包含rre和cte的遺傳構建體和組合物及其用途的製作方法
2023-08-03 16:27:11
專利名稱：包含rre和cte的遺傳構建體和組合物及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及改進的遺傳構建體。具體而言，本發明涉及核酸分子；該核酸分子可用於產生由所述核酸分子的核酸序列編碼的蛋白的高水平表達。本發明也涉及改進的DNA疫苗和基因治療劑。
背景技術：
HIV-1 Rev-RRE是眾所周知的，但並未完全被理解。已知編碼HIV結構蛋白的基因，即HIV基因gag、pol和env均含有由HIV蛋白Rev識別的RRE。已知這些序列與HIV蛋白Rev相互作用。細胞中含有RRE的核酸分子與存在於細胞中的Rev結合併運輸到細胞質中。該運輸導致與在類似的構建體中不存在RRE或Rev時所觀察到的情況相比更高水平的基因表達。美國專利No.5,554,528和5,604,114公開了HIV RRE序列，其在此引入作為參考。美國專利No.5,650,309和5,665,577公開了包含HIV RRE序列的載體，其在此引入作為參考。
CTE系統是眾所周知的，並描述於美國專利No.5,585,263和5,880,276，其均在此引入作為參考。根據該系統，宿主蛋白識別mRNA上的CTE序列，並將其從核轉運到細胞質中。該轉運導致與在類似的構建體中不存在RRE或Rev時所觀察到的情況相比更高水平的基因表達。CTE系統也描述於以下文獻中Bray，M.，S.Prasad，J.W.Dubay，E.Hunter，K.-T.Jeang，D.Rekosh和M.-L.Hammarskjold(1994)。來自梅森-普菲策爾猴病毒(Mason-Pfizer monkey virus)基因組的小元件使得1型人免疫缺陷病毒表達和複製不依賴於Rev.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 911256-1260；Saavedra，C.，B.Felber和E.Izaurralde.1997。與HIV-1 RRE不同，猿猴逆轉錄病毒-1組成型運輸元件利用細胞mRNA輸出所需的因子。Curr.Biol.619-628，ErnstRK，Bray M，Rekosh D，Hammarskjold ML.(1997)Secondarystructure and mutational analysis of the Mason-Pfizer monkey virusRNA constitutive transport element.RNA.3(2)210-22；和Kang Y，Bogerd HP，Cullen BR.(2000).Analysis of cellular factors that mediatenuclear export of RNAs bearing the Mason-Pfizer monkey virusconstitutive transport element.J Virol.74(13)5863-71，其各自均在此處引入作為參考。
需要提供用於增強核酸分子的編碼序列表達的改進的系統。需要提供顯示核酸分子的編碼序列高水平表達的改進的疫苗、免疫方法和基因治療方法以及組合物。
發明概述本發明涉及包含HIV-1 Rev的編碼序列和所需蛋白的編碼序列的遺傳構建體。在此遺傳構建體中，所需蛋白的編碼序列包含包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分和至少一個CTE。
本發明也涉及包含至少兩個核酸分子的組合物，其中至少一個核酸分子包含HIV-1 Rev的編碼序列，且至少一個核酸分子包含所需蛋白的編碼序列。所需蛋白的編碼序列包含包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分和至少一個CTE。所需蛋白通常是不同於HIV-1 Rev的蛋白。
