRL1472)中分離，逆轉錄成cDNA，並被用作PCR模板。六種寡核苷酸引物(下示圖1-6)根據公開的毛皮素cDNA序列(Fuller，et al.，Science，246482，1989)，用ABI394DNA合成儀(Applied Biosystems，Inc.CA)製成。分別覆蓋人毛皮素DNA的編碼序列1-951，922-1604及1565-2385bp的三種DNA片段從相應的PCR產物中提純。編碼氨基末端蛋白序列的cDNA片段，用毗鄰的cDNA片段，通過此二片段間的27bp重疊來退火。所得的cDNA混合物用相應於第-片段的5′端和第二片段3′端的引物再擴增。所得的1.6kb cDNA藉助Bsp HI位點與編碼剩餘羧基末端毛皮素的第三cDNA片段連接。整體cDNA片段構件被亞克隆進TA克隆載體pCR1000(Invitrogen，La Jolla CA)。用Sequenase藥盒(United States Biochemical Corp.，OH)確定人毛皮素cDNA序列。限制位點圖和部分序列分析揭示，該被克隆的cDNA與先前報導的人毛皮素相同。含全長度人毛皮素的EcoRI-NotI片段被克隆入哺乳動物表達載體pEFneo，該pEFneo是將新表達單元插入改性的pEF-BOS產生的(Mizushima，et al.，Nucl.Acids Res.，185322，1990)。
用於通過PCR複製人毛皮素cDNA的六種合成的寡核苷酸引物是SEQ ID NOF1 5』-AAGAATTCCCCCATGGAGCTGAGGCCCTGGTTG-3』 18F2 3』-GTGGTTGTCATAGATGTGCGACAGGTAG-5』 19F3 5』-ACACCAACAGTATCTACACGCTGTCCAT-3』 20F4 3』-TACCCAAATTACTGACCCGGAAGTACTG-5』 21F5 5』-ACTACTCCGCAGATGGGTTTA-3』 22F6 3』-TTTCTGGTCTCGCGGGAGACTCTTAAGAA-5』23F1和F2被用於1-951毛皮素(furin)編碼序列擴增，而F3和F4被用於擴增922-1604。用27bp重疊使兩種PCR產物退火，而所得的cDNA通過F1和F4引物再擴增。1.6kb的衍生cDNA藉助BspHI位點與放大F5和F6擴增的編碼人毛皮素基因的片段1565-2385bp的cDNA片段。整個毛皮素cDNA被插入EcoRI消化的SRα載體中。這種稱為SRα-hfnrin的新質粒被轉化到DH5E.coli細胞。質粒DNA從培養細胞中分離，而該合成寡核苷酸和整個人毛皮素基因的DNA序列通過DNA序列測定證實。C.在COS-1細胞中表達GIF該質粒SRα-hGIF或SRα-hcGIF加SRα-hfurin被轉染入COS-1細胞。將質粒DNA以1μg/ml的濃度加至含10％Hank’sBSS、2％FCS、40μg/ml DEAE葡聚糖、100μM氯奎的DMEM/F12(1∶1)培養基中。此混合物被遍鋪在培養皿中的COS-1細胞上，然後培養(5小時，37℃，5％CO)。培養後，細胞被洗滌並培養過夜(37℃，在含10％FCS的DMEM/F12(1∶1)培養基中)。再次洗滌後，在含20μg/ml牛胰島素(Sigma)，20μg/ml人轉鐵蛋白(Sigma)，40mM單乙醇胺，0.1μM硒酸鈉及1mg/ml BSA的無血清DMEM/F12培養基中，於37℃培養該細胞1周。作為對照物，將無插入段的載體轉染入COS-1細胞。
用抗-鼠GIF多克隆抗體作Western印跡估計在此培養物上清液中的GIF量。產自SRα-hcGIF轉染的COS-1細胞的此上清液，被表明含有成熟型GIF。與降鈣素-GIF一起被表達的毛皮素裂解分泌GIF的降鈣素前體序列。自COS-1細胞分泌的GIF量與降鈣素前體一GIF分泌的量差不多。
本領域普通技術人員還可構建與SRα-hGIF或SRα-hcGIF相匹敵的其它的哺乳動物表達載體。人GIF編碼序列可通過以BgIII和KpnI酶切而從SRα-hGIF或SRα-hcGIF中回收，然後通過連接而插入很多載體，如pCD(Okayama，et al.，Mol.Cell.Biol.，2161，170，1982)，pCDM8(Seed，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，843365-3369，1987)，及pDSVE(US Ser.Nos.025，344and152，045)中。這些載體在適宜的宿主細胞，如CHO，3T3及BHK細胞中轉化可導致GIF的表達。這是挑選較好載體系統，挑選有或無信號序列的GIF，cDNA，及挑選適宜宿主細胞以便增加GIF分泌的常規程序。D.構建分泌重組體截斷肽，不與毛皮素cDNA共轉染的獨特融合表達載體。
毛皮素在多種組織中被表達，並似乎大多定位於高爾基區(Bresnaham，P.A.et al.，J.Cell.Biol.1112851，1990；Mitsui，Y.，et al.，J.Biol.Chem.，26616954，1991)，這表明，毛皮素或毛皮素類酶參與前蛋白裂解，以便經必要的分泌途徑分泌成熟的蛋白。Smeekens等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.898822，1992)預言過毛皮素類酶在COS細胞中存在。因此，如果採用該酶的合適裂解型主COS細胞中的毛皮素類酶可用於處理重組體融合蛋白，以便分泌成熟肽。
一種Fc cDNA被用於設計有效的蛋白水解分裂位點的試驗目的。人IgG的Fc片段沒有信號肽，而編碼Fc片段的cDNA片段不載帶轉譯起始密碼子ATG，該蛋白一般不能通過cDNA轉染入哺乳動物細胞而表達。pro-CT被用於該Fc片段的載體肽，而該pro-CT的羧基末端的胺基酸序列被修改以便產生合適的，可被推測的COS-1細胞中的毛皮素類酶識別的裂解型主。根據先前的關於加工酶的裂解型主的信息，四種不同的胺基酸序列被引入pro-CT中。編碼pro-CT的cDNA，通過以人降鈣素cDNA作模板，用一個5′端引物(CT1)及4個列於表X的不同的3′端引物(CT2，CT3，CT4和CT5)的PCR而擴增。在不同位置引入幾個鹼基而將引物(CT2，CT3，CT4和CT5修飾，以便研究此種變化對COS-1細胞的推測內切蛋白酶加工效率的影響。
表X人pro-CT的PCR擴增的寡核苷酸引物一覽表Met Gly Phe Gln Lys PheCT1(28MER) GAAT TCT GTC ATG GGC TTC CAA AAG TTC↓CT2(30MER) -6 -5 -4 -3 -2 -1 +1Leu Asp Ser Pro Arg Ser Lys Arg Ser ArgCTG GAC AGC CCC AGA TCC AAG AGA TGT AGAGAC CTG TCG GGG TCA AGG TCT TCT AGA TCTCT3(30MER) Leu Asp Arg Pro Met Ser Lys Arg Ser ArgCTG GAC AGA CCC ATG TCC AAG AGA TCT AGAGAC CTG TCT GGG TAC AGG TTC TCT AGA TCTCT4(30MER) Leu Asp Arg Pro Arg Ser Lys Arg Ser ArgCTG GAC AGA CCC AGA TCC AAG AGA TCT AGAGAC CTG TCT GGG TCT AGG TTC TCT AGA TCTCT5(30MER) Leu Asp Ser Pro Met Ser Lys Arg Ser ArgCTG GAC AGC CCC ATG TCC AAG AGA TCT AGAGAC CTG TCG GGG TAC AGG TTC TCT AGA TCT帶虛線的箭頭表示按5′-3′方向合成的引物。CT1編碼pro-CT的氨基末端，而4個其它的引物編碼pro-CT的羧基末端。帶實線的箭頭表示內切蛋白酶的酶切位點。CT2-CT5中的核苷酸序列AGATCTAGA被BgIII和XbaI識別。(SEQ ID NOS24-32)為構建質粒，將EcoRI限制性位點引入CT1中，並將BglII加Xba I限制性位點引入其它4種引物中。在生成4種相應的pro-CTcDNA片段後，將它們亞克隆入該質粒pBluescript II SK(+)(Stratagene)的EcoRI和Xba I位點。由於Not I變為該質粒載體上的Xba I後的相鄰限制性位點，所以pro-CT cDNA可被EcoRI和Not I酶切。接著，4種不同的有突變3′端的pro-CT cDNA的每種被插入該哺乳動物表達載體pME18S中，該載體承載了嵌合反轉錄病毒啟動子，SRα(Takabe，et al.，Mol.Cell.Biol.，8466，1988)。這種新質粒被稱作pMEpro-CT(圖7)。此載體由ⅰ)嵌合啟動子SRα(由SV40啟動子加該反轉錄病毒的長末端重複R區融合)，ⅱ)pro-CT，ⅲ)SV40早期多(A)附加信號組成。在pro-CT的羧基末端蛋白水解分裂位點之後，包括對Bgl II、Xba I及Not I的多種克隆位點。以便插入討論中的外來基因。被Bgl II和Xba I識別的核苷酸序列(AGATCTAGA)編碼該讀框中的Arg-Ser-Arg殘基。因此，外來cDNA可被引入並與此讀框的pro-CT cDNA融合。
