修飾型生物素結合蛋白的製作方法
2023-08-04 03:20:26 1
修飾型生物素結合蛋白的製作方法
【專利摘要】本發明涉及修飾型生物素結合蛋白。本發明的修飾型生物素結合蛋白是在包含SEQ?ID?NO:2所述的胺基酸序列、或在該序列中具有一個～數個胺基酸突變的胺基酸序列、或與該序列具有80％以上的同一性的胺基酸序列且顯示生物素結合活性的蛋白質中，選自下組中的一個或多個殘基被取代成酸性胺基酸殘基或中性胺基酸殘基而成的：1)SEQ?ID?NO:2的104位的精氨酸殘基；2)SEQ?ID?NO:2的141位的賴氨酸殘基；3)SEQ?ID?NO:2的26位的賴氨酸殘基；以及4)SEQ?ID?NO:2的73位的賴氨酸殘基。
【專利說明】修飾型生物素結合蛋白
[0001]本申請是申請日為2009年8月13日、申請號為200980140630.6 (國際申請號為PCT/JP2009/064302)，名稱為「修飾型生物素結合蛋白」的發明專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0002]本申請要求2008年8月13日提出的日本國專利申請2008-208766的優先權。
[0003]本發明涉及修飾型生物素結合蛋白。
【背景技術】
[0004]抗生物素蛋白是卵清來源的蛋白質，鏈黴菌抗生物素蛋白是放線菌(Streptomyces avidinii)來源的蛋白質。抗生物素蛋白或鏈黴菌抗生物素蛋白與生物素(D-[ (+) -Cis-六氫-2-氧代-1H-噻吩並-(3，4)-咪唑-4-戊酸]之間的親和性(affinity)非常高(KD = 10_16~_14)，是兩生物分子間相互作用之中最強的相互作用之一。分子量是60kDa左右。現在，抗生物素蛋白/鏈黴菌抗生物素蛋白-生物素相互作用在生物化學、分子生物學或醫學領域有著廣泛應用(Green, (1975), Adv.Protein Chem.，29:85-133 ;Green, (1990), Methods Enzymol.，184:51-67)。抗生物素蛋白/鏈黴菌抗生物素蛋白這兩種蛋白質均形成四聚體，每一個亞基結合I分子的生物素。
[0005]在抗生物素蛋白的利用方面，其非特異性結合是一個問題。抗生物素蛋白有些情況下與細胞、DNA、蛋 白質或膜這些生物體成分非特異性結合，例如，在使用抗生物素蛋白-生物素結合對物質進行檢測時，有些情況下抗生物素蛋白與檢測對象物質以外的物質發生非特異性結合，導致背景增高。作為抗生物素蛋白的非特異性結合高的理由，可以列舉出等電點高、具有分子量的約10%的糖鏈、等等。抗生物素蛋白是強鹼性蛋白質，其等電點為10以上非常之高，整體上帶有正電荷，因而可以認為其容易與帶負電荷的物質居多的生物體成分發生結合。
[0006]此外，可以認為，抗生物素蛋白表面的糖鏈容易與生物體成分結合(Marttila等，(2000)FEBS Lett，467，31-36)。為了降低抗生物素蛋白的非特異性結合，進行了下述的研究:利用糖苷酶除去抗生物素蛋白的糖鏈而得到的化學修飾中性抗生物素蛋白的研究(Bayer 等，(1995) Appl Biochem Biotechnol, 53 (I)，1-9),通過將抗生物素蛋白中的糖基化靶點即17位的天冬醯胺殘基取代成異亮氨酸殘基來生物合成不受糖鏈修飾的抗生物素蛋白的研究(Marttila等，(2000)FEBS Lett, 467，31-36),等等。而且,還進行了通過採用基因工程方法將抗生物素蛋白所具有的賴氨酸殘基、精氨酸殘基變換為中性胺基酸、酸性胺基酸，來降低抗生物素蛋白的等電點的研究(Marttila等，(1998)FEBSLett, 441，313-317)。
[0007]然而，通過這樣的修飾，雖然例如DNA、細胞針對抗生物素蛋白的非特異性結合得以降低，但關於在應用於臨床檢查系統等時所必須的針對人血清的非特異性結合的抑制，尚未進行充分研究。此外，在生物合成抗生物素蛋白變體時，有必要使用基於昆蟲細胞的表達系統。因此，現狀是因培養需要時間及成本高，序列修飾抗生物素蛋白尚未達到實用化。[0008]作為關於抗生物素蛋白、鏈黴菌抗生物素蛋白這樣的生物素結合性蛋白質與生物素之間的親和性的研究，有報告稱，對鏈黴菌抗生物素蛋白的結構進行大的修飾，增強了其與螢光生物素的結合(Aslan 等，(2005) Proc Natl Acad Sci U.S.A.，102，8507-8512)。但是，該蛋白質同時大幅損失了與生物素的結合能力。
[0009]本發明人等從食用菌白黃側耳(Plueurotus conucopiae)中純化了對稻痕病菌(Magnaporthe grisea)顯示抗菌性的蛋白質。發現該蛋白質顯示生物素結合性，將其命名為tamavidin(tamavidinl)。tamavidinl蛋白質的胺基酸序列、以及編碼該蛋白質的基因的鹼基序列均在W002/072817中公開(W002/072817中的SEQ ID NO:1和2)。而且，還從同一食用菌中鑑定出tamavidinl的同源物(tamavidin2),其顯示具有強的生物素結合能力。tamavidin2蛋白質的氣基酸序列、以及編碼該蛋白質的基因的喊基序列均在W002/072817中公開(W002/072817中的SEQ ID NO: 3和4)，且重組蛋白質的生產也取得了成功。tamavidinl和2可在大腸桿菌中表達,特別是tamavidin2可以通過使用亞胺基生物素柱的純化容易地製備，且其與鏈黴菌抗生物素蛋白相比具有更高的耐熱性，就這點而言，其是一種優異的生物素結合性蛋白質。然而，在針對核酸和/或蛋白質的非特異性結合方面，其雖然比傳統的抗生物素蛋白少，但卻與鏈黴菌抗生物素蛋白程度等同。[0010]現有技術文獻
[0011]專利文獻
[0012]專利文獻1:TO02/072817A1
[0013]非專利文獻
[0014]非專利文獻2:TO2008/081938A1
[0015]非專利文獻l:Marttila 等，(2000)FEBS Lett, 467，31-36
[0016]非專利文獻2: Bayer 等,(1995) Appl Biochem Biotechnol, 53 (I)，1-9)
[0017]非專利文獻3:Marttila 等，(1998)FEBS Lett, 441，313-317
[0018]非專利文獻4:Α1οη 等，(1990)Biochem Biophys Res Commun, 170, 1236-1241
[0019]非專利文獻5:Aslan 等，(2005)Proc Natl Acad Sci U.S.A.，102，8507-8512
[0020]非專利文獻6:Weber 等，(I989)ScienceM3:85-88