本發明進一步涉及在個體中誘導針對免疫原的免疫應答的方法。本發明的一些方法包含如下步驟，即向個體施用包含HIV-1 Rev的編碼序列和免疫原的編碼序列的遺傳構建體。所述免疫原的編碼序列包含包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分和至少一個CTE。本發明的一些方法包含如下步驟，即向個體施用包含至少兩個核酸分子的組合物。至少一個核酸分子包含HIV-1 Rev的編碼序列，且至少一個核酸分子包含免疫原的編碼序列。所述免疫原的編碼序列包含包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分和至少一個CTE。
本發明進一步涉及向個體送遞蛋白的方法。本發明的一些方法包含如下步驟，即向個體施用包含HIV-1 Rev的編碼序列和蛋白的編碼序列的遺傳構建體。所述蛋白的編碼序列包含包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分和至少一個CTE。本發明的一些方法包含如下步驟，即向個體施用包含至少兩個核酸分子的組合物。至少一個核酸分子包含HIV-1 Rev的編碼序列，且至少一個核酸分子包含所需蛋白的編碼序列。所述蛋白的編碼序列包含包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分和至少一個CTE。
本發明進一步涉及在細胞中生產蛋白的方法。本發明的一些方法包含培養包含遺傳構建體的細胞的步驟，所述遺傳構建體包含HIV-1Rev的編碼序列和蛋白的編碼序列。所述蛋白的編碼序列包含包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分和至少一個CTE。本發明的一些方法包含培養包含至少兩個核酸分子的細胞的步驟。至少一個核酸分子包含HIV-1 Rev的編碼序列，且至少一個核酸分子包含所需蛋白的編碼序列。所述蛋白的編碼序列包含包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分和至少一個CTE。
附圖簡述
圖1-5顯示了來自施用3個質粒之一後針對HIV-1 Env的免疫應答的比較的數據，這3個質粒的每一個都編碼Env，其中Env編碼序列含有RRE。這些數據在下面的實施例中進行描述。
發明詳述根據本發明，核酸分子是用兩種運輸元件提供的，當這兩種元件在mRNA上存在的時候，導致mRNA從細胞核到細胞質的往返以及細胞內蛋白的生產加快。這兩種運輸元件均可相互獨立地發揮作用，並且共同使用時產生的對蛋白生產的增強作用比簡單的加性效應更高。
所使用的每種運輸系統均已明確。其一是HIV-1 Rev-Rev應答元件(RRE)系統。另一種是從梅森-普菲策爾猴病毒分離的CTE系統。根據本發明，遺傳構建體不僅包含RRE而且包含至少一個CTE。此外，還向該構建體提供了HIV-1 Rev編碼序列，以給細胞提供參與RRE和影響運輸的Rev蛋白。
如此處用到的，「遺傳構建體」這一術語是指包含編碼一種蛋白的核酸序列(編碼序列)的核酸分子，該核酸序列可操作地連接到所述編碼序列表達所必需的元件上。在一些實施方案中，遺傳構建體為DNA，優選是質粒或病毒載體的基因組。在一些實施方案中，遺傳構建體為RNA，優選是逆轉錄病毒載體的基因組。
根據本發明，所提供的遺傳構建體包含Rev的編碼序列和所需蛋白的編碼序列。如此處用到的，「所需蛋白」這一術語係指任何蛋白，包括具有生理活性或免疫原性活性序列的蛋白，前提是所述蛋白包含HIV結構蛋白的至少部分編碼序列，該部分編碼序列包括RRE，且包括所述蛋白編碼序列的mRNA包含至少一個CTE。在一些實施方案中，所需蛋白是HIV結構蛋白，且包含HIV結構蛋白編碼序列的mRNA包含至少一個CTE。在一些實施方案中，所需蛋白是融合蛋白，該融合蛋白包含HIV結構蛋白的至少一部分和非HIV部分。在一些實施方案中，非HIV部分可以是有免疫原性或生理活性的蛋白或其免疫原性或生理活性的片段，所述蛋白或其片段進而包含HIV結構蛋白或其中包含RRE的片段。如果所需蛋白不是HIV結構蛋白，即它為一種融合蛋白，那麼非HIV序列的性質將決定該遺傳構建體是疫苗還是基因治療劑。也就是說，如果作為所需蛋白的融合蛋白是免疫原，則該構建體可被用作疫苗來誘導免疫應答，或用作生產蛋白的起始原料。如果融合蛋白有生物活性而無免疫原性，則該構建體可被用作基因治療劑或產生蛋白的起始原料。