該Fc cDNA用PCR擴增法以兩種28個核苷酸引物，G1和G2，和以得自人白血病細胞系ARH-77(ATCC，CRL1621)的多(A)+mRNA作模板獲得。該5′端引物G1(5′-CTCTAGAGACAAAACTCACACATGC-3′)(SEQ ID NO33)和3′端引物G2(5′-GGCGGCCGCCGCACTCATTTACCCGGAG-3′)(SEQ IDNO34)分別含有下標線的Xba I位點和Not I位點。將這樣獲得的Fc cDNA亞克隆入質粒pBluescript II KS(+)的Xba I和Not I位點。該cDNA片段用ABI270A測序儀(Applied Biosystems Inc.，CA)測序。該Fc cDNA編碼Asp殘基開始序列，該殘基位於鉸鏈區三個Cys殘基的第一個位(Ellison，et al.，Nucl.Acids Res.，104071，1982)。該cDNA於pro-CT區後框架內被插入pMEpro-CT。1.該嵌合蛋白的分泌和分裂為了檢測由pro-CT區和Fc片段構成的融合蛋白是否能從質粒轉染的COS-1細胞以分泌形式而產生，使用含有編碼僅帶有二元Lys-Arg殘基的pro-CT cDNA的嵌合質粒。將用抗-人IgG轉染的細胞培養物上清液作免疫印跡分析表明非還原條件下，約66KDa分子量處，還原條件下，37KDa分子量處才能檢測到融合蛋白。用pMEpro-CT質粒DNA轉染的細胞培養物上清液作類似的免疫印跡分析證實不產生對抗-IgG CT具活性的蛋白。
根據非還原形式下主要蛋白的分子大小是還原形式下的此分子大小的約2倍這一發現，假設該融合蛋白必須作為二聚物蛋白被合成。由於在該pro-CT區中無Cys殘基存在，所以此二聚物可由Fc片段的鉸鏈區中的Cys殘基間形成的二硫化物鍵產生。儘管如此，該蛋白的分子大小(作為二聚物是66KDa，作為單體是37KDa)表明該蛋白代表由pro-CT和Fc片段構成的融合蛋白，而不是成熟的Fc片段。
藉助不同的分裂型主將嵌合cDNA轉染入COS-1細胞，來測定加工效率。免疫印跡分析表明當嵌合質粒在裂解位點含編碼二元Lys-Arg型主的Pro-CT cDNA時由適宜的蛋白水解裂解而釋放的Fc片段檢測不到。全部分泌的與抗IgG CT抗體反應的蛋白是還原條件下的37KDa融合蛋白。除Lys-Arg型主外，凡融合蛋白在P6位有Arg殘基時，也獲得類似的結果。除Lys-Arg型主外凡該融合蛋白於P4位有Arg殘基時，也在被轉染的COS-1細胞中檢測到Fc片段。然而，成熟Fc片段僅代表能與抗-IgG反應的分泌蛋白的小部份。相反在pro-CT的羧基端的P4和P6位都有Arg殘基的融合蛋白被最有效地處理使之分泌出成熟Fc片段。當用嵌合質粒轉染COS細胞以便形成帶有Arg-pro-Arg-Ser-Lys-Arg裂解型主的融合蛋白時，在上清液中，測到微量融合蛋白，和大量此融合蛋白片段以及大量成熟的Fc片段。這結果表明COS細胞提供了識別Arg-X-Arg-X-Lys-Arg序列的加工酶。2. pMEpro-CT質粒對表達生物活性重組體GIF的用途由於上述對Fc片段分泌作用的實驗表明，在COS細胞中，設想的毛皮素類酶的分裂型主是Arg-X-Arg-X-Lys-Arg，所以將該序列用於形成生物活性重組體GIF。利用CT1和CT2引物進行PCR擴增pro-CT cDNA(見表X)，然後將此擴增的cDNA插入PME-pro-CT質粒中。通過上述針對SRαhcGIF的方法，將人GIF cDNA引入該質粒中，而後與pro-CT cDNA融合。該質粒轉染入COS細胞導致了13KDa GIF的分泌。
實施例14提純於哺乳動物細胞中表達的重組體GIF產物為進行親和性提純，按製造商推薦的程序，將單克隆抗人GIF，388F1(Thomas，et al.，J.Immunol.，148729，1992)，或抗重組體鼠GIF的多克隆兔抗體與Affigel10(Biorad)，或HiTrap NHS-激活的柱(Pharmacia)偶聯。單克隆抗體(2-3mg)或多克隆抗血清的球蛋白級分(8-12mg)與1ml凝膠偶聯。
在4℃，於該免疫吸附劑上進行培養物上清液的分級。以超濾將COS-1細胞的培養物上清液濃縮10-20倍，而後將10-15體積該濃縮上清液通過1體積的免疫吸附劑柱過夜。若濃縮物體積有限時，則將2-4體積的上清液與1體積免疫吸附劑混合過夜，而後將此懸浮液填入該柱中。此柱用7-10柱體積的PBS洗滌，而殘留在該柱中的蛋白用3-4柱體積的甘氨酸HCl緩衝液(pH3.0)洗脫。在用Tris緩衝液將pH調到7-8之後，用SDS-PAGE分析此試樣，而後通過銀染色或用多克隆抗重組體GIF的Western印跡法測GIF。部分洗滌級分和酸性洗脫級分以RPMI1640培養液透析以便作生物檢測。酸性洗脫液級分中的13KDa蛋白的純度高於90％。
此外，哺乳動物細胞衍生的GIF用常規的柱層析法提純。在此例中，100ml COS-1上清液被濃縮10倍，然後於PBS平衡的TSKG2000SW(Toyo Soda)柱(21.5×600mm)上樣。該柱於室溫下以3ml/分的流量運行。正如採用多克隆抗GIF抗體進行Western印跡測定結果所示，GIF在估計為低分子量級分中洗脫。合GIF的各級分被匯集，而後用超濾濃縮，然後於20mM Tris HCl緩衝液(pH8.0)平衡的TSK DEAE-5PW(Toyo Soda)柱上樣。該柱以0.5ml/分的流量於室溫下運行。上樣之後，用相同的緩衝液洗此柱，並且在此洗滌步驟中回收GIF。E.coli衍生的GIF和COS-1衍生的GIF之間在與DEAE結合能力方面的差異，可用存在O-連接的糖基化或磷酸化來解釋。
用Vydac Protein C4逆相柱(The Separations Group)(4.6×150mm)進行GIF的進一步提純。將得自DEAE柱的GIF級分(10ml)於100mM乙酸銨緩衝液平衡的C4柱上樣，然後以0.4ml/分的流量，於室溫用柱緩衝液中0-90％的乙醇梯度液提純GIF。GIF洗脫入含50-60％乙醇的級分中，而後通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳和用多克隆抗GIF抗體的Western印跡對其鑑定。
實施例15重組體GIF的生物活性A.重組體GIF的GIF活性的評價用測試樣的使鼠T細胞雜交瘤12H5細胞從產生糖基化IgE-結合因子(IgE-BF)轉換成產生非糖基化IgE-BF的能力來評價重組體人GIF的糖基化抑制活性(Iwata and Ishizaka，J.Immunol.，1413270，1988)。在此檢測中，12H5細胞與10μg/ml小鼠IgE，在有或沒有測試樣品存在時培養24小時。經CF50A膜過濾培養物上清液以去除IgE。將此濾液通過小扁豆植物凝血素Sepharose柱，而後用2柱體積的DPBS洗此柱。殘留在此柱上的蛋白用0.2Mα甲基甘露糖苷洗脫。與洗液合併的流過物級分和洗脫液級分分別以DPBS透析二天，而後將各級分濃縮。IgE-BF在各級分中的存在通過前述的方法(Yodoi，et al.，J.Immunol.，124425，1980)以某一級分對帶有以IgE包覆固定的牛紅細胞的FcεR+B細胞形成玫瑰花結能力的抑制來評價。被線蟲，鉤蟲brasiliensis感染的大鼠腸繫膜淋巴節細胞被用作FcεR+細胞的來源。當12H5細胞與小鼠IgE單獨培養時，基本上由該細胞產生的全部IgE-BF都與小扁豆植物凝血素Sepharose結合，而且通過甲基甘露糖苷洗脫而回收。這樣，流出物/洗脫液餾份間的玫瑰花結抑制百分比小於0.2。如果將足量的GIF和小鼠IgE一起加到12H5細胞培養物中，則由此細胞所形成的IgE-BF的大部不存留於該小扁豆植物凝血素Sepharose中，並自流出物級分中回收。這樣，如果流出物/洗脫物級分間的玫瑰花結抑制百分數之比為2.0或更高，則試驗樣品中的GIF記為(+)。
與質粒SRαhcGIF和SRα-furin共轉染的COS-1細胞的培養物上清液有使12H5細胞從產生糖基化IgE-BF轉換到產生非糖基化IgE-BF的能力。當用上述方法對20倍濃縮培養物上清液的一系列稀釋液作GIF活性的評價時，該活性於1∶100的稀釋液中測得。將濃縮上清液的4ml等分試樣在2ml388F1(單克隆抗-GIF)偶聯的Sepharose上分級；基本上全部活性物(＞75％)回收於酸性洗脫液級分中，其中只測到13KDa肽。用Western印跡鑑定出該蛋白是GIF。流過物和酸性洗脫液級分中的GIF生物活性滴定表明，該流過物級分中的活性物比洗脫液級分中回收的活性物1/10還小。要能檢測出GIF活性則在洗脫液級分的最大稀釋液中13KPa蛋白的濃度約為10ng/ml。
得自388F1Affigel的酸性洗脫液級分，在與多克隆抗重組體mGIF的γ球蛋白級分偶聯的Affigel上進一步分級。該級分中全部GIF生物活性物和13KDa肽均與該免疫吸附劑結合，並回收於酸性洗脫物級分中。該級分中的13KDa肽的濃度通過與作為對照物的E.coli衍生rGIF的一系列稀釋液對比而估算。為測定GIF生物活性所必需的該蛋白最小濃度為5ng/ml。此結果綜合地表明，活性重組體hGIF與單克隆抗-人GIF和與抗重組體GIF(13KDa)的多克隆抗體結合，而且可用酸性洗脫回收。
同樣的培養物上清液在與單克隆抗-脂調節素141-B9偶聯的Sepharose上分級。得自該免疫吸附劑的酸性洗脫液級分仍有GIF活性物。
由於以pMEpro-CT-hGIF質粒轉染COS-1細胞可得到人GIF(實施例13，D2)，所以將被轉染的COS細胞的培養物上清液在388F1Affigel上分級，用酸性洗脫回收的13KDa肽進行GIF生物活性鑑定。以此法獲得的10-20ng/ml13KDa肽對GIF活性測定足夠了。此結果表明，實施例13D中所述的方法是形成高度生物活性GIF的有效方法。