[0021]非專利文獻7: Livnah 等，(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.90:5076-5080
[0022]非專利文獻8: Qureshi et al.(2001) J.Biol.Chem.276 (49)，ρ.46422-46428
【發明內容】
[0023]發明所要解決的問題
[0024]本發明的課題是提供:在保持生物素結合能力高的tamavidin的特性的同時，性能提升的修飾型生物素結合蛋白，所述性能提升是指非特異性結合性降低和/或進一步的生物素結合提高。
[0025]解決問題的方法
[0026]本發明通過對天然的tamavidin2(以下，在本說明書中也記作「TM2」)的胺基酸序列(SEQ ID NO:2)進行修飾，成功地提高了其性能。
[0027]本發明的優選實施方式
[0028]本發明優選包含以下實施方式。[0029][實施方式I]
[0030] 在包含SEQ ID NO:2所述的胺基酸序列、或在該序列中具有一個~數個胺基酸突變的胺基酸序列、或與該序列具有80%以上的同一性的胺基酸序列，且顯示生物素結合活性的蛋白質中，選自下組中的一個或多個殘基被取代成酸性胺基酸殘基或中性胺基酸殘基的修飾型生物素結合蛋白:
[0031]DSEQ ID NO: 2的104位的精氨酸殘基；
[0032]2) SEQ ID NO: 2的141位的賴氨酸殘基；
[0033]3) SEQ ID NO: 2的26位的賴氨酸殘基；以及
[0034]4) SEQ ID NO: 2的73位的賴氨酸殘基。
[0035][實施方式2]
[0036]實施方式I所述的修飾型生物素結合蛋白，其中，選自I)~4)中的胺基酸殘基被取代成疏水性指數為2以下的胺基酸殘基。
[0037][實施方式3]
[0038]實施方式I所述的修飾型生物素結合蛋白，其中，1)SEQ ID N0:2的104位的精氨酸殘基、和/或、2) SEQ ID NO: 2的141位的賴氨酸殘基被取代成酸性胺基酸殘基或中性氨
基酸殘基。
[0039][實施方式4]
[0040]實施方式3所述的修飾型生物素結合蛋白，其中，1)SEQ ID N0:2的104位的精氨酸殘基、和/或、2)SEQ ID NO:2的141位的賴氨酸殘基被取代成酸性胺基酸殘基。
[0041][實施方式5]
[0042]實施方式3或4所述的修飾型生物素結合蛋白，其中，1)SEQ ID N0:2的104位的精氨酸殘基、和/或、2) SEQ ID NO: 2的141位的賴氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基。
[0043][實施方式6]
[0044]實施方式I~5中任一項所述的修飾型生物素結合蛋白，其中，進一步，SEQ IDNO:2的40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬醯胺殘基。
[0045][實施方式7]
[0046]實施方式I~6中任一項所述的修飾型生物素結合蛋白，其選自下組:
[0047]在SEQ ID NO: 2中，104位的精氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基的修飾型生物素結合蛋白(R104E-K141E)；
[0048]在SEQ ID N0:2中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬醯胺殘基、且104位的精氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基的修飾型生物素結合蛋白(D40N-R104E)；
[0049]在SEQ ID NO:2中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬醯胺殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基的修飾型生物素結合蛋白(D40N-K141E);以及
[0050]在SEQ ID NO:2中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬醯胺殘基、104位的精氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基的修飾型生物素結合蛋白(D40N-R104E-K141E)。
[0051][實施方式8]
[0052]實施方式I~7中任一項所述的修飾型生物素結合蛋白，其滿足以下a)-1)的條件中的一個至全部:[0053]a) SEQ ID NO: 2的14位的天冬醯胺殘基未被修飾、或者被取代成穀氨醯胺或天冬
氨酸；
[0054]b)SEQ ID NO:2的18位的絲氨酸殘基未被修飾、或者被取代成蘇氨酸或酪氨酸；
[0055]c)SEQ ID NO: 2的34位的酪氨酸殘基未被修飾、或者被取代成絲氨酸、蘇氨酸或苯
丙氨酸；
[0056]d) SEQ ID NO: 2的36位的絲氨酸殘基未被修飾、或者被取代成蘇氨酸或酪氨酸； [0057]e) SEQ ID NO: 2的40位的天冬氨酸殘基未被修飾、或者被取代成天冬醯胺；
[0058]f) SEQ ID NO: 2的69位的色氨酸殘基未被修飾；
[0059]g) SEQ ID NO: 2的76位的絲氨酸殘基未被修飾、或者被取代成蘇氨酸或酪氨酸；
[0060]h) SEQ ID NO: 2的78位的蘇氨酸殘基未被修飾、或者被取代成絲氨酸或酪氨酸；
[0061]i) SEQ ID NO: 2的80位的色氨酸殘基未被修飾；
[0062]j) SEQ ID NO: 2的96位的色氨酸殘基未被修飾；
[0063]k) SEQ ID NO: 2的108位的色氨酸殘基未被修飾；以及
[0064]DSEQ ID NO: 2的116位的天冬氨酸殘基未被修飾、或者被取代成穀氨酸或天冬醯胺。
[0065][實施方式9]
[0066]實施方式I所述的修飾型生物素結合蛋白，其包含與SEQ ID NO:2所述的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列。
[0067][實施方式10]
[0068]實施方式I~9中任一項所述的修飾型生物素結合蛋白，其滿足以下性質中的一個至全部:
[0069]i)與由SEQ ID NO:2所述的胺基酸序列組成的蛋白質相比，具有低的等電點；
[0070]ii)與由SEQ ID N0:2所述的胺基酸序列組成的蛋白質相比，顯示對核酸和/或蛋白質的低的非特異性結合；
[0071]iii)與由SEQ ID N0:2所述的胺基酸序列組成的蛋白質相比，顯示低的纖連蛋白結合性；