本發明也提供一種組合物，其包含至少兩個核酸分子，至少其中一個包含HIV-1 Rev的編碼序列，且至少其中一個包含所需蛋白的編碼序列。在一些實施方案中，核酸分子是DNA分子，優選質粒。
本發明的遺傳構建體以及本發明組合物的核酸分子包括選自gag、pol、env及其包含RRE的一個片段的編碼序列。也就是說，本發明可用於使gag、pol或env編碼的HIV蛋白高水平表達，或者可選擇地，也可用於使含有RRE的gag、pol或env基因產物部分的融合蛋白高水平表達。此遺傳構建體也包含編碼HIV-1 Rev蛋白的編碼序列，此編碼序列可操作地連接到調控元件上，以使Rev蛋白得以產生。此組合物含有一個核酸分子，它含有可編碼HIV-1 Rev蛋白的編碼序列，此編碼序列可操作地連接到調控元件上，以使Rev蛋白得以產生。
根據本發明，在要生產的蛋白序列的組合物的遺傳構建體或核酸分子中含有上述CTE序列或多個CTE序列。在優選實施方案中，CTE序列包括於多腺苷酸化尾的3』的位點。在某些實施方案中，該遺傳構建體可以含有多於一個CTE序列。在某些實施方案中，它可以含有2、3、4或5個CTE序列。
本發明進一步提供了在個體中誘導針對免疫原的免疫應答的方法，向個體送遞蛋白的方法和生產蛋白的方法。
在個體中誘導針對免疫原的免疫應答的方法以及向個體送遞蛋白的方法包括向個體施用上述的遺傳構建體或組合物的步驟。在誘導免疫應答的方法中，所需蛋白是免疫原性的。如果所需蛋白是一種HIV結構蛋白，那麼此遺傳構建體即為疫苗，而且所需蛋白是為了用作免疫原而表達的。類似地，如果所需蛋白是一種免疫原性蛋白，那麼此遺傳構建體或組合物可用作疫苗，並且所需蛋白是為了用作免疫原而表達的。誘導免疫應答可提供保護性或治療性效應，或者產生針對所述免疫原特異性的抗體以及抗原特異性免疫系統細胞。此抗體和細胞可被收集和利用。
能用本發明編碼的免疫原的實例包括HIV結構蛋白Gag、Pol、Env及其片段。此外，疫苗可根據1997年1月14日授權的美國專利No.5,593,972所述進行製備，其中免疫原是靶蛋白，所述專利在此處引入作為參考。此種免疫原可以是病原蛋白、與過度增殖性疾病相關的蛋白或者與自身免疫病相關的蛋白以及變應原。對於所有的非HIV結構蛋白的免疫原，所述免疫原性蛋白必須以融合蛋白的形式被呈遞，所述融合蛋白由嵌合基因編碼，此嵌合基因的編碼序列中包括至少一部分作為RRE的HIV結構蛋白編碼序列。在免疫應答被送遞的本發明實施方案中，本發明可與佐劑、免疫調製蛋白以及編碼諸如細胞因子、趨化因子和生長因子的免疫調製蛋白的遺傳序列聯合應用。
向個體送遞蛋白的方法包括向個體施用如前所述的遺傳構建體或組合物的步驟。在一些實施方案中，所需蛋白為細胞因子、生長因子、趨化因子、共刺激分子、抗體、可溶性受體、酶、凝血因子或它們的片段。在一些實施方案用中，所需蛋白為病原體抗原、癌基因翻譯產物或者其他癌相關抗原、自身免疫病相關蛋白、變應原或它們的片段。在一些實施方案中，所需蛋白為胰島素、IL-1、IL-2、IL-5、IL-12、IL-15、VEGF、EGF、EPO、GMCSF、GCSF、它們的受體、CD28、CD80、CD86、CD40、CD40L、mAbs、Fabs、F(ab)2s、嵌合的、人源化的、靈長類化的、人mAbs、Fabs、F(ab)2s、DNA酶(DNAse)、tPA、凝血因子I-XII或它們的活性片段。在一些實施方案中，所需蛋白是美國專利No.5,593,972所提出的一種抗原，其在此處引入作為參考。
在細胞中生產蛋白的方法包括培養細胞的步驟，該細胞含有上述的遺傳構建體或組合物的至少兩個核酸分子。在此方法中，細胞可以是RRE系統和CTE系統同時具有活性的任何細胞。在某些實施方案中，此細胞為哺乳動物細胞。在某些實施方案中，此細胞為人的細胞。
在優選實施方案中，此遺傳構建體是可以直接向患者施用的質粒。有許多方法可用於向患者直接送遞DNA。除了美國專利No.5,593,972中所描述的那些方法外(其在此處引入作為參考)，其他方法包括美國專利No.5,739,118(其在此處引入作為參考)和美國專利No.5,981,505(其在此處引入作為參考)中所述的方法。另外，可以利用本文所述的改進採用在www.dnavaccine.com公開的專利和出版物中描述的方法，所述專利和出版物均在此引入作為參考。例如，此發明可與任何質粒送遞系統相容，如lipofectins、陽離子脂質、陰離子脂質、脂質體、轉染劑和細胞靶向劑。