為確定重組體hGIF的生物活性是否比得上雜交瘤衍生的GIF的生物活性，將產生GIF的人T細胞雜交瘤，31E9在DMEM中培養，而培養物上清液中的GIF使用與多克隆抗GIF抗體偶聯的免疫吸附劑提純。通過Western印跡估價酸性洗脫液級分中的13KDa GIF的濃度，並用12H5細胞標定該級分測GIF活性。結果表明，5-14ng/ml13KDa肽對使12H5細胞轉變為產生非糖基化IgE-BF是足夠的。因此看來就轉換IgE-BF糖基化能力而言，重組體GIF與雜交瘤衍生的GIF差不多。該實驗還表明，雜交瘤衍生的GIF與抗重組體GIF抗體反應。
由於先前的實驗表明，當用鹼性磷酸酶處理時鼠雜交瘤衍生的GIF生物活性提高了3-10倍(Ohno et al.，Internat，Immunol.，1425，1989)，因此決定研究這種作用對重組體hGIF的生物活性的影響。將牛血清白蛋白以2mg/ml的濃度加至得自388F1-Affigel，親和性提純的rGIF中，然後以含0.1M NaCl的50mM TrisHCl緩衝液(pH8.2)透析。將該製品的一半與足量的不溶性鹼性磷酸酶(Sigma)混合，得到5單位/ml的酶濃度，而後將此懸浮液於室溫下輕輕混合2小時。此後，通過離心分離去除此酶，以RPMI1640培養液透析，然後將鹼性磷酸酶處理過或未處理過的試樣進行GIF活性測定。這些研究表明，未經處理的重組體GIF能以1∶30，稀釋度轉變12H5細胞使產生非糖基化IgE-BF，而以1∶60稀釋度則不能，同時鹼性-磷酸酶處理過的試樣中的GIF活性可於1∶200的稀釋度測得。
將E.coli轉化而得，或以質粒SRαhGIF轉染COS-1而得的重組體GIF製品，進行生物活性比較。由E.coli可溶級分衍生的提純GIF(見實施例10A)，在388F1-Affigel，或多克隆抗-GIF偶聯的Affigel上進一步分級，而後以酸性pH值洗脫而回收。
全部製品都在SDS-PAGE中給出13KDa單一帶。通過銀染色評估13KDa GIF的濃度，並用12H5細胞標定親和性提純GIF的GIF生物活性。該結果表明，要使細胞從產生糖基化IgE-BF轉變為產生非糖基化IgE-BF，需要100-200ng/ml GIF。得自以質粒SRα-hGIF轉染的COS-1細胞培養物上清液的GIF，還用S88F1-Affigel提純，而後作GIF活性評估。對於轉換12H5細胞而言，該13KDa GIF的最低濃度約為150ng/ml(表XI)。
表XI親和提純重組體GIF的生物活性重組體免疫吸附劑 濃度aGIF-13KDa蛋白GIF 標定b的最低濃度cμg/ml ng/mlhcGIF 388F1 0.8 1∶100 8388F1接著 0.2 1∶40 5是多抗-GIF141B9 0.1 1∶10 10hGIF 388F1 1.5 1∶10 150E.coli- 388F1 2.0 1∶20 100衍生的GIF 未分級的 10.0 1∶10 1000多抗-GIF 2.0 1∶10 200a)各製品中的13KDa GIF蛋白濃度，以SDS-PAGE評估。b)用12H5細胞標定該製品的GIF活性。c)為使12H5細胞從形成糖基化IgE-BF，轉換到形成非糖基化IgE-BF所需的13KDa的最低濃度。B.巨噬細胞移動抑制活性的缺少由於GIF和MIF間cDNA核苷酸序列同源(Weiser，et al.，Supra，1989)，所以以GIF作MIF活性檢測。人MIF抑制人單核細胞，豚鼠和小鼠的巨噬細胞的遷移，因此，用小鼠巨噬細胞確定重組體hGIF活性。將3ml消毒礦物油腹腔內注射入正常的BALB/c小鼠中，三天後回收腹腔滲出細胞。經FCS層離心分離回收單核細胞，而含約5×107單核細胞的細胞沉澱則被懸浮在預熱過的，含15％FCS的DMEM中的50μl0.35％瓊脂糖中。將1μg此懸浮液滴分散入平底96井微滴板各井的中心，該井在冰上保持5分鐘。將含15％FCS的DMEM與欲被檢測的樣品，以100μl總體積加到各井中。一種試樣作3或4次同樣檢測。用例象顯微鏡測量各液滴的直徑。培育20-24小時後，測出移動細胞外區直徑，而且計算出移動指數。用下面公式計算移動抑制百分比移動抑制百分數＝[1－測試樣品的移動指數/無樣品的移動指數]×100用鼠γ-幹擾素作陽性對照物評估rhGIF的MIF活性。用SRα-hcGIF和SRα-hfurin共轉染的COS-1細胞得到重組體hGIF的系列稀釋物，然後如上所述用388F1-Affigel進行親和性提純。即使該製品的GIF效價為1∶100，而最終以1∶8或1∶4稀釋度也未測到明顯的巨噬細胞移動。在同樣實驗中，1單位/ml IFNγ可抑制20-48％的巨噬細胞移動。
用瓊脂滴中的人單核細胞(Remold.H.G and Menddis，A.D.，Methods in Enzymology，116379，1985)用人MIF作陽性對照物證實了此結果。能使12H5細胞變得能形成未糖基化IgE-BF(以1∶100的稀釋度)，並含約0.8μg/ml13KDa GIF肽的該重組體hGIF，卻不能以1∶5的最終稀釋度抑制人單核細胞的移動。此結果表明在生物活性方面rhGIF與MIF不同。
實施例16用重組體hcGIF體外產生抗原特異性抑制T-細胞先前的實驗已表明，得自大鼠-小鼠T細胞雜交瘤23A4細胞的GIF有利於從已接觸抗原的脾細胞產生抗原特異性抑制T細胞(Iwata，M.and Ishizaka，K；J.Immunol，1413270，1988)。當為產生IgE抗體反應而用明礬吸附的卵清蛋白給BDF1鼠免疫接種時，它們的脾細胞主要分泌糖基化增強因子(GEF)，並因抗原刺激產生IgE增效因子(糖基化的IgE-BF)和結合抗原的GEF。如果該已接觸抗原的脾細胞被卵清蛋白刺激，而抗原刺激的T細胞由IL-2在有GIF存在時繁殖，則此細胞分泌GIF。由於抗原刺激，這些細胞產生非糖基化IgE-BF和結合抗原的GIF，其後者以載體特異性方式抑制同源小鼠對DNP-OVA的抗體反應。為了更完全地研究此現象，決定確定重組體hcGIF是否有離體產生生成GIF的T細胞的能力。
用1μg吸附於氫氧化鋁凝膠上的卵清蛋白(OVA)激發BDF1鼠以便產生IgE抗體反應。免疫後兩周得到脾細胞，而懸浮液(5×106細胞/ml)用10μg/ml OVA培養三天以便激活已由抗原引發的T細胞。抗原激活細胞的等分試樣(2.5×105細胞)用重組體鼠IL-2(50單位/ml)在有或無rhcGIF(0.25μg/ml)時繁殖。培養4天後，回收細胞，洗滌3次，以1.5×106細胞/ml的濃度再懸浮於新鮮培養基中。4ml從GIF(+)或GIF(-)培養物中回收的該細胞懸浮液，與8×105OVA激發的，有Iab和Iad的LB27.4細胞一起培育24小時，(美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD)。抗原刺激的T細胞的培養物上清液用IgE偶聯的Sepharose吸附，而IgE-BF通過酸性洗脫自此免疫吸附劑回收。然後得自該IgE-Sepharose的流過物級分在OVA偶聯的Sepharose上分級。而結合OVA的因子用甘氨酸-HCl緩衝液(pH3.0)洗脫而回收。得自IgE-Sepharose的洗脫物(即，IgE-BF)在小扁豆植物凝血素Sepharose上分級以便確定該因子的性質。表XII中所示結果表明，得自單獨用IL-2繁殖的T-細胞的IgE-BF的大部分結合於小扁豆植物凝血素Sepharose，而後用α-甲基甘露糖苷洗脫而回收。相反，在有hcGIF存在時用IL-2繁殖的T-細胞形成非糖基化的IgE-BF，它是不能在小扁豆植物凝血素Sepharose上存留的。
也評估GEF或GIF活性物與結合OVA的因子的聯合。由於抗原刺激，單用IL-2繁殖的T-細胞形成結合OVA的GEF，而在有重組體GIF存在時繁殖的T-細胞則形成結合OVA的GIF(表XII)。已表明，得自這種T細胞的結合OVA的GIF能以抗原(載體)特異性的方式抑制BDF1小鼠的抗體反應(Iwata，M.and Ishizaka，K；J.Immunol.，1988)。因此，該重組體GIF有利於抑制T細胞的產生，該細胞產生抗原特異性抑制T細胞因子。
表XII以重組體hcGIF和IL-2生成產生GIF的細胞繁殖OVA特異性 IgE-BF的特性b結合OVA的因子cT細胞aGEF GIFIL-24/28 + -IL-2+hcGIF 26/6 - +a在有或無重組體hcGIF存在時，用IL-2繁殖抗原刺激的T細胞。b用IL-2繁殖的T細胞由抗原激發的LB27.4細胞刺激。上清液中的IgE-BF在小扁豆植物凝血素Sepharose上分級。數字代表流出物/洗脫液級分(分別得自小扁豆植物凝血素Sepharose)的玫瑰花結抑制百分比。c得自OVA-Sepharose的酸性洗脫液級分，分別用12H5細胞和23A4細胞作GIF和GEF活性評估。
實施例17重組體GIF的體內活性重組體GIF的體內活性先前的實驗已表明重複注射產生GIF的雜交瘤的培養物濾液的GIF富集級分於經免疫接種的鼠中，導致對IgE和IgG抗體反應的抑制，注射開始於接觸抗原之日(Akasaki，M.，et al.，J.Immunol.，1363172，1986)。為確定在體內重組體GIF是否具有同樣效果，用實施例10和14中所述方法提純表達於E.coli中的rhGIF(實施例10A)，和表達於COS-1細胞的rhGIF(實施例13A)至均一，然後評價它們抑制IgE和IgG1抗體反應的能力。通過i.p注射吸附於2mg明礬的0.2μg DNP-OVA給BDF1鼠免疫接種。重組體GIF於0、2、4、6、8、10及12天i.p.注射，然後通過ELISA測定血清中的抗-DNP抗體。