[0072]iv)與由SEQ ID NO: 2所述的胺基酸序列組成的蛋白質相比，顯示高的生物素結合性。
[0073][實施方式11]
[0074]在包含SEQ ID NO:2所述的胺基酸序列、或在該序列中具有一個~數個胺基酸突變的胺基酸序列、或與該序列具有80%以上的同一性的胺基酸序列，且顯示生物素結合活性的蛋白質中，SEQ ID NO: 2的40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬醯胺殘基的修飾型生物素結合蛋白。
[0075][實施方式12]
[0076]實施方式11所述的修飾型生物素結合蛋白，其與由SEQ ID N0:2所述的胺基酸序列組成的蛋白質相比，顯示高的生物素結合性。
[0077][實施方式13]
[0078]編碼實施方式I~12中任一項所述的蛋白質的核酸。
[0079][實施方式14][0080]包含實施方式13所述的核酸的載體。
[0081][實施方式15]
[0082]固定化有實施方式I~14中任一項所述的蛋白質的載體。
[0083]以下，對用於實施本發明的優選實施方式進行說明。
[0084]tamavidin
[0085]tamavidin是從作為食用菌的擔子菌白黃側耳(Pleurotus conucopiae)中發現的新的生物素結合蛋白(W002/072817)。該文獻中記載:
[0086]-tamavidinl與tamavidin2相互之間的胺基酸同源性為65.5%,與生物素強結合；
[0087]_tamavidin2在大腸桿菌中高表達在可溶性級分中；以及
[0088]-用大腸桿菌表達tamavidin2時,經過4.5小時的培養,每50ml培養可以獲得約Img的高純度純化重組蛋白質。與已知的生物素結合性蛋白質抗生物素蛋白、鏈黴菌抗生物素蛋白相比，這是非常高的值。
[0089]本說明書中的 「tamavidin2」是指:tamavidin2 (TM2)或其變體。本發明通過對TM2或其變體的特定胺基酸殘基進行修飾，提供顯示對核酸和/或蛋白質的非特異性結合比野生型TM2更低的修飾型TM2。在本說明書中，當記作「tamavidin2」、「TM2」時，如無特別說明，是指野生型的TM2及其變體。但是，根據文意，有些情況下也作為包括本發明的修飾型TM2在內的TM2的野生型、突變型和本發明的修飾型的統稱使用。此外，TM2顯示生物素結合性，因而在本說明書中，有時也將TM2稱作「生物素結合蛋白」。
[0090]具體地，TM2(野生型)典型地，可以是包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的蛋白質、或由包含SEQ ID NO:1的鹼基序列的核酸編碼的蛋白質。或者，TM2可以是包含SEQ IDN0:2的胺基酸序列的蛋白質或由包含SEQ ID NO:1的鹼基序列的核酸編碼的蛋白質的變體，該蛋白質具有與tamavidin2等同的生物素結合活性。TM2的變體可以是包含在SEQ IDN0:2的胺基酸序列中包含一個或多個胺基酸的缺失、取代、插入和/或添加的胺基酸序列的蛋白質，該蛋白質具有與TM2等同的生物素結合活性。取代可以是保守取代，即將特定的胺基酸殘基替換為具有相似物理化學特徵的殘基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基團的胺基酸殘基之間的取代(例如He、Val、Leu或Ala間的相互取代)、極性殘基之間的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之間的相互取代)等。
[0091]胺基酸缺失、取代、插入和/或添加而成的變體可以通過對編碼野生型蛋白質的DNA實施例如作為公知技術的定點誘變(例如參見Nucleic Acid Research, Vol.10,N0.20,p.6487-6500，1982，通過引用將其全文引入到本說明書中)而產生。在本說明書中，「一個或多個胺基酸」是指通過定點誘變方法能夠缺失、取代、插入和/或添加的程度的胺基酸。此外，在本說明書中，「一個或多個胺基酸」根據情況可以指一個或數個胺基酸。
[0092]就定點誘變方法而言，例如，除希望的變異即特定的不一致之外，還可以使用與要突變的單鏈噬菌體DNA互補的合成寡核苷酸引物按如下方式進行。即，使用上述合成寡核苷酸作為引物合成與噬菌體互補的鏈，用得到的雙鏈DNA轉化宿主細胞。將轉化後的細菌的培養物鋪在瓊脂上，由含噬菌體的單個細胞形成噬菌斑。這樣，理論上有50%的新菌落含有單鏈形式的具有突變的噬菌體，其餘的50%攜帶原序列。在合適的溫度下，使獲得的噬菌斑與通過激酶處理而標記的合成探針雜交，所述合適的溫度指該溫度下所述探針與和帶有目的突變的DNA完全一致的噬菌斑雜交，而不與攜帶原有鏈的噬菌斑雜交。然後，收集與該探針雜交的噬菌斑，進行培養，回收DNA。
[0093]而且，在保持其活性的同時對生物活性肽的胺基酸序列施加一個或多個胺基酸的缺失、取代、插入和/或添加的方法，除了上述的定點突變外，還有用誘變物處理基因的方法，以及選擇性地斷開基因，然後刪除、取代、插入或添加選定的核苷酸，再進行連接的方法。更優選地，本發明中的TM2是由在SEQ ID NO:2中缺失、取代或添加I~10個胺基酸的胺基酸序列組成、且具有生物素活性的蛋白質。
[0094]TM2的變體還可以是:包含與SEQ ID NO: 2的胺基酸序列具有至少80 %以上、優選85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上、更優選99.3%以上的胺基酸同一性的胺基酸序列、且具有與TM2等同的生物素結合活性的蛋白質。
[0095]兩個胺基酸序列的同一性％可通過目測和數學計算來確定。或者兩個蛋白質序列的同一性百分比可以通過使用以Needleman, S.B.及ffunsch, C.D.(J.Mol.Bol.,48:443-453,1970)的算法為基礎的、可從威斯康星州大學遺傳學計算機組(UWGCG)獲得的GAP電腦程式進行序列信息比較來確定。GAP程序優選的默認參數包括=(I)Henikoff，S.以R Henikoff, J.G.(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，89:10915-10919，1992)所記載的得分 / 矩陣(7 7 u >夕''.?卜U '7夕7 )、blosum62 ； (2) 一個空位扣12分；(3)連續空位加扣4分；以及(4)末端空位不扣分。