在優選實施方案中，質粒DNA經肌內注射向個體施用。除質粒DNA外，可注射的組合物中任選包含促進劑(facilitating)如布比卡因或相關組合物，包括在PCT申請系列號PCT/US94/00899中所描述的那些，其在此處引入作為參考。
除了在質粒中使用外，本發明的構建體也可用於其他遺傳送遞系統中，其中編碼需要表達的蛋白的DNA是在細胞核中轉錄的，如，逆轉錄病毒載體或其它病毒載體或非病毒載體。
實施例在圖1-5中所附的數據報導了施用3個質粒之一後針對HIV-1 Env的免疫應答的比較，這3個質粒的每一個都編碼Env。Env編碼序列含有上述RRE。所述數據清楚地顯示包括CTE的Env和Rev的編碼序列的組合產生了增強的免疫應答，與在施用僅含有Env和Rev的編碼序列或具有CTE的Env的編碼序列的遺傳構建體後所觀察到的情形形成對照。
權利要求
1.遺傳構建體，其包含a)HIV-1Rev的編碼序列，和b)所需蛋白的編碼序列，其中所需蛋白的編碼序列包含i)包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分，和ii)至少一個CTE。
2.權利要求1中的遺傳構建體，其中所述的遺傳構建體為DNA分子。
3.權利要求2中的遺傳構建體，其中所述的遺傳構建體為質粒。
4.權利要求1中的遺傳構建體，其中所需蛋白是包括至少一個CTE的HIV結構蛋白。
5.權利要求1中的遺傳構建體，其中所需蛋白是融合蛋白，該融合蛋白含有HIV結構蛋白的至少一部分和非HIV部分。
6.權利要求1中的遺傳構建體，其中所需蛋白是融合蛋白，該融合蛋白含有HIV結構蛋白的至少一部分和免疫原性的非HIV部分。
7.權利要求1中的遺傳構建體，其中所述的遺傳構建體包含1到5個CTE。
8.組合物，其含有至少兩個核酸分子a)至少一個核酸分子包含HIV-1Rev的編碼序列，和b)至少一個核酸分子包含所需蛋白的編碼序列，其中所需蛋白的編碼序列包含i)包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分，和ii)至少一個CTE。
9.權利要求8中的組合物，其中所述的核酸分子為DNA分子。
10.權利要求9中的組合物，其中所述的DNA分子為質粒。
11.權利要求8中的組合物，其中所需蛋白是包含至少一個CTE的HIV結構蛋白。
12.權利要求9中的組合物，其中所需蛋白是融合蛋白，該融合蛋白含有HIV結構蛋白的至少一部分和非HIV部分。
13.權利要求8中的組合物，其中所需蛋白是融合蛋白，該融合蛋白含有HIV結構蛋白的至少一部分和免疫原性的非HIV部分。
14.權利要求8中的組合物，其中至少一個核酸分子包含所需蛋白的編碼序列，其中所需蛋白的編碼序列包含i)包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分，和ii)1到5個CTE。
15.在個體內誘導針對免疫原的免疫應答的方法，包含向所述個體施用以下組合物的步驟a)含有遺傳構建體的組合物，該遺傳構建體包含i)HIV-1Rev的編碼序列，和ii)所述免疫原的編碼序列，其中所述免疫原的編碼序列包含1)包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分，和2)至少一個CTE；或b)含有至少兩個核酸分子的組合物i)至少一個核酸分子包含HIV-1Rev的編碼序列，和ii)至少一個核酸分子包含免疫原的編碼序列，其中所述免疫原的編碼序列包含1)包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分，和2)至少一個CTE。
16.權利要求15的方法，包含向所述個體施用含有遺傳構建體的組合物的步驟，所述遺傳構建體包含i)HIV-1Rev的編碼序列，和ii)所述免疫原的編碼序列，其中所述免疫原的編碼序列包含1)包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分，和2)至少一個CTE；或者