在此第一個實驗中，PBS中的E.coli衍生的rGIF以每次注射18μg的劑量施用，而對照鼠只接受PBS注射。使12H5細胞從形成糖基化IgE-BF轉換到形成非糖基化IgE-BF的最小rGIF濃度約為1μg/ml。
在對照和GIF處理的小鼠中，IgE抗體滴度在2周時達到最大值，然後下降，而IgG1抗-DNP抗體滴度在免疫接種後4-5周內持續上升。因此，2周時的IgE抗體滴度和4周時的IgG1抗體滴度被用於進行GIF處理組和未處理組間的對比。E.coli衍生的rGIF的效果試樣N抗-DNP IgEaIgG1b對照66.7±3.5 78.0rGIF31.5±1.3(p＜0.05)4.5a免疫接種(μg/ml)後二同b免疫接種(μg/ml)後四周。
第二個實驗中，將用SRα-hcGIF載體表達的，COS-1衍生的rhGIF，以每次注射2.5μg的劑量經腹膜給藥。能轉換12H5細胞使其形成非糖基化IgE-BF的hGIF最小濃度為0.2μg/ml。對照鼠僅用PBS注射。其結果示於下表哺乳動物細胞系衍生的rGIF的效果試樣N抗-DNP IgEa(μg/ml)對照826±1.2rGIF50.70±0.55(p＜0.05)a免疫接種後2周沒有動物對GIF有不良反應。該實施例說明GIF的免疫抑制效果。
實施例18產生對抗原-特異性糖基化抑制因子的mABA.原料和方法1.抗原和抗體冷凍乾燥的峰毒磷脂酶A2(PLA2)得自Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO。結晶的卵清蛋白(OVA)得自NutritionalBiochemical Corp.，Cl eveland，OH。相應於PLA2分子中的胺基酸殘基13-28和25-40的合成肽由Pr.Howard Grey(Cytel Corp.，La Jolla，CA)提供。與PLA2分子中胺基酸19-35相應的肽由Kirin Pharmaceutical Laboratory，Maebashi，Japan合成。全部合成肽均由HPLC提純，而且其胺基酸序列均被證實。
該單克隆抗人GIF抗體388F1(ATCC HB10472)於實施例5介紹。2.細胞系實施例3中所述人T細胞雜交瘤細胞表達CD3和TCRαβ，而且主要分泌GIF。該細胞在含10％FCS、10％ NCTC135培養基(Gibco，Grand Island，NY)，10mM HEPES緩衝液，0.2μ/ml牛胰島素(Sigma)，50μg/ml丙酮酸鈉，150μg/ml草醯乙酸及抗生素的高葡萄糖DMEM中培養。
產生抗人GIF的B細胞雜交瘤，由已用親和性提純的結合抗原的GIF免疫接種(見後文)的BALB/c小鼠(Jackson Lab，BarHarbor，ME)的脾細胞構建。最後一次加強免疫後一周，通過已公開的方法(Iwata，et al.，J.Immunol.，1321286，1984)使此脾細胞與次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶缺乏的Sp2/0AG14細胞(Schulman，et al.，Nature，271269，1978)融合。通過有限稀釋進行該雜交瘤的亞克隆。該雜交瘤保持在上述的完全DMEM中。3.GIF的分級與提純將無血清培養基中未被刺激的AC5細胞培養物上清液中的非持異性GIF，在DEAE Sepharose柱上用層析法而富集。培養物上清液被濃縮20-100倍。用蒸餾水稀釋3倍，用Tris調到PH8.0，然後通過已用含50mM NaCl的10mM Tris HCl緩衝液(pH8.0)平衡過的DEAESepharose(Pharmacia)柱。流過物級分與用緩衝液洗滌的洗液合併而後濃縮。原來的培養物上清液中的非特異性GIF，用388F1偶聯的Affigel進行親和性提純。濃縮的培養物上清液經此免疫吸附劑再循環過夜。用30柱體積DPBS洗滌後，與此免疫吸附劑結合的蛋白用0.1M甘氨酸HCl緩衝液(pH3.0)洗脫而回收。
為產生結合抗原的GIF，通過CD3的交聯刺激AC5細胞(Thomas，et al.，J.Immunol.，148729，1992)。該細胞(5×106/ml)用5μg/ml單克隆抗-CD3(SPV-T3b)處理30分鐘(於4℃)，然後該抗體處理的細胞於4℃用10μg/ml柱小鼠Ig培育30分鐘。洗滌後，該細胞以2×106細胞/ml重懸浮於ABC培養基中，然後培養24小時。以超濾將培養物上清液濃縮10-15倍，而後經PLA2偶聯的Sepharose柱再循環過夜。該柱用DPBS洗滌，存留於此柱中的蛋白通過0.1M甘氨酸HCl緩衝液(pH3.0)洗脫而回收。
親和提純的GIF通過經與HPLC(Beckman System Gold，Fulteron，CA)連接的Superose12柱(1.6×50cm，Pharmacia)以凝膠過濾而分級。用PBS，以0.85ml/分的流量將蛋白從此柱上洗脫。該柱用BSA(m.w.67,000)、OVA(m.w.43,000)、大豆胰蛋白酶抑制因子(m.w.20,1 00)和細胞色素C(m.w.12,500)校定。在某些實驗中，親和性提純的GIF製品被還原及烷基化。於含0.15M NaCl的，0.05M Tris HCl緩衝液中將該GIF製品於室溫下，用10mM的二硫蘇糖醇培育1小時，而後用30％摩爾超量碘乙醯胺烷基化。將此還原和烷基化的試樣於同樣的Superose12柱上樣，蛋白用PBS洗脫。4.ELISA檢測Nunc F板(Max Sorp，Nunc)中的每個井均用50μl GIF製品的系列稀釋液塗覆於4℃過夜，每2井或3井為一組。在以下每個步驟(除加底物前的步驟外)之間用含0.05％Tween20(Sigma)磷酸鹽緩衝鹽水將這些板洗5次。在37℃用於Tween/PBS中的2％BSA將這些板封閉1小時。用一种放大系統測定mAb388F1與GIF的結合將50μl含150ng/ml生物素化的mAb388F1的PBS加於各井中。於37℃培育2小時後，然後洗滌，50μl適當稀釋(1∶6000)的抗生蛋白鏈菌素偶聯的鹼性磷酸酶(Zymed)被加至各井中，而後將此板於37℃培育2小時。此板用含0.15M NaCl的0.05M Tris HCl緩衝液(pH7.5)中的0.05％Tween20洗滌，用50μl鹼性磷酸酶底物培育30分鐘，接著使用放大溶液(GIBGO/Bethesda Research Lab)將ELISA信號顯現。以ELISA閱讀器MR5000(Pynatech)測定490nm波長處的吸收率。
ELISA也用抗結合抗原的GIF進行。在Max Sorp板被GIF製品塗覆和用BSA封閉後，將50μg溶於PBS的mAb(200ng/ml)加於各井中，將該板於37℃培育2小時。視具體所試該mAb的同型物而異，或者將1∶3000稀釋度的辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的山羊抗小鼠IgM(Biorad)或抗小鼠IgG(Zymed)加至各井，或者將1∶2000稀釋度的HRP-偶聯的抗小鼠IgG+A+M(Zymed)加至各井中。通過過氧化物酶底物(Zymed)顯影ELISA信號，而後測定405nm波長處的吸收率。5.SDS-PAGE及免疫印跡將親和性提純的GIF以0.01％SDS透析，而後冷凍乾燥。試樣用Laemei系統，以15％聚丙烯醯胺板狀凝膠進行SDS凝膠電泳分析(Leamei，U.K.，Nature，227680，1980)。通過銀染色檢測蛋白帶(Ochs，et al.，Electrophoresis，2304，1981)。為進行免疫印跡，在還原的條件下分析親和性提純的GIF。提純的重組體GIF(得自E.coli)同時進行電泳，作為標準。SDS-PAGE凝膠中的蛋白於PVDF膜(Immobilon-P Milipore)上進行印跡分析，並用Blocker Blotto(Pierce)於4℃培養過夜而將該膜阻斷。在用pH7.5的溶於PBS中的0.05％Tween20溶液洗滌後，用兔抗-rGIF的1μ/ml IgG級分處理此膜1小時(37℃)。兔IgG與蛋白帶的結合使用HRP偶聯的驢抗兔IgG和ECL Western印跡測定試劑(Amersham)，接著再用放射自顯影法檢測。X射線底片上的rGIF帶位置被用作14KDa標準。B.製備對結合抗原的GIF具特異性的單克隆抗體用抗CD3，接著用抗MGG處理AC5細胞，而後用PLA2偶聯的Sepharose親和性提純該上清液中的結合抗原的GIF。該製品可於1∶30-1∶60的稀釋度使12H5細胞從產生糖基化IgE-BF轉換到產生非糖基化IgE-BF。通過i.p.注射0.1ml於CFA中的此製品，接著再5次增強注射不完全弗氏佐劑中的同樣抗原給BALB/c小鼠免疫接種。最後一次增強注射後2周，將此動物殺死，而後將其脾細胞與B細胞系SP2/OAG14融合。
檢測雜交瘤培養上清液的鼠Ig的存在。這些產生Ig的雜交瘤通過ELISA檢測進一步檢驗其抗-GIF的存在。Maxi-Sorp各井被結合PLA2的GIF塗覆，而該培養物上清液中的小鼠Ig與GIF塗覆井的結合用HRP偶聯的抗-鼠IgG+A+M確定。8種雜交瘤培養物上清液通過ECISA給出實質性的ELISA吸收率。8種雜交瘤上清液中抗GIF抗體的存在，用每種培養物上清液培養親和提純的，結合PLA2的GIF，接著將此混合物經Centricon100(Amersham)過濾而證實。將該濾液進行GIF活性檢測表明，得自所有8種雜交瘤的抗體都與GIF結合，而結合PLA2的GIF濾液本身具有活性。