[0096]也可使用該領域技術人員使用的進行序列比較的其它程序。關於同一性百分比，例如:Altschul 等(Nucl.Acids.Res.,25, p.3389-3402,1997)中記載的可用 BLAST 程序對序列信息進行比較和確定。該程序可於網絡上在Nantional Center for BiotechnologyInformation(NCBI)或 DNA Data Bank of Japan(DDBJ)網站使用。在相同站點，對利用BLAST程序進行同一性檢索的各種條件(參數)進行了詳細記載，可對部分設定進行適當變更，但檢索通常使用默認值來進行。此外，兩個胺基酸序列的同一性％也可用遺傳信息處理軟體GENETYX Ver.7 (GENETYX制)等程序或FASTA算法等來確定。此時，也可用默認值進行檢索。
[0097]兩個核酸序列的同一性％可通過目測和數學計算來確定，此外，該比較更優選使用電腦程式對序列信息進行比較。具有代表性的優選電腦程式為遺傳學計算機組(GCG ;威斯康星州Madison)的威斯康星.軟體包、10.0版「GAP」程序(Devereux等，1984,Nucl.Acids Res.,12:387)。使用該「GAP」程序,不僅可對兩個核酸序列進行比較,還可比較兩個胺基酸序列，並可對核酸序列和胺基酸序列進行比較。此處，「GAP」程序的優選默認參數包括:(1)實行關於核苷酸的(包括相同物質為I，不同物質為O的值)一元(unary)比較矩陣的GCG時，如Schwartz和Dayhoff主編的」多肽序列及結構圖譜(Atlas ofPolypeptide Sequence and Structure) 」 (國立生物醫學研究財團，353-358 頁，1979 年)所記載的Gribskov及Burgess (Nucl.Acids Res.,14:6745,1986)的加權胺基酸比對矩陣；或其它可比對的比對矩陣；(2)胺基酸的各空位罰分30，各空位中的各記號追加I罰分；此外，核苷酸序列的各空位罰分50，各空位中的各記號追加3罰分；(3)末端空位不罰分；以及(4)長空位沒有最大罰分。技術人員使用的其它序列比較程序中，可使用例如美國國立醫學圖書館的網站:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html 提供的版本2.2.7的BLASTN程序、或UW-BLAST2.0算法。關於UW-BLAST2.0標準默認參數的設定，以下網站:http://blast.wustl.edu中有記載。而且,BLAST算法使用BL0SUM62胺基酸得分矩陣，可使用的選擇參數如下:(A)包含具有低組成複雜性的提問序列片斷(由Wootton及Federhen 的 SEG 程序(Computers and Chemistry, 1993)確定；參考 Wootton 及 Federhen,1996「序列資料庫中組成偏移區域的分析(Analysis of compositionally biased regionsin sequence databases) 」 Methods Enzymol., 266:544-71),或用於掩蔽短周期性內部重複形成的片段(由 Claverie 及 States (Computers and Chemistry, 1993)的 XNU 程序確定)的濾器，以及(B)用於報告資料庫序列匹配的有統計學意義的閾值，或根據E-得分(Karlin和Altschul，1990)統計學模型得到的單純偶然發現匹配的期待機率；某種匹配引起的有統計學意義的差值大於E-得分閾值時，不能報告該匹配；優選的E-得分閾值的數值為0.5，此外按照優選度增大的順序依次為0.25,0.1,0.05,0.01,0.001,0.0001、le_5、Ie-10、Ie-15、le_20、le_25、le_30、le_40、le_50、le_75、Ie-1OO。
[0098]此外，TM2的變體還可以是由包含在嚴格條件下與SEQ ID NO:1的鹼基序列的互補鏈雜交的鹼基序列的核酸編碼的、具有與TM2等同的生物素結合活性的蛋白質。
[0099]此處，「嚴格條件下」是指:在中度或高度的嚴格條件下進行雜交。具體來說，關於中度嚴格條件，根據例如DNA長度，掌握常規技術的該領域技術人員能夠容易地確定。基本條件如 Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版,第 6 章，ColdSpring Harbor Laboratory Press, 2001 所不，例如包括下述條件的使用:5 X SSC、0.5 %SDS, 1.0mM EDTA (pH8.0)的預洗滌溶液、約42°C的約50 %的甲醯胺、2 X SSC-6 X SSC優選5-6XSSC、0.5% SDS(或約42°C、約50%甲醯胺中的Stark』 s溶液等其它類似的雜交液)的雜交條件，以及例如在約50°C -68°C >0.1-6XSSC、0.1% SDS的洗滌條件。優選的中度嚴格條件包括約50°C、6XSSC、0.5% SDS的雜交條件(及洗滌條件)。關於高度嚴格條件，根據例如DNA長度，本領域技術人員能夠容易地確定。 [0100]通常，這樣的條件包括較中度嚴格條件更高溫度和/或更低鹽濃度的雜交(例如:含0.5 %左右的SDS、約65 °C，6 X SSC~0.2 X SSC,優選6 X SSC、更優選2 X SSC、更優選0.2 X SSC或者0.1XSSC的雜交)和/或洗滌，例如可定義為上述雜交條件以及伴隨大約65°C -68°C >0.2~0.1 X SSC,0.1% SDS的洗滌。關於雜交及洗滌的緩衝液，可以使用SSPE (I X SSPE 為 0.15M NaCl、IOmM NaH2PO4 以及 1.25mM EDTA，pH7.4)代替 SSC (I X SSC 為
0.15M NaCl以及15mM檸檬酸鈉)，在雜交結束後15分鐘~I小時左右進行洗滌。
[0101]此外，也可使用探針中不使用放射性物質的市售雜交試劑盒。具體可以列舉出使用 ECL direct labeling&detection system(Amersham 公司制)進行的雜交等。嚴格雜交條件的例子為，向試劑盒的雜交緩衝液中加入5% (w/v)的封閉試劑，使NaCl達到0.5M，在42°C進行4小時雜交，關於洗滌，在0.4% SDS,0.5xSSC中，55°C條件下洗滌兩次，每次20分鐘，在2xSSC中，室溫條件下，洗滌一次5分鐘。
[0102]TM2的變體的生物素結合活性可以採用任何公知方法來測定。例如，可以像Kada等(Biochim.Biophys.Acta., 1427:44-48(1999))所描述的那樣,採用使用了突光生物素的方法來測定。該方法是利用以下性質的測定系統:在生物素結合蛋白的生物素結合位點上結合螢光生物素時，螢光生物素的螢光強度消失。或者，可以使用基於表面等離子體共振原理的生物傳感器等能夠測定蛋白與生物素間的結合的傳感器，來評價變體蛋白的生物素結合活性。