17.權利要求15的方法，包含向所述個體施用組合物的步驟，所述組合物含有至少兩個核酸分子i)至少一個核酸分子包含HIV-1Rev的編碼序列，和ii)至少一個核酸分子包含免疫原的編碼序列，其中所述免疫原的編碼序列包含1)包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分，和2)至少一個CTE。
18.向個體送遞蛋白的方法，包含向所述個體施用以下組合物的步驟a)含有遺傳構建體的組合物，該遺傳構建體包含i)HIV-1Rev的編碼序列，和ii)所述蛋白的編碼序列，其中所述蛋白的編碼序列包含1)包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分，和2)至少一個CTE；或b)含有至少兩個核酸分子的組合物i)至少一個核酸分子包含HIV-1Rev的編碼序列，和ii)至少一個核酸分子包含所述蛋白的編碼序列，其中所述蛋白的編碼序列包含1)包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分，和2)至少一個CTE。
19.權利要求18的方法，包含向所述個體施用含有遺傳構建體的組合物的步驟，該遺傳構建體包含i)HIV-1Rev的編碼序列，和ii)所述蛋白的編碼序列，其中所述蛋白的編碼序列包含1)包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分，和2)至少一個CTE。
20.權利要求18的方法，包含向所述個體施用含有至少兩個核酸分子的組合物的步驟i)至少一個核酸分子包含HIV-1Rev的編碼序列，和ii)至少一個核酸分子包含所述蛋白的編碼序列，其中所述蛋白的編碼序列包含1)包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分，和2)至少一個CTE。
21.在細胞內生產蛋白的方法，包括細胞培養的步驟，所述細胞包含a)遺傳構建體，其包含i)HIV-1Rev的編碼序列，和ii)所述蛋白的編碼序列，其中所述蛋白的編碼序列包含1)包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分，和2)至少一個CTE；或b)至少兩個核酸分子，其中i)至少一個核酸分子包含HIV-1Rev的編碼序列，和ii)至少一個核酸分子包含所述蛋白的編碼序列，其中所述蛋白的編碼序列包含1)包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分，和2)至少一個CTE。
22.權利要求21的方法，包含培養含有遺傳構建體的細胞的步驟，該遺傳構建體包含i)HIV-1Rev的編碼序列，和ii)所述蛋白的編碼序列，其中所述蛋白的編碼序列包含1)包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分，和2)至少一個CTE。
23.權利要求21的方法，包含培養含有遺傳構建體的細胞的步驟，該遺傳構建體含有至少兩個核酸分子i)至少一個核酸分子包含HIV-1Rev的編碼序列，和ii)至少一個核酸分子包含所述蛋白的編碼序列，其中所述蛋白的編碼序列包含1)包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分，和2)至少一個CTE。
全文摘要
公開了包含HIV－1 Rev的編碼序列和所需蛋白的編碼序列的遺傳構建體。公開了包含至少兩個核酸分子的組合物，其中至少一個核酸分子包含HIV－1 Rev的編碼序列，且至少一個核酸分子包含所需蛋白的編碼序列。在此遺傳構建體和包含核酸分子的組合物中，所需蛋白的編碼序列包含包括RRE的HIV結構蛋白編碼序列的至少一部分和至少一個CTE。也公開了在個體中誘導針對免疫原的免疫應答的方法，向個體送遞蛋白的方法和生產蛋白的方法。
文檔編號C12Q1/70GK1738897SQ200380108913
公開日2006年2月22日 申請日期2003年11月19日 優先權日2002年11月19日
發明者D·B·韋納, K·穆圖馬尼 申請人:賓夕法尼亞州大學信託人