然後檢查相同培養物上清液的抗非特異性GIF的單克隆抗體存在。Maxi-Sorp板以親合性提純的非特異GIF或抗原特異GIF塗覆，然後將每種B細胞雜交瘤的培養物上清液加到各井中。於37℃保溫2小時後，洗滌各井，將1∶2000稀釋度的HRP偶聯山羊抗小鼠IgG+A+M加入各井中通過過氧化物酶底物將ELISA信號顯影，再於405nm波長處測量。減去以GIF塗覆，並用HRP偶聯的抗體和底物培育的對照井的吸收率。該實驗結果表明，只有兩種雜交瘤，即110和205，由於有結合PLA2的GIF(即抗原特異GIF)而給出實質上高於抗原非特異GIF引起的信號。通過有限稀釋，使雜交瘤110和205亞克隆，而每個克隆的培養物上清液再通過ELISA試驗測定單克隆抗體與結合PLA2的GIF之間的選擇性結合。在反覆亞克隆後，獲得兩種雜交瘤，即110BH3和205AD2的各亞克隆，其培養物上清液僅當具結合抗原的GIF時才給出ELISA信號。單克隆抗體110BH3是μk同型，而205AD2是。μk同型。
兩種單克隆抗體都結合PLA2特異性GIF，但不能結合非特異的GIF，可以生物檢測法來加以證實。GIF製品的等分試樣用110BH3細胞或205AD2細胞的培養物上清液培育過夜，然後將該混合物經Centricon過濾。用12H5細胞測定該濾液中GIF活性表明，兩種抗體均與結合PLA2的GIF結合，但不能與非特異GIF結合。接著，用1/3飽和度的硫酸銨液使其沉澱而自該雜交瘤培養物上清液中富集mAb110BH3，並將5mg IgM與1.5ml Sepharose偶聯。將該得自AC5細胞的結合PLA2的GIF和非特異性GIF，在抗體偶聯的Sepharose上分級。通過在PLA2偶聯Sepharose上親和性提純。由抗CD3處理的AC5細胞培養物上清液製備結合PLA2的GIF，而非特異性GIF則用388F1偶聯的Sepharose，由未經刺激的AC5細胞培養物上清液製備。表XIII中所示的結果表明，結合PLA2的GIF與免疫吸附劑結合，並通過酸pH值洗脫而回收，而非特異GIF不能存留在此免疫吸附劑上。
表XIII在110BH3偶聯的Sepharose上分級GIF製品a得自免疫吸附劑的結合PLA2的GIF 非特異性 GIF級分b稀釋度GIF活性c稀釋度 GIF活性c未分級 1∶10 25/0(+) 1∶30 28/0(+)流過物 1∶2 0/30(-) 1∶30 29/4(+)洗液 1∶2 0/23(-) 1∶2 3/32(-)洗脫液 1∶10 25/0(+) 1∶2 0/30(-)培養液對照 0/33 1/30a結合PLA2的GIF和非特異的GIF可分別以1∶10和1∶30的稀釋度，使12H5細胞從形成糖基化IgE-BF轉換成形成非糖基化IgE-BF。b1ml GIF製品與0.25ml110BH3偶聯的Sepharose混合。將流過物級分和1ml含DPBS的洗液合併(流過物級分)。用5mlBPBS洗柱(洗液)，而用pH3.0的1ml甘氨酸HCl緩衝液洗脫(洗脫液)。透析後，每個級分都濃縮至1.0ml以便作GIF檢測。c用12H5細胞確定GIF活性。列中的數字表示得自小扁豆值物凝血素Sepharose的流出物/洗脫液級分的玫瑰花結抑制百分比(c.f法)，(+)(-)表示GIF活性的存在與否。
作過種種用ELISA檢測該結合抗原的GIF和非特異性GIF的嘗試。用在DEAE-Sepharose柱上的離子交換柱層析法分級未刺激AC5細胞培養物上清液，富集非特異性GIF。帶有含50mM NaCl的Tris緩衝液的流過物級分被濃縮。抗CD3刺激細胞的培養物上清液中的結合抗原因子，用PLA2偶聯的Sepharose提純，而酸性洗脫液中的因子在110BH3偶聯的Sepharose上再分級。抗原特異性和非特異性GIF製品使12H5細胞從形成糖基化IgG-BF轉換到形成未糖基化IgE-BF，稀釋度為1∶60。接著，Max-Sorb井用該製品之一種的系列稀釋液塗覆，而且，封閉後，將388F1或110BH3塗於該井。非特異性GIF和結合抗原的GIF製品使mAb388F1均給出ELISA信號，而mAb110-BH3隻與結合抗原的因子反應，卻不與非特異性GIF反應。因為在該檢測中，當mAb以不相關IgG2a或IgM置換時便沒有信號被檢出，那麼看來ELISA信號是由於mAb的特異性結合而出現。
用PLA2-Sepharose接著用110BH3-Sepharose得到了親和提純的上述結合抗原的因子，並通過SDS-PAGE分析此製品。用PLA2-偶聯Sepharose，接著用110BH3偶聯的Sepharose提純結合抗原的GIF。得自該免疫吸附劑的酸性洗脫液級分在有0.01％SDS存在時以蒸餾水透析，然後冷凍乾燥。通過在還原和非還原條件下進行SDS-PAGE和銀染色分析該製品。在非還原條件下，該製品給出了三個主帶85KDa、66KDa、58KDa及一個次帶13KDa。在還原條件下，85KDa帶消失而測到若干新帶。由於在還原條件下測到的主帶之一是14KDa該遷移率相當於非特異性GIF的遷移率，於是進行分析，以確定此帶是否為GIF。通過在110BH3-Sepharose上的親和性色譜法從抗CD3刺激的AC5細胞培養物上清液中得到結合抗原的GIF的另一製品。使用12H5細胞從免疫吸附劑的流過物級分和酸性洗脫液級分的系列稀釋液中標定GIF活性表明該培養物上清液中GIF活性物大部分與該免疫吸附劑結合，而且通過酸性洗脫被回收。在該洗脫液級分的1∶30稀釋液中測得活性，而該流過物級分都給出1∶6的GIF效價。如表XIV中所示，mAb110BH3和205AD2二者均使該洗脫液級分給出ELISA信號。而流出物級分以該抗體給不出明顯ELISA信號。然而當使用對非特異性GIF的抗體(388F1)時，儘管洗脫液級分含濃度非常高的GIF，而流過物級分仍可給出弱的，但明確的ELISA信號。然後在還原條件下進行SDS-PAGE，接著用抗rGIF的多克隆抗體作免疫印跡試驗分析該洗脫液級分。將得自E.coli的重組體GIF塗於同樣凝膠的下一個井中。在還原條件下電泳後，凝膠中的蛋白被轉移到PVDF膜，該膜隨後用抗rGIF的γ球蛋白級分處理。在兩種膜中，被用作對照物的rGIF在X光底片上給出清晰的譜帶(未示出)。由於分子量標誌不包括任何小於18KDa的蛋白，所以在X射線底片上的rGIF帶被用作13KDa標誌。該結果表明，該抗體確實與13KDa帶結合。13KDa帶和非特異GIF間的關係通過分析非特異GIF而確定，該GIF是自未經刺激AC5細胞培養物上清液中，以親和性層析法(在388F1偶聯的Sepharose上進行)提純的。通過SDS-PAGE和用抗-rGIF抗體的免疫印跡分析此非特異GIF製品表明，該製品也含與此抗體反應的13KDa蛋白。
表XIVGIF活性和GIF抗原在得自110BH3-Sepharosea的流過物和洗脫液級分間的分布得自110BH3- GIFb效價ELISA信號Sepharose的級分 205DA2c110BH3c388F1d流過物 1∶3 0.0630.0930.36酸性洗脫物 1∶150.7501.0680.86a抗CD3處理細胞培養物上清液被濃縮然後在110BH3-Sepharose上分級。各級分被濃縮至濃縮上清液的原體積，稀釋2倍而後滴定GIF活性和進行ELISA檢測。b使12H5細胞從產生糖基化IgE-BF轉換成產生非糖基化IgE-BF的級分的最大稀釋度。c在405nm波長處的吸收。d在490nm波長處的吸收。
假定13KDa GIF和結合抗原的多肽鏈彼此聯合形成結合抗原的GIF。如果情況如此，那麼在生理學條件下，結合抗原的GIF的分子量要大於非特異性GIF的分子量。為檢驗這種可能性，將得自AC5細胞的結合PLA2的GIF用110-BH3-Sepharose部分提純，而該製品經Superose12柱凝膠過濾被分級。各級分用mAb388F1和110BH3作ELISA分析，測定結合抗原的GIF。結果表明，用mAb388F1測出的GIF大部分是55.5和60.5分之間從該柱洗脫的，峰值在58.5分。該分子量，從其洗脫時間估計，是74KDa。正如預料的一樣，用12H5細胞進行生物檢測該級分含GIF活性。應注意到由於mAb110BH3，該含GIF的級分給出ELISA信號。此結果有力地說明，由mAb388F1所識別的抗原決定簇和由mAb110BH3所識別的抗原決定簇與同樣的分子相聯合。
如果結合抗原的GIF確實由結合抗原的鏈和非特異性GIF構成，那麼該結合抗原的GIF可通過還原和烷基化處理被分解成單獨的多肽。
為探討這種可能性，將親和性提純的結合抗原的GIF於10mM DTT中還原。用碘乙醯胺烷基化後，將此試樣於相同的Superose12柱上樣，然後通過ELISA確定388F1-抗原和110BH3抗原的分布。此結果表明，被還原和烷基化的原料中的GIF約一半被回收於其洗脫時間與15KDa分子相應的級分中。由於當原始的結合抗原的GIF被分級時，同樣的級分卻不含GIF，所以15KDa看來是由此結合抗原的GIF衍生的。此實驗還表明，由110BH3所識別的分子的兩個峰值，若第一峰與原始的結合抗原的GIF相應，而第2峰的洗脫時間則與62-64KDa相應。由於用ELISA測定後一級分不含顯著量的GIF，那麼此級分中的蛋白應是引起抗原特異結合的結合抗原的GIF的裂解產物。C.結合抗原的GIF的抗原決定簇特異性曾進行一些實驗來證明結合PLA2的GIF對峰毒PLA2是特異性的。從抗CD3刺激的AC5細胞的培養物上清液中，用PLA2偶聯的Sepharose，繼以酸性pH洗脫結合的蛋白，提純該結合抗原的GIF。將該製品的等分試樣與OVA-偶聯的Sepharose混合過夜，然後測定流過物和洗脫液級分中的GIF活性。正如期望的那樣，基本上全部GIF活性物不能在OVA-Sepharose中存留，而是回收於流過物級分中。用DPBS洗OVA-Sepharose，而後用甘氨酸-HCl緩衝液(pH3.0)洗脫該免疫吸附劑。然而在該酸性洗脫液級分中未測到GIF活性。