[0103]在本發明的修飾tamavidin中，希望不進行修飾的胺基酸殘基如後述。
[0104]本發明的非特異性結合降低的修飾tamavidin
[0105]本發明的修飾型TM2的特徵是:在包含SEQ ID NO: 2所述的胺基酸序列、或在該序列中具有一個~數個胺基酸突變的胺基酸序列、或與該序列具有80%以上的同一性的胺基酸序列，並顯示生物素結合活性的蛋白質(野生型TM2以及突變型TM2)中，選自下組中的一個或多個殘基被取代成酸性胺基酸殘基或中性胺基酸殘基:
[0106]DSEQ ID NO: 2的104位的精氨酸殘基；[0107]2) SEQ ID NO: 2的141位的賴氨酸殘基；
[0108]3) SEQ ID NO: 2的26位的賴氨酸殘基；以及
[0109]4) SEQ ID NO: 2的73位的賴氨酸殘基。
[0110]野生型TM2的等電點(Pl)，由其一級結構計算得到的值是約7.4，實測值為
8.2-8.6左右，是中性~弱鹼性的蛋白質。TM2的非特異性結合程度遠比抗生物素蛋白少，與作為中性蛋白質的鏈黴菌抗生物素蛋白基本上等同。
[0111]本發明人等對進一步減少TM2的非特異性結合進行了研究。即，本發明人認為，即使是TM2這樣的中性~弱鹼性蛋白質，通過降低pl，也可能進一步降低非特異性結合，從而將TM2所具有的鹼性胺基酸殘基修飾成酸性胺基酸或中性胺基酸，並進行了實驗。
[0112]這裡，對於鏈黴菌抗生物素蛋白或抗生物素蛋白而言，已知有些情況下一個或數個胺基酸的取代會導致其對生物素的結合親和力降低，因此，在實驗中，不僅是降低等電點，還對如何不損害作為TM2的優良特徵的高生物素結合能力進行了如後述的研究，來進行胺基酸殘基的修飾。
[0113]深入研究的結果，本發明人等發現:滿足這樣的條件的本發明的低Pl修飾型TM2是包含選自下組中的一個或多個殘基的突變的修飾TM2蛋白質，從而想到了本發明:
[0114]DSEQ ID NO: 2 的 104 位的精氨酸殘基(R104)；
[0115]2) SEQ ID NO: 2 的 141 位的賴氨酸殘基(K141)；
[0116]3) SEQ ID NO: 2的26位的賴氨酸殘基(K26);以及
[0117]4) SEQ ID NO: 2 的 73 位的賴氨酸殘基(K73)。
[0118]突變後的胺基酸是酸性胺基酸殘基(天冬氨酸、穀氨酸)或中性胺基酸殘基(天冬醯胺、絲氨酸、穀氨醯胺、蘇氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)。
[0119]此外，非極性的胺基酸存在具有基於疏水性相互作用的非特異性結合的可能性，因而優選疏水性指數為2以下的酸性胺基酸殘基或中性胺基酸殘基。疏水性指數(hydropathy inde 是指:例如Kyte and Doolittle, J.Mol.Biol., 157, 105-132 (1982)中記載的將各胺基酸殘基的疏水性程度數值化而得到的指數，其是本領域技術人員公知的。「疏水性指數為2以下的酸性胺基酸殘基或中性胺基酸殘基」是作為酸性胺基酸殘基的天冬氨酸和穀氨酸，以及作為中性胺基酸殘基的天冬醯胺、絲氨酸、穀氨醯胺、蘇氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和丙氨酸。
[0120]更優選，I) SEQ ID NO: 2的104位的精氨酸殘基、和/或、2) SEQ ID NO: 2的141位的賴氨酸殘基被取代成酸性胺基酸殘基或中性胺基酸殘基。更優選，1)SEQ ID N0:2的104位的精氨酸殘基、和/或、2) SEQ ID NO: 2的141位的賴氨酸殘基被取代成酸性胺基酸殘基。[0121 ] K26的位置上更優選A (丙氨酸)、K73的位置上更優選Q (穀氨醯胺)、R104的位置上更優選E (穀氨酸)或D (天冬氨酸)、K141的位置上更優選E (穀氨酸)或D (天冬氨酸)；而R104的位置上更優選E，K141的位置上更優選E。
[0122]本發明的低pi型修飾TM2與野生型TM2相比，顯示顯著低的等電點。具體地，可以明確:在實施例1的1-8)中導入了突變的修飾型TM2的等電點，均較野生型的TM2降低了 I以上。
[0123]由此性質，與野生型或突變型TM2蛋白質相比，本發明的修飾型TM2蛋白質顯示對核酸和/或蛋白質的低的非特異性結合。具體地，在實施例1的1-11)中顯示了針對DNA的非特異性結合降低。而且，實施例1的1-9)中顯示血清蛋白質的非特異吸附性降低。在K26、K73、K141的位置上發生突變，均減少至野生型TM2的6成左右；而R104-K141 (R104和K141這兩個位置發生突變)甚至減少至TM2的2成多。與此相對，對於抗生物素蛋白的鹼性胺基酸變體，雖然有報告稱對DNA或細胞的非特異性結合降低(Marttila等，(2000)FEBS, 467，p.31-36)，但對血清蛋白質的非特異性結合的這樣的大幅降低還未見報告。
[0124]此外，對於本發明的低pi型修飾TM2，考察了與纖連蛋白之間的結合性，發現其大幅降低。纖連蛋白是存在於細胞外基質中的細胞粘附分子，特別是在對血漿、血清中的蛋白質進行檢測時，其會成為噪聲的原因之一。因此，希望與纖連蛋白之間的結合少。如實施例1的1-10)所示，與TM2相比，任何一種變體的纖連蛋白結合量均減少。特別是，就K141、R104-K141而言，結合量顯著減少至野生型TM2結合量的I成~2成。而且，pi值與纖連蛋白結合能力之間的關係是此前未知的，實際上未發現Pl值與纖連蛋白減少程度明確相關。考慮到這一點，K141 、R104-K141的變體的纖連蛋白結合量的減少非常之大，達到了意料不到的顯著。
[0125]纖連蛋白結合減少的本發明的優選修飾TM2的一例是，將TM2胺基酸序列的141位的賴氨酸殘基修飾成酸性胺基酸或中性胺基酸而得到的修飾TM2。更優選修飾成疏水性指數為2以下的酸性胺基酸或中性胺基酸而得到的修飾TM2。更優選E (穀氨酸)或D (天冬氨酸)，其中最優選E。
[0126]或者，纖連蛋白結合減少的其它修飾TM2是，將R104和K141這兩個胺基酸殘基同時修飾成酸性胺基酸或中性胺基酸而得到的修飾TM2。更優選修飾成疏水性指數為2以下的酸性胺基酸或中性胺基酸而得到的修飾TM2，更優選E (穀氨酸)或D (天冬氨酸)，其中最優選E。
[0127]牛.物素結合倉R力提高的{I條飾tamavidin
[0128]TM2與生物素之間的結合速度常數(ka)是9.19 X IO5 (MH，解離速度常數(kd)是e.SSXlO—U)，解離常數(KD)是7.43X10_12(M)，TM2非常強烈地結合生物素。針對作為其它生物素結合性蛋白質的鏈黴菌抗生物素蛋白進行了同樣的測定，結果ka是