由於前面對得自鼠Ts雜交瘤383的結合PLA2的GIF所作實驗已表明，該因子具有與代表蜂毒PLA2分子中的胺基酸殘基19-34的肽的親和活性，因此決定研討得自AC5細胞的人結合抗原的GIF是否可與偶聯了代表PLA2分子中的胺基酸19-35之合成肽的Sepharose相結合。如表XV中所示，基本上該製品中全部GIF活性物都被p19-35Sepharose吸收，並通過酸性pH的洗脫而回收。為證實抗原決定簇特異性，用0.2mg/ml代表胺基酸13-28、19-25或25-40的合成肽培育結合PLA2的GIF的等分試樣6小時，每種混合物均被PLA2-Sepharose吸附。測定流過物級分和酸性洗脫液級分中的GIF活性表明，GIF與PLA2-Sepharose的結合被p13-28或p19-35所阻斷，但不被p25-40阻斷(表XV)。該結果被ELISA證實。當結合PLA2的GIF在存在或不存在p25-40的情況下均被PLA2-Sepharose吸附時，得自該免疫吸附劑的酸性洗脫液級分以110BH3可給出ELISA信號。而同時該流過物級分則不給出此信號。如果在有p19-25存在時，同樣的結合PLA2的GIF被相同免疫吸附劑吸附，那麼，該流出物級分，而不是酸性洗脫級分採用單克隆抗體可給出ELISA信號。綜合這些結果表明，PLA2分子中的胺基酸 9-28的序列含有被結合抗原的GIF所識別的抗原決定簇。
表XV結合PLA2的GIF的抗原決定簇特異性例 免疫吸附劑 所加的肽GIF活性c流過物級分 洗脫液級分1aPLA2-Sepharose 無 2/28(-) 23/6(+)P19-35-Sepharose 無 3/30(-) 28/4(+)培養液對照無 4/28——2bPLA2-Sepharose 無 0/28(-) 27/3(+)P13-28 22/0(+) 0/23(-)P19-35 20/5(+) 0/28(-)P25-40 2/25(-) 23/0(+)培養液對照無 3/24——a其GIF效價為1∶10的6ml得自PLA2-Sepharose的酸性洗脫液級分，是在1.5ml與p19-35偶聯的Sepharose上分級的，每種流過物、洗滌液和酸性洗脫液級分都被調到6.0ml，而其GIF活性用12H5細胞測定。b其GIF效價為1∶30的，得自PLA2-Sepharose的酸性洗脫液級分的0.5ml等分試樣，與0.5ml PLA2-Sepharose，在有或沒有適宜的肽存在時混合過夜。得自PLA2-Sepharose的流過物級分和酸性洗脫液級分均被調到1.0ml，以RPMI1640培養液透析，然後作GIF活性測定。將1ml12H5細胞懸浮液與等體積的欲被檢測的試樣混合，然後在有IgE存在時培養。c此值代表得自小扁豆植物凝血素Sepharose的流出物/洗脫液級分的玫瑰花結抑制百分數。(+)(-)表示存在或不存在GIF。材料的保藏下列細胞系已在美國典型培養物保藏中心，1301RarklawnDrive，Rockvill，MD，USA(ATCC)保藏
細胞系ATCC 入藏號保藏日388F1HB 10472May31，1990AC5 HB 10473May31，199031E9 HB 11052June2，1992110BH3HB 11345May14，1993這些寄存根據Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganism for thePurpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder(Budapest Treaty)條款進行，該條款保證存活培養物從保藏之日起保持30年。一旦相關之US專利公告，或對任何美國或外國應用專利之公眾公開，無論哪一項先行公開，則任何公眾可根據保證公眾對該培養物後代享有永久和不受限制的獲取權的該布達佩斯條約，通過ACTT，均能獲得該生物體，並能保證根據35USC§122所授權的美國專利和商標局局長及按局長的具體執行規則所指定的個人，享有對該培養物後代的獲取權(包括具體與886OG638相關的37CFR§1.14)。
本申請的受託人已同意，如果在適當的條件下培養時該培養保藏物死亡，遺失或損壞，將根據通知立即用同樣的培養物之存活樣品替換。保藏菌種獲取權不能被解釋成可違背經政府當局根據其專利法所授之權利而實施本發明的執照。
上述詳細說明被認為足以使本領域中普通技術人員實施本發明。本發明不限於由已保藏的細胞系所限定的範圍，因為保藏的例子旨在作本發明的某一方面的單一解釋，而任何功能等同的細胞系均在本發明的範圍之中。材料的保藏不構成這樣一種認可；即本文所包含的陳述對使本發明的任何方面都能得以實施是不足的，這包括其最佳模式同時也不被解釋為將權利要求的範圍限制於其所代表的特定的說明之中。確實，除在本文中已展示和陳述過的之外，本發明的各種改變，若本領域中普通技術人員參照以上陳述，將是顯而易見的，而這些改變也落在所附的權利要求範圍之中。
序列概述SEQ ID NO1是肽AP-1的胺基酸序列(第52頁，第2行)；SEQ ID NO2是肽AP-23的胺基酸序列(第52頁，第4行)；SEQ ID NO3是肽AN-4的胺基酸序列(第52頁，第11行)；SEQ ID NO4是肽AN-5的胺基酸序列(第52頁，第12行)；SEQ ID NO5是肽AN-7的胺基酸序列(第52頁，第13行)；SEQ ID NO6是肽T-1的胺基酸序列(第52頁，第21行)；SEQ ID NO7是鼠GIF的N-末端PVDF-固定的蛋白的胺基酸序列(第53頁，第1行)；SEQ ID NO8是用於鼠GIF cDNA克隆的5′→3′引物的核苷酸序列(第53頁，第8行)；SEQ ID NO9是用於鼠GIF cDNA克隆的5′→3′引物的核苷酸序列(第53頁，第10行)；SEQ ID NO10是用於人GIF cDNA克隆的5′→3′引物的核苷酸序列(第56頁，第10行)；SEQ ID NO11是用於人GIF cDNA克隆的3′→5′引物的核苷酸序列(第56頁，第12行)；SEQ ID NO12是用於在鼠GIF cDNA兩端產生AflII和BamHI限制位點的5′→3′引物的核苷酸序列(第57頁，第9和10行)；SEQ ID NO13是用於在鼠GIF cDNA兩端產生限制點位AftII和BamHI的3′→5′引物的核苷酸序列(第57頁，第11行)；SEQ ID NO14是用於在人GIF cDNA上產生BglII或KpnI位點的5′→3′引物的核苷酸序列(第62頁，第6行)；SEQ ID NO15是用於在人GIF cDNA上產生RglII或KpnI位點的3′→5′引物的核苷酸序列(第62頁，第8行)；SEQ ID NO16具有PstI的5′→3′引物的核苷酸序列(第63頁，第21行)；SEQ ID NO17具有PstI的3′→5′引物的核苷酸序列(第63頁，第22行)；SEQ ID NO18，20，和22是用於複製人furin cDNA的5′→3′引物的核苷酸序列(第65頁，第5，7和9行)；SEQ ID NO19，21，和23是用於複製人furin cDNA的3′→5′引物的核苷酸序列(第65頁，第6，8和10行)；SEQ ID NO24是人pro-ct的引物(CT1)的核苷酸序列(第68頁，第4行)；SEQ ID NO25是人pro-ct的引物(CT2)的核苷酸序列(和推斷胺基酸序列)(第68頁，第4行)；SEQ ID NO26是人pro-ct的引物(CT2)的推斷胺基酸序列；SEQ ID NO27是人pro-ct的引物(CT3)的核苷酸序列(和推斷胺基酸序列)(第68頁，第4行)；SEQ ID NO28是人pro-ct的引物(CT3)的推斷胺基酸序列；SEQ ID NO29是人pro-ct的引物(CT4)的核苷酸序列(和推斷胺基酸序列)(第68頁，第4行)；SEQ ID NO30是人pro-ct的引物(CT4)的推斷胺基酸序列；SEQ ID NO31是人pro-ct的引物(CT5)的核苷酸序列(和推斷胺基酸序列)(第68頁，第4行)；SEQ ID NO32是人pro-ct的引物(CT5)的推斷胺基酸序列；SEQ ID NO33是用於分離Fc cDNA的5′端引物，G1的核苷酸序列(第69頁，第11和12行)；SEQ ID NO34是用於分離Fc cDNA的3′端引物的核苷酸序列(第69頁，第13行)；SEQ ID NO35是鼠GIF的核苷酸序列(和推斷胺基酸序列)(圖1)；SEQ ID NO36是鼠GIF的推斷胺基酸序列(圖1)；SEQ ID NO37是人GIF的核苷酸序列(和推斷胺基酸序列)(圖2)SEQ ID NO38是人GIF的推斷胺基酸序列(圖2)。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人La Jolla Institute for Allergy andImmunology(ⅱ)發明名稱生產生物活性多肽的重組體的方法(ⅲ)序列數38(ⅳ)通訊地址(A)收信人Spensley Horn JubasLubitz(B)街道1880Century Park East，Suite500(C)城市Los Angeles(D)州California(E)國家USA(F)郵編90067(ⅴ)計算機可讀型式(A)媒介類型Floppy disk(B)計算機IBM PC compatible(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，Version#1.25(ⅵ)本申請資料(A)申請號PCT(B)申請日1994，5，13(C)分類(ⅷ)代理人/事務所信息(A)姓名Wetherell，Jr.，Ph.D.，John R.