2.28 X IO6 (MU，kd 是 2.52 X I(T6 (s_1)，KD 是 L 11 X 1(T12 (M)。即，與鏈黴菌抗生物素蛋白相比，ΤΜ2與生物素之間的結合力處於同一數量級，但稍弱(W02008/081938A1)。在希望生物素結合蛋白與生物素更快結合或更多結合的情況下，需要具有更高的生物素結合能力。
[0129]發明人等對ΤΜ2的胺基酸殘基進行修飾，成功製作了針對原本就具有高生物素結合能力的野生型ΤΜ2進一步提高了生物素結合能力的高親和性型修飾ΤΜ2。本發明的高親和性型TM2是在TM2的SEQ ID NO: 2的胺基酸序列中、至少40位的天冬氨酸殘基(D40)發生突變而得到的。突變後的胺基酸優選為N(天冬醯胺)。
[0130]D40的修飾可以與前述的用於降低非特異性結合的R104、K141、K26和/或K73的修飾組合進行(實施方式6)，或者也可以單獨進行(實施方式11)。如實施例2和3所示，與野生型TM2相比，D40經修飾的修飾TM2顯示顯著地高的生物素結合能力。
[0131]非特異性結合降低、且生物素結合能力提高的修飾tamavidin
[0132]製作將上述的「非特異性結合降低的修飾tamavidin」和「生物素結合能力提高的修飾tamavidin」中的胺基酸突變組合而成的修飾tamavidin時,得到了非特異性結合降低、生物素結合能力提高的修飾tamavidin。這樣的修飾tamavidin是包含TM2胺基酸序列的K26、K73、R104、K141中的至少一個胺基酸殘基的突變、且D40的胺基酸殘基突變成N而得到的修飾TM2蛋白質(實施方式6)。
[0133]K26、K73、R104、K141突變後的胺基酸是酸性胺基酸或中性胺基酸，優選疏水性指數(hydropathy index:Kyte and Doolittle, J.Mol.Biol., 157, 105-132 (1982))為 2 以下的酸性胺基酸或中性胺基酸。K26的位置上更優選A (丙氨酸)、K73的位置上更優選Q (穀氨醯胺)、R104的位置上更優選E (穀氨酸)或D (天冬氨酸)、Κ141的位置上更優選E (穀氨酸)或D (天冬氨酸)；而R104的位置上更優選Ε，Κ141的位置上更優選Ε。
[0134]對於同時進行了 R104與D40的修飾而得到的修飾tamavidin,可見親和性提高和蛋白質非特異性結合的降低(實施例3的3-7)和3-9))。
[0135]此外，對於同時修飾了 R104、K141、D40而得到的修飾tamavidin，觀察到了等電點的降低、親和性提 高、蛋白質非特異性結合的降低、纖連蛋白結合性的降低以及核酸非特異性結合的降低(實施例3的3-6)、3-7)、3-9)、3-10)和3_11)。而且，令人驚訝的是，蛋白質結構的熱穩定性大幅提高(實施例3的3-8))。
[0136]因此，優選同時對D40和R104胺基酸殘基進行修飾，更優選同時對D40、R104和K141進行修飾。
[0137]如以上，優選本發明的修飾型TM2可以選自下組，但不限於此:
[0138]在SEQ ID N0:2中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬醯胺殘基、且104位的精氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基的修飾型生物素結合蛋白(D40N-R104E)；
[0139]在SEQ ID NO:2中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬醯胺殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基的修飾型生物素結合蛋白(D40N-K141E);以及
[0140]在SEQ ID NO:2中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬醯胺殘基、104位的精氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基的修飾型生物素結合蛋白(D40N-R104E-K141E)。
[0141]本發明的修飾TM2蛋白質的優選實施方式具有例如SEQ ID NO:8、10、16、20、22、24以及25中的任何一個胺基酸序列。
[0142]更優選D40N-R104E、D40N-K141E 或 D40N-R104E-K141E，最優選D40N-R104E-K141E。
[0143]本申請發明的修飾型TM2蛋白質優選滿足以下性質中的一個直至全部:
[0144]i)與由SEQ ID NO:2所述的胺基酸序列組成的蛋白質相比，具有低的等電點；
[0145]ii)與由SEQ ID NO: 2所述的胺基酸序列組成的蛋白質相比，顯示對核酸和/或蛋白質的低的非特異性結合；
[0146]iii)與由SEQ ID NO:2所述的胺基酸序列組成的蛋白質相比，顯示低的纖連蛋白結合性；
[0147]iv)與由SEQ ID NO: 2所述的胺基酸序列組成的蛋白質相比，顯示高的生物素結合性。
[0148] 關於i)，野生型TM2的等電點是約8.5-8.8。本發明的修飾TM2的等電點優選是8.0以下，更優選是7.7以下。
[0149]關於iii)，設野生型TM2對纖連蛋白的結合性為1.3~1.4的情況下，本發明的修飾TM2的纖連蛋白結合性優選是1.0以下、更優選0.7以下、0.25以下、0.15以下。
[0150]希望在本發明的修飾TM2中未進行修飾的胺基酸殘基
[0151]關於本發明的修飾TM2中的胺基酸殘基的修飾，需要不影響生物素結合能力。另一方面，作為生物素結合蛋白之一的鏈黴菌抗生物素蛋白的生物素口袋(pocket)已經闡明。該鏈黴菌抗生物素蛋白與TM2之間的胺基酸序列同源性僅為50%左右，但發明人等為了獲得關於TM2的生物素口袋的認識，將TM2與鏈黴菌抗生物素蛋白的胺基酸序列進行了並列比較。於是發現:形成鏈黴菌抗生物素蛋白的生物素口袋的胺基酸中的、與生物素直接相互作用的殘基 N23、S27、Y43、S45、N49、W79、S88、T90、W92、W108、W120、D128 (Weber 等，(1989) Science243:85-88,Livnah 等，(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.90:5076-5080)，在 TM2 中分別相當於 N14、S18、Y34、S36、D40、W69、S76、T78、W80、W96、W108、D116,是非常保守的。
[0152]唯一的例外是，鏈黴菌抗生物素蛋白的49位的N(天冬醯胺)在TM2中是40位的D (天冬氨酸)，正如所述，將其修飾成與鏈黴菌抗生物素蛋白相同的天冬醯胺而得到的D40N TM2的生物素結合能力提高。由這些結果可以認為，TM2與鏈黴菌抗生物素蛋白的生物素結合口袋具有非常相似的結構，這些胺基酸殘基在很大程度上參與了生物素結合。