(B)登記號31，678(C)參考/備審號FD-2581(ⅸ)電訊信息(A)電話(619)455-5100(B)傳真(619)455-5110(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度11個胺基酸(B)類型胺基酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅶ)直接來源(B)克隆AP-1(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞肽(B)位置1..11(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Asn Tyr Ser Lys1 5 10(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)股單股
(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅶ)直接來源(B)克隆AP-23(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞肽(B)位置1..20(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2Leu Leu Cys Gly Leu Leu Ser Asp Arg Leu His Ile Ser Pro Asp Arg15 10 15Val Tyr Ile Asn20(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅶ)直接來源(B)克隆AN-4(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞肽(B)位置1..15(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Xaa Asn Gly Ser Thr Phe Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO4的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度13個胺基酸(B)類型胺基酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅶ)直接來源(B)克隆AN-5(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞肽(B)位置1..13(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4Asp Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile Gly Lys1 5 10(2)SEQ ID NO5的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅶ )直接來源(B)克隆AN-7(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞肽(B)位置1..15(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5Asp Arg Leu His Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile Asn Tyr Tyr1 5 10 15(2)SEQ ID NO6的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度11個胺基酸(B)類型胺基酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅶ )直接來源(B)克隆T-1(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞肽(B)位置1..11(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg1 5 10(2)SEQ ID NO7的信息(ⅰ)序列特徵
(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅶ)直接來源(B)克隆N-末端(ⅸ )特點(A)名稱/關鍵詞肽(B)位置1..15(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7Met Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val1 5 10 15(2)SEQ ID NO8的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度36個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..36(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8ATGCCGATGT TCATCGTAAA CACCAACGTG CCCCGC(2)SEQ ID NO9的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度36個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..36(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO9GCCGATGCTG TGCAGGCTGC AGAGCGCGCA CGGCTC 36(2)SEQ ID NO10的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度60個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..60(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10AACCTAAGA AAAACCAAGG AGGTAATAAA TAATGCCGAT GTTCATCTAA AACACCAACG60(2)SEQ ID NO11的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度42個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..42(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO11CACCCGACCT TGTTGAGGTG GAAGCGGATT ATCCCTAGGC AA 42(2)SEQ ID NO12的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度60個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..60(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO12AACCTTAAGA AAAACCAAGG AGGTAATAAA TAATGCCTAT GTTCATCGTG AACACCAATG60(2)SEQ ID NO13的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度43個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..43(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO13GCACCCGACC TTGCCAAGGT GGAAGCGAAC TATCCCTAGGCAA43(2)SEQ ID NO14的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度39個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..39(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO14CCCAGATCTA AGCGGATGCC GATGTTCATC GTAAACACC 39(2)SEQ ID NO15的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..32(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO15CCTTGTTGAG GTGGAAGCGG ATTCCATGGC AA 32(2)SEQ ID NO16的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度26個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..26(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO16AACTGCAGAT GGGCTTCCAA AAGTTC 26(2)SEQ ID NO17的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..32(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO17GACCTGTCGG GGTCTAGATT CGCCGACGTC CA 32(2)SEQ ID NO18的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..33(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO18AAGAATTCCC CCATGGAGCT GAGGCCCTGG TTG 33(2)SEQ ID NO19的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度28個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..28(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO19GTGGTTGTCA TAGATGTGCG ACAGGTAG 28(2)SEQ ID NO20的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度28個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..28(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO20ACACCAACAG TATCTACACG CTGTCCAT 28(2)SEQ ID NO21的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度28個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..28(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO21TACCCAAATT ACTGACCCGG AAGTACTG 28(2)SEQ ID NO22的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度21個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..21(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO22ACTACTCCGC AGATGGGTTT A 21(2)SEQ ID NO23的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..29(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO23TTTCTGGTCT CGCGGGA6AC TCTTAAGAA 29(2)SEQ ID NO24的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度28個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..28(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO24GAATTCTGTC ATGGGCTTCC AAAAGTTC 28(2)SEQ ID NO25的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..30(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO25CTG GAC AGC CCC AGA TCC AAG AGA TCT AGA30Leu Asp Ser Pro Arg Ser Lys Arg Ser Arg1 5 10(2)SEQ ID NO26的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO26Leu Asp Ser Pro Arg Ser Lys Arg Ser Arg1 5 10(2)SEQ ID NO27的信息(ⅰ)序列特徵
(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..30(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO27CTG GAC AGA CCC ATG TCC AAG AGA TCT AGA 30Leu Asp Arg Pro Met Ser Lys Arg Ser Arg1 5 10(2)SEQ ID NO28的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO28Leu Asp Arg Pro Met Ser Lys Arg Ser Arg1 5 10(2)SEQ ID NO29的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸
(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ )特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..30(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO29CTG GAC AGA CCC AGA TCC AAG AGA TCT AGA 30Leu Asp Arg Pro Arg Ser Lys Arg Ser Arg1 5 10(2)SEQ ID NO30的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO30Leu Asp Arg Pro Arg Ser Lys Arg Ser Arg1 5 10(2)SEQ ID NO31的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..30(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO31CTG GAC AGC CCC ATG TCC AAG AGA TCT AGA 30Leu Asp Set Pro Met Ser Lys Arg Set Arg1 5 10(2)SEQ ID NO32的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO32Leu Asp Ser Pro Met Set Lys Arg Ser Arg1 5 10(2)SEQ ID NO33的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..25(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO33CTCTAGAGAC AAAACTCACA CATGC 25(2)SEQ ID NO34的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度28個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..28(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO34GGCGGCCGCC GCACTCATTT ACCCGGAG 28(2)SEQ ID NO35的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度635個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅶ )直接來源(B)克隆鼠GIF(ⅸ )特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置82..426(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO35GGCACGACGT CAGGTCCCTG GCTTGGGTCA CACCGCGCTT TGTACCGTCC TCCGGTCCAC 60GCTCGCAGTC TCTCCGCCAC C ATG CCT ATG TTC ATC GTC AAC ACC AAT GTT111Met Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val1 5 10CCC CGC GCC TCC GTG CCA GAG GGG TTT CTG TCG GAG CTC ACC CAG GAG159Pro Arg Ala Ser Val Pro Glu Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln15 20 25CTG GCG CAG CGC ACC GGC AAG CCC GGA CAG TAC ATC GCA GTG CAC GTG207Leu Ala Gln Arg Thr Gly Lys Pro Ala Gln Tyr Ile Ala Val His Val30 35 40GTC CCG GAC CAG CTC ATG ACT TTT AGC GGC ACG AAC GAT CCC TGC GCC255Val Pro Asp Gln Leu Met Thr Phe Ser Gly Thr Asn Asp Pro Cys Ala45 50 55CTC TGC AGC CTG CAC AGC ATC GGG AAG ATC GGT GGT GCC CAG AAC CGC303Leu Cys Ser Leu His Ser Ile Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg60 65 70AAC TAC AGT AAG CTG CTG TGT GGC CTG CTG TCC GAT CGC CTG CAC ATC351Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Cys Gly Leu Leu Ser Asp Arg Leu His Ile75 80 85 90AGC CCG GAC CGG GTC TAC ATC AAC TAT TAC GAC ATG AAC GCT GCC AAC399Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn95 100 105GTG GGC TGG AAC GGT TCC ACC TTC GCT TGAGTCCTGG CCCCACTTAC 446Val Gly Trp Asn Gly Ser Thr Phe Ala110 115CTGCACCGGT GTTCTTTGAG CCTCGCCTCT CCACGTAGTG TTCTGTGTTT ATCCACCGGT 506AGCGATGCCC ACCTTCGAGC CGGGAGAAAT AAATGGTTTA TAAGAGACCA AAAAAAAAAA 566AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 626AAAAAAAAA 635(2)SEQ ID NO36的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度115個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO36Met Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro1 5 10 15Glu Gly Phe Leu Ser GIu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Arg Thr Gly20 25 30Lys Pro Ala Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met35 40 45Thr Phe Ser Gly Thr Asn Asp Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser50 55 60Ile Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Asn Tyr Ser Lys Leu Leu65 70 75 80Cys Gly Leu Leu Ser Asp Arg Leu His Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr85 90 95Ile Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Gly Ser100 105 110Thr Phe Ala115(2)SEQ ID NO37的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度557個鹼基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅶ)直接來源(B)複製人GIF cDNA(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置75..419(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO37CAGGCACGTA GCTCAGCGGC GGCGCGGCGC GTGCGTCTGT GCCTCTGCGC GGGTCTCCTG 60GTCCTTCTGC CATC ATG CCG ATG TTC ATC GTA AAC ACC AAC GTG CCC CGC110Met Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg1 5 10GCC TCC GTG CCG GAC GGG TTC CTC TCC GAG CTC ACC CAG CAG CTG GCG158Ala Ser Val Pro Asp Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala15 20 25CAG GCC ACC GGC AAG CCC CCC CAG TAC ATC GCG GTG CAC GTG GTC CCG206Gln Ala Thr Gly Lys Pro Pro Gln Tyr Ile Ala Val Mis Val Val Pro30 35 40GAC CAC GTC ATG GCC TTC GGC GGC TCC AGC GAG CCG TGC GCG CTC TGC254Asp His Val Met Ala Phe Gly Gly Ser Ser Glu Pro Cys Ala Leu Cys45 50 55 60AGC CTG CAC AGC ATC GGC AAG ATC CGC GGC GCG CAG AAC CGC TCC TAC302Ser Lau His Ser Ile Gly Lys Ile Arg Gly Ala Gln Asn Arg Ser Tyr65 70 75AGC AAG CTG CTG TGC GGC CTG CTG GCC GAG CGC CTG CGC ATC AGC CCG350Ser Lys Leu Leu Cys Gly Leu Leu Ala Glu Arg Leu Arg Ile Ser Pro80 85 90GAC AGG GTC TAC ATC AAC TAT TAC GAC ATG AAC GCG GCC AAT GTG GGC398Asp Arg Val Tyr Ile Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly95 100 105TGG AAC AAC TCC ACC TTC GCC TAAGAGCCGC AGGGACCCAC GCTGTCTGCG 449Trp Asn Asn Ser Thr Phe Ala110 115CTGGCTCCAC CCGGGAACCC GCCGCACGCT GTGTTCTAGG CCCGCCCACC CCAACCTTCT 509GGTGGGGAGA AATAAACGGT TTAGAGACTA AAAAAAAAAA AAAAAAAA 557(2)SEQ ID NO38的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度115個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO38Met Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro1 5 10 15Asp Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Lau Ala Gln Ala Thr Gly20 25 30Lys Pro Pro Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp His Val Met35 40 45Ala Phe Gly Gly Ser Ser Glu Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser50 55 60Ile Gly Lys Ile Arg Gly Ala Gln Asn Arg Ser Tyr Ser Lys Leu Leu65 70 75 80Cys Gly Leu Leu Ala Glu Arg Leu Arg Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr85 90 95Ile Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Asn Ser100 105 110Thr Phe Ala11權利要求
1.產生基本上純的，生物活性的，由結構基因編碼的多肽的方法，該法包括a.培養由編碼下式融合多肽的多核苷酸序列轉化的真核細胞R1-[X1-X2-X1-X2-Lys-Arg]-R2；其中R1是載體肽，R2是由結構基因編碼的多肽，X1是Lys或Arg，而X2是任何胺基酸；b.分離基本純的由該結構基因編碼的多肽。
2.權利要求1的方法，其中該載體肽是蛋白前體的前區。
3.權利要求1的方法，其中該前區是降鈣素前體衍生的。
4.權利要求1的方法，其中由該結構基因編碼的該多肽是抗原非特異性糖基化抑制因子(GIF)。
5.權利要求1的方法，其中該GIF是鼠的。
6.權利要求1的方法，其中該GIF是人的。
7.產生基本純的，生物活性GIF的方法，該法包括a.培養用含有以可操作方式連接的，編碼GIF的多核苷酸的載體轉染的宿主細胞；b.分離此基本純的，生物活性的GIF。
8.權利要求7的方法，其中編碼GIF的多核苷酸，以可操作方式連接於編碼下式多肽的多核苷酸上R1-[X1-X2-X1-X2-Lys-Arg]-；其中R1是載體肽，X1是Lys或Arg，X2是任何胺基酸。
9.權利要求8的方法，其中該載體肽是一種蛋白前體的前區。
10.權利要求9的方法，其中該前區是降鈣素前體衍生的。
11.權利要求7的方法，其中該GIF是鼠的。
12.權利要求7的方法，其中該GIF是人的。
13.抑制人對抗原的免疫反應的方法，該方法包括給人施用免疫抑制有效量的抗原非特異性GIF。
14.權利要求13的方法，其中該施用是腸胃外的。
15.權利要求14的方法，其中該腸胃外施用通過皮下、肌肉內、腹膜內、腔內，透皮或靜脈注射進行。
16.權利要求13的方法，其中該施用以約0.001mg/公斤/劑-約2mg/公斤/劑的劑量進行。
17.權利要求13的方法，其中該施用以約0.001mg/公斤/劑-約0.2mg/公斤/劑的劑量進行。
18.一種藥用組合物，它包含免疫抑制量的基本純的抗原非特異性GIF和藥學上惰性的載體。
19.權利要求18的藥用組合物，其中該GIF是人的。
20.權利要求18的藥用組合物，其中該GIF是鼠的。
21.下式的基本純的融合多肽R1-[X1-X2-X1-X2-Lys-arg]-R2其中R1是載體肽，R2是由一種結構基因編碼的多肽，X1是Lys或Arg，X2是任何的胺基酸。
22.權利要求21的融合多肽，其中該載體肽是蛋白前體的前區。
23.權利要求22的融合多肽，其中該前區是降鈣素前體衍生的。
24.權利要求21的融合多肽，其中由結構基因編碼的多肽是抗原非特異性糖基化抑制因子(GIF)。
25.權利要求24的融合多肽，其中該GIF是鼠的。
26.權利要求24的融合多肽，其中該GIF是人的。
27.被分離的編碼權利要求21的融合多肽的多核苷酸序列。
28.含權利要求27的多核苷酸的重組體表達載體。
29.權利要求28的載體，其中該載體是病毒。
30.權利要求28的載體，其中該載體是質粒。
31.含權利要求28的載體的宿主細胞。
32.權利要求31的宿主細胞，其中該宿主是真核生物。
33.權利要求32的宿主細胞，其中該宿主是COS。
34.與抗原特異性GIF上的抗原決定簇結合的單克隆抗體。
35.權利要求34的單克隆抗體，其中該單克隆抗體具有由ATCC入藏號HB11345的雜交瘤細胞系110BH3所產生的單克隆抗體的特異性。
36.權利要求34的單克隆抗體，其中該單克隆抗體是由ATCC入藏號HB11345的雜交瘤細胞系110BH3所產生的單克隆抗體。
37.一種被分離的編碼抗原非特異性GIF的多核苷酸序列。
38.權利要求37的多核苷酸，其中該GIF序列選自由下列核酸序列所組成的組a.圖1，其中T也可為U；b.圖2，其中T也可為U；c.與圖1和2互補的核酸序列，及d.長度至少為15個鹼基，而且可選擇性地與編碼GIF的基因組DNA雜交的a，b，或c的片段。
39.含權利要求37的多核苷酸序列的重組體載體。
40.權利要求39的載體。其中該載體是病毒。
41.權利要求39的載體。其中該載體是質粒。
42.含權利要求39的載體的宿主細胞。
43.權利要求42的宿主細胞，其中該宿主是原核生物。
44.權利要求43的宿主細胞，其中該宿主是E.coli。
45.權利要求42的宿主細胞，其中該宿主是真核生物。
46.權利要求45的宿主細胞，其中該宿主是COS細胞。
47.產生生物活性GIF的方法，該法包括a.培養權利要求42的宿主細胞，及b.將基本純的GIF從該培養物中分離。
48.權利要求47的方法，其中該宿主是真核生物。
49.權利要求48的方法，其中該宿主是COS細胞。
全文摘要
多肽、多核苷酸、其片段、及其單克隆抗體被用於製備抗原特異性和抗原非特異性糖基化抑制因子，以及從編碼多肽的結構基因產生生物活性多肽重組體的方法。
文檔編號C07K16/00GK1126494SQ94192673
公開日1996年7月10日 申請日期1994年5月13日 優先權日1993年5月14日
發明者K·石坂, Y·-C·劉, T·三個山 申請人:拉霍拉敏感及免疫學研究所, 麒麟麥酒株式會社