[0153]特別是，4個色氨酸殘基(W69、W80、W96、W108)被認為對生物素口袋的結構起著重要的作用，因而希望不進行修飾。另一方面，被認為參與與生物素的結合的其它胺基酸，即被認為在TM2中與生物素直接相互作用的胺基酸殘基(N14、S18、Y34、S36、S76、T78、D116)，也希望不進行修飾。或者，在對這些胺基酸進行修飾時，希望修飾成性質或者結構類似的胺基酸，以能夠維持與生物素的結合。例如，對於天冬醯胺(N14)，希望修飾成穀氨醯胺(Q)、天冬氨酸(D)，優選天冬氨酸；對於天冬氨酸(D40)，希望修飾成天冬醯胺(N);對於絲氨酸(S18、S36、S76)，希望修飾成蘇氨酸(T)或者酪氨酸(Y)，優選蘇氨酸；對於酪氨酸(Y34)，希望修飾成絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)或者苯丙氨酸(F)，優選苯丙氨酸；對於蘇氨酸(T78)，希望修飾成絲氨酸(S)、酪氨酸(Y)，優選絲氨酸；對於天冬氨酸(Dl 16)，希望修飾成穀氨酸(E)、天冬醯胺(N)，優選天冬醯胺。
[0154]胺基酸的修飾方法
[0155]用於對TM2的胺基酸進行修飾來獲得本發明的修飾TM2的方法，可以採用公知的對胺基酸序列實施突變的方法，對其沒有特殊限制。優選對編碼TM2的核酸的鹼基序列實施修飾，來進行修飾。
[0156]例如，為了對胺基酸序列的特定位置的胺基酸進行修飾，可以列舉出例如利用PCR的方法(Higuchi等(1988), Ho ^ (1989))。即，通過利用包含目標突變的錯配密碼子的引物進行PCR，製作編碼目的變體的DNA並使之表達，能夠得到目的變體。
[0157]另外，胺基酸缺失、取代、插入和/或添加而成的變體可以通過對編碼野生型蛋白質的DNA實施例如作為公知技術的定點誘變(例如參見Nucleic Acid Research, Vol.10,N0.20，p.6487-6500，1982，通過引用將其全文引入到本說明書中)而產生。就定點誘變方法而言，例如，除希望的變異即特定的不一致之外，還可以使用與要突變的單鏈噬菌體DNA互補的合成寡核苷酸引物按如下方式進行。即，使用上述合成寡核苷酸作為引物合成與噬菌體互補的鏈，用得到的雙鏈DNA轉化宿主細胞。將轉化後的細菌的培養物鋪在瓊脂上，由含噬菌體的單個細胞形成噬菌斑。這樣，理論上有50%的新菌落含有單鏈形式的具有突變的噬菌體，其餘的50%攜帶原序列。在下述溫度下，使獲得的噬菌斑與通過激酶處理而標記的合成探針雜交，所述溫度下所述探針與和帶有目的突變的DNA完全一致的噬菌斑雜交，而不與攜帶原有鏈的噬菌斑雜交。然後，收集與該探針雜交的噬菌斑，進行培養，回收DNA。
[0158]編碼修飾tamavidin2 (TM2)蛋白質的核酸
[0159]本發明提供編碼本發明的修飾型TM2的核酸。這樣的核酸的鹼基序列是將TM2的鹼基序列(SEQ ID NO:1)修飾成編碼修飾型TM2蛋白質的修飾胺基酸的鹼基序列而得到的。被修飾的鹼基序列只要是編碼修飾後胺基酸的鹼基序列即可，對其沒有限制。例如包括:為了對由SEQ ID NO:1的鹼基序列組成的核酸，或與其互補鏈在嚴格條件下雜交、且編碼具有生物素結合活性的蛋白質的核酸(以下稱作「TM2基因」)實施本發明的修飾，而對鹼基序列進行修飾而得到的。
[0160]本發明的核酸優選編碼SEQ ID N0:8、10、16、20、22、24以及25中的任何一個胺基酸序列。更優選編碼胺基酸序列22或24。本發明的核酸優選由SEQ ID NO:7、9、15、19、21以及23的核酸序列組成。更優選由SEQID NO:21或23的核酸序列組成。
[0161]包含發明的核酸的載體
[0162]此外，本發明提供包含編碼修飾TM2蛋白質的核酸的載體。優選用於表達修飾TM2蛋白質的表達載體。
[0163]編碼本發明的修飾TM2蛋白質的核酸如上述「編碼修飾tamavidin蛋白質的核酸」中所述，沒有特殊限制。
[0164]而且，編碼修飾TM2蛋白質的核酸的一端或兩端可以具有限制酶識別位點或aatBl、aatB2、aatB3等Gateway系統(Invitrogen公司)中使用的序列等，此外修飾TM2蛋白質編碼核酸的上遊可以配置在希望的宿主中發揮功能的啟動子，或者其下遊可以配置終止子。
[0165]而且，對於限制酶識別位點的種類沒有特殊限制，但優選在表達載體中其是唯一的識別位點。對識別位點的數量沒有特殊限制，可以是I個或2個以上，優選10個以下。
[0166]而且，限制酶位點、aatB序列與修飾TM2核酸的鹼基序列之間可以配置編碼I個胺基酸以上、優選5個胺基酸以上、更優選10個胺基酸以上、更優選25個胺基酸以上且50個胺基酸以下的接頭胺基酸序列(對其沒有特殊限制，可以是富含甘氨酸、絲氨酸的序列等本領域技術人員通常使用的序列)的核酸序列，此外，並非特殊限制，還可以配置例如編碼諸如腸激酶、Factor Xa等蛋白酶的識別位點的序列。
[0167]此外,在將例如scFv、Fab等抗體基因插入該表達載體的情況下,在細胞質內部這樣的還原條件不適合融合蛋白質的表達時，在啟動子與由用於插入編碼修飾tamavidin的核酸序列構成的單元之間，可以包含編碼諸如信號肽、分泌信號等前導肽的核酸序列。
[0168]本發明的載體優選是表達載體。表達載體除了具有這樣的表達單元之外，還可以具有用於能夠在希望的宿主中進行複製的單元例如具有複製起點，或者還可以具有用於選擇希望的宿主細胞的藥物抗性標記基因。對於宿主沒有特殊限制，優選是大腸桿菌。此外，該表達載體中還可以組合入例如大腸桿菌中的乳糖阻遏物系統這樣的合適的表達調控系統。
[0169]固定化有修飾tamavidin的載體
[0170]本發明提供固定化有本發明的修飾TM2蛋白質的載體。
[0171]構成的載體的材料可以使用公知材料。包括例如纖維素、特氟隆、硝酸纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯醯胺、聚酯、聚碳酸酯、聚醯胺、聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、二氧化矽、玻璃、玻璃纖維、金、鉬、銀、銅、鐵、不鏽鋼、鐵氧體、矽晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹脂、多糖類、蛋白質(白蛋白等)、碳或它們的組合，但不限於此。此外，優選具有一定強度、組成穩定、且非特異性結合少的載體。
[0172]固體載體的形狀包括但不限於:珠子、磁珠、薄膜、微細管、濾膜、平板、微量板、碳納米管、傳感器晶片等。正如本【技術領域】公知的那樣，薄膜或平板等平坦的固體載體上可以設置凹坑、溝槽、濾膜底部等。 [0173]在本發明的一類實施方式中，珠子可以具有約25nm~約Imm範圍的球體直徑。在優選的實施方式中，珠子具有約50nm~約ΙΟμπι範圍的直徑。磁珠的尺寸可以根據特定的用途來進行選擇。數種細菌孢子具有約I μ m數量級的尺寸，因此用於捕捉這些孢子的優選珠子具有大於Iym的直徑。
[0174]對於蛋白質針對載體的結合沒有特殊限制，可以使用使蛋白質結合於載體的公知方法。具體的結合方法，本領域技術人員可以根據載體的種類等適宜選擇。
[0175]發明的效果
[0176]根據本發明，能夠提供:在保持tamavidin的生物素結合能力高的特性的同時,性能提升的修飾型生物素結合蛋白，所述性能提升是指非特異性結合性降低和/或進一步的生物素結合提高。通過利用這些修飾tamavidin，能夠在利用了抗生物素蛋白_生物素結合的用於測定檢測對象的檢測方法例如免疫測定、核酸雜交測定中，謀求降低背景、提高靈敏度、保持惡劣環境(高溫、變性劑、酶存在下等)中的生物素結合性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0177]圖1顯示了本發明的低pi型修飾TM2蛋白質對於血清蛋白質固定化磁珠的非特異性結合性。**P〈0.01對ΤΜ2
[0178]圖2顯示了本發明的低pi型修飾ΤΜ2蛋白質對於纖連蛋白的非特異性結合性。*p〈0.01 對 ΤΜ2
[0179]圖3顯示了本發明的低pi型修飾ΤΜ2蛋白質對DNA的非特異性結合性。
[0180]圖4中考察了血清蛋白質針對固定化有本發明的低非特異性結合-高親和性型ΤΜ2蛋白質的磁珠的非特異吸附性。*ρ〈0.1對ΤΜ2
[0181]圖5顯示了本發明的低非特異性結合-高親和性型ΤΜ2蛋白質對纖連蛋白的非特異性結合性。*ρ〈0.01對ΤΜ2[0182]圖6顯示了本發明的低非特異性結合-高親和性型TM2蛋白質對DNA的非特異性結合性。圖6的上、中、下分別顯示了野生型TM2、TM2R104EK141E、TM2D40NR104EK141E的結
果O
實施例
[0183]以下，通過實施例對本發明進行具體說明，但這些並不是對本發明的技術範圍的限定。本領域技術人員可以基於本說明書的記載容易地對本發明加以修飾、變更，這些也包含在本發明的技術範圍內。
[0184]實施例1低Dl型TM2的構律與分析
[0185]1-1)低Dl型TM2的構律
[0186]以降低TM2的等電點為目的，將TM2中的鹼性胺基酸殘基取代成中性胺基酸或酸性胺基酸，構建了以下的7個修飾體。
[0187](1)將26位的賴氨酸取代成丙氨酸的TM2 (以下稱作「TM2K26A」，鹼基序列SEQ IDNO:3，胺基酸序列 SEQ ID NO:4)；
[0188](2)將73位的賴氨酸取代成穀氨醯胺的TM2(以下稱作「TM2K73Q」，鹼基序列為SEQ ID NO:5，胺基酸序列為 SEQ ID NO:6)；
[0189](3)將104位的精氨酸取代成穀氨酸的TM2(以下稱作「TM2R104E」，鹼基序列為SEQ ID NO:7，胺基酸序列為 SEQ ID NO:8)；
[0190](4) 141位的賴氨酸突變成穀氨酸的TM2(以下稱作「TM2K141E」，鹼基序列為SEQID NO:9，胺基酸序列為 SEQ ID NO: 10)；
[0191](5)具有33位的賴氨酸一蘇氨酸的取代和37位的賴氨酸一丙氨酸的取代的TM2(以下稱作「TM2K33TK37A」，鹼基序列為SEQ ID NO: 11，胺基酸序列為SEQ ID NO: 12)；
[0192](6)具有33位的賴氨酸一蘇氨酸的取代、37位的賴氨酸一丙氨酸的取代以及104位的精氨酸一穀氨酸的取代的TM2(以下稱作「TM2K33TK37AR104E」，鹼基序列為SEQ IDNO: 13，胺基酸序列為SEQ ID NO: 14);以及
[0193](7)具有104位的精氨酸一穀氨酸的取代和141位的賴氨酸一穀氨酸的取代的TM2(以下稱作「TM2R104EK141E」，鹼基序列為SEQ ID NO: 15，胺基酸序列為SEQ ID NO: 16)。
[0194](8)將19位的賴氨酸取代成蘇氨酸的TM2 (以下稱作「TM2K19T」，鹼基序列為SEQID NO: 17，胺基酸序列為 SEQ ID NO: 18)；
[0195]R104E的Ε、K33TK37A的T和A是通過TM2與鏈黴菌抗生物素蛋白的胺基酸序列比較，參考鏈黴菌抗生物素蛋白序列上的該部分的胺基酸確定的。此外，K141E的E是參考tamavidinl序列上的該部分的胺基酸確定的。
[0196]首先，為了構建低pi型TM2，設計了用於導入各突變的引物。設計了由TM2基因的5』部分及在其上遊編碼Pci I限制酶切割位點(ACATGT)的序列構成的引物Tm2NtermPC1、以及由TM2基因的3』部分及在其下遊編碼BamH I限制酶切割位點(GGATCC)的序列構成的引物Tm2CtermBam。針對各變體的包含錯配密碼子的一系列有義引物和反義引物分別如下(SEQ ID NO:26-37)。
[0197]表1低pi型TM2構建用引物
[0198][表 I][0199]
【權利要求】
1.一種修飾型生物素結合蛋白，其選自: (1)SEQID NO:2的40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬醯胺殘基的修飾型生物素結合蛋白(TM2D40N)； (2)在SEQID NO:2中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬醯胺殘基、且104位的精氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基的修飾型生物素結合蛋白(TM2D40N-R104E);以及 (3)在SEQID NO:2中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬醯胺殘基、104位的精氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基的修飾型生物素結合蛋白(TM2D40N-R104E-K141E)。
2.編碼權利要求1所述蛋白質的核酸。
3.包含權利要求2所述核酸的載體。
4.固定化有權利要求1所述蛋白質的載體。
【文檔編號】C12N15/31GK103923195SQ201410186634
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2009年8月13日 優先權日:2008年8月13日
【發明者】高倉由光, 市川雅子 申請人:日本菸草產業株式